H D B M B – 4 0 G O D I N A

HRVATSKO PRIRODOSLOVNO DRU[TVO (OSNOVANO 1885.) Mjese~nik za popularizaciju

prirodnih znanosti

Godina 106., Broj 1049

25 KUNAPriroda izlazi od 1911. godine

ISSN 0351-0662

1–2/16.

Priroda

PRIRODA • SIJE�ANJ/VELJA�A • 2016. 13

S T R U K T U R A P R O T E I N A

zama. U prirodi postoji više od pet stotina razli�itih aminokise-lina, me�utim samo njih 20 izgra�uje proteine. Aminokiselin-ski slijed u pojedinom proteinu odre�en je redoslijedom nukleotida u molekuli DNA. Odnos slijeda nukleotida u DNA (ili RNA) i slijeda aminokiselina u proteinima odre�en je ge-netskom šifrom. Genetska šifra skup je pravila kojim se definira koji redoslijed nukleotida odre�uje pojedinu aminokiselinu. U svim stanicama proteini nastaju procesom ekspresije gena koji zapo�inje transkripcijom, tj. prepisivanjem molekule DNA u molekulu glasni�ke RNA (mRNA). U procesu translacije pre-vodi se slijed nukleotida u molekuli mRNA (prema pravilima genetske šifre) u slijed aminokiselina u molekuli budu�eg pro-teina. Zahvaljuju�i to�no odre�enom redoslijedu aminokiseli-na u proteinskom lancu molekule proteina smataju se u preci-zno oblikovane trodimenzijske strukture. Funkcija proteina izravno ovisi o njihovoj trodimenzijskoj gra�i.

Biokemi�are zanima koje su aminokiseline u proteinu važne za njegovu trodimenzijsku strukturu i funkciju. Stoga oni, ko-rištenjem metoda geneti�kog inženjerstva i molekularne biolo-gije, mijenjaju redoslijed nukleotida u genu (mutageneza). Ek-spresijom promijenjenog gena nastaje protein promijenjenog sastava i redoslijeda aminokiselina. Za mnoge enzime uo�eno je da promjena ve� samo jedne ili ponekad nekoliko aminoki-selina dovodi do potpunog gubitka enzimske aktivnosti. Na taj na�in biokemi�ari otkrivaju mehanizme enzimskog djelo-vanja, te saznaju na koji na�in enzim katalizira odre�enu bio-kemijsku reakciju i kako veže svoje supstrate. Uo�eno je da neke promjene poboljšavaju enzimsku aktivnost ili mijenjaju

Jasmina ROKOV PLAVEC, Zagreb

Proteini su najsvestranije molekule u živim sustavima, a obavljaju bitne funkcije u svim biološkim procesima (vidi poster: Molekularna mašinerija). Mnogi proteini su

enzimi koji djeluju kao biološki katalizatori te ubrzavaju bioke-mijske reakcije i do nekoliko bilijuna puta. Neki proteini preno-se i pohranjuju druge molekule, npr. molekule kisika, neki osi-guravaju mehani�ku potporu i imunosnu zaštitu, neki omogu�uju kretanje, neki prenose živ�ane impulse, a neki kon-troliraju rast i diferencijaciju stanica...

Molekule proteina su lan�asti (linearni) polimeri gra�eni od niza aminokiselina koje su me�usobno povezane peptidnim ve-

Dizajniranje Proteina

TKO JE AUTORICA �LANKA

Doc. dr. sc. Jasmina Rokov Plavec zaposlena je u Zavodu za biokemiju Prirodoslovno-matemati�kog fakulteta Sveu�ilišta u Zagrebu. Bavi se istraživanjima biljnih aminoacil-tRNA-sintetaza, proteina koji sudjeluju u biosintezi proteina u stanici. Istražuje njihovu strukturu, funkciju, spe-cifi�nost prema supstratima, raspodjelu unutar stanica te proteinske interakcije koriste�i biokemijske i molekularno biološke tehnike, uklju-�uju�i proteinsko inženjerstvo. Od 2013. godine �lanica je Predsjedniš-tva, odnosno Izvršnog odbora, Hrvatskog društva za biokemiju i mole-kularnu biologiju.

