projekt forskerspirer 2011 · julie lolk wolff-sneedorff projekt forskerspirer 2011 herlufsholm...

Projekt Forskerspirer 2011

Isolering af tumor specifikke memory T celler fra humant blod med henblik på udvikling af et fremtidigt lægemiddel til

hindring af tilbagefald til kræft

Julie Lolk Wolff-Sneedorff BIO/SUND Herlufsholm Skole

http://www.google.dk/imgres?q=blodceller&hl=da&biw=1366&bih=425&gbv=2&tbm=isch&tbnid=RjfzH-AONv5i2M:&imgrefurl=http://sverigesradio.se/sida/artikel.aspx?programid=2195&artikel=3963354&docid=d54W8FfCBEUz6M&w=209&h=251&ei=FEV7TsPqN4b64QTghLnkDw&zoom=1&iact=rc&dur=4&page=2&tbnh=98&tbnw=82&start=18&ndsp=21&ved=1t:429,r:15,s:18&tx=56&ty=53

Julie Lolk Wolff-Sneedorff Projekt Forskerspirer 2011 Herlufsholm Skole

BIO/SUND Synopsis Oktober 2011

~ 2 ~

INDHOLDSFORTEGNELSE

Forside………………………………………………. s. 1

Indholdsfortegnelse…………………………………. s. 2

Indledning…………………………………………… s. 3

Problemformulering og formål……………………… s. 3-4

Metodevalg…………………………………………. s. 4-5

Teori og projektets udførsel………………………… s. 6-7

Videre arbejde………………………………………. s. 7-8

Kontakter……………………………………………. s. 8-9

Litteraturliste…………............................................. s. 9-10

Bilag………………………………………………… s. 11-22

Bilag 1………………………………………………... s. 11-15

Bilag 2……………………………………………………….. s. 16-18

Bilag 3………………………………………………… s. 19-22



~ 3 ~

INDLEDNING

Gennem de seneste årtier har kræft fået en næsten unik status som en uhelbredelig sygdom. Dog har

en udvikling og effektivisering af forskellige behandlingsformer såsom kirurgi, stråleterapi samt

kemoterapi været medvirkende til, at stadig flere kræftpatienter bliver helbredt eller får en vis

udsættelse af dødstidspunktet. På trods af at de traditionelle behandlingsformer har vist deres

effektive virkning, hænder det ofte, at en kræftpatient, der ellers synes at være helbredt, får et eller

flere tilbagefald. Desuden kan særligt stråleterapi samt kemoterapi medføre en lang række

bivirkninger, der kan føre til en forringelse af patientens livskvalitet.

Firmaet CytoVac A/S1 søger at åbne nye muligheder for behandling af kræft ved udvikling af

cellebaserede terapeutiske produkter, der støtter kræftpatientens eget immunforsvar. CytoVac’s

lægemiddel, der er under udvikling, er designet til den enkelte patient, idet der i hvert enkelt

tilfælde tages udgangspunkt i patientens egne celler. De lymfoid effektor celler2 (ULR 1) i

immunforsvaret, som kroppen ikke selv evner at opformere i tilstrækkelig grad, opformeres uden

for kroppen med henblik på at kunne behandle patienten med et præparat baseret på de opformerede

lymfoid effektor celler. Præparater baseret på lymfoid effektor celler bliver på nuværende tidspunkt

anvendt i kliniske forsøg, og de foreløbige resultater er særdeles lovende.3 På baggrund af

CytoVac’s anden forskning vil en teoretisk undersøgelse af muligheden for isolering af tumor

specifikke memory T celler blive belyst i denne opgave med henblik på at kunne udvide CytoVac’s

behandlingsmetode med sådanne celler. Isolering af tumor specifikke memory T celler håbes at

kunne danne grundlag for udviklingen af et lægemiddel baseret på kræftpatientens egne

hukommelsesceller, der skal kunne hindre tilbagefald til den pågældende kræftsygdom.

PROBLEMFORMULERING OG FORMÅL

I denne opgave vil jeg søge at finde svar på følgende problemstilling:

Hvorledes kan tumor specifikke memory T celler isoleres fra en blodprøve fra en

kræftpatient?

I min forskning vil jeg, med inspiration fra Dr. Arne Bøyums teori og metode til isolering af

mononucleære celler fra humant blod, opstille samt udføre et forsøg, hvor jeg fra to forskellige

1 http://www.cytovac.dk/

2 LEC: Lymphoid effector cells. Der er her tale om hhv. NK-celler (Natural Killer cells) (ULR 1) og CTL-celler (Cytotoxic

Lymphocytes). 3 CytoVac: CytoVac, Prospekt for kapitaludvidelse i CytoVac A/S, CytoVac, 2010

http://www.cytovac.dk/



~ 4 ~

bloddonationer vil isolere, tælle og fryse PBMC4. I forlængelse af dette forsøg, vil jeg adskille

monocytter og lymfocytter fra hinanden. Forsøgsbeskrivelse samt resultater og illustrationer

vedlægges som bilag Bilag 1 og Bilag 2

. Herudover vil jeg undersøge, hvorledes aktiverede lymfocytter5

angriber isolerede tumorceller fra en brystkræftpatient Bilag 3

. Desuden vil jeg på teoretisk plan

undersøge mulighederne for isolering af tumor specifikke memory T celler fra det isolerede PBMC.

Denne del af opgaven vil der være særlig fokus på, idet dette ville være et supplement til det

nuværende kendskab til forebyggelse af tilbagefald til kræft.

Formålet med dette projekt er at danne grundlag for videre forskning, hvor jeg vil tage

udgangspunkt i CytoVac’s teori og metode til opformering af lymfoide effektor celler uden for

kroppen. Ud fra opformerede tumor antigen specifikke memory T celler fra en kræftpatient, vil den

pågældende patient kunne behandles med disse, hvilket vil kunne hindre tilbagefald af

kræftsygdommen med minimale (hvis nogen) bivirkninger til følge.

METODEVALG

For at finde en teori for hvorledes man kan isolere tumor specifikke memory T celler, tages der

udgangspunkt i CytoVac’s metode til isolering af cytotoksiske lymfocytter6 samt Dr. Arne Bøyums

teori og metode til isolering af mononucleære celler fra humant blod. I første fase af forsøget

isoleres PBMC fra en blodprøve ved brug af LymphoprepTM 7

Bilag 1

. Efterfølgende adskilles

monocytter og lymfocytter fra det isolerede PBMC, og lymfocytterne fryses, da de skal anvendