praktikum pewarnaan gram
DESCRIPTION
qTRANSCRIPT
1
PEWARNAAN GRAM
Modul Kulit dan Jaringan Penunjang 2010
SEKSI PENDIDIKAN 2009
Ade Ilyas Mukmin
Anggi Puspita Nalia Pohan
Dessy Framita
Dina elita
Karina Kalani Firdaus
Monika Besti Yolanda
Naela Himayati Afifah
Oktrian
Riska Wahyuningtyas
Rizka Ramadhani
Zahra Suhardi
FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS INDONESIA 2010
2
Tentir Praktikum Pewarnaan Gram
Landasan Teori
Pewarnaan gram terdiri dari 4 komponen, yaitu:
- Zat warna primer/primary stain (kristal karbol ungu, metil ungu, atau Gentian
ungu)
- Mordant (Gram’s Iodine, atau cairan lugol)
- Decolorizer (etil alcohol 95%, aseton, atau campuran etanol dan aseton dengan
perbandingan 1:1)
- Zat warna kedua/counter stain (dilute carbol fuchsin, safranin, atau neutral red)
a. Prosedur:
Mikroba pada gelas alas ditutup/direndam dengan beberapa tetes zat warna primer. Gentian
ungu adalah campuran dari metal ungu dan kristal ungu. Zat warna primer mengubah
semua bakteri menjadi berwarna ungu. Setelah beberapa menit direndam dengan zat
warna tersebut, sediaan dicuci dengan air.
Kemudian, sediaan tersebut ditetesi beberapa tetes Gram’s Iodine atau cairan lugol dan
dibiarkan beberapa menit. Hal ini akan menyebabkan terjadinya pembentukan kompleks dye-
iodine di dalam sitoplasma. Gram’s iodine berperan sebagai mordant (perekat zat
warna). Sediaan kemudian dicuci lagi dengan air, lalu didekolorisasi di dalam etil alcohol
atau aseton. Campuran antara aseton dan etil alcohol (1:1) juga dapat digunakan untuk
dekolorisasi. Proses dekolorisasi cepat terjadi, sehingga tidak boleh lebih dari 30 detik.
Aseton adalah decolorizer yang sangat poten dan dapat digunakan hanya dalam waktu 2-3
detik. Campuran antara etanol dan aseton bekerja lebih lambat daripada aseton murni.
Dekolorisasi adalah bagian yang paling penting dalam pewarnaan gram dan kesalahan-
kesalahan dapat terjadi pada proses ini. Dekolorisasi yang terlalu lama dapat menyebabkan
sediaan tidak terlalu berwarna ungu, sehingga bakteri Gram positif yang seharusnya berwarna
ungu pun dapat terlihat berwarna pink. Sementara itu, dekolorisasi yang terlalu cepat dapat
menyebabkan sediaan terlalu berwarna ungu, sehingga bakteri Gram negatif yang seharusnya
3
berwarna merah/pink pun dapat terlihat seperti Gram positif (berwarna ungu). Setelah
dekolorisasi, sediaan langsung dicuci di dalam air.
Terakhir, sediaan ditetesi beberapa tetes zat warna kedua (counter stain), seperti dilute
carbol fuchsin, neutral red, atau safranin. Sediaan kemudian dicuci dengan air. Air yang
berlebihan dapat dikeringkan menggunakan kertas saring, kemudian dibiarkan sampai benar-
benar kering sebelum dilihat di bawah mikroskop.
Bakteri yang tetap mengikat kompleks dye-iodine primer dan tetap berwarna ungu disebut
Gram positif, sedangkan bakteri yang terdekolorisasi dan mengikat zat warna kedua
(pink/merah) disebut Gram negative.
Basic fuchsin (biasanya dalam bentuk larutan karbol fuchsin) dapat mewarnai bakteri Gram
negative lebih intens daripada safranin, sehingga lebih mudah dilihat. Beberapa bakteri yang
sulit diwarnai dengan safranin, seperti Haemophillus spp., Legionella spp, dan beberapa
bakteri anaerob, dapat langsung diwarnai oleh basic fuchsin.
b. Mekanisme reaksi Gram:
Berbagai teori telah diajukan untuk menjelaskan mengapa beberapa bakteri dapat
mempertahankan zat warna primer, dan beberapa lainnya tidak dapat. Teori seperti perbedaan
dalam pH sitoplasma (2 pada bakteri Gram positif, dan 3 pada bakteri Gram negative), serta
keberadaan Magnesium ribonukleat pada bakteri Gram positif belum dapat diterima secara
luas. Ketebalan dinding sel Gram positif dan kandungan lemak yang lebih banyak pada
dinding sel Gram negative merupakan alasan yang lebih dapat diterima untuk menjelaskan
reaksi pewarnaan Gram.
