pos usp aula biomol dna rna prot genomica parte1
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Aula ministrada para Pos-graduacao IBUSPTRANSCRIPT
Fundamentos de Biologia
Molecular, métodos
avançados e ferramentas
aplicativas a Botânica
Objetivos do Curso
Métodos avançados em biologia
molecular, com aprofundamento do
conhecimento para abordagens
pessoais em biomol, com viés
aplicativo a sua própria pesquisa.
Roberta A. Campos PhD. March 2012 2
Qualificação
Bióloga: Bacharel & Licenciada – RGS (2001)
MSc Biotecnologia (UCS e UFRGS) - (2001-2003)
DTI 7G: Projeto Genoma Sul – Micoplasma – RGS (2004)
PhD Biofísica (UFRJ) - Heat Schock Protein – RJ (2005-2009)
PD IQUSP: Projeto BIOEN – Genoma Cana – SP (2009-2011)
PD Petrobras – Projeto: Transcriptoma Araucaria (2011-2012)
Roberta A. Campos PhD. March 2012 3
DNA – Introdução
O carreador da Informação Genética
Roberta A. Campos PhD. March 2012 4
Os diferentes alfabetos
Roberta A. Campos PhD. March 2012 5
Componentes
dos Ácidos
Nucléicos
BASES
NITROGENADAS
Roberta A. Campos PhD. March 2012 6
DNA - Polímero de desoxribonucleotídeos
Roberta A. Campos PhD. March 2012 7
Anti-paralelismo do DNA
Roberta A. Campos PhD. March 2012 8
DNA
Roberta A. Campos PhD. March 2012 9
RNA
Roberta A. Campos PhD. March 2012 10
Modelo de
Replicação do DNA
Watson e Crick
propuseram mais do que isto ...
Roberta A. Campos PhD. March 2012 11
… Eles propuseram:
Dogma Central de BIOMOL
Roberta A. Campos PhD. March 2012 12
Dogma Central de BIOMOL
Roberta A. Campos PhD. March 2012 13
•DNA macromolécula inerte, ou
seja, não tem atividade catalítica. É
apenas reservatório da informação
genética. (Genótipo).
•Proteínas macromoléculas
catalíticas efetoras da mensagem
genética, ou seja, traduzem a
informação genética em uma
função. (Fenótipo).
•RNA macromoléculas que faz
a intermediação da linguagem de
nucleotídeos para aminoácidos..
Possui atividade catalítica.
Roberta A. Campos PhD. March 2012 14
Fluxo da informação gênica
Roberta A. Campos PhD. March 2012 15
Replicação Semi-
conservativa do DNA
Roberta A. Campos PhD. March 2012 16
COMPACTAÇÃO DO DNA EM NUCLEOSOMAS
Roberta A. Campos PhD. March 2012 17
DNA - COMPACTAÇÃO
Roberta A. Campos PhD. March 2012 18
DNA Diferentes Níveis
de Compactação da
Cromatina
Roberta A. Campos PhD. March 2012 19
Síntese de DNA
Mecanismo Enzimático da Replicação
Uma das unidades
PRECURSORA
do RNA
Ribonucleotídeo
trifosfatado
Roberta A. Campos PhD. March 2012 21
Como
duplica?
Replicação
do DNA
Roberta A. Campos PhD. March 2012 22
DNA - Incorporação do primeiro
d-XTP ao primer de RNA
Roberta A. Campos PhD. March 2012 23
DNA - Hidrólise do trifosfato e adição do
primeiro d-XTP
Roberta A. Campos PhD. March 2012 24
Forquilhas de
Replicação
Bi-direcional do DNA
Roberta A. Campos PhD. March 2012 25
A REPLICAÇÃO DO DNA SÓ
OCORRE NO SENTIDO
5’ 3’
E COMO AS FITAS SÃO
ANTI-PARALELAS
ENTÃO ... Roberta A. Campos PhD. March 2012 26
DNA - Forças de Torção Criadas
pela Abertura da Dupla Hélice
Roberta A. Campos PhD. March 2012 27
A REPLICAÇÃO DO DNA SÓ OCORRE NO SENTIDO
5’ 3’
E COMO AS FITAS SÃO ANTI-PARALELAS ENTÃO ...
