pro enzyme end

8/17/2019 Pro Enzyme End

http://slidepdf.com/reader/full/pro-enzyme-end 1/22

1

MỤC LỤC

1. TỔ NG QUAN ................................................................................................................................ 3

1.1. Trùn quế. ........................................................................................................................... 3

1.2. Protease. ............................................................................................................................ 4

2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ........................................................................................... 5

2.1. Vật liệu .............................................................................................................................. 5

2.2. Hóa chất – dụng cụ - thiết bị : ................................................................................. 6

2.3. Phương pháp phân tích sử dụng ........................................................................... 6

2.3.1. Xác định hàm lượ ng Protein bằng phương pháp Biure ................................ 6

2.3.2. Xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp Anson cải tiến .................... 8

2.3.3. Tinh sạch bằng sắc kí lọc gel ........................................................................ 9

2.3.4. Phương pháp điện di SDS-PAGE .............................................................. 11

2.4. Quy trình thí nghiệm ................................................................................................ 12

2.4.1. Sơ đồ thí nghiệm ......................................................................................... 12

2.4.2. Tiến trình thí nghiệm .................................................................................. 14

3. K ẾT QUẢ VÀ BIỆ N LUẬ N .............................................................................15

3.1. Đo độ ẩm mẫu ban đầu ........................................................................................... 15

3.2. Xác định hàm lượng protein mẫu sau t ự phân và mẫu ban đầu .......... 15

3.3. Xác định hoạt tính protease mẫu sau t ự phân và mẫu ban đầu ........... 16

3.4. Lọc gel ............................................................................................................................. 18

3.5. Điện di ............................................................................................................................ 20

4. K ẾT LUẬN VÀ KIẾ N NGHỊ………………………………………………..19

TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................................. 20



2

Danh mục hình

Hình 1: Trùn quế………………………………………………………………………….4

Hình 2: Phản ứng tạo phức Cu2+ - protein………………………………………………..7

Hình3. Sắc ký lọc gel……………………………………………………………………..9

Hình4. Đồ thị miêu tả mối liên hệ giữa hoạt tính và hoạt tính riêng…………………….17

Hình6. Kết quả điện di…………………………………………………………………...18

Danh mục bảng

Bảng 1: Một số serine protease thông dụng hiện nay…………………………………….5

Bảng 2. Thành phần đổ gel……………………………………………………………….12

Bảng 3. Hàm lượ ng protein trong dịch trùn tự phân và mẫu ban đầu……………………15

Bảng4. Kết quả phân tích hoạt tính enzyme……………………………………………...16



3

1. TỔNG QUAN

1.1. Trùn quế.

Trùn Quế có tên khoa học là Perionyx excavatus, chi Pheretima, họ Megascocidae.

Chúng thuộc nhóm trùn ăn phân, thườ ng sống trong môi trường có nhiều chất hữu cơ đang

phân hủy, trong tự nhiên ít tồn tại vớ i phần thể lớn và không có khả năng cải tạo đất tr ực

tiếp như một số loài trùn địa phương sống trong đất.

Phân loại khoa h ọc:

Giớ i (regnum) Animalia

Ngành ( phylum) Annelida

Lớ p (class) Clitellata

Phân lớ p ( subclass) Oligochaeta

Bộ (ordo) Haplotaxida

Họ ( familia) Megascolecidae

Chi ( genus) Perionyx

Loài ( species) P. excavatus

Trùn Quế là một trong những giống trùn đã đượ c thuần hoá, nhậ p nội và đưa vào nuôi công

nghiệ p với các quy mô vừa và nhỏ. Đây là loài trùn mắn đẻ, xuất hiện r ải rác ở vùng nhiệtđớ i, dễ bắt bằng tay, vì vậy r ất dễ thu hoạch. Chúng đượ c sử dụng r ộng rãi trong việc chuyển

hóa chất thảm ở Philippines, Australia và một số nước khác.