Diyakini bahwa kristal ungu yang
bermuatan positif masuk ke dalam sel
melalui dinding sel dan membrane sel,
dan terikat pada komponen-komponen
yang bermuatan negative di dalam sel.
Penambahan iodine yang bermuatan
negative (di dalam mordant/lugol) akan
mengikat zat warna bermuatan positif
yang tadi, dan membentuk kompleks
4
dye-iodine di dalam sel. Kristal ungu (heksametil-para-rosanilin klorida) berinteraksi dengan
larutan KI-I2 (lugol) melalui pertukaran anion untuk membentuk presipitat kimia. Anion
klorida yang kecil pada kristal ungu akan digantikan oleh iodida yang lebih besar, sehingga
kompleks yang terbentuk menjadi tidak larut dalam air.
Selama dekolorisasi, alcohol melarutkan lipid yang ada pada membrane luar bakteri gram
negatif dan membawa serta kompleks dye-iodine ke luar sel. Lapisan tipis peptidoglikan
tidak dapat mempertahankan kompleks dye-iodine tersebut. Kompleks dye-iodine tercuci dari
sel Gram negative bersama dengan membrane luar. Oleh karena itu, sel Gram negative dapat
langsung terdekolorisasi.
Sementara itu, sel Gram positif menjadi dehidrasi akibat pemberian alcohol, sehingga pori-
porinya tertutup akibat dinding sel yang menyusut selama dehidrasi. Kompleks dye-iodine
pun terjebak di dalam lapisan peptidoglikan yang tebal dan tidak dapat terdekolorisasi.
c. Tambahan
- Walaupun pewarnaan Gram ditujukan untuk pewarnaan bakteri, beberapa fungi
seperti Candida dan Cryptococcus juga dapat dideteksi dengan pewarnaan Gram, dan
bersifat Gram positif (berwarna ungu).
Meskipun demikian, untuk mendeteksi fungi tersebut biasanya menggunakan KOH
10%.
- Spora pada bakteri yang memilikinya (endospora) tampak berupa wilayah yang
jernih, tidak terwarnai.
Alat dan Bahan Pewarnaan Gram
Alat:
a. Gelas alas
b. Sengkelit (alat untuk mengambil mikroba)
c. Kertas saring
d. Pensil gelas
e. Pensil warna
f. Rak untuk pewarnaan
g. Bunsen/lampu spiritus
5
Bahan:
a. Kristal karbol ungu/Gentian ungu
b. Cairan Lugol
c. Etil alcohol 95%
d. Safranin
e. NaCl 0,9%
f. Biakan bakteri
Cara Kerja
1. Buat dua buah lingkaran pada gelas alas menggunakan pensil gelas.
Kemudian letakkan gelas alas tersebut pada meja (tidak boleh di atas kertas, karena
kertas berwarna putih, jadi cairannya tidak terlihat, sementara mejanya
berwarna hitam, jadi sedikit lebih terlihat).
Gelas alas diletakkan terbalik (lingkaran yang tadi dibuat harus menghadap ke
bawah, jadi tidak akan terkena biakan bakterinya).
2. Ambillah biakan bakteri, kemudian sebarkan pada salah satu lingkaran. Ambil biakan
bakteri lainnya, kemudian sebarkan pada lingkaran lain.
Cara mengambil biakan:
a. Gunakan sengkelit dengan tangan kanan, kemudian bakar sampai berwarna
merah.
b. Ambil tabung biakan dengan tangan kiri, kemudian kapas penutupnya digenggam
dengan jari manis dan kelingking tangan kanan (ibu jari, telunjuk, dan jari
tengah masih menggenggam sengkelit). Putar tabung biakan dengan tangan kiri
sambil menariknya, sehingga kapas penutup akan terlepas.