Roberta A. Campos PhD. March 2012 28
Roberta A. Campos PhD. March 2012 29
Forquilha de Replicação
Simplificada
Roberta A. Campos PhD. March 2012 30
DNA - Remoção dos
Primers de RNA e
Fechamento dos Nicks
Roberta A. Campos PhD. March 2012 31
Proteinas estabilizadoras de DNA
simples fita (SSB Proteins)
Roberta A. Campos PhD. March 2012 32
Complexo de Replicação Completo
Roberta A. Campos PhD. March 2012 33
DNA Ligase
Estabelece a ligação
fosfodiester após a remoção
dos primers de RNA
Roberta A. Campos PhD. March 2012 34
Origem (Iniciação) de Replicação do DNA
Roberta A. Campos PhD. March 2012 35
DNA
Topoisomerase I
Relaxamento das Forças
de Torção pela
Roberta A. Campos PhD. March 2012 36
Atividade
(exonucleásica 3-5)
de Correção de Erros
das DNAs
Polimerases
Roberta A. Campos PhD. March 2012 37
Síntese de RNA
Transcrição
Transcrição do DNA
Roberta A. Campos PhD. March 2012 39
Síntese de RNA
RNAs polimerases I, II e III
(Somente 5’ 3’)
Precursores de RNA
Roberta A. Campos PhD. March 2012 41
O Promotor SEMPRE esta no comando!
Sequências de reconhecimento das RNA polimerases
Roberta A. Campos PhD. March 2012 42
Roberta A. Campos PhD. March 2012 43
Roberta A. Campos PhD. March 2012 44
Ambas as fitas do DNA podem ser transcritas
Roberta A. Campos PhD. March 2012 45
Em EUCARIOTOS
A sequência dos genes/exons é
interrompida por introns
Roberta A. Campos PhD. March 2012 46
Roberta A. Campos PhD. March 2012 47
Síntese do Transcrito Primário do mRNA
Roberta A. Campos PhD. March 2012 48
Síntese de Proteínas
TRADUÇÃO
(Somente sentido 5’ 3’)
Tradução do mRNA
Roberta A. Campos PhD. March 2012 50
t-RNA, O adaptador das Linguagens
Roberta A. Campos PhD. March 2012 51
O Código
Genético
Roberta A. Campos PhD. March 2012 52
Quadros de Leitura
ORFs (open-reading frames) & Codons do mRNA
Roberta A. Campos PhD. March 2012 53
Quadros de diferentes Leituras (ORFs)
Pode resultar em aminoácidos diferentes,
proteínas diferente, polimorfismos gênicos ou
mutação genéticas.
Ex.: doenças metabolismo inato.
Roberta A. Campos PhD. March 2012 54
Superposição de quadros de leitura
(frames)
Roberta A. Campos PhD. March 2012 55
oAlterações da “frame” por mutações
Roberta A. Campos PhD. March 2012 56
Estrutura do tRNA e anti-codon
Roberta A. Campos PhD. March 2012 57
Iniciação da
Síntese de
Proteínas
Roberta A. Campos PhD. March 2012 58
Sinais de Reconhecimento da Iniciação
Roberta A. Campos PhD. March 2012 59
Alongamento
da Síntese de
Proteínas
Roberta A. Campos PhD. March 2012 60
Translocação do
Ribosoma
Roberta A. Campos PhD. March 2012 61
Terminação da
Síntese de
Proteínas
Roberta A. Campos PhD. March 2012 62
Transcrição e Tradução Simultânea
Roberta A. Campos PhD. March 2012 63
Controle da Expressão Gênica
Etapas do Controle da Expressão Gênica
Roberta A. Campos PhD. March 2012 65
Roberta A. Campos PhD. March 2012 66
Síntese do Transcrito Primário do mRNA
mRNA Maduro
Roberta A. Campos PhD. March 2012 67
Elementos Básicos de Região
Promotora da Transcrição no DNA
Roberta A. Campos PhD. March 2012 68
Roberta A. Campos PhD. March 2012 69
Proteínas
PTN Estrutura
Primária ou nível
primário
Secundária ou nível
secundário ou helicoidal
Terciária ou nível
terciário
Quaternária ou nível
quaternário
71 Roberta A. Campos PhD. March 2012
PTN Estrutura
Estrutura Primária ou Nível Primário
É a seqüência em número de aminoácidos (cadeia peptídica). A ligação
estabilizante é a ligação peptídica (covalente). Se imaginarmos os
aminoácidos representados por letras: A, B, C, D, ... teremos uma
esquematização da estrutura primária de uma proteína:
A – B – C – D – A – E É importante salientar que o número de aminoácidos determina o número de
proteínas. Uma variação na seqüência conduz a uma proteína diferente e com
ação bioquímica diferente. Ex: a ocitocina e a vasopressina diferem entre si na
seqüência de apenas dois aa; a ocitocina provoca as contrações uterinas e a
vasopressina provoca aumento da pressão sangüínea.
72 Roberta A. Campos PhD. March 2012
PTN Estrutura
Estrutura secundária ou nível secundário (helicoidal)
É o enrolamento da estrutura primária em torno de um eixo imaginário, originando
uma hélice chamada de hélice. Assim, esta estrutura está relacionada com a
disposição espacial das estruturas primárias, e pode ser em forma de um hélice ou
uma folha pregueada.
