predavanje iv godina biotehnoloski lekovi2.pdf

8/20/2019 predavanje IV godina biotehnoloski lekovi2.pdf

1/51

1

© 2006 SPI USA, Inc.

Biotehnologija - biotehnološki lekovi /biofarmaceutici

(eng. biopharmaceuticals )

Doc. dr Snežana Savi ć


Šta je biotehnologija?

Termin se odnosi na bilo koju tehniku koja koristi živeorganizme (npr. mikroorganizme) u proizvodnji ilimodifikaciji proizvoda.

Klasičan primer – proteinski lekovi dobijenirekombinantnom - rDNK tehnologijom

Međutim, biotehnologija danas uključuje primenu kulturatkiva, živih ćelija, ćelijskih enzima, da bi se dobiodefinisani proizvod

Na prvom mestu – tehnologija rekombinantne DNK itehnologija monoklonskih antitela u razvoju novihdijagnostičkih sredstava i lekova


2/51

2


Prvi primeri biotehnoloških lekova bili su jednostavniproteini – "replacement therapy “

Tranzicija ka molekularnoj medicini i otkrivanje npr. većeg

broja gena koji su povezani sa malignim oboljenjima

(otkriveni su i klonirani neki kancer-determinišući geni) –

biotehnološki lekovi kao zamena za hemoterapiju

Trenutno – ispitivanja na više od 100 potencijalno terapijskih

gena su u toku, sprovode se klinička ispitivanja nakonjugatima molekula dobijenih genetskim inženjeringom –

specifično toksični za ćelije neoplazmi

Prvi rekombinantni protein bio je humani insulin uveden

1982. godine

Razvoj biotehnologije...


Razvoj biotehnologije...

Kasnih 90-tih više od 350 biotehnoloških lekova bilo je urazličitim fazama razvoja u više od 140 farmaceutskih ibiotehnoloških kompanija

Predviđalo se da pacijenti sa hemofilijom, ozbiljnimsepsama, ulcerima kože, reumatoidnim artritisom, i

brojnim kancerima mogu imati koristi u nastupajućim godinama, kada lekovi koji prođu klinička ispitivanjadobiju dozvolu za puštanje u promet

Neki od ovih lekova već su na tržištu (Refacto zahemofiliju, Fuzeon za terapiju HIV-a, Kineret zahemoterapiju, Xigris za teške sepse...)


3/51

3


FDA definicija biotehnološkog

proizvoda

Bilo koji virus, terapijski serum,toksin, antitoksin, ili analogniproizvod koji se može primeniti uprevenciji, tretmanu ili lečenjubolesti ili povreda kod ljudi.


Biofarmaceutici(izvor: Medical Biotechnology, Elsevier, 2009.)

Jedan od najočiglednijih (i najprofitabilnijih!) doprinosabiotehnologije = lekovi za čiju se proizvodnju koristebiotehnološki postupci

Više od 1/3 lekova koji se trenutno razvijaju subiofarmaceutici

BIOFARMACEUTIK je PROTEIN ili NUKLEINSKAKISELINA, koji se koriste kao lek, a proizvode ih živiorganizmi

MONOKLONSKA ANTITELA, REKOMBINANTNIPROTEINI ILI OLIGONUKLEOTIDI (VAKCINE),SEKVENCE NUKLEOTIDA I VEKTORI (GENSKATERAPIJA), KAO I VELIKI BROJ REKOMBINANTNIHPROTEINA KOJI SE KORISTE KAO LEKOVI...


4/51

4


Biofarmaceutici

Biofarmaceutici se takođe definišu i kaomodifikatori biološkog odgovora (engl. biological response modifiers ili biologics ); definišu se kaoprirodne supstance (identične kao humane),koje modifikuju normalan (često imuni)odgovor...

