Praktikum Protein & asam aminoTujuan percobaan :: 1. Memperlihatkan uji kasar terhadap protein melalui tes Biuret (menunjukkan adanya dua atau lebih ikatan peptida).2. Menjelaskan uji terhadap gugus fungsi - amino (tes Ninhidrin)3. Menjelaskan uji terhadap asam amino yang mengandung inti benzena (test Xanto- protein). 4. Menjelaskan uji terhadap asam amino yang mengandung hidroksi benzena (test Millon)

5. Menjelaskan uji terhadap asam amino yang mengandung cincin indolil (tes Hopkins-Cole)

6. Menjelaskan hal-hal yang dapat menyebabkan denaturasi protein : pengaruh asam anorganik kuat, pengaruh logam berat, pengaruh asam asam organik dan pengaruh pelarut organik.

Analisis protein Dapat dilakukan dengan dua metode, yaitu :1. Secara kualitatif reaksi Xantoprotein, reaksi Hopkins-Cole, reaksi Millon, reaksi Nitroprusida dan reaksi Sakaguchi. 2. Secara kuantitatif terdiri dari : metode Kjeldahl, metode titrasi formol, metode Lowry, metode spektrofotometri visible (Biuret), dan metode spektrofotometri UV.

1. Reaksi biuret Uji terhadap 2 atau lebih ikatan peptida Pereaksi Biuret : CuSO4 7% dalam NaOH 10% Positif : warna lembayung Pengganggu : 2 molekul urea Pada uji Biuret, semua protein yang diujikan memberikan hasil positif. Biuret bereaksi dengan membentuk senyawa kompleks Cu dengan gugus CO dan -NH pada asam amino dalam protein.

Fenol tidak bereaksi dengan biuret karena tidak mempunyai gugus CO dan gugus NH pada molekulnya.Reaksi biuret Campurkan 2 ml larutan albumin 2% dengan 2 ml NaOH 10% dan tambahkan 1 tetes larutan CuSO4 7%. Bila belum terbentuk warna merah jambu atau lembayung, tambahkan 1 tetes CuSO4 (maksimal 10 tetes). Ulangi percobaan dengan kasein 2% dan pepton 2%.

Reaksi biuret (+)

Reaksi Biuret Uji ini untuk menunjukkan adanya senyawa- senyawa yang mengandung gugus amida asam yang berada bersama gugus amida yang lain. Uji ini memberikan reaksi positif yaitu ditandai dengan timbulnya warna merah violet atau biru violet.

2. Reaksi ninhidrin Pereaksi ninhidrin identifikasi asam -amino. Dasar reaksi : deaminasi, dekarboksilasi dan oksidasi. Reaksi menghasilkan gas CO2, gas NH3, hindrindantin, dan suatu aldehid. Gas NH3 + pereaksi ninhidrin biru

Pengganggu : (NH4)2SO4, garam2 amina

Reaksi NinhidrinProtein yang mengandung sedikitnya satu gugus karboksil dan gugus asam amino bebas akan bereaksi dengan ninhidrin membentuk persenyawaan berwarna.

Uji ini bersifat umum untuk semua asam amino, dan menjadi dasar penentuan kuantitatif asam amino.

Pada uji ini, hanya kasein yang menunjukkan uji negatif terhadap ninhidrin. Hal ini disebabkan karena kasein tidak mengandung sedikitnya satu gugus karboksil dan gugus amino yang terbuka.

3. Reaksi xanthoprotein

Uji terhadap asam-asam amino yang mengandung gugus benzena kuning.

Dasar reaksi : penitroan gugus benzenaReagents : HNO3 pekat + panasAsam amino yang bereaksi : tirosin, triptofan, fenilalaninPengganggu : senyawaan dengan inti benzena, contoh : fenol.

Inti benzena dapat ternitrasi oleh asam nitrat pekat menghasilkan turunan nitrobenzena. Fenilalanin, Tirosin, dan Triptofan yang mengandung inti benzena pada molekulnya juga mengalami reaksi dengan HNO3 pekat. Untuk perbandingan, dapat ditunjukkan oleh fenol yang bereaksi membentuk nitrobenzena.

Reaksi XantoproteinLarutan asam nitrat pekat ditambahkan dengan hati-hati ke dalam larutan protein. Setelah dicampur, terjadi endapan putih yang dapat berubah menjadi kuning bila dipanaskan. Reaksi yang terjadi ialah nitrasi pada inti benzena yang terdapat pada molekul protein. Reaksi ini positif untuk protein yang mengandung tirosin, fenilalanin dan triptofan.