73 Roberta A. Campos PhD. March 2012
PTN Estrutura - Estabilidade
Ligação ou Ponte de Hidrogênio: formada pela interação ou atração
entre: - oxigênio da carboxila de um AA e hidrogênio do grupo amina
de outro/ - oxigênio da carboxila de um AA e hidrogênio do grupo
carboxila de outro.
Ligação Iônica: formada pela atração entre as cadeias laterais dos
AA ácidos e AA básicos.
Ligação hidrófoba ou apolar: formada pela interação de radicais
apolares como: metil, etil, metileno. AAs constituintes da molécula.
Ligação ou ponte dissulfeto: formada pela união de grupos –SH dos
AA cisteína.
OBS: - As ligações estabilizantes em maior número são as pontes de “H”.
- A ligação estabilizante mais forte é a ligação dissulfeto.
74 Roberta A. Campos PhD. March 2012
Estrutura
c) Estrutura terciária ou nível terciário
É a sua forma tridimensional ocasionada pelo enrolamento da espiral
sobre si mesma (novelo). As ligações estabilizantes são as mesmas da estrutura
secundária.
75 Roberta A. Campos PhD. March 2012
Estrutura
d) Estrutura Quaternária ou Nível Quaternário
É a que resulta da reunião de várias estruturas terciárias que, em conjunto, assumem
formas espaciais bem definidas. As ligações estabilizantes são as mesmas da estrutura
secundária.
OBS: nem todas as proteínas apresentam esta estrutura, mas de uma maneira geral,
todas as enzimas as apresentam.
76 Roberta A. Campos PhD. March 2012
Desnaturação
A desnaturação de uma proteína é a desorganização das estruturas
quaternárias, terciárias e secundárias.
Agentes desnaturantes são os que provocam a desorganização.
São eles: agentes físicos (calor, radiações UV, alta pressão e ultra som)
agentes químicos (ácidos fortes, bases fortes, metais pesados e uréia)
A proteína desnaturada apresenta as seguintes alterações:
a) Físicas: aumento da viscosidade; não podem ser cristalizadas ou auto-organizadas.
b)Químicas: maior reatividade: devido a exposição de grupos químicos que estavam
encobertos por estruturas; diminuição da solubilidade do PHi e, consequente
precipitação.
c) Biológicas: perda de suas propriedades enzimáticas, antigênicas e hormonais;
facilmente digeridas por enzimas hidrolíticas.
77 Roberta A. Campos PhD. March 2012
Enovelamento
Protéico
Chaperona
Molecular
Roberta A. Campos PhD. March 2012 78
Métodos Avançados
Biotecnologia & Biomol
Sequenciamento
Histórico
Década de 50 até Atualidade...
* 1953 Discovery of the structure of the DNA double helix (Watson, Crick, Franklin).
* 1958 Prove the semi-conservative nature of dna replication (Meselson, Stahl)
* 1961 First DNA triplet is decoded (Matthei, Nierenberg)
* 1972 Development of recombinant DNA technology, which permits isolation of defined fragments
of DNA; = sequencing were from bacteriophage or virus DNA.
* 1972 The first gene is sequenced
* 1975 The first complete DNA genome to be sequenced is that of bacteriophage φX174
* 1977 Allan Maxam and Walter Gilbert publish "DNA sequencing by chemical degradation“.
* Fred Sanger, independently, publishes "DNA sequencing by enzymatic synthesis".
* 1980 Fred Sanger and Wally Gilbert receive the Nobel Prize in Chemistry
* 1982 Genbank starts as a public repository of DNA sequences.
* 1982 Andre Marion and Sam Eletr from Hewlett Packard start Applied Biosystems in May, which
comes to dominate automated sequencing.
* 1982 Akiyoshi Wada proposes automated sequencing and gets support to build robots
with help from Hitachi.
* 1983 Polymerase-Chain-Reaction (Mullis) PCR
* 1984 RFLP fingerprinting (Jeffreys)
* 1984 Medical Research Council decipher complete DNA sequence of the Epstein-
Barr virus, 170 kb.
* 1985 Kary Mullis and colleagues develop the polymerase chain reaction, a technique to replicate
small fragments of DNA
* 1986 Leroy E. Hood's laboratory at the California Institute of Technology and Smith announce the
first semi-automated DNA sequencing machine. by Applied Biosystems as 370A.
* 1987 Applied Biosystems markets first automated sequencing machine, the model ABI 370.
Seq-history
* 1990 The U.S. National Institutes of Health (NIS) begins large-scale sequencing trials on Mycoplasma
capricolum, Escherichia coli, Caenorhabditis elegans, and Saccharomyces cerevisiae (at 75 cents (US)/base).
