poly(hydroxyethyl methacrylate-co-glycidyl methacrylate) reactive membrane utilised for cholesterol...

7
Poly(hydroxyethyl methacrylate- co-glycidyl methacrylate) reactive membrane utilised for cholesterol oxidase immobilisation Sinan Akgo ¨l, 1 Gu ¨lay Bayramog ˇlu, 2 Yasemin Kacar, 3 Adil Denizli 1 and M Yakup Arıca 3 * 1 Department of Chemistry, Hacettepe University, 06532 Beytepe-Ankara, Turkey 2 Department of Chemistry, Kırıkkale University, 71450 Yahs ¸ihan-Kırıkkale, Turkey 3 Department of Biology, Kırıkkale University, 71450 Yahs ¸ihan-Kırıkkale, Turkey Abstract: Poly(2-hydroxyethyl methacrylate-co-glycidyl methacrylate) p(HEMA±GMA) membrane was prepared by UV-initiated photopolymerisation of 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA) and glycidyl methacrylate (GMA) in the presence of an initiator, azobisisobutyronitrile (AIBN). Cholesterol oxidase was immobilised directly on the membrane by forming covalent bonds between its amino groups and the epoxide groups of the membrane. An average of 53 mg of enzyme was immobilised per cm 2 of membrane, and the bound enzyme retained about 67% of its initial activity. Immobilisation improved the pH stability of the enzyme as well as its temperature stability. The optimum temperature was 5 °C higher than that of the free enzyme and was signi®cantly broader. The thermal inactivation rate constants for free and immobilised preparations at 70 °C were calculated as k i (free) 1.06 10 1 min 1 and k i (imm) 2.68 10 2 min 1 , respectively. The immobilised enzyme activity was found to be quite stable in the repeated experiments. # 2002 Society of Chemical Industry Keywords: pHEMA membrane; epoxy support; immobilization; covalent attachment; cholesterol oxidase INTRODUCTION Immobilised enzymes have a large number of applica- tions, particularly in biomaterials, food processing and analytical chemistry. The use of immobilised enzymes for chemical analysis has generated considerable interest in recent years. Sensors and biosensors based on ¯ow injection have been proposed in recent decades in numerous analyses. 1,2 The methods and supports employed for enzyme immobilisation are chosen to ensure the highest retention of enzyme activity and its stability and durability. 3,4 Many methods of immobilisation have been tried, ranging from covalent attachment, to adsorption, or physical entrapment. The supports used are often of polymeric character, being networks of high molecular weight which can adsorb solvent, mainly water, but are themselves insoluble. Epoxy-activated hydrogel mem- brane supports are very suitable to perform very easy immobilisation of proteins and enzymes at both laboratory and industrial scales. 4±6 Cholesterol oxidase is a ¯avin-dependent enzyme that catalyses the oxidation and isomerisation of 3b- hydroxy steroids. The enzyme contains one molecule of cofactor ¯avin adenine dinucleotide. The highest enzyme activity is observed using cholesterol as a substrate. 7,8 Normal human blood plasma contains 130±260 mg of cholesterol per 100 ml, of which two- thirds are esteri®ed with fatty acids and one-third is present as sterol. The determination of cholesterol is very important in clinical diagnosis, since a high serum cholesterol level is generally related to arteriosclerosis, myocardial infarction and cerebral thrombosis. 9 Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (pHEMA) based support material has previously been used in immobilisation of enzymes via adsorption, covalent attachment or entrapment due to its stability under a wide variety of reaction conditions. pHEMA is a non- toxic and biocompatible polymer whose most impor- tant application has been its use in the preparation of soft contact lenses, as a result of its high water content and high permeability. High water content and permeability are also important in its use as haemo- dialysis membranes, as a soft tissue augmentation material or as support material in enzyme electrodes and enzyme membrane reactors. 10±12 Glycidyl methacrylate (GMA), the ester of methacrylic acid and 2.3-epoxypropanol, bears a reactive epoxide group which reacts with sulfhydryl-, amino-, carboxyl- or hydroxyl groups to form stable covalent bonds with biomelecules without any linker. (Received 18 April 2001; revised version received 13 November 2001; accepted 2 January 2002) * Correspondence to: M Yakup Arıca, Kırıkkale University, Department of Biology, 71450 Yahs ¸ihan-Kırıkkale, Turkey E-mail: [email protected] # 2002 Society of Chemical Industry. Polym Int 0959±8103/2002/$30.00 1316 Polymer International Polym Int 51:1316±1322 (2002) DOI: 10.1002/pi.875

Upload: sinan-akgoel

Post on 06-Jul-2016

218 views

Category:

Documents


2 download

TRANSCRIPT

Page 1: Poly(hydroxyethyl methacrylate-co-glycidyl methacrylate) reactive membrane utilised for cholesterol oxidase immobilisation

