preparazione di campioni biologici per la microscopia ......microscopia elettronica ga 2-4% in...
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Preparazione di campioni biologici per la microscopia ottica
ed elettronica
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Il microscopio ottico ed elettronico (T.E.M)
OCULARE
OBBIETTIVI
TAVOLINO PORTA CAMPIONE
CONDENSATORE
DIAFRAMMA DI CAMPO
LAMPADA
CANNONE ELETTRONICO
PORTA CAMPIONE
CONDENSATORE
OBBIETTIVO
SCHERMO FLUORESCENTE
CAMERA FOTOGRAFICA
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Occhio umano
Microscopio ottico
Microscopio elettronico a trasmissione
Microscopio elettronico a scansione
Aumentando la risoluzione aumentano proporzionalmente anche gli artefatti e la loro visibilità
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• la luce del microscopio ed il fascio di elettroni possono
attraversare solo materiale di spessore molto ridotto
• il tessuto deve essere sezionato mediante speciali apparecchi, detti microtomi ed utramicrotomi
• la maggioranza dei tessuti biologici sono molli
• prima del taglio, il tessuto deve essere indurito
– Fissazione
– Inclusione
– Congelamento
• i tessuti sono normalmente quasi incolori e privi di contrasto
• prima dell’osservazione al microscopio, il tessuto deve essere colorato o contrastato
• coloranti con affinità per componenti cellulari e tissutali diverse possono essere combinati nella stessa sezione istologica
Problematiche…
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Fasi della preparazione
• Prelievo • Fissazione • Disidratazione • Inclusione • Taglio • Colorazione
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Prelievo
• Il prelievo è l’operazione fisica con la quale si ottiene il campione da esaminare
• Deve essere eseguito da materiale biologico vivente
• Riduzione 10x10x3 mm per la microscopia ottica
Spessore ≤ 2 mm per la microscopia elettronica
• Deve essere eseguito il più velocemente possibile
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La Fissazione
Ha lo scopo di bloccare i processi di degenerazione del tessuto prelevato rendendolo stabile nel tempo ed inalterabile all’azione dei successivi trattamenti
Mantiene inalterate le caratteristiche strutturali del campione, preservandone la morfologia
Protegge il campione da danni osmotici (swelling e shrinking)
FISICA
CHIMICA
Congelamento in N2 o -30°C
Calore (fiamma viva per materiale biologico strisciato su vetrino
Esposizione del tessuto a T molto alte o molto basse:
Uso di sostanze chimiche:
Perfusione
Immersione
Con vapori
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La fissazione chimica LE ALDEIDI
FORMALDEIDE
• usata in soluzione (4-10%) in tampone pH 7.4
• elevato potere di penetrazione ( 0.8 mm/h)
• agisce formando legami crociati con gli aa delle proteine (reversibili)
• preserva una buona morfologia
PARAFORMALDEIDE
• preserva la reattività delle macromolecole
• indicata per indagini biochimiche
Formaldeide 4-10% + Saccarosio 2% in PBS pH 7.4
4 ore 4°C
Microscopia Ottica
PFA 10% + Saccarosio 2% in PBS pH 7.4
4 ore 4°C
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GLUTARALDEIDE
• penetra bene nei tessuti, ma meno rapidamente della formaldeide
• forma cross-legami più velocemente e più stabilmente della formaldeide
• non fissa i lipidi, quindi per preservare le membrane
La fissazione chimica LE ALDEIDI
Microscopia Elettronica
GA 2-4% in Tampone Fosfato pH 7.4
2-4 ore 4°C
Post-fissazione con Osmio Tetrossido
• Fissa i lipidi insaturi
• agisce rapidamene, ma penetra molto poco Fissativo 2°
• reagisce in modo differente con i vari componenti cellulari accentuando le differenze di densità e fornendo una sorta di colorazione
OsO4 1-2% In Tampone Fosfato pH 7.4 2 ore 4°C buio
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I Tamponi
I fissativi devono essere diluiti in tamponi a pH 7-7.4 in modo che non ci sia diversità di pH fra il tessuto e la soluzione fissativa e per evitare artefatti dovuti a differenze di osmolarità
Gli stessi tamponi utilizzati per diluire i fissativi devono essere impiegati per effettuare i lavaggi che seguono la fissazione (1-2 ore)
PBS
Tampone fosfato di Sorensen
Tampone Cacodilato
Fosfato bisodico 0.2M + Fosfato monosodico 0.2M
Cacodilato di Na 0.24M + HCl 0.2M
Più stabile nel tempo, ma contiene arsenico che è tossico
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La Disidratazione E’ il passaggio che permette la sostituzione dell’acqua contenuta nel tessuto con un solvente dei mezzi di inclusione (Paraffina o resine)
La disidratazione si effettua mediane passaggi del campione in soluzioni di alcool in una scala crescente di concentrazioni
Alcool 70%
Alcool 90% Alcool 100%
Fissazione 3° con Acetato di Uranile in alcool 70% (T.E.M.)