* 1990 BLAST algorithm for aligning sequences published (Lipman, Myers).
* 1990 capillary electrophoresis published (Barry Karger, Lloyd Smith, Norman Dovichi).
* official start of the Human Genome Project
* 1991 Craig Venter develops strategy to find expressed genes with ESTs (Expressed Sequence Tags).
o Uberbacher develops GRAIL, a gene-prediction program.
* 1992 Craig Venter leaves NIH to set up The Institute for Genomic Research (TIGR).
o William Haseltine heads Human Genome Sciences, to commercialize TIGR products.
o Wellcome Trust begins participation in the Human Genome Project.
o Simon et al. develop BACs (Bacterial Artificial Chromosomes) for cloning.
+ Weissenbach - complete human genetic map[31].
* 1993 Wellcome Trust and MRC open Sanger Centre, near Cambridge, UK.
o The GenBank database migrates from Los Alamos (DOE) to NCBI (NIH).
* 1995 Venter, Fraser and Smith publish first sequence of free-living organism, Haemophilus influenzae
(genome size of 1.8 Mb).
o Michael Reeve and Carl Fuller, thermostable polymerase for sequencing[8].
* 1996 International HGP partners agree to release sequence data into public databases within 24 hours.
o International consortium releases genome sequence of yeast S. cerevisiae (genome size of 12.1 Mb).
o Yoshihide Hayashizaki's at RIKEN completes the first set of full-length mouse cDNAs.
o ABI introduces a capillary electrophoresis system, the ABI310 sequence analyzer.
* 1997 Blattner, Plunkett et al. publish the sequence of E. coli (genome size of 5 Mb).
* 1997 First cloned animal, Sheep "Dolly", is born (Wilmut). Roberta A. Campos PhD. March 2012 82
Seq-history
* 1998 Phil Green and Brent Ewing of Washington University publish “phred” for interpreting
sequencer data.
o Venter starts new company “Celera”; “will sequence HG in 3 yrs for $300m.”
o Applied Biosystems introduces the 3700 capillary sequencing machine.
o Wellcome Trust doubles support for the HGP to $330 million for 1/3 of the sequencing.
o Sulston, Waterston et al finish sequence of C. elegans (genome size of 97Mb).
* 1999 NIH moves up completion date for rough draft, to spring 2000.
o NIH launches the mouse genome sequencing project.
o First sequence of human chromosome 22 published.
* 2000 Celera and collaborators sequence fruit fly Drosophila melanogaster (180Mb) -
validation of Venter's shotgun method.
* 2000 HGP consortium publishes sequence of chromosome 21.
* 2000 HGP & Celera jointly announce working drafts of HG sequence, promise joint publication.
* 2000 Estimates for the number of genes in the human genome range from 35,000 to 120,000.
* 2000 International consortium completes first plant sequence,Arabidopsis thaliana
(genome size of 125 Mb).
* 2001 HGP consortium publishes Human Genome Sequence draft in Nature (15 Feb)[38].
* 2001 Celera publishes the Human Genome sequence.
* 2002 HapMap project initiated to decipher human genetic variation
* 2005 420,000 VariantSEQr human resequencing primer sequences published on new NCBI database.
* 2005 Genographic project launched to study human migration
* 2007 Craig Venter publishes his full diploid genome.
Roberta A. Campos PhD. March 2012 83
Seq-history
Era do Pós-genomas
Roberta A. Campos PhD. March 2012 84
Derivar conhecimento significativo de sequências de DNA definirá a pesquisa biológica através das próximas décadas, exigindo a interação entre químicos, biólogos, médicos, farmacêuticos, engenheiros, cientistas da computação, sociólogos e etc = Era da pluralidade.
◦ Temos = Número de genes, localização exata e funções de “N” organismos
◦ Rotas de Regulação gênica
◦ Temos = Organização da sequência de DNA
◦ Temos = Estrutura e organização cromossômica
◦ Tipos, quantidade, distribuição e funções do DNA não-codificante (íntrons)
◦ Mapeamento da expressão gênica, síntese de proteínas e eventos pós-tradução
◦ Interação de proteínas em máquinas moleculares complexas
◦ Funções de genes prevista X experimentalmente determinadas
◦ Conservação evolucionaria entre organismos
◦ Proteomas - Transcriptomas - Regulomas ◦ Predição para pré-disposição a doenças baseada nas variações das
sequências dos genes – SNPs. = EUGENIA – DROGAS PERSONALIZADAS.
Roberta A. Campos PhD. March 2012 85
Roberta A. Campos PhD. March 2012 86
Projeto Genomas Vegetais
By Sanger
Morning - The end
Roberta A. Campos PhD. March 2012