Trùn quế thích sống nơi ẩm thấ p, ấm áp, yên tĩnh. Chúng sợ ánh sáng, nhiệt độ cao, tiếng

động, hóa chất bảo vệ thực vật, muối, vôi. Nhiệt độ thích hợ p 20 - 30°C, ẩm độ 75-80%,

pH 7,0 - 7,5. Ở nhiệt độ khoảng 30°C và ẩm độ thích hợp trùn Quế sinh trưởng và sinh sản

r ất nhanh

Kích thước Trùn Quế trưởng thành từ 10 – 15 cm, nướ c chiếm khoảng 80 – 85%, chất khôkhoảng 15 – 20%. Hàm lượng các chất (tính trên trọng lượ ng chất khô) như sau:

Protein: 68 – 70%

Lipid: 7 – 8%,

Chất đườ ng: 12 – 14 %

Tro 11 – 12%.

http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=Pheretima&action=edit&redlink=1



http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=Megascocidae&action=edit&redlink=1



http://vi.wikipedia.org/wiki/Gi%E1%BB%9Bi_(sinh_h%E1%BB%8Dc)




http://vi.wikipedia.org/wiki/Animalia


http://vi.wikipedia.org/wiki/Ng%C3%A0nh_(sinh_h%E1%BB%8Dc)


http://vi.wikipedia.org/wiki/Annelida


http://vi.wikipedia.org/wiki/L%E1%BB%9Bp_(sinh_h%E1%BB%8Dc)




http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=Clitellata&action=edit&redlink=1


http://vi.wikipedia.org/wiki/Ph%C3%A2n_l%E1%BB%9Bp



http://vi.wikipedia.org/wiki/Oligochaeta


http://vi.wikipedia.org/wiki/B%E1%BB%99_(sinh_h%E1%BB%8Dc)



http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=Haplotaxida&action=edit&redlink=1


http://vi.wikipedia.org/wiki/H%E1%BB%8D_(sinh_h%E1%BB%8Dc)



http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=Megascolecidae&action=edit&redlink=1


http://vi.wikipedia.org/wiki/Chi_(sinh_h%E1%BB%8Dc)


http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=Perionyx&action=edit&redlink=1


http://vi.wikipedia.org/wiki/Lo%C3%A0i


http://vi.wikipedia.org/wiki/Protein

http://vi.wikipedia.org/wiki/Protein




















4

Do có hàm lượng Protein cao nên Trùn Quế được xem là nguồn dinh dưỡ ng bổ sung quýgiá cho các loại thức ăn gia súc, gia cầm, thủy hải sản… Ngoài ra, Trùn Quế còn được dùngtrong y học…. Phân trùn là loại phân hữu cơ sinh học có hàm lượng dinh dưỡng cao, thíchhợ p cho nhiều loại cây trồng, không gây ra tình trạng "sốc" phân, yêu cầu tr ữ dễ dàng, đặc

biệt thích hợp cho các loại hoa kiểng, làm giá thể vườn ươm và là nguồn phân thích hợ pcho việc sản xuất rau sạch.

Hình 1: Trùn quế

1.2. Protease.

Protease là nhóm enzyme đượ c ứng dụng r ỗng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như côngnghiệp và chế biến thực phẩm, y học, nông nghiệp, công nghiệ p thuộc da, công nghiệ p sản

xuất xà phòng.

Người ta có thể thu nhận protease từ nhiều nguồn khác nhau như thực vât, động vât và visinh vật.

Phân loại protease

Protease là nhóm xúc tác phản ứng thủy phân liên kết peptide của protein.

Năm 1960, Hartley đã phân loại enzyme thủy phân protein theo 4 nhóm dựa theo tên hóahọc các amino acid tham gia vào tâm vị trí xúc tác.