����� ����������� ����� ��� ,4:%'%+*%'&& 4&00&5;<�: %0�%00&8���.-7

Poly(hydroxyethyl methacrylate-��-glycidylmethacrylate) reactive membrane utilised forcholesterol oxidase immobilisationSinan Akgol,1 Gulay Bayramoglu,2 Yasemin Kacar,3 Adil Denizli1 andM Yakup Arıca3�1Department of Chemistry, Hacettepe University, 06532 Beytepe-Ankara, Turkey2Department of Chemistry, Kırıkkale University, 71450 Yahsihan-Kırıkkale, Turkey3Department of Biology, Kırıkkale University, 71450 Yahsihan-Kırıkkale, Turkey

(Rec

� CoE-ma

� &

��������� �� ������������� ������������������������ ������������� � ��������� ��������

��� �������� �� !���������� ��������������� " ������������� ������������ ����� ���

�������� ������������ ���� �� ��� �������� " �� ��������# �$������%���������� �&'(�)

*�������� ������ ��� ���������� �������� � ��� �������� �� "����� �+����� ���� �������

��� ���� ��%�� ��� ��� ������ ��%�� " ��� ��������) �� �+����� " ,-�� " ��$��� ������������� ��� ��� " ��������# ��� ��� �%�� ��$��� �������� ��%� ./0 " ��� ������� ����+���)

&����������� ����+�� ��� �� ��������� " ��� ��$��� �� ���� �� ��� ��������%�� ���������) 1��

����%� ��������%�� ��� ,°* ������ ���� ���� " ��� "��� ��$��� ��� ��� �����2������ ������) 1��������� ������+���� ���� �������� "� "��� ��� ���������� ����������� �� /3°* ���� ����%����� ���� "���� 4)3.�43�4 ����4 ��� �� ���� �).5�43�� ����4# ��������+���) 1�� ���������� ��$��� ����+������ "%�� � �� 6%��� ������ �� ��� �������� �����������)

� �33� 7����� " *������� &��%����

8������� ����� ������� �� �� ���� �� ��� ������� �� � ����� ��������� �� ����� � �����

INTRODUCTION��� ������� ������� ��� ��� ����� � ������

�� ��� �������� �� �� ������� � � � ������� ��

������� ��������� �� ��� � ��� ������� �������

� ������� ������ �� ������� � ��������

������� �� ����� ���� !��� � �� �� ���� � ����

� " # ��$���� � ��� ���� � � ��� �� �����

������ �� ���� �� �������%�& �� ���� �� ��

���� �� ���� ��� � ������ ��� ������� � �

�� ��� � ����� ��� ������� ������ � � ������

������� �� ��� �������� �� ���������'�( ���

���� �� � ��� ������� � ��� ���� ����� �����

� � � ����� ��������� � �� ��� �� �������

��������� �� ���� �� ���� � ���� � � ������

������ ����� ���# )� � ���� � ����� #�����

#���� �� �� � � ������ ����� #��� ��� �

���������� ��� ������ �� ���������� ��� ��� ����

��� ���� �� � ��� ������� � ��� � ��� ���

��� ������� � � � ����� �� ������� � � ��

�� � � �� �������� ������(*+

,� ����� � ����� �� "������������� ������

��� ������� ��� ����� � �� �� ������ � � '����� �� ��� ���� �� ������ � ����� �� � ������

� � ��� "��� ������ ������� ����� �� �������

������ ������� �� ������ ����� �� ����� � �

eived 18 April 2001; revised version received 13 November 2001; acc

rrespondence to: M Yakup Arıca, Kırıkkale University, Department ofil: [email protected]

00& ! ����� � ,������ �������� ����� ��� 0272*.%0'8&00&89'