Kapas penutup tabung harus terus digenggan, jangan letakkan di atas meja.
c. Setelah tabung biakan terbuka, bakar sebentar atau lewatkan ujung tabung pada
api.
d. Masukkan sengkelit pada tabung untuk mengambil biakan.
o Jika biakannya dalam medium cair, maka sengkelit cukup dicelupkan,
kemudian dioleskan pada lingkaran di gelas alas.
o Jika biakannya dalam medium agar, maka kita harus membuat suspensi
(campuran bakteri dan larutan NaCl) terlebih dahulu.
6
Untuk membuat suspensi, ambillah tabung larutan NaCl dan oleskan larutan
tersebut pada lingkaran di gelas alas dengan prosedur yang sama. Kemudian,
ambillah tabung biakan (medium agar), dan dengan prosedur yang sama
oleskan biakan pada lingkaran yang sudah basah oleh larutan NaCl.
Hati-hati ketika memasukkan sengkelit ke dalam tabung biakan. Sengkelit
cukup dioleskan pada permukaan agar (jangan sampai ada agar yang
kebawa sengkelit).
e. Setelah bakteri dioleskan pada gelas alas, bakar ujung tabung biakan maupun
tabung NaCl, kemudian tutup kembali dengan kapas yang tadi. Lalu simpan
kembali tabung tersebut
f. Bakar juga sengkelit sampai berwarna merah, kemudian simpan sengkelit.
3. Keringkan bakteri di udara
4. Setelah kering, gunakan penjepit kayu untuk mengambil gelas alas, kemudian
lewatkan gelas alas tersebut di atas api, 2-3 kali. Hal ini dilakukan untuk
menempelkan bakteri pada gelas alas (untuk fiksasi).
Bagian yang ada bakterinya jangan terkena api secara langsung. Jadi yang
dibakar itu bagian bawahnya.
5. Teteskan Gentian ungu pada sediaan sampai seluruhnya terendam, dan biarkan selama
1 menit.
6. Cuci dengan air yang mengalir. Airnya jangan terlalu besar, nanti bakterinya bisa
kebawa air.
7. Teteskan cairan Lugol sampai seluruhnya terendam, biarkan selama 1 menit,
kemudian cuci dengan air.
8. Masukkan sedian (celupkan) ke dalam gelas yang berisi alcohol. Sediaan dinaik-
turunkan (dicelup-celupkan) berkali-kali sampai tidak ada zat warna ungu yang
mengalir dari sediaan lagi.
(Di buku panduan praktikum sih kyk gitu, tp klo d sumber teori tidak boleh
melebihi 30 detik. Alkohol kan utk ngilangin warna ungunya (dekolorisasi), jd
klo kelamaan, yg gram positif warnanya jd kurang ungu. Trus klo kecepetan, yg
gram negative jd agak-agak ungu. Jd katanya hrus tpat 30 detik. Klo msih ada
ungu-ungunya, jangan dipaksa diilangin, soalnya mungkin itu bakterinya)
9. Cuci dengan air
10. Teteskan safranin sampai seluruhnya terendam, biarkan selama 45 detik, kemudian
cuci dengan air
7
11. Keringkan dengan kertas saring (kertasnya cukup ditempelkan ke sediaan, jangan
digosok-gosokkan ke sediaan). Kemudian tunggu beberapa saat sampai benar-benar
kering.
12. Lihat di bawah mikroskop dengan perbesaran 10x100 dengan meneteskan minyak
emersi. (Seperti biasa, lihatnya dari perbesaran 4x dulu, trus 10, 40, baru 100.
Dari pengalaman praktikum kemaren, ada beberapa mikroskop yg perbesaran
40 nya gak keliatan, gak tau knapa. Jd klo dpt mikroskop yg kyk gtu, klo udh
keliatan yg perbesaran 10, langsung ke perbesaran 100 aja)
8
Hasil
Streptococcus sp.
9
Staphylococcus sp.
10
11
12
13
Candida albicans
Maaf ya kalo ada gambar yang tidak terlalu jelas, yang pasti itu emang di dapat dari
miroskop saat praktikum. Jadi harap maklum aja ya..
By : Ade Ilyas Mukmin