Aspartic peptidase là những protease chứa nhóm carboxyl (-COOH) trong trung tâm hoạtđộng, tác động lên liên kết peptide tạo phức hợ p trung gian bằng những liên kết không cộng

hóa trị giữa enzyme và cơ chất. Các nhóm carboxyl này thuộc mạch bên R của aspartic,

glutamic hoặc có thể là nhóm carboxyl đầu C của chuỗi polypeptide. Aspartic peptidase

thườ ng hoạt động trong vùng pH acid và bị ức chế đặc hiệu bở i pepstatin.

http://vi.wikipedia.org/wiki/Gia_c%E1%BA%A7m






5

Cysteine peptidase: các enzyme thuộc nhóm này có nhóm thiol (-SH) của cysteine trong

trung tâm hoạt động, tác động lên nhóm – CO của liên kết peptide tạo phức hợ p trung gian

thiolacyl-enzyme. Các cysteine peptidase thườ ng hoạt động mạnh ở vùng pH trung tính,chúng chỉ hoạt động khi nhóm thiol ở tr ạng thái không bị bao vây. Do đó chất như cysteine,

acid ascorbic thường có tác dụng làm bền và hoạt hóa enzyme này. Cystatin, leupeptin là các chất ức chế thuận nghịch và E64 chất ức chế không thuận nghịch

cho nhóm cysteine peptidase rất thông dụng hiện nay.

Kim loại peptidase là những protease trong trung tâm hoạt động có chứa các ion kim loại

tr ực tiế p tham gia phản ứng, chúng tác động lên liên kết peptide tạo phức hợ p trung gian

bằng liên kết không cộng hóa trị giống như nhóm aspartic peptidase. Nhóm kim loại

peptidase hoạt động mạnh nhất ở vùng pH trung tính và bị giảm hoạt tính dưới tác dụng

của EDTA.

Serine peptidase: là những protease có nhóm hydroxyl (– OH) của serin trong trung tâmhoạt động. Các peptidase serine này thườ ng hoạt động ở vùng pH khá rộng từ trung tínhđến kiềm, nhóm -OH của serine tác động lên nhóm – CO của liên kết peptide tạo phức hợ ptrung gian acyl-enzyme. Các enzyme thuộc nhóm này thông dụng nhất là trypsin vàchymotrypsin

Bảng 1: Một số serine protease thông dụng hiện nay.

Enzyme Vị trí cắt Nguồn thu

TrypsinChymotrypsin

Elastase

Plasmin

Thrombin

V8-protease (Glu-C)

Lys-C

Subtilisin

Carboxypeptidase A

Arg, LysTyr,Trp,Phe

Gly, Ala, Val

Arg, Lys

Arg

Aps, Glu

Lys

Tyr, Phe, Leu

Đầu C các amin

Hệ thống tiêu hóa ở động vật và một số loại khác Hệ thống tiêu hóa ở động vật và một số loại khác

Hệ thống tiêu hóa ở động vật và một số loại khác

Máu

MáuStaphylococcus aureus V8

Lysobacter enzymogenes

Các chủng bacillus khác nhau

Hệ thống tiêu hóa ở động vật

2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. Vật liệu



6

Trùn quế dùng trong thí nghiệm ở dạng trùn đông lạnh, đượ c mua tại địa chỉ 139/39/2c

Tr ịnh Đình Trọng, phường Phú Trung, quận Tân Phú, Tp.Hồ Chí Minh

2.2. Hóa chất – dụng cụ - thiế t bị :

- Hóa chất :

Acetone : 50ml

Dệm phosphate pH 7

Thuốc thử biure

Dd casein 1%

Dd TCA 5%

Dd NaOH 0.5 N

Thuốc thử Folin

- Dụng cụ : Ống nghiệm : 20 ống

Becher 100ml : 3 cái

Erlen 250ml : 3 cái

Erlen 100 :

Pipet 1ml, 5ml, 10ml

Bình nướ c cất, phễu, bóp caosu, đũa khuấy

Ống ly tâm : 4 cái - Thiết bị :

Máy xay sinh tố

Máy đo độ ẩm

Máy đo quang

Máy ly tâm

Tủ ủ

Tủ sấy

Thiết bị lọc gel

Thiết bị chạy điện di

2.3.

Phương pháp phân tích sử dụng

2.3.1. Xác định hàm lượng Protein bằng phương pháp Biure

2.3.1.1. Nguyên tắc



7

Các chất chứa từ hai lien k ết peptide ( -CO-NH-) tr ở lên đều cho phản ứng Biure: trong môitrườ ng kiềm mạnh, các liên k ết peptide phản ứng vớ i CuSO4 tạo thành một phức chất cómàu từ tím đỏ tớ i xanh.