��������-�. / �� ���� �� � ���� � �����

%'0*&+0�� � �� ����� � �� %00��� � #���� �# �

����� � �����1�� #��� ���� ���� �� ������� ��

������ � ��� �� �� ��������� � � �� ����� � ��

��� ��� ��� �� ������� ���� ���� ����� ���� ����

�� ����� � ����� �� ������� ����� � ��� ���� ����

�� ���� ������ � �� ����� �� �� ����2

3 ��4&���� ������� ���������5 4�����5

���� ���� � ����� �� ���� ���� ���� ���� ��

��� ������� � � ������� �� �� ��� �� � �����

�������� �������� ��� � ��� �������� ����

#��� ����� � ���� � � ����� ��� ����� �� � ��

� ��� �� �� � ������� � ���� #� �� � �� ��� �

��� ������� � �� ���� ��� ��� �� ��� ����� � �

� �� � ���� ������� � ����� � ��� ���� #�� � �����

�� ���� ����������� ���� #�� � ����� ��

���������� � �� ��� ��� �� ��� ��� � ��� �

������� �������� � � �� ������ �������� �

����� � ���� � ����� �� ������ ����� ���

�� ������ ������ ��� ��%0*%&

6������� ��������� 46��5� ��� ���� �

��������� ��� �� &�'��� ��� �� �� ���

������ �� ���� � �� #���� ���� #��� �����������

��� �� �� ���� ��� ��� � ��� � � � �����

� ����� � ��� #��� �� ��������� #��� �� �� ���)��

epted 2 January 2002�

Biology, 71450 Yahsihan-Kırıkkale, Turkey

0�00 %'%+

Page 2: Poly(hydroxyethyl methacrylate-co-glycidyl methacrylate) reactive membrane utilised for cholesterol oxidase immobilisation

��������������� ���� ���� � ��� ���� ���� ����! ��"��

=� � ������� ��)� � ����� � � ������� � ����� ��

������ ��� �� ���� ����� �� �)���� �����%'�%(

! �� � ��� ���� �� ���� ��� � ���� �����

�� �� ������� �: 4%5 ��������� � � ������

����� #��� �� �� �������� ����� 4���� � ��� �

��� � ����� ������ ����� �� �������5� 4&5

����� � � ������ �� � � �������� � � �#

�������� � � ��� � ������� ������ � ��� 4����

� � ��4������� ���������� ���������� ������������5� � ��4��� ������� ����� ���)�����������5 � ��4��� ������������ ���������� �������

���5�%7�%+ �� ����� � � ���� ������ ��� �����

� ����� ��� ���� �� ��� ������ �� ������ ����

�� �� � ��� ��� ������ �� ������ ��� ������

�� �� ������ �� ���� � ���� � ������ ��

� ��� �� �� ��� � ��� ��� ��� ���� ��

�$������ ��� � �� �� � ������ �� � �� �����

� � � ��� �� ��� � �������� � �������

�� ��� ������ ������ � �� �4����*6��5

���� � ������� ������ �� �� ���� � ��� #�

����� �� ��� ������ � � �� � � �������� �

� &���� ������� ��������� 4����5 #��� ��������

��������� 46��5 �� >?��������� �� � � �����

���� � �� ��� ������� � � ������ 4������ ����� ����� ������� ��=/5� ��� ���� � �� ��������� �� ���

��� ������ �� �� � ��� �� ����� �� ��� �����

��� ��� ������ ���� #��� �� ��� ���� � ��

������ � � � � � � � ����� ��� ������� � �

������ �� � ����� �� ������ �� ������ ����

� � #� ���� � ��� ��� ������� � � �� ����� �

����� �� � ����� ��������� �� ����� � �� ����

�� � ����� ��� ������� � �� �����*6��

� � ���� ������ �� � ������ ������� ������

��� ������ � ��� ������ � ��� �� ���� � ����

�� � ��� � ������� � � � ������ ����� �� �

��������� � � � ������� � � �� ����� � ��

�� � ���� "����� <������ � ����� �� � ��� ��

��� ������� ������ �������� �� ������ ���

�������� �� )������ ������ 4�� �� ���5#�� ���������� �� ����� � � ����� �������� �����

�� �� �� ��������� �� ������ ��� � ��� ���

� ������� ������ #�� �� ��������

EXPERIMENTALMaterials,� ����� � ����� 4�, %�%�'�+� � � ������� ��������� �� �������� � #��� #��� �����1� �������

'(>���%� � ���5 �� �� ����� 43<;� �, %�%%�%�-� ��� ��� � � � ������� &00>���%� � ���� #���������� �� ��� !��� ,������ , 4!� @ ���� �<�

>!�5 �� ���� � �������� &���� ������� �����

����� 4����5 �� �������� ��������� 46��5

#�� ������ � � A��) �6 4!#�������5� ��

� �� #� ��������� ���� ������ ������ �� ���

������� � ��� B��� �� �� )��� � (°, ����� ������������ �� ������� ������ 4��=/5� �� ����� ��

�� � C�%00� ������������ ����� ��� ��� ��

� ���� ���� ������ 4=!�5 #�� ������ � �

!��� ,������ , � ��� ��� �������� #�� �

����� ��� ,4�%'%+*%'&& 4&00&5

������� ��� �� ������� � � ���) �6

4;������ 6����5�

Preparation of poly(2-hydroxyethyl methacrylate-��-glycidyl methacrylate) membrane �� � ��4&���� ������� ���������� �������������������5 �4����*6��5 ��� ��� �� ��� ����

��� � � #� ����� �� >? �������� �� � � ���

������ �� �� � �������� � #� ���� �� ��

��� ���� � ��� 4������: 2�0��5 � &7°, ���� ��� ��� �� ����� � %�� �� ������ ����

�� � ������ 47��5 � ������ ���� 4%�+��

%�'&�%0�& � �5� 6�� 40�(�� '�'%�%0�& � �5���=/ 4%0��5 � � �������� � ������ �� �� ��

���� ����� 4'��� 70��� �� -�05� �� ��������

������ #� ����� �� �B�������� � &7°, �

%7��� �� ���� ����� #������ �� ������ #�

���� � ��� ��� ��� � ��� �� ��� ��� � � ���#��

����� ��� ���� � � &0���� ���� � �������� ��

��� �4����*6��5 ������� #�� #���� �����

����� #��� ��������� #�� �� ��� ��� ����� ������

4������: %�0��5 #��� ��� � �

Membrane characterisation studies���������� �� �� ��� ������ �� �������#�� �� #�� � � ) �� ��������� #�� � (.�� �# ����

������ ���)� 4�%�5 #�� #������ ��� �� ������� ������ � #��� �� ���� �� ����� ��� �

+0°, � &(� ����� � ����� #������ �� #�� � ����� � ��� ������� �������� �

� �� #�:

D�� � ����� 4%w/w) � ���� � ������� � %00�%�

D��� �� �� �� � ��� #������ � �# ���� �� ��

������� ������������

� ������ � ��� �� �� ���� !������ ����� � ��� ����� � ��� ���� � ��4����*6��5 �������

#�� ������ ����� E�<@ E�! 7+00 �������

����� � ��� �� ��� ��� � ���� #��� � �� ����

������ �������

���� �� ��� A �F ����� � ��� �4����*6��5������ #� ������ ����� !������� A �F

.000 ����� ����� �� � ����� �4����*6��5

������ 40�%�5 �� G= 40�%�5 #�� �� �����

������ ��� ������ #� ������ � � � ����� ��

��� ������� �� ����

Immobilisation of cholesterol oxidaseA����� �� �� �� � �� ����� �4����*6��5

������ ���)� 4%0�� ������ %�0��5 #�� �B�����

���� �� �� ����� ����� 470��� �� .�05 � &��

�� ������� �� � ��� ��� ���� ������ � �����

��� �� ����� � ����� 470��� %�� ���%5� ��� �������� � � �� ����� � ����� � ��� �4����*6��5

������ ���)� #� ���� �� � &&°, � %.��

#���� � ����� ���� ������ ��� ���� � ������� ����

%'%-

Page 3: Poly(hydroxyethyl methacrylate-co-glycidyl methacrylate) reactive membrane utilised for cholesterol oxidase immobilisation

� $#��%� �� �

���� ��� �� ��� �4����*6��5 ������ ���)�

#�� �� ��� � � ��� ������ �� #���� #��� %�

/,� �� ���� �� ����� ����� 40�%�� �� -�05�

�� � ��� � ��� ������� �� ����� � ����� �

��� �4����*6��5 ������ ���)� #� �����

����� �� ������� ��� ������ �� 1�� � ������

�� �� � � ���� #����� ��� ��� ������� � ������

����� , ����� =������ =��� � ��� ���� �

�������� �� =�� ��%- � ������ � ���� � ��

������� #��� =!� � ���� �� � )� #� � ������� �

40�07*0�70�� ���%5 #� ���� �� ��� ������� � �� ���� �� ��� ������ �� #�� � ���� ���

Activity assays of free and immobilised cholesteroloxidase �� ������� � ��� �� ��� ������� �� ����� �

����� #� ��������� �� ���� � ��� � �� #���

� ����� ������ ���� ���

,� ����� �<& �&< �����������,� ����� � �����

,� ��������'� ���&<& �&�

�&<& ��;��������� ������3� �������;����������&<

������ �������

�'�� %00�� �� ����� � � ���� � 4%00��5 #� ���

��� �� ���� ����� �� ����� � 4'�.+�5 �� ������ �

� ���&� � 4%'��5 �� �� � C�%00 4(��5� ����

������ � '0���� ��� � ���� #� ��� �� � %00��

#��� �� ����� ����� 40�%�� �� -�05� ��� �����

� ���� � #� ���� �� ��� �� ��� ������

�� ��� ������ � ������ �� ����� 4+�0��5

�� ������������ 4%'�&��5 �� �� ����� �����

4%00��� 0�%�� �� -�05� �� ��B� � � (�.�� � ����

������ �� 0�%�� � �� ����� � � ���� � 40�7*

%0��5 #�� ����� �� ���������� � '7°, �

%0��� �� #�� ���� �� ���� � #� ���� �����

�� ����� 0�%�� � ������ � ���� � 4� �������

�� ����� � ����� %�� ���%5 ��� ������� ���

���� 4�# ������ ���)�5� ���� ����� � �

�������� ��� 4%�7��� '0H5 �� ���� #�

������ � 7&7�� �� >?8?�� ����� �� � ����

4!������� � ��� %+0%� )� � E��5�

���� ������� ���� #�� ���� �� �� ��� ��

��� (�0*.�0 �� �������� ��� &0*(7°, �

�������� ��� �� �� �������� � 1��� � ��� ���

�� ��� ��� ������� ��������

<�� �� ����� � ����� ���� � ��� ���� � � �

����� � � %�� � �� ��������'� �� �� �&<& �� ������� ��� � ����� ��� �� �����1� ������� �� ���

����� � �� ����� � ����� ����� �� �� � � �����

Stability of immobilised cholesterol oxidase inrepeated use �� ������ � � ��� ��� ������� �� ����� � �����

������� ��� ������ ���� ��� #� ������ �

�������� � �� �� ��� �������� ���� !���� �� ����

��� ��� ��� ������������� ���)� #�� #����

%'%.

#��� �� ����� ����� 40�%�� �� -�05 �� ���� �

����� ��� ���� ������ '0 ����� �������������

Thermal stability �� ����� ���������� � ��� ��� �� ��� �������

�� ����� � ����� #�� ���� �� �� ������� ���

������ ������� � ��� ������ ��� ��� � ����

�������� ��������� 470� +0 �� -0°,5 �� �� ������ ����� 40�%�� �� -�05 � %00���� ���� ���

%0��� ���� ������� ����� #� �� ��� ��

����� � �������� ������� � �������� � ���

�� 1��� �� �������� � �� � ������ #� #���������� � �

��$ � ��$0 � #�� �(�#��� $0 �� ��� ������ ������� �� $ �� ��� ������� ������� � 4���5�

Storage stability ��� ��������� #� � ������� � �������� ���

�������� � ��� �� ��� ������� �� ����� � �����

����� �� ��� �� �� �� �� ����� ����� 40�%��

�� -�05 � (°, � +0 ���� �� ������ ���������

#�� ���� ��������� � �������� � ��� �� ���

������� � ��� ����� � #� �������� � ������

��� � ��� ������ ������� � ���� � ��� ������

��������

RESULTS AND DISCUSSIONProperties of the p(HEMA–GMA) membrane support�� ��� ������ ������ � �� �� ���� � ����

� ������� ������ ���� #� ����� �� � � ���

������ � � ��� ������ � � ��� &���� �������

���������� #��� �������� ��������� �� >?

�������� �� � � �������� � �� ��� ������� � �

������ 4��=/5� �� � �� ��B������ ���� ���� ��

�� �� ����� � �� � � ����� ������ ��� ������� �

��� ���� ������ ��� ������ � � ���� ��

��������� � ����� ���� � ������� ������ ��� �����

� ���� �� � ��4����� �� � �5� �� ������ ���� �

#� ��������� �� ��� ��� ������ �� �� � �� #�

����� ��� ����� ��� ��� ���� #��� �� �� � ���

1��� �� �� �� ���� � ��� � ��� � �������� � 8

� ����� ��� ������� � � � ������ �� <I, ��

/I, � ��� � ��� �� ��� �� ���� � ��� �

�������� ������ � ��� ��� �� ������ �������

���� � ������ � ��� �� ���� � ��� ��� ������� �

� ������� �� � ������ A����� �� �� �� ����

���� ���� �� � ��� � � � � ����� ���)��� #���

�������� ���� ���� � ��� 4��� � ��� �� ���� ���

� ���5 � ��� � ���� ������� ���� �������

���������� � ����� �� 4�� �� -�05%+ �� �������

������� � ��� �4����*6��5 ������ �� ���

������ �� A�� %�

�� ������ �� �4����*6��5 ������ ���

������ ��� �� ��� ������� ��� � �������� ��� ����

!����� ��� � �� � � #�� #�)��� ��� ��� ���

� ��� #����� ��� ��� ���� ��� ������ ��� �������

���#��� ��� � ���� ����� �� ����� � ���)� �

����� ��� ,4�%'%+*%'&& 4&00&5

Page 4: Poly(hydroxyethyl methacrylate-co-glycidyl methacrylate) reactive membrane utilised for cholesterol oxidase immobilisation

Figure 1. Chemical structure of p(HEMA–GMA) membrane.

Figure 2. SEM micrographs of poly(HEMA–GMA) membrane: (A) surface;(B) cross-section.