Autorica se zahvaljuje Tinu Plavecu i Mateu Plavecu na pomo�i pri ure-�enju slika.

PRIRODA • SRPANJ/KOLOVOZ • 2015.14

D O G A \ A N J A

PRIRODA • SIJE�ANJ/VELJA�A • 2016.14

S T R U K T U R A P R O T E I N A

specifi�nost prema supstratu pa je razvijena nova disciplina proteinsko inženjerstvo.

Proteinsko inženjerstvo omogu�uje dobivanje proteina željenih svojstava, odnosno dizajniranih proteina, pri �emu se rabe ra-zli�iti pristupi (sl. 1.).

Jedan od njih poznat je pod imenom racionalni dizajn. Na te-melju poznavanja strukture i funkcije proteina divljeg tipa (onakvog kakav postoji u prirodi), predvidi se promjena u ami-nokiselinskom slijedu koja bi trebala dovesti do željenog svoj-stva proteina. Ova promjena uvodi se ciljanom mutagenezom gena za protein divljeg tipa pa �e ekspresijom tako mutiranoga gena biti dobiven promijenjeni protein �ija �emo svojstva onda

ispitati. Ponekad metoda racionalnog dizajna ne daje željene rezultate, jer još uvijek ne znamo sve tajne strukture i funkcije proteina.

Drugi pristup temelji se na nasumi�noj mutagenezi gena za pro-tein divljeg tipa. Nasumi�ne mutacije, s obzirom na položaj u genu i s obzirom na vrstu promjena, omogu�uju dobivanje veli-koga broja ina�ica ciljnog proteina. Tehnikama pretraživanja i probira, identificiraju se poboljšane ina�ice proteina. Ako dobi-vene ina�ice nisu dovoljno dobre, one se koriste kao temelj za novi ciklus mutageneze, pretraživanja i probira. Postupak se ponavlja sve dok se ne prona�e ina�ica proteina sa željenim svojstvima. Ovaj pristup još nazivamo i usmjerena evolucija in vitro (u laboratoriju), jer podsje�a na evoluciju živih vrsta koja

Slika 1. Dva pristupa u proteinskom inženjerstvu: racionalni dizajn i usmjerena evolucija. Racionalnim dizajnom se, na temelju poznavanja struk-ture i funkcije proteina, osmisli promjena. Promjena su uvodi ciljanom mutagenezom u gen koji kodira protein. Mutirani gen unese se u stanicu doma�ina (transformacija) u kojoj dolazi do njegove ekspresije i biosinteze proteina. Promijenjeni protein pro�iš�ava se i biokemijski analizira. S druge strane, u procesu usmjerene evolucije uvode se nasumi�ne mutacije u gen koji kodira odre�eni protein. Mutirani geni unose se u stanice doma�ina (transformacija) u kojima dolazi do njihove ekspresije. S obzirom na to da nastaje velik broj mogu�ih ina�ica, dobiveni proteini se ne pro�iš�avaju, ve� se stanice koje ih eksprimiraju podvrgnu tehnikama pretraživanja i probira koje omogu�uju odabiranje onih proteinskih ina�ica koje �emo poslije biokemijski analizirati. U oba pristupa, poboljšanu ina�icu proteina mogu�e je i dodatno poboljšavati novim ciklusima ciljane ili nasumi�ne mutageneze – sve dok ne dobijemo protein željenih svojstava.

Prilago�eno prema http://www.lookfordiagnosis.com/mesh_info.php?term=Protein+Engineering&lang=1.

PRIRODA • SIJE�ANJ/VELJA�A • 2016. 15

se temelji na nasumi�nim mutacijama i prirodnom odabiru ovi-sno o okolišnim uvjetima.