Vì cường độ màu tỉ lệ thuận vớ i nồng độ protein ( nồng độ protein càng cao thì màu sắc

càng đậm) do đó có thể đo cường độ màu bằng máy quang phổ r ồi suy ra nồng độ protein

của một dung dịch bất kì.

Hình 2: Phản ứng tạo phức Cu2+ - protein

2.3.1.2. Cách tiến hành

7 ống nghiệm tỉ lệ albumin (ml)/nướ c cất (ml)

Albumin 0 0 2 4 6 8 10

Nướ c cất Nướ c cất 10 10 8 6 4 2 0

Lấy 1ml

Thời gian: 20 phút

4ml thuốc thử biure nhiệt độ phòng

Bước sóng 540nm

Pha dung

dịch protein

Phản ứngBiure

Đo độ hấ p thụ

OD

Albumin



8

2.3.2. Xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp Anson cải tiến


Dùng enzyme protease để thủy phân cơ chất protein, cụ thể là dung dịch Casein, sản

phẩm tạo thành là các peptide mạch ngắn hay các acid amine. Trong các loại acid amine,tyrosin chiếm đa số. Định lượ ng mẫu, cụ thể là tyrosin và tryptophan hòa tan bằng phản

ứng màu vớ i thuốc thử Folin. Dựa vào đồ thị chuẩn của Tyrosin để định lượ ng sản phẩm

do enzyme xúc tác tạo nên. Hoạt tính của protease theo định nghĩa là số µmol tyrosin sinhra do thủy phân casein bở i 1ml dung dịch hay 1mg hỗn hợ p chứa protease trong 1 phút ở điều kiện chuẩn ( 35.50C, pH 7.6)

2.3.2.2. Cách tiến hành

- Chuẩn bị 12 ống nghiệm sạch, khô để làm 6 ống thử thật, 6 ống thử không,có dán

nhãn .

Dung dịch hóa chất Ống nghiệm

Thử thật Thử không

Dung dịch casein 1% (ml) 5 5

Dung dịch TCA 5% (ml) 0 10

Dung dịch enzyme mẫu (ml) 1 1

Lắc đều và giữ ở 35,5oC trong 20 phút

Dung dịch TCA 5% (ml) 10 0

Để yên 30 phút, lọc lấy dịch bên dưới

- Chuẩn bị 2 ống nghiệm khác, cho vào ống thứ nhất 5ml dịch lọc của ống thử thật vàcho vào ống thứ 2 5ml dịch lọc của ống thử không.

- Cho thêm vào mỗi ống 10ml NaOH 0.5N và 3ml thuốc thử Folin, lắc đều 10 phút.

- Đo độ hấp thu ở bước sóng 660nm. Tính ΔOD = ODTT – ODTK



9

2.3.2.3. Tính kết quả

Định nghĩa đơn vị Anson: một đơn vị Anson là lượng enzyme tối thiểu trong điều kiện thínghiệm ( 35,5oC: pH 7,6 … ) thủy phân casein trong 1 phút tạo thành sản phẩm hòa tan

trong TCA, phản ứng với thuốc thử Folin cho ta độ hấp thu OD ở bước sóng 660nm tươngứng với 1 µM tyrosine trong đường chuẩn.

Hđ Protease = ∗∗∗1

∗∗

Với: Hđ Protease : hoạt độ enzyme protease ( UI/g) V1: thể tích pha loãng ban đầu : 100 ml

V : tổng thể tích hỗn hợp trong ống thử thật hoặc ống thử không (ml)

v : thể tích dịch lọc đem phân tích (ml) t : thời gian thủy phân (phút)m : khối lượng mẫu enzyme đem đi xác định hoạt tính (g)

L: độ pha loãng enzyme

µM tyrosine: lượng µM tyrosine trong v (ml) suy ra từ đường chuẩn

2.3.3.