Veliki broj utiče na autoimuna oboljenja

(reumatoidni artritis, psorijaza, Kronova bolest...) Većina onih koji se razvijaju imaju za metu

različite forme kancera


Biofarmaceutici

Primer biofarmaceutika koji je efikasan utretmanu kancera dojke – trastuzumab(Herceptin®), monoklonsko antitelo protivHer2 receptora za tirozin kinazu, koji je

pre-eksponiran u oko 1/3 tumora dojke. Biofarmaceutici postaju standardni oblik

terapije, što ima značajne implikacije poproizvođače, dizajn i ispitivanje ovihsupstanci...


5/51

5


Biofarmaceutici i genska terapija

Biofarmaceutici prve generacije su uglavnom kopijeendogenih proteina ili antitela, proizvedenirekombinantnom DNK tehnologijom

Biofarmaceutici druge generacije su inženjeringompoboljšani proteini ili antitela na nivou fizičko-hemijskihkarakteristika

PRIMENE:- Terapijska monoklonska antitela- Rekombinantni hormoniGENSKA TERAPIJA: podrazumeva genetsku modifikaciju

ćelija u cilju sprečavanja, ublažavanja ili lečenja oboljenja


Potencijalna primena genske terapije:

Radikalno lečenje monogenih bolesti (cističnafibroza, hemoglobinopatija).

Poboljšanje bolesti sa ili bez genetskihkomponenti, uključujući mnoge maligne,neurodegenerativne i infektivne bolesti.


6/51

6


PregledBiotehnološki lekovi

• Proteinski ili ugljeno-hidratniproizvodi

• Ekstrahovani iz živihorganizama

• Kompleksne strukture• Slabije definisane fizičko-

hemijske karakteristike: makromolekuli (> 500 kD) Tercijarna struktura Mesto, obim i tip PEGilovanja,

proteinilacije, glikolizacije…• Osetljivi na toplotu i

mehanički stres

Konvencionalni lekovi

• sintetski, organska jedinjenja

• Definisani su strukturai fizičkohemijskekarakteristike

Hemijska sinteza mikromolekule

• stabilni


Sintetski lekovi

Primeri Acetaminofen Ibuprofen Naproxen Na Prozac


7/51

7


Struktura

Jednostavna 3-dimenzionalna strukturakoja ih čini visoko stabilnim jedinjenjima Samo drastične promene u okruženju mogu

da dovedu do trajnog oštećenja ovih molekula

Prisustvo jakih kiselina ili baza

Visoke temperature


Karakteristike

Laki za rukovanje, a pacijentima seprimenjuju u različitim farmaceutskimoblicima (najčešće konvencionalnim) tablete injekcije supozitorije...


8/51

8


Tradicionalni lekovi – lekovite supstance:razvoj zahteva dugotrajan vremenskiperiod za pretragu velikog broja sličnih

jedinjenja – da bi se odredile njihoveinterakcije i mesta vezivanja in vivo .

Biotehnološki lekovi su proteini koji suidentični ili slični prirodnim biološkimsupstancama prisutnim u ljudskomorganizmu.


Primeri

Antitela Interleukini Vakcine Enzimi Hormoni

Human Growth Hormone


9/51

9


Nestabilna struktura proteina

Većina lekova dobijenih biotehnološkimmetodama su proteini koji su veomaosteljivi na promene u njihovom (in vitro iin vivo) okruženju.

Njihova struktura zavisi od različitih i slabihinterakcija između aminokiselina.

Ove reakcije se odigravaju unutar veomauzanog opsega ambijentalnih uslova koji suslični onim uslovima koji vladaju u humanomorganizmu


Nestabilna struktura proteina

Relativno male promene mogu da oštetestrukturu Temperatura Koncentracija soli pH

Na ovaj način funkcija proteina je potpunoili delom "neutralisana”


10/51

10


Proteinska struktura

Proteini

Polipeptidi – kovalentno povezaneaminokiseline (AK)

Polipeptidi sa manje od 40/100 AK zovuse peptidi

Polipeptidi sa više od 40/100 AK su

proteini Funkcija /terapijska efikasnost proteina

određena je njihovom ne-kovalentnom 3Dstrukturom



Primarna struktura odgovara "linearnom“nizu – sekvenci aminokiselina (AK)


11/51

11



Sekundarna struktura je uređena strukturakreirana vodoničnimpovezivanjem(uglavnom unutarpeptidnog niza). Kod proteina su

najčešće zastupljenisekundarni strukturnielementi. alfa (α) heliks beta (β) lanac (ponekad

označen i kao betanaborana ploča)



Tercijarna strukturanastaje umotavanjem

jednog polipeptidnoglanca Vodeća sila je interakcija

hidrofobnih i hidrofilnihgrupa.