Proteinsko inženjerstvo iznimno je dinami�na disciplina te se stalno pronalaze novi na�ini kojima se dobivaju dizajnirani pro-teini novih svojstava. Tehnologijom rekombinantne DNA mo-gu�e je spojiti dijelove dvaju ili više gena, �ime se dobiva hibridni protein koji ima više funkcija. Osmišljene su i tehnike koje omo-gu�uju ugradnju i drugih aminokiselina u proteine (osim uobi�a-jenih dvadeset koje se nalaze u svim proteinima). Ove neuobi�a-jene aminokiseline donose nova fizikalno-kemijska svojstva i reaktivnost pa takvi proteini imaju sasvim nove funkcije. Kemij-skom sintezom molekula DNA mogu�e je prirediti potpuno nove gene koji kodiraju proteine koji ne postoje u prirodi pa je danas mogu�e dizajnirati sasvim nove proteinske strukture.

Primjena dizajniranih fuzijskih proteina u pro�iš�avanju proteina

Stanica sadržava nekoliko tisu�a razli�itih proteina. Mnogi od njih nisu prisutni u velikoj koli�ini pa iz takve smjese nije jed-nostavno izdvojiti i pro�istiti željeni protein da bismo mogli analizirati njegova svojstva. Tehnike geneti�koga inženjerstva i

molekularne biologije omogu�uju prekomjernu ekspresiju gena za ciljni protein u stanici doma�ina, npr. u bakteriji, �ime se znatno pove�ava udjel željenoga proteina u smjesi stani�nih proteina i time olakšava njegovo izdvajanje i pro�iš�avanje. Proteine nastale korištenjem tehnika geneti�koga inženjerstva, odnosno tehnologije rekombinantne DNA, nazivamo rekombi-nantni proteini. Velika ve�ina proteina, koje koristimo u temelj-nim i primijenjenim istraživanjima (biotehnologija, medicina, industrija...) su rekombinantni proteini.

Osim toga, tehnologijom rekombinantne DNA može se prire-diti i tzv. fuzijski protein, koji nastaje spajanjem željenog prote-ina s afinitetnim privjeskom koji dodatno olakšava njegovo pro�iš�avanje. Naj�eš�e se proteinu dodaje histidinski privjesak koji sadržava niz od šest aminokiselina histidina (sl. 2.). Histi-dinski privjesak ima veliki afinitet prema ionima nikla. Kada u stanici eksprimiramo fuzijski protein te propustimo ukupnu smjesu stani�nih proteina preko podloge na koju su vezani ioni nikla, na njoj �e se, zbog histidinskog privjeska, zadržati samo fuzijski protein. Na taj na�in, jednostavno i u�inkovito, pro�i-š�avamo željeni protein od svih ostalih stani�nih proteina – �ak i kada ne znamo njegovu strukturu i funkciju, ali nam je poznat gen koji ga kodira.

Slika 2. Pro�iš�avanje proteina s histidinskim privjeskom. Lijevo: A, ion nikla vezan je za podlogu koja sadržava zrnca silikagela (siva kuglica). B, fuzijski protein sastoji se od ciljnog proteina i histidinskog privjeska koji se veže na ion nikla. Interakcija histidinskog privjeska i iona nikla omogu�uje izdvajanje fuzijskog proteina iz smjese ukupnih stani�nih proteina u jednom koraku. Desno: Tijek pro�iš�avanja proteina prati se gel-elektroforezom koja razdvaja proteine ovisno o njihovoj masi. Nakon gel-elektroforeze proteini se boje plavo, bojilom Coomassie Brilliant Blue. Linija 1, ukupni sta-ni�ni proteini izolirani iz stanica u kojima nije eksprimiran fuzijski protein. Linija 2, ukupni stani�ni proteini izolirani iz stanica u kojima je prekomjerno eksprimiran fuzijski protein (ozna�en strelicom). Linija 3, pro�iš�eni fuzijski protein (ozna�en strelicom). Slika pod A prilago�ena je premahttp://www.affymetrix.com/estore/browse/brand/usb/product.jsp?navMode=34000&productId=131366#1_1