Reaksi MillonUji terhadap asam-asam amino yang mengandung gugus hidroksi benzen merah.Dasar reaksi : penitroan gugus benzenaReagents : HgNO3 & HNO2Asam amino yang bereaksi : tirosin, Pengganggu : senyawaan dengan inti benzena, contoh : fenol.

2. Uji Millon : Prinsip : pembentukan garam merkuri dari tirosin yang ternitrasi. Tirosin merupakan asam amino yang mempunyai molekul fenol pada gugus R-nya, yang akan membentuk garam merkuri dengan pereaksi Millon. Dari hasil percobaan, diketahui bahwa protein albumin dan kasein mengandung Tirosin sebagai salah asam amino penyusunnya, sedangkan gelatin dan pepton tidak mengandung Tirosin.

Reaksi Millon Pereaksi Millon adalah larutan merkuro danmerkuri nitrat dalam asam nitrat. Bila pereaksi ini ditambahkan pada larutan protein, akan menghasilkan endapan putih yang dapat berubah menjadi merah oleh pemanasan. Pada dasarnya reaksi ini positif untuk fenol-fenol, karena terbentuknya senyawa merkuri dengan gugus hidroksifenil yang berwarna.

3. Reaksi Hopkins ColeUji terhadap asam-asam amino yang mengandung triptofan ungu.

Dasar reaksi : penitroan gugus benzena

Reagents : asam glioksilat dalam H2SO4 pekat

Asam amino yang bereaksi : triptofan yang mempunyai inti indole yang membentuk cincin berwarna ungu pada perbatasan ke-2 cairan tersebut.

Reaksi Hopkins-Cole Larutan protein yang mengandung triptofan dapat direaksikan dengan pereaksi Hopkins- Cole yang mengandung asam glioksilat. Pereaksi ini dibuat dari asam oksalat dengan serbuk magnesium dalam air. Setelah dicampur dengan pereaksi Hopkins-Cole,asam sulfat dituangkan perlahan-lahan sehingga membentuk lapisan di bawah larutan protein. Beberapa saat kemudian akan terjadi cincin ungu pada batas antara kedua lapisan tersebut.

Uji Xanthoprotein. Sebanyak 2 mL larutan protein ditambahkan 1 ml HNO3 pekat, dicampur, kemudian dipanaskan, diamati timbulnya warna kuning tua. Di dinginkan, ditambahkan tetes demi tetes larutan NaOH pekat sampai larutan menjadi basa. Diamati perubahan yang terjadi. Uji dilakukan terhadap larutan albumin 2%, gelatin 2%, kasein 2%, pepton 2%, dan fenol 2%.

Denaturasi protein Akibat denaturasi : Struktur protein rusak secara irreversibel Aktifitas biologis hilangYang dapat mengakibatkan denaturasi : panas pH ekstrim larutan urea pelarut organik, misalnya alkohol detergent logam berat pengocokan intensif

Percobaan terhadap asam-asam amino dalamprotein1. Reaksi biuret Campurkan 2 ml larutan albumin 2% dengan 2 ml NaOH 10% dan tambahkan 1 tetes larutan CuSO4 7%. Bila belum terbentuk warna merah jambu atau lembayung, tambahkan 1 tetes CuSO4 (maksimal 10 tetes). Ulangi percobaan dengan kasein 2% dan pepton 2%.

2. Reaksi ninhidrin 2 ml larutan albumin 2% ditambahkan 3 tetes larutan ninhidrin 1%. Taruh dalam penangas air yang mendidih selama 10 menit. Reaksi (+) bila terjadi warna biru. Ulangi percobaan dengan (NH4)2SO4 jenuh, larutan kasein 0,2% dan pepton 0,2%.

3. Reaksi ksantoprotein (xanthoprotein) Campurkan 2 ml larutan albumin 2% dengan 1 ml HNO3 pekat, akan terjadi endapan berwarna putih. Panaskan hati-hati, larutan tersebut akan berubah menjadi kuning. Dinginkan dibawah keran dan dengan hati-hati tambahkan tetes demi tetes larutan NaOH/NH4OH. Perhatikan apa yang terjadi ? Ulangi percobaan dengan gelatin 2%, larutan kasein 2% dan larutan fenol 2%.