Vodonično povezivanjeuključuje grupe i izpeptidnog niza – kičme iiz bočnih lanaca i važno je u stabilizacijitercijarne strukture.


12/51

12



Kvaternerna strukturauključuje asociranjedva ili višepolipeptidnih lanaca ustrukturu koja se sastojiiz više pod-jedinica. Ne ispoljavaju svi

proteini kvaternernustrukturu.



Laktat

dehidrogenaza:

smeša α / β

Imunoglobulin:

preklopljen: β

Hemoglobin B

lanac: α


13/51

13


Terapijski proteini

Insulin (dijabetes)

Interferon β (relapsna MS)

Interferon γ (granulomi)

TPA (srčani napad)


"Problemi " sa proteinima -izvod

Velike i nestabilne molekule Struktura se održava slabim ne-

kovalentnim silama Veoma osetljivi, čak i pri veoma blagim

uslovima Lako se uništavaju/eliminišu i u organizmu Teško ih je dobiti/proizvesti u velikim

količinama!!!


14/51

14


Razvoj skup,proizvodnja skupa

Razvoj skup, proizvodnja jeftina

25% nivo uspešnosti u fazama I-III kliničkih ispitivanja

6% nivo uspešnosti u fazama I-III kliničkih ispitivanja

Ciljni molekuli su ograničeni naone van ćelije

Teorijski bilo koji ciljni molekulmože biti dostižan

Imunogeni efekti mogućiRetke imunološke reakcije

Uglavnom predvidiv FK profilNepredvidiv farmakinetičkiprofil

NekancerogeneMoguće kancerogenesupstance

Interakcije su retkeInterakcije sa drugim lekovima

Specifično vezivanjeNespecifično vezivanje



Proteinski lekovi - danas

>200 FDA odobrenih proteinskih lekova(do jula 2006.), od preko 500biotehnoloških proizvoda (rekombinantni idrugi proteini, monoklonska antitela,

radioimunokonjugati, vakcine, enzimi itoksini, proizvodi krvi, kulture ćelija itkiva...)

>30% su rekombinantni (rDNK) proteini


15/51


16/51

16


Tehnike koje se koriste za

proizvodnju biotehnoloških proizvoda

Brojne tehnike: Rekombinantna DNK tehnologija (rDNK) Tehnologija monoklonskih antitela (MAb) – hibridoma

tehnologija PCR (polymerase chain reaction) Genska terapija Blokada nukleotida ili antisens nukleinske kiseline

Peptidna tehnologija


Ph. Eur. 7.0


17/51

17


Ph. Eur. 7.0


Ph. Eur. 7.0


18/51

18


Koncepti u genetskom inženjeringu Bitni termini šta to zna č i? MUTACIJE promene genetskog kodaMUTAGENEZA inženjering genetskog koda

TRANSFORMACIJA ubacivanje gena u bakterijuKONJUGACIJA drugi način za ulazak gena u bakteriju

PLAZMIDI nosači za mutacijuBAKTERIOFAGE vektor kojim se DNK insertuje u neki organizam

REKOMBINACIJA kombinovanje gena sa genomskom DNKTRANSPOZICIJA obratno insertovanje gena

DNK REPLIKACIJA pravljenje kopije DNKDNK REPARACIJA način prirodnog popravljanja/reparacije DNKRNK TRANSKRIPCIJA pravljenje jedne RNK kopije dela DNK

TRANSLACIJA sekvenca amino kiselina

bitni termini šta to zna č i genotip DNK sekvencafenotip posledica DNK sekvence (merljivo)


Jednostavni proteini se mogu dobitiprimenom određenih sojeva bakterija.