S T R U K T U R A P R O T E I N A

PRIRODA • SRPANJ/KOLOVOZ • 2015.16

D O G A \ A N J A

PRIRODA • SIJE�ANJ/VELJA�A • 2016.16

Dizajnirani subtilizin u detergentima za pranje rublja

Proteinsko inženjerstvo �esto je usmjereno prema proteinima koji imaju medicinsku ili industrijsku primjenu. Jedan od protei-na koji je detaljno analiziran metodama proteinskog inženjerstva je subtilizin. Ovaj bakterijski protein pripada obitelji proteaza, enzima koji razgra�uju proteine. S obzirom na to da mrlje od hrane �esto u sebi sadržavaju proteine, subtilizin se dodaje deter-gentima da pospješi pranje rublja. Me�utim, sredstvo za izbjelji-vanje, kojeg se tako�er dodaje detergentima, inaktivira subtili-zin. Strukturnom analizom utvr�eno je da do inaktivacije do lazi zbog oksidacije aminokiseline metionin na položaju 222 ovog proteina koji sadržava 275 aminokiselina. Ciljanom mutagene-zom taj metionin zamijenjen je aminokiselinom alanin. Ova ko izmijenjeni subtilizin stabilniji je i aktivniji pa danas ve�ina de-tergenata sadržava upravo ovaj poboljšani subtilizin. Osim toga, identificirane su i druge poboljšane ina�ice subtilizina: neke su otporne na visoke temperature, neke na lužnate uvjete, nekima je promijenjena supstratna specifi�nost... Kada na detergentima vidite oznaku bioaktivni detergent, onda on najvjerojatnije sadr-žava neku od poboljšanih ina�ica subtilizina. Najnoviji dizajner-ski proteini, koji su pravi ekološki hit, ina�ice su subtilizina koje su aktivne u hladnoj vodi te omogu�uju u�inkovito pranje rublja pri niskim temperaturama �ime se štedi energija.

Zabavni � uorescentni proteini

Zeleni fluorescentni protein (GFP, engl. green fluorescent prote-in) izoliran je iz meduze Aequorea victoria, a ime je dobio po

tome što fluorescira zeleno kada ga se obasja plavom ili ultra-ljubi�astom svjetloš�u. Kombinacijom racionalnog dizajna i nasumi�ne mutageneze biokemi�ari i molekularni biolozi prire-dili su mnogobrojne dizajnirane ina�ice GFP-a koje fluorescira-ju u drugim bojama. Fluorescentni proteini izuzetno su važni u stani�noj biologiji, jer se mogu spojiti s ciljnim proteinima koje se onda može uživo pratiti u stanici fluorescencijskom mikro-skopijom. Uzgojene su i akvarijske ribice zebrice koje proizvode (eksprimiraju) raznobojne ina�ice GFP-a pa i veliki i mali mogu kod ku�e uživati promatraju�i svoje fluoresciraju�e akvarijske ribice (sl. 3.).

Lije�enje dizajniranim inzulinom

Inzulin je proteinski hormon koji regulira razinu glukoze u krvi i koristi se za lije�enje še�erne bolesti. Aktivni oblik inzulina u krvi je monomer koji se sastoji od dva polipeptidna lanca, lanac A i lanac B. Ovi lanci me�usobno su povezani disulfidnim ve-zama. Inzulin nastaje u stanicama guštera�e gdje je pohranjen kao heksamer koji se sastoji od 6 monomera (sl. 4.a). Na tržištu ima nekoliko inzulinskih lijekova koji imaju razli�ita svojstva. Brzodjeluju�i inzulin koristi se odmah nakon obroka. Protein-skim inženjerstvom oblikovana je ina�ica brzodjeluju�eg inzu-lina koja nije stabilna kao heksamer ve� se raspadne na mono-mere �im u�e u krvne žile. U toj ina�ici inzulina zamijenjen je redoslijed zadnjih dviju aminokiselina na jednom kraju lanca B. Ova mala promjena znatno utje�e na stabilnost heksamera pa se mutirani heksamer 200 puta brže raspada na monomere u odnosu na divlji tip heksamera (sl. 4.b). S obzirom na to da se

Slika 3. Dizajnirane akvarij-ske ribice koje sadržavaju raz-nobojne fluorescentne protei-ne. Prodaju se pod nazivom GloFish. Preuzeto iz literaturnog navoda broj 2.

S T R U K T U R A P R O T E I N A

PRIRODA • SIJE�ANJ/VELJA�A • 2016. 17

brzodjeluju�i inzulin brzo raspada na monomere pa stoga brzo nestaje iz krvotoka, znanstvenici su osmislili i sporodjeluju�e ina�ice inzulina koje djeluju dulje vrijeme izme�u obroka i tako osiguravaju stalnu kontrolu razine še�era u krvi. Zbog promje-na u slijedu aminokiselina heksameri sporodjeluju�eg inzulina stabilniji su pa se sporije raspadaju na aktivne monomere.

Literatura1. Vojcic L, Pitzler C, Körfer G, Jakob F, Ronny Martinez, Maurer

KH, Schwaneberg U. Advances in protease engineering for laundry detergents. N Biotechnol. 2015;32(6):629–34.

2. http://mmg-233-2014-genetics-genomics.wikia.com/wiki/Assi-gnment_6:_GloFish,_A_Genetically-Modif ied_Organism (21. 3. 2016.)

3. http://pdb101.rcsb.org/motm/194 (21. 3. 2016.)

Slika 4. Struktura i dizajn inzulina. A: odnos inzulinskog heksamera (lijevo) i monomera (desno). Svaki mo no-mer inzulina sadržava dva polipeptidna lanca, lanac A (zeleno) i lanac B (plavo) koji su povezani disulfidnim vezama (žuto). Rozo je ozna�en ion cinka koji stabilizi-ra heksamer koji se sastoji od 6 monomera. B: heksa-merni inzulin (lijevo) i njegova ina�ica brzodjeluju�i in-zulin (desno). Zna�enje boja jednako je kao i u dijelu A slike. U divljem tipu inzulina na jednom kraju lanca B nalaze se aminokiseline prolin (bijelo) i lizin (svijetlo plavo) kojima su u brzodjeluju�em inzulinu zamijenjena mjesta. Ta mala promjena znatno djeluje na stabilnost brzodjeluju�eg inzulina pa se on 200 puta brže raspada na monomere. Prilago�eno prema literaturnom navodu broj 3.

DIZAJNIRANJE REKOMBINANTNIH PROTEINA U HRVATSKOJ

Eksprimiranje, pro�iš�avanje i analiziranje rekombinantnih proteina u Hrvatskoj zapo�elo je tijekom 1990-ih godina u laboratoriju prof. dr. sc. Željka Ku�ana i prof. dr. sc. Ivane Weygand-\uraševi� u Zavodu za bioke-miju Prirodoslovno-matemati�kog fakulteta Sveu�ilišta u Zagrebu. Od ta da pa do danas u Zavodu za biokemiju pripremljeno je više od stotinu rekombinantnih proteina od kojih su mnogi imali izmijenjena svojstva te su poslužili za detaljan studij strukture i funkcije tih proteina te odre�iva-nje njihovog unutarstani�nog smještaja.

S T R U K T U R A P R O T E I N A

KAKO ]ETE POSTATI PRETPLATNIK »PRIRODE«?

1. Po{aljite nam svoju adresu obi~nom po{tom (̂ asopis Priroda, Hrvatsko prirodoslovno dru{tvo, Trg žrtava fašizma 10, 10000 Zagreb), telefo-nom (01-468-0240) ili elektroničkom po{tom (priroda hpd.hr).

2. ̂ ekajte da vam do|e prvi broj Prirode s uplatnicom. Kada je uplatite, postali ste na{ pretplatnik!

ŽELITE LI KUPITI OVAJ BROJ »PRIRODE« JAVITE NAM SE TELEFONOM (01-468-0240)

ILI ELEKTRONIČKOM POŠTOM (priroda hpd.hr). POŽURITE BROJ PRIMJERAKA JE OGRANIČEN.

ŽELITE LI PODRŽATI ČASOPIS »PRIRODA«, JEDAN OD STARIJIH ČASOPISA ZA POPULARIZACIJU

ZNANOSTI U SVIJETU, POSTANITE NAŠ PRETPLATNIK!