Chiarificazione L’ultimo agente deve essere miscibile con i mezzi di inclusione
Xilolo
Acetone assoluto
Ossido di propilene
Paraffina
Resine idrofobiche per T.E.M.
Infiltrazione Dopo aver concluso la disidratazione del campione bisogna sostituire gradualmente lo xilolo o l’acetone con il mezzo di inclusione in forma liquida (Xilolo/acetone:mezzo di inclusione)
3:1 2:1 1.1 1:2 1:3
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Inclusione E’ il passaggio che permette di impregnare il campione in un materiale abbastanza duro ed omogeneo tale da poter essere tagliato in fette molto sottili
PARAFFINA (M.O.)
RESINE (T.E.M.)
• Miscela di idrocarburi saturi
• solida a T ambiente
• punto di fusione a 54-60°
• insolubile in H2O, solubile in xilolo
• Epon, Araldite
• liquida a T ambiente
• polimerizza a 60-70°C
• insolubile in H2O, solubile in acetone
• si preparano a partire da soluzioni di monomeri, da sostanze plasticizzanti che migliorano la consistenza finale del polimero e da un acceleratore chimico per la reazione di polimerizzazione
Il campione viene immerso in paraffina o resina pura per completarne l’infiltrazione
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T ambiente 4°C
Polimerizzazione
Paraffina (m.o.) Resina (T.E.M)
60-70°C
Blocchetti pronti per essere tagliati in sezioni
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Il taglio delle sezioni
MICROTOMO
Strumento che permette di sezionare i blocchetti di paraffina contenenti il campione in fette spesse 3-10 uM
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La raccolta delle sezioni
La colorazione
I coloranti sono di solito in soluzione acquosa.
Le sezioni devono essere sparaffinate in xilolo e reidratate con scala decrescente di alcool (100, 90, 80, 70, 50,H2O)
Metodica ematossilina eosina
Ematossilina 10 min
Lavaggio con H2O corrente
Eosina 1 min
Disidratazione
Montaggio
Vetrini Xilanizzati
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COLORANTI PER MICROSCOPIA OTTICA
I tessuti assumono i coloranti in base alle caratteristiche delle strutture che li compongono
ACIDI carica negativa formano sali con basi colorano citoplasma BASICI carica positiva formano sali con acidi colorano i nuclei NEUTRI formati dall’unione di un colorante acido con uno basico
NATURALI animali : es. carminio (colorante acido nucleare) vegetali: es. ematossilina (colorante acido) ARTIFICIALI eosina (colorante basico citoplasmatico)
fucsina, violetto di genziana (coloranti nucleari)
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Materiale vegetale incluso in gel e tagliato con
microtomo a vibrazione
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COLORAZIONI
• chimiche: reazione tra colorante e substrato
evidenziano molecole come lipidi e zuccheri
COLORAZIONI ISTOCHIMICHE
OLIO ROSSO O O.R.O (PER LIPIDI)
• o.r.o. sciolto in soluzione di alcool etilico ed etere
• alcool etilico ed etere estraggono dalle cellule i lipidi
• o.r.o si deposita al loro posto
P.A.S. (PER ZUCCHERI)
• acido periodico di schiff ossida i gruppi CHOH-CHOH
degli zuccheri
CHOH-CHOH
reagisce con composto fucsina-acido solforoso e da’ colorazione fucsia
CHO-CHO
chimiche
fisiche
chimico fisiche
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• FISICHE: precipitazione di metalli su strutture biologiche
• CHIMICO-FISICHE : meccanismo di assorbimento elettrico
substrato e colorante hanno cariche diverse e formano sali fra loro
EMATOSSILINA
EOSINA
Es. impregnazione argentica Sali d’argento + sostanza riducente
liberazione di Ag metallico che si deposita sulle strutture biologiche argentofile (fibre nervose)
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ULTRAMICROTOMO
Strumento usato per sezionare i blocchetti di resina in sezioni molto sottili
SEMIFINI: sezioni di 1 uM di spessore, la cui osservazione al m.o. permette di selezionare i campi utili destinati ell’esame ultrastrutturale al T.E.M.
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SEZIONI ULTRAFINI: sezioni di 60-70 nm di spessore
Lama di diamante
Il taglio delle sezioni
Raccolta delle sezioni
retino
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LA COLORAZIONE
• il contrasto dipende dal numero atomico degli atomi del campione
• piu’ e’ alto il numero atomico, piu’ elettroni sono dispersi, maggiore e’ il contrasto
• le molecole biologiche sono costituite da atomi con numero atomico basso (H, C, O)
• le sezioni vengono contrastate con sali di metalli pesanti
Acetato di Uranile e Citrato di Piombo
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…un esempio di applicazione
semifini fini
Sezione trasversale di una foglia Ultrastruttura di cellule a palizzata