Složenije supstance dobijaju se iz ćelija

sisara. !!! Da bi se dobili proizvodi identični

njihovim humanim ekvivalentima,odgovarajući humani geni moraju bitiumetnuti – insertovani u kulture ćelija.


19/51

19


Rekombinantna DNK

tehnologija Rekombinantna DNK tehnologija:

Insertovanje ili modifikacija gena da bi se proizveo željeniprotein

Primena proteina/enzima označenih kaoRESTRIKCIONI ENZIMI omogućuje da se određenigen(i) iz humane DNK izoluje(u) i insertuju u malecirkularne ekstrahromozomalne bakterijske DNK(PLAZMIDI) na mesta koja su prethodno isečena istimenzimom.

Kada se insertuje u plazmid, gen se "lepi" primenomdruge vrste enzima označenih kao DNK ligaza.

Restrikcioni enzimi i DNK ligaza su "makaze i lepak"rekombinantne tehnologije.


Rekombinantna DNKtehnologija

Jednom konstruisan, rekombinantniplazmid se isertuje u bakterijsku, ćelijuplesni ili animalnu ćeliju u procesu koji seoznačava kao TRANSFORMACIJA.


20/51

20

© 2006 SPI USA, Inc.Figure 9.1.1

© 2006 SPI USA, Inc.Figure 9.1.2


21/51

21


Tretiran restrikcionim enzimom

DNK od interesa

PLAZMID IZ BAKTERIJE

Mešanje, krajevi sakomplementarnim

parovima baza, spajanjekrajeva isečaka



Ove genetski izmenjene ćelije sadrže:

Enzime koji su potrebni da obezbede uvijanjepolipeptidnih lanaca i proizvodnju proteina

Genetske informacije za sintezu željenogproizvoda


22/51

22


Raspored ovih baza na oba vlakna DNK činispecifični gen za specifičnu osobinu

Tipični gen ima stotine baza uređenih u paru inosi informaciju važnu za očuvanje ćelija iorganizma i održavanje vrste

Da bi se stvorila nova ćelija ili novi organizamDNK mora biti u stanju da se duplira – klonira

Takođe, ona preko mRNK prenosi informaciju

za sintezu proteina iz 23 AK u ćeliji (mala fabrikaza produkciju hiljade proteina) Npr. E. coli je u stanju da proizvede oko 2000

proteina


Sposobnost da se selektivno hidrolizuje populacija DNKmolekula sa brojnim endonukleazama uvela je tehnikuudruživanja/spajanja dva različita DNK molekula:rekombinantnu DNK (rDNK) tehnologiju

Ova tehnika koristi druge tehnike (replikacija, separacija,identifikacija) koje omogućuju proizvodnju velikih količinaprečišćenih DNK fragmenata

Ove kombinovane tehnike (rDNK) mogu da dovedu douklanjanja dela DNK iz kompleksne molekule

rDNK se priprema sa DNK fragmentima iz bakterijakombinovanih sa fragmentima humane DNK, ili virusneDNK se kombinuju sa fragmentima DNK drugih virusa...

Mogućnost da se spoje dva različita dela DNK naspecifičnim mestima unutar molekula postiže se sa dvaenzima, restrikciona endonukleaza i DNK ligaza


23/51

23


Sa rDNK tehnologijom mogu se koristiti nehumanećelije (npr. E. Coli) za proizvodnju proteina identičnihonim koje proizvodi humana ćelija

Ovaj proces omogućio je naučnicima da proizvodemolekule humanog porekla u velikim količinama

Npr., približno 50 hipofiza od kadavera potrebno je da bise ektrakcijom dobila količina hormona potrebna za jednogodišnju terapiju samo jednog deteta pre uvođenja

rDNK tehnologije u dobijanju humanog hormona rasta(hGH) hGH i insulin bili su prvi rDNK proteini koji su dobili

dozvolu za puštanje u promet – primena u terapijskesvrhe



Rekombinantna DNK tehnologijaobuhvata procedure kojima se DNKrazličitih vrsta mogu izolovati, isecati ispajati⇒ nove “rekombinantne "molekule i potom multiplikovati u većojkoličini u populaciji mitotički visoko-aktivnih ćelija (npr. bakterije, plesni).