��������������� ���� ���� � ��� ���� ���� ����! ��"��

#��� �� #�� � ����� �� ��� �� ��� ��� ���

#��� ��� ��� � ������� �� ������ ��� ������� �

�� � ���������� �� #�� � ����� � ��� �4����*

6��5 ������ #� ��������� �� ��� #�����

��������� ���#��� ��� #�� �# ���� �� ��� ��

������� �� �� #� (-H�

!������ ����� � ��� ���� 4!��5 �������� ��

A�� &4�5 �� 4=5 �� # ��� ����� �� � �������� ��

������� � �4����*6��5 ������� ������

������� �� ������ �� #� ������ � �� �����

�� ���) �������� #���� � ��� � ���� ��� �

� ��� ������� � � �������� �� ����� � ������

� ��� �4����*6��5 ������ �� �� � ����

���� ��� ����� �� ��� � ���� ������ �����

� #��� � # ������� �� ��� ����� �������� �� ���

�����

�� � � ����� � � �� ��� � ���� �� 6��

����� � � ��� �� A �F ����� �� ��� �� �� #� ��

A�� '� ��� A �F ����� � �4����*6��5 ��� ���

���������� ��������� ����� � ��� � ��� ��� �

����� ���� �� � � � ���� � �'700���%��� �� ��� ���������� ����� �� � � �� ����

�� 6�� � ��� ��������� ����� � � �&2'0���%

�� ��� ������ ����� � � &2+0���%� �� ����� �� %-(0���% �������� ��� ���� � �1���� � � � ������ �� 6��� �� �� ���� � �� ����� ��� ���

� 2%0���%�

Figure 3. FTIR Spectrum ofp(HEMA–GMA) membrane.

����� ��� ,4�%'%+*%'&& 4&00&5

Immobilisation of cholesterol oxidase �� ������ #� ��� ������� � ��� �4����*

6��5 ������ �� � ����� � ����� ���� �)����

� ����� ��� �� ������ �� ���� � ��� � ���

������ �� ��� ��� � ��� � ��� ������ #��

%'%2

Page 5: Poly(hydroxyethyl methacrylate-co-glycidyl methacrylate) reactive membrane utilised for cholesterol oxidase immobilisation

Figure 4. Covalent immobilisation of cholesterol oxidase onp(HEMA–GMA) membrane.

Figure 5. Effect of pH on the activity of free and immobilised cholesteroloxidase.

Figure 6. Effect of temperature on the activity of free and immobilisedcholesterol oxidase.

� $#��%� �� �

� ���� ��� � ���� �� ���� ������ � ������ ���

��� ������� � ���� � 4A�� (5� �� ���� �� A�� &� ���

������ �� ��� �� ��� ������� � �� � ��� ������

����� � ��� ������ �� #����� ��� � � ����

�� ��� ������ �� ���� � ���� ��� ����� �

� ��� ���� � � ��� ������� #��� ��� ��� �������

������� �� ���� � 7'�� � ������ #� ��� �������� �� ��& � ������� �� ��� � ��� ������

������ � �� +-H � ��� ������ ��������

?���� � ��� )������ ������ �� � ��� � ����� ��� ������� �� ����� � ������ #�� ���������

����� �� ����� � � �������� �� ��� ��� ��

��� ������� ������ �������� ��������*������

)������ ����� � #� ������� A ��� ��� ������

�� #� %�2��� ��� � � ������� ��� �������

�� ����� � ������ ��� ����� �� #� &�-���

�� ������� '.H ����� ��� ��� � ��� ���

������� A ��� ��� ������� ��� #� '&>���%

� ����� ��� �� � � ����� ��� ������� � � ���

������ � ��� �4����*6��5 ������� ���������� �����1����� � &%>���%� �� ����� ����� )������ ������ � ��� ��� ������� ������

� ��� �� ��� � ��� ��� ����� ������� �� 4�������

�� � ����5� � ����� � ������� �������

������ �� ��� ������ � ������ 4��� ����� ��

� ����� ��������5� A����� �� �� �� ��� ��

����� ��� ��� ������� � � ��� ������ �� �����

������ ��� � �� ���� � ��� ������� ����

�������� ��� ����� ��������� �� �� ���� ���

��� ������� �� ����� � ����� �� #�� � #� ������

1���� � ������ � ���� � ��� ��� � �������

Effect of pH and temperature on catalytic activity �� �� ������ � ��� ������� � ��� �� ��� �������

�� ����� � ����� �� ���� ������� �� ����� � ���� �

� �������� �� ����� 4(�0*.�05 �� ��� ������ �

�������� �� A�� 7� �� ����� � ������ ������� �

��� ��� ��� ������� �� ����� � ����� � �� �� ���

��� 4 ��� �� -�05� �� �� � 1�� � ��� ��� �

������� ������ �� � �������� �������� ���� ���

��� ������� �� ����� � ����� ������� �����1�����

%'&0

��� ��� �������� �� ��� ��� � � � � #� ��

������ ��� ����� �� � ���� �� �������� � ���

��������� � � �� ����� � ����� � ������� ��������

� � ������ ��� �������� � ��� ������ � �������

� ��� ����� � ��� �4����*6��5 �������

�� ������ � �������� � ������ ������� #�

����������� �� �� ����� ����� 40�%�� �� -�05 �� ���

�������� ��� &0*(7°,� �� ����� ��������� ������ � ��� ��� ������ #� � �� '7°,�#���� ��� � ��� ��� ������� ������ �� ��� � �

��������� �� � ����� ��� ������� � #� � �� (0°,4A�� +5� �� ��� �������� � �� ��� ������� �������

��������� ����� ������ �������� ����� ���

���� ��� � �������.�%2 �� ������ ��� � ����� �

��� ������ � ��� ���� � �� ����� � �� ��� ��

"��������� �� ����� �� ����� ������ � ����� � ���

������ � ������ � � ����� ��� � �� � �� ��

�� � � ������� � ��� ��������&0

����� ��� ,4�%'%+*%'&& 4&00&5

Page 6: Poly(hydroxyethyl methacrylate-co-glycidyl methacrylate) reactive membrane utilised for cholesterol oxidase immobilisation

Figure 7. Stability in repeated use of immobilised cholesterol oxidase.

Figure 9. Thermal stability of immobilised cholesterol oxidase at threedifferent temperatures.

��������������� ���� ���� � ��� ���� ���� ����! ��"��

Stability in repeated use �� ���� �� �������� � ��� ������� ������

������� �� ��� ��� ��� �� � ������� �� �������

�������� � ��� �)� ��� ������� ������� � �

������ �� ��� ���� ��� � �������� <���

�� �� �������� � ��� ��� ������� �� ����� � �����

#� ��������� � ���������� ���� ���� �� �

'7°,� �� ������ �������� �� A�� - �� # ��� ���

��� ������� ������ ������� ������ �� �� ���

��� � ��� ����� ������� ��� %+ ������� ���� ����

����� ������ �� �� ����� � ����� � �� #�

������� �� ���� � �� ����� &(H ��� '0 ������ �

���� ���� �� � ������ �������� � � ��� �������

�� � � �� ����� � ����� �� � ����

Thermal stability �� ������ � �������� � ��� �������� � ��� ���

�� ��� ������� �� ����� � ����� �� �� #� �� A��� .

�� 2� ������������ �� ����� � ��� ��������

Figure 8. Thermal stability of free cholesterol oxidase at three differenttemperatures.

����� ��� ,4�%'%+*%'&& 4&00&5

�������� ��� ����� �� � ����� �������� �

#� ������ � ��� ��� ������� �� ����� � �����

� ��� �4����*6��5 ������ � ���� #���

��� � ��� ��� ������� �� 70°,� ��� ��� ����� ������� ������� ������ +'H �� ..H ��������

������������ ��� %00��� � ��� �������� �� +0°,���� ��� ������� � � #� ��������� � ���� �� #�

�� ��� ��� ��� � �� = �� ��� ��� �� ��� �������

������� � �� �� � ���� ������ ������� � -0°, ���

(0��� �� .0��� � ��� �������� ������������ ��

�������� �� ����� �������� � �� � ������ �

��� �� ��� ������� ������� #�� ��������� � �

��� �������� ������ ������� &�'� ����� � ������������ ���������� ��� ������ � �������� ��

��� %� �� ����� �������� � �� � ������ �

��� �� ��� ������� ����� �� � -0°, #��

�������� � #� 4���5 %�0+�%0�% ����% �� #� 4���5&�+.�%0�& ����%� ������������ ���� ������ ���������� ��� ���� �������� � ��� ������� �� ����� �

����� ��� ��� �����1����� ����� � ����� ����

������� �� ��� ��� �������� � ������� �������

�� � ��� ������� �� ��� � ������ ������� � � �����

������� # ��� �� ��������� ������� �����

�������� �� ���� �� ��� � ����� � ��� ���

����� �������� �� ��� � ���� ���# ) �� ������

� ��� �������� �� � ����� ��� ������� � ���� ��

� ���� ��� � ������ ��� ����� ������� �

��������&0 �� ����� �� �� �� �� ���� �� ��� ���

��� ��� ���� ���� � !������� !��� ���

� ��4��� ������� ���������5 �� � ���������

� ���� ������� � � ����� �������� � �� �����

����� ����� �����������&% <� ��� ���� � �����

������ ��� �4����*6��5 ������ �� ��� �

������ ���# ) #���� ������� ����� ����� ��������

��� ��� � ��� ��� � �������

%'&%

Page 7: Poly(hydroxyethyl methacrylate-co-glycidyl methacrylate) reactive membrane utilised for cholesterol oxidase immobilisation

Table 1. Half-life (t1/2) and inactivation rate constant (ki) of the free andimmobilised cholesterol oxidase at three temperatures

�����������

°�

���� � ���� ����������� � ����

�� ���� �� � �� ���� �� �

�� ��������� ��� ��������� ��

�� ��������� �� �������� ���

� ��������� �� �������� ��

Figure 10. Storage stability of free and immobilised cholesterol oxidase,stored at 4°C in phosphate buffer (0.1M, pH 7.0).