Tinh sạch bằng sắc kí lọc gel


Phương pháp này dựa vào kích thước phân tử. Mẫu sẽ đượ c nạp vào đầu một cột chứa

nhiều hạt có lỗ làm từ polymer không tan nhưng có tính hydrat hóa cao như dextran,agarose hay polyacrylamide. Những phân tử có kích thướ c nhỏ lọt vào bên trong lỗ gel và

bị trì hoãn, do đó di chuyển chậm qua cột, trong khi những phân tử lớn hơn di chuyển bênngoài các hạt gel nên sẽ di chuyển nhanh hơn và được tách ra k hỏi cột sớm hơn các phântử nhỏ.

Hình3. Sắc ký lọc gel



11

2.3.4. Phương pháp điện di SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate

PolyAcrylamide)


Dựa vào sự di chuyển của các phân tử có mang điện tích trong điện trường. Điện di proteintrên gel tiến hành xử lý gel bằng SDS. Phân tử protein có điện tích tự do chứa những nhómacide và base. Nếu các phân tử protein có điện tự do chứa những nhóm acid và base. Nếu

các phân tử protein không được đạt ở điểm đẳng điện thì dướ i ảnh hưở ng của điện trườ ng

ngoài, chúng sẽ di chuyển sang các cực. Các protein khác nhau có trị số điện tích tự do khácnhau. Vì thế, tốc độ di chuyển của chúng trong điện trườ ng ở những điều kiện nhất định về

pH, lực ion và nhiệt độ cũng khác nhau. Do đó, hỗn hợp các loại protein được tách ra thành1 vùng riêng biệt hoặc những phân đoạn riêng biệt.

2.3.4.2. Chuẩn bị gel điện di

Gel polyarcylamine thường đặt đứng, để chế gel cần sử dụng các tấm thủy tinh có kết cấu

chuyên dụng để tạo khuôn.

R ửa sạch các tấm thủy tinh bằng nướ c, để khô rồi lau lại bằng ethanol. Ráp các tấm thủy

tinh theo hướ ng dẫn của hang sản xuất và kẹp khuôn trên giá đỡ .

Pha gel điện di với thành phần (cho 1 mmieengs gel) như bảng 1

TEMED có tác dụng làm đông gel, là thành phần pha vào sau cùng. Sau đó nhẹ nhàng trộn

đều hỗn hợ p gel vừa pha và đổ vào khôn kính đã lắ p sẵn

Đổ gel chạy (running gel) trướ c tớ i vạch dướ i của khuôn kính. Thêm isopropanol lên lớ ptrên gel chạy vừa đổ, isopropanol có tác dụng làm phẳng và hút bọt khí của lớ p gel chạy.

Đợ i khoảng 30 phút cho gel đông.

R ửa sạch lớp isopropanol đã đổ vào gel bằng nướ c cất nhiều lần. Để khô.

Đổ gel gom (stacking gel) tới mép đông. Tháo bộ kính ra khỏi khuôn kính. Lắ p bộ kính cógel vào khung điện cực, đổ đệm điện di đầy bộ khung điện cực.



12

Bảng 2. Thành phần đổ gel

Running gel Stacking gel

Mono solution 2,5 ml 0,325 ml

4X Running gel

buffer (pH8.8)1,875 ml

4X Stacking gel

buffer (pH 6.8)0,625 ml

H2O 3,125 ml 1,525 ml

APS 10% 25 l 12,5 l

TEMED 5 l 2 l

2.3.4.3. Chuẩn bị mẫu

Hút mỗi mẫu cần điện di 100 l vào tube 1,5 ml có bổ sung 20 l Load buffer 6X.

Đun sôi cách thủy trong 5 phút, để nguội.

2.3.4.4. Tiến hành điện di

Nhẹ nhàng lấy lượ t ra khỏi bộ điện di. Bơm từng mẫu vào từng giếng với lượng là 20 l.

Thang chuẩn là Protein Ladder với lượ ng 13-15 l.

Đóng nắ p hộp điện di, tiến hành chạy điện di với dòng điện ổn định, thường là 100V – 200V, trong 30 – 90 phút.

Sau khi lấy gel ra, cho gel vào hộp có chứa dung dịch nhuộm protein (Staining solution).

Lắc nhẹ 10 – 30 phút cho Staining solution thấm vào gel

Chuyển gel sang dung dịch r ửa màu (Destaining solution). Thay dung dịch r ửa mới vàilần vớ i thờ i gian khoảng 15 phút/lần cho đến khi miếng gel có màu trong suốt và xuất

hiện nhiều vạch xanh lơ trên gel.

2.4. Quy trình thí nghiệm

2.4.1. Sơ đồ thí nghiệm



13

-60oC

- t= 18;24;30;36h

- Tỷ lệ 1:2

- 4000 vòng/phút

- t=10 phút

- đệm pH 7

Trùn quế

(đông lạnh)

Rã đông, xay nhuyễn

Xác định hàm lượ ng

rotein, họa tính enz me

Pha thành dung dịch

trùn 13%

Dịch

enzyme thô

Hòa tan tủa với đệm

phosphate

Ly tâm thu tủa

enzyme

Tủa acetone

Ly tâm (4000vòng/phut/), 10 phút

Tự phân với nướ c

Điện di kiểm tra mẫu

enzyme sau tinh sạch

Lọc gel

Enzyme sau

tinh sạch


protein, họa tính enzyme

Xác định độ ẩm, hàmlượ ng chất khô







14

2.4.2. Tiến trình thí nghiệm

2.4.2.1. Tuần 1

- Nộp đề cương thí nghiệm.

- Nhận dụng cụ thí nghiệm.

- Chuẩn bị nguyên vật liệu : trùn được mua hôm thứ 6 ngày 26/02/2016 sau đó bảoquản tronng tủ đông để chuần bị tiến hành thí nghiệm.

2.4.2.2. Tuần 2

- Tiến hành rã đông trùn sau đó cho vào máy xay sinh tố, xay trong thời gian 10 phút - Xác định độ ẩm trùn quế để pha thành dung dịch trùn có nống độ 13 %.

- Xác định hàm lượng protein và hoạt tính enzyme trong mẫu ban đầu.

- Sau khi có dịch trùn 13 %, tiến hành khảo sát thờ i gian thủy phân dịch trùn ở cáckhoảng thờ i gian 18, 24, 30, 36 giờ , mỗi lần khảo sát thực hiện 3 mẫu. Tuần 2 tiến

hành thủy phân trùn ở khoảng thời gian 18 và 24 giờ bằng cách cân 5 g dịch trùn

13% cho vào erlen, bịt lại bằng bao ni lông, cho vaò tủ ủ 600C trong khoảng thờ igian khảo sát.

- Sau khi đủ thờ i gian thủy phân, tiến hành lấy mẫu ra và tiến hành ly tâm ở 4000

vòng/phút trong 10 phút, thu dịch sau đó lấy dịch đem đi xác định hàm lượ ng protein

bằng phương pháp Biure và hoạt tính enzyme bằng phương pháp Anson cải tiến.

- Trong thờ i gian chờ thủy phân, dựng đườ ng chuẩn Biure và đườ ng chuẩn Tyrosin.

2.4.2.3. Tuần 3+4 :

Tiế p tục khảo sát thờ i gian thủy phân trùn ở 2 khoảng thời gian còn lại là 30 và 36 giờ .

2.4.2.4. Tuần 5 :

Sau khi khảo sát các khoảng thờ i gian thủy phân, tìm đượ c thờ i gian thủy phân trùn tối ưu,chọn mẫu trùn có hàm lượng protein và hoạt tính enzyme tốt nhất đem đi tủa vớ i acetone

và hòa với đệm phostphate đem đi tinh sạch bằng sắc kí lọc gel.

Xác định hoạt tính và hoạt tính riêng ở những mẫu có peak.

2.4.2.5. Tuần 6

Diện di kiểm tra k ết quả thu đượ c sau khi lọc gel. Chọn mẫu điện di gồm : mẫu có peak khilọc gel, mẫu trướ c khi lọc gel và enzyme thô.



15

3. K ẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

3.1. Đo độ ẩm mẫu ban đầu

- Khối lượng trùn đem đo : 4.024g

- Sấy ở 1050C

- Độ ẩm mẫu dịch trùn nguyên liệu ban đầu máy đo được là 87%

3.2. Xác định hàm lượng protein mẫu sau tự phân và mẫu ban đầu

Phưng trình đườ n chuẩn:

- Phương trình đườ ng chuẩn Albumin: y = 0.0582x – 0.007, R 2 = 0.9998

Bảng 3. Hàm lượ ng protein trong dịch trùn tự phân và mẫu ban đầu

STT mẫuThờ i

gian (h)

Độ pha

loãng(%)

Nhiệt

độ (0C)OD

Hàm lượ ng

protein

(mg/ml)

1 18 10 60 0.18 3.1048

2 18 10 60 0.228 3.9296

3 18 10 60 0.193 3.32824 24 10 60 0.398 6.8505

5 24 10 60 0.558 9.5997

6 24 10 60 0.222 3.8265

7 30 10 60 0.258 4.4450

8 30 10 60 0.28 4.8230

9 30 10 60 0.304 5.2354

y = 0.0582x - 0.0007R² = 0.9998

-0.1

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0 2 4 6 8 10 12

G i á t r ị O D

Hàm lượng protein (mg/ml)

Đường chuẩn Biure



16

10 36 10 60 0.333 5.7337

11 36 10 60 0.195 3.3625

12 36 10 60 0.505 8.6890

Mẫu ban đầu 0.315 5.4244

- Mẫu số 5 có hàm lượ ng protein cao nhất (9,5997 mg/ml) ứng vớ i thờ i gian thủy phân24h.

- Số liệu có sự chênh lệch và thay đổi tương đối nhiều, nguyên nhân chủ yếu dẫn đến

k ết quả là do máy đo mật độ quang không ổn định, giá trị thay đổi nhiều, một phần khác làdo trong lúc thao tác thí nghiệm, vortex không đều. Một nguyên nhân khác là do tủ ủ 600C,

vì thờ i gian thực hiện thí nghiệm phải để mẫu qua đêm nên nhiệt độ tủ ủ có thể bị điều

chỉnh hoặc mở ra mở vào nhiều lần khiến nhiệt độ không ổn định.

3.3. Xác định hoạt tính protease mẫu sau tự phân và mẫu ban đầu

Phưng trình đườ n chuẩn:

Đường chuẩn y=0.503x+0.006 ; R 2 =0.998 với y là ΔOD,x là µM tyrosin

y = 0.503x + 0.006R² = 0.998

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

OD

OD

Linear (OD)

M Tyrosin



17

Bảng4. Kết quả phân tích hoạt tính enzyme

ST

T

thờigian

(h)

pha

loãng(%)

nhiệt độ

(ºC) ΔOD µM

tyrosin

HT

(UI/ml)

HTR

(UI/mg)

1 18 10 60 0.113 0.0213 21.2724 3.4257

2 18 10 60 -0.13 -0.0270 -27.0378 -0.2752

3 18 10 60 0.069 0.0125 12.5248 0.1505

4 24 10 60 0.009 0.0006 0.5964 0.0029

5 24 10 60 0.05 0.0087 8.7475 0.0325

6 24 10 60 -0.073 -0.0157 -15.7058 -0.1579

7 30 10 60 -0.013 -0.0038 -3.7773 -0.0327

8 30 10 60 -0.01 -0.0032 -3.1809 -0.0244

9 30 10 60 -0.048 -0.0107 -10.7356 -0.082010 36 10 60 -0.267 -0.0543 -54.2744 -0.2958

11 36 10 60 -0.013 -0.0038 -3.7773 -0.0374

12 36 10 60 -0.019 -0.0050 -4.9702 -0.0185

Mẫu ban đầu 0.018 0.0024 2.3857 0.0176

- Số liệu cũng có sự thay đổi và chênh lệch mặc dù trong cùng 1 điều kiện thủy phân,

cùng thời gian, địa điểm.

- Vì sô liệu chênh lệch nên ta chọn một số mẫu để đem làm kết quả sau cùng.

- Ta chọn mẫu số 3, 5, và mẫu ban đầu để khảo sát mối liên hệ giữa hoạt tính và hoạttính riêng, ta có đồ thị sau:



18

Hình4. Đồ thị miêu tả mối liên hệ giữa hoạt tính và hoạt tính riêng

Từ biểu đồ trên ta thấy hoạt tính enzyme càng cao thì hoạt tính riêng của enzyme cũng tăng.

Cột 1,2 là kết quả hoạt tính ứng vớ i thờ i gian thủy phân 18h và 24h, so vớ i mẫu ban đầu

(cột 3). Ta thấy sau khi thủy phân thì enzyme có hoạt tính và hoạt tính riêng cao hơn lúcchưa thủy phân.

3.4. Lọc gel

B ảng 5 K ế t quả l ọc gel

Ống số 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

OD 0.013 0.048 0.062 0.076 0.049 0.071 0.045 0.037 0.012 0.000

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

0.16

1 2 3

0

2

4

6

8

10

12

14

Hoạt tính riêng- UI/mg

H

o ạ t t í n h -

U I / m l ) Hoạt tính- Hoạt tính riêng

Hoạt tính

Hoạt tính riêng



19

Hình5. Đồ thị biểu diễn giá trị OD Biure trong các mẫu sau lọc gel

Từ hình 5 nhận thấy có 2 điểm ghi nhận được giá trị OD cao đột biến. Điểm thứ nhất ở ống

số 4, OD tăng từ 0,062 lên 0,076; đây là điểm ghi nhận đượ c phần tử có kích thướ c lớ n nhất

trong mẫu ra khỏi cột gel. Điểm còn lại xuất hiện ở ống 6 , OD từ 0,049 tăng đột biến lên0,071; đây là 2 peak ghi nhận sự có mặt của các phân tử nhỏ trong mẫu lọc gel – amino

acid, peptide. Còn 1 peak đo đượ c ở mẫu số 3.

Sau đó ta xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp anson, giá trị OD anson của mẫu

số 6 là OD = ODTT – ODTK = 0,156 – 0,138 = 0,018. Vì thể tích dịch lọc thu đượ c ở mẫu

số 4 quá ít nên không đủ thể tích để xác định hoạt tính enzyme. Hoạt tính và hoạt tính riêngcủa mẫu số 4 : enzyme trong mẫu số 4 có hoạt tính là 2,3857UI/ml và có hoạt tính riêng là0,9051 UI/mg

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

0.08

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

O D

Ống số

Giá trị OD Biure trong các ống lọc gel



20

3.5. Điện di

Hình6. K ết quả điện di

Thang chuẩn khá rõ nhưng trên miếng gel lại không thấy xuất hiện vệt màu xanh lơ. Nguyênnhân là do thao tác trong lúc thí nghiệm trong giai đoạn đổ gel. Dẫn đến việc các phân tử

protein không tách ra đượ c.

Vì thờ i gian từ lúc lọc gel xong đến khi điện di bảo quản trong điều kiện đông lạnh trong 2

tuần. Sau đó đem ra rã đông nên hàm lượ ng protein bị mất đi.



21

4. K ẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. Kết luận

Thờ i gian tối ưu để thủy phân trùn quế thu enzyme protease là 24 h ở nhiệt độ 60 0C

4.2. Kiến nghị

Vì thờ i gian thí nghiệm không nhiều nên chỉ khảo sát một yếu tố đó là thờ i gian thủy

phân, còn các điều kiện khác như nhiệt độ thủy phân, lượng dung môi… vẫn chưa đượ ckhảo sát nên nếu đượ c khảo sát các yếu tố khác thì sẽ tốt hơn.

Phòng thí nghiệm nên trang bị thêm máy đo quang mới để k ết quả thí nghiệm được chínhxác hơn



22

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1]. Nguyễn Đức Lượng, “Công nghệ enzyme”, Nhà xuất bản Đại học quốc gia TP. Hồ

Chí Minh, 2012.

pro enzyme end

Documents