24/51

24


Rekombinantna DNK

tehnologija

Trenutno je relativno lako da se isečespecifično mesto na DNK, proizvedeveliki broj kopija, odredi sekvencanukleotida, blago izmeni i potomtransferuje nazad u ćeliju.


e om nantnatehnologija

Rekombinantna DNK tehnologija jebazirana na brojnim važnimmomentima:

Bakterija sadrži ekstrahromozomalnemolekule DNK zvane plazmidi koji sukružnog oblika.


25/51

25


Rekombinantna DNK

tehnologija

Bakterija takođe proizvodi enzime zvanirestrikcione endonukleaze koji isecajuDNK fragmente na specifičnim mestima –restrikcioni fragmenti.


Rekombinantna DNK tehnologija

Restrikcioni enzimi i plazmid

Postoji više različitih vrsta restrikcionih

endonukleaza Svaka iseca DNK na specifičnom mestu –

mestu raspoznavanja


26/51

26


Rekombinantna DNK

tehnologija

Restrikcioni enzimi i plazmid

Restrikcioni enzimi su primarno pronađeniu bakterijama i davana su im skraćenaimena bazirana na rodu i vrsti bakterija.

Jedan od prvih restrikcionih enzima bio jeEcoRI – izolovan iz Escherichia coli,vrste zvane RY13.


Digestija DNK sa EcoRI da bi se dobiokohezivni kraj


27/51

27


Dobijanje rDNK



plazmidi

Plazmidi su otkriveni u kasnim šezdesetim, iubrzo je shvaćeno da se mogu koristiti da"pojačaju " gen koji je specifično interesantan.

Plazmid koji je odgovoran za rezistencijuprema nekom antibiotiku (obično ampicilinu) ilitetraciklinu, koristi se kao VEKTOR.


28/51

28


Rekombinantna DNK tehnologija Gen od interesa koji poseduje rezistenciju

na ampicilin insertuje se u vektorskiplazmid i novo-konstruisani plazmid sepotom smešta u E. coli, koja je osetljiva naampicilin.

Bakterija se potom zasejava na podlogukoja sadrži ampicilin.



Plazmidi i rezistencija na antibiotik

Ampicilin obezbeđuje selektivan pritisak,zbog toga što samo ona bakterija koja

sadrži plazmid može da raste na ovojpodlozi. One bakterije koje ne sadrže plazmid sa

insertovanim genom od interesa ćeuginuti.


29/51

29


Rekombinantna DNK tehnologijaPlazmidi i rezistencija na antibiotik

Što duže bakterija raste u podlozi saampicilinom, ona će duže koristiti plazmidda bi opstala i kontinuirano će gareplicirati, zajedno sa genom odinteresa, koji je prethodno insertovan uplazmid.


rDNKtehnologija

Izbor gena uplazmidu iizbor

antibiotika.


30/51

30


rDNK tehnologijaKloniranje humanog gena

Kada se jednom nađe u bakteriji, plazmidkoji sadrži cDNK se može umnožavati uveliki broj replika.


rDNKtehnologija


31/51

31


Prednosti

Efikasnost i sigurnost Određene molekulskim karakteristikama

terapijskog proteina Zbog njihove strukture, proteini imaju jak afinitet

za specifične "target" molekule Retko ulaze u nespecifične reakcije tako da su

interakcije sa drugim lekovima i neželjeni efekti

manje prevalentni Terapijski proteini se ne vezuju nespecifično

za receptore koji stimulišu rast i uzrokujukancer


Prednosti

Nisu u stanju da penetriraju u unutrašnjostćelije Nedostatak: broj mogućih meta je ograničen

Terapijski proteini veoma nalikujuendogenim proteinima Metabolizam se može lako predvideti, a

interindividualne varijacije su mnogo manje


32/51

32


Nedostaci

Veća verovatnoća da će ući u imunološkereakcije od malih molekula Imaju veliku površinu za napad imunskog

sistema Imunski sistem ih može interpretirati kao znak

infekcije Ovo se može prevenirati primenom humanizovanih

terapijskih antitela Proizvedenih insertovanjem gena za humana antitela u

kulture ćelija


Nedostaci

Teško uklanjanje viralne kontaminacije Prioni Nukleinske kiseline

Problemi sa deamidacijom oksidacijom drugim modifikacijama


33/51

33

© 2006 SPI USA, Inc.Table 9.1.1

© 2006 SPI USA, Inc.Table 9.1.2


34/51

34


Biofarmaceutici prve generacije



35/51

35




36/51

36


I

C

č

.

ć ć

.

.

č

.

č .


č


37/51

37


č

č

č č 5, ( )

(

)


č

(. , ), .

D, č ( ),

ć .

( C) / () .


38/51

38


č č 1) ,

2) đ ć

đ , č

Basal Insulin(~0.5-1.0 U/hr)

‘Bolus’ Insulin(Meal Associated)

" " )

6080 µ /

0.51.0 /)

515 µ /

E


ć .

)

ć .

)

Dć . )


39/51

39


F

10160,51

10160,51

D 10161,5


40/51

40


( ć)

1) ć ( ć )

C .

0.4%

.

č .


( ć)

, .

đ ⇒

. ć

.


41/51

41


. E. 7.0)

28

29

)

B (29. A) (2. A)⇒ 1 .

, ( ).

đ, , đ č .

ć .

, , .


I (. . 7.0), AB2

I

I A (2. A B) .

B ć ć , () .

I A B , B29 .

I č, ć .


42/51

42


( ć)

Bć ( ) (D) .

( 6 ), ć đ ć .

I č , ć ć .

č, .

đ, .


(ć)

2) (. )

: ( . E. 6.0).

D, , ć () .

/ () EA!!!

čć ć .


43/51

43


(ć)

č .

H H (č) ( 30 K ).

% .

H č 12 , 612, 124.

K , , ,č .


(ć)

H č ć ć

ć . , (1035 đ

, č)

č ć

.


44/51

44


H


(ć)

3) DDEĆ (.

( 50)

.

K 21, B .

B č č H 5,3 H 6,7, H .


45/51

45


đ A A21 č

.

D

, č

.

I ( =

4.0), ().

, .


đ ,

24,

.

/č .


46/51

46


.

K B30 K B29 ⇒ , .

č č 2 , č , 24.

, , .


K () (. )

ć (. 70/30, 50/50, ...)⇒ H

, ć ć, (

)⇒ č 1530 , 2,5 , 24.

1014 , č 230 .

č č .


47/51

47


(.

)

"" č .

23 .

ć .

: 75/25 75% , 25% 70/30 70% , 30% 50/50 50% , 50% 70/30 70% H, 30% 50/50 50% H, 50%


FK

Rosenstock J. Clin Cornerstone. 2001;4:50-61.

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

N i v o i i n s u l i n a u p l a

z m i

Vreme (h)

NPH (10–20 hr)

Regularni (6–10 hr)

Ultralente (~16–20 hr )

Glargin (~24 hr)

Aspart, Lispro, Glulizin (4–5 hr)

Detemir~18hr


48/51

48


č

( č, 10 , 3 )

C


L đ . )


49/51

49


ć , , , 1. H D č

2. F; /D

; /D

, H ; E L E ..

, ; /D č

, ; D G, č

č


ć

Insulini i analozi, parenteralni, srednje dugog dejstva , B; D G, č

B ; D G, č ; 100 ../, , 53 , H H; E L E ..

, ,

30 ; H K .D. /

, 50 ; /D

, 1. 30 F; /D


50/51

50


“Biosimilars” - pojam?




51/51




predavanje iv godina biotehnoloski lekovi2.pdf

Documents