4. Reaksi Millon Tambahkan 2-3 tetes pereaksi Millon pada 2 ml larutan albumin 2%, campurkan. Terjadi endapan berwarna putih. Panaskan dengan hati-hati. Reaksi (+) bila terjadi warna merah daging. Ulangi percobaan dengan gelatin, kasein 2% dan fenol 2% !

5. Reaksi Hopkins-Cole. Sebanyak 2 ml larutan albumin 2% dicampur dengan 2 ml pereaksi Hopkins-Cole dalam tabung reaksi. Ditambahkan 3 ml H2SO4 pekat melalui dinding tabung sehingga membentuk lapisan dari cairan. Di diamkan, setelah beberapa detik akan terbentuk cincin violet (ungu) pada pertemuan kedua lapisan cairan, bila positif mengandung triptofan. Uji dilakukan terhadap larutan gelatin 2%, kasein 2%, dan pepton 2%.

6. Reaksi Natriumnitroprusida Natriumnitroprusida dalam larutan amoniak akan menghasilkan warna merah dengan protein yang mempunyai gugus SH bebas. Jadi protein yang mengandung sistein dapat memberikan hasil positif.

7. Reaksi Sakaguchi Pereaksi yang digunakan ialah naftol dan natriumhipobromit. Pada dasarnya reaksi ini memberikan hasil positif apabila ada gugus guanidin. Jadi arginin atau protein yang mengandung arginin dapat menghasilkan warna merah.

8. Daya larut albumin Sediakan 4 tabung reaksi yang masing-masing diisi dengan 3 ml larutan albumin 2%. Tabung 1 : 3 ml air Tabung 2 : 3 ml NaOH 10% Tabung 3 : 3 ml Na2CO3 Tabung 4 : 3 ml HCl 0,2 % Apakah terbentuk presipitat ?

9. Presipitasi Protein (Denaturasi Protein)A. Pengaruh asam anorganik kuat 5 ml larutan albumin 2% yang telah disaring ditambahkan beberapa tetes HCl pekat. Campur dan perhatikan apakah terjadi presipitat? Tambahkan HCl tetes demi tetes. Perhatikan apakah presipitat yang telah terbentuk dapat larut kembali dengan kelebihan asam? Ulangi percobaan dengan H2SO4 pekat dan HNO3 pekat !

B. Pengaruh logam berat 5 ml larutan albumin 2% ditambahkan CuSO4 2% tetes demi tetes dan perhatikan pengaruh tiap tetesan. Apakah presipitat yang terjadi dapat larut kembali ? Ulangi percobaan dengan Pb asetat dan FeCl3.

C. Presipitasi oleh berbagai pereaksi 5 ml larutan albumin 2% ditambahkan larutan asam pikrat jenuh tetes demi tetes. Perhatikan pengaruh tiap tetesan! Apakah presipitat yang telah terbentuk dapat larut kembali dengan kelebihan pereaksi atau pemanasan ? Ulangi percobaan dengan asam trichloro- asetat, asam sulfosalisilat, asam fosfomolibdat dan asam tannat !

Asam pikratAsam pikrat (asam trinitrofenol) dapat digunakan sebagai antiseptik untuk sunat.

Asam trikhloroasetat

10. Salting out proteinMemisahkan protein-protein berdasarkan prinsip bahwa protein kurang larut pada larutan garam konsentrasi tinggi.Konsentrasi garam yang diperlukan untuk presipitasi protein berbeda untuk berbagai jenis protein.Proses ini juga untuk memekatkan larutan protein yang encer.Dialisis dapat juga digunakan untuk menghilang-kan garam, bila diperlukan.

Ada asam amino yang hidrofobik dan asamamino yang hidrofilik pada molekul protein. Setelah protein dilarutkan, asam amino yanghidrofobik biasanya membentuk area hidrofobikyang terlindung, sedangan asam amino hidrofilikberinteraksi dengan molekul-molekul pelarutsehingga protein dapat membentuk ikatan-ikatanhidrogen dengan molekul-molekul air sekitarnya.Bila terdapat cukup bagian permukaan protein bersifat hidrofilik, maka protein dapat larut dalam air.

12. Pengaruh alkohol terhadap protein 1 ml larutan albumin 2% dicampurkan dengan alkohol 95%. Apakah terjadi presipitat ? Apakah presipitat tersebut larut dalam air ? Ulangi percobaan dengan gelatin 2% dan pepton 2%.