� $#��%� �� �

Storage stabilityA�� �� ��� ������� �� ����� � ����� ����� ��

#�� �� �� �� �� ����� ����� 40�%�� �� -�05 �

(°, �� ������� ���������� ���� �� �

��� � � +0 ��� 4A�� %05� �� ��� ������ � ��

� �������� ��� ������� #����� &0 ���� ��� �������

����� �� � �� '7H ������� ����� ��� ��� ��� ��

��� ������� � ����� ���� � � �� ��� ������ ��

����� � ���� � �� � ���� � � ��� ��� � �������

�� ��� ������� �� ����� � ����� ������� � ��

('H � ��� ������ ������� � ����� ��� +0 ��� �� ��

��� ��

CONCLUSIONS<�� � ��� � �� ��� ��� ��� � ��� ������ �����

%'&&

� � �� �� ��� ���������� � ��� � �� ��� ��

�������� � �������� �� ������ � ��������� �

������� � ��� ������ �������� ��� ��� ������� �

���� ��� �� ���� � ���� �� �� ��� ������ ������

������ �� ���� � ����� ������� �4����*6��5

������ ���� �� #�� ����� �� � � �������

�� � � &���� ������� ��������� #��� ��������

��������� �� ���� � � ����� ��� ������� � �

�� ����� � ������ �� �������� ��� ������ ����

� � �� � ���� � ��1��� �� ���� ��� �

���� ����� � ��� ������� �� ������ �� ����

� ����� ������� �4����*6��5 ������� ��

����� � � � ������ � ������ ���� � ��

�������� )���� � ������ � ��� �� ��� ������� �����

�� ������ ���� #��� �� ���� � �� ������ � �����

��� ������ ������ ���� � #��� �� ������ �� ���

�� ���� ����� � �� � �� � ������ ����� ���

REFERENCES% A�# E� �� ���� ��<� $��� (�� ,9:2'' 4%2.-5�

& ,�� ��6� )�������* � �� �� �� ����� �� �F� 3���� <�� �

4%2205�

' J� � KJG �� ,��� C;� + ���� ,���� :5:+- 4&00%5�

( ����� �E �� , �� ;�6� ,�-�� .� �" � ���� �/:&+

4&0005�

7 6 �$��� � � G ���� � ? �� ;�� � �� + .�" � � 4,�:&'7

4%2225�

+ ��� ,� ���� <� A�������@������ F �� 6���� E��

,�-�� .� �" � ���� �.:702 4&0005�

- G�� �� ��� � F� ��� � =; �� 6 �� !G� $��� (���

$ �� :4::(' 4&0005�

. D�� � �� �� !� ����� / $ �'���� ) ,.:&& 4%2225�

2 ?������ 3 �� J� � � )��� ���� )���� ,-:'2% 4%22-5�

%0 !����� =� F����� � �� ���� 3?� + .�� (����� )* ,�-����� /:.7

4%2225�

%% ��� �L� G�M L� ����� � �� ;������ �� �� �� )�� ��

-.:.(- 4&00%5�

%& ��� �L� + $��� ����� � � //:&000 4&0005�

%' G�����)��G��� � �� G��� ;�� + .�� (���� )* ,�-�����

43:%7- 4&0005�

%( ��$� !G� G �� �� F$� ,F� 3 ����� ! �� !�����

E6� + )��� ���� /,:%% 4&0005�

%7 6 ���� EE �� ��� ��� )������� / )��� ��� 44:%0'%

4%22+5�

%+ 6�� DA� F���� D �� >����� �� �� ���'� ������� ,�

����� /�# L )� �� %(+ 4%22&5�

%- =�� � ��� $����� )�� �� /�:&(. 4%2-+5�

%. ����L� !M���� !� ������� �N�� 6� 3�� ! ��;������ �� + $���

����� � � /,:%+.7 4&0005�

%2 ��� �L� L��� �� 3�� ! �� ;������ �� + .�� (���� )*

,�-����� 44:%&- 4&0005�

&0 ��� �L� ����� ��� :9:--7 4&0005�

&% ��� �L� ;������ �� =� �� ����� ?� ����� ��� :.:'(7

4%22.5�

����� ��� ,4�%'%+*%'&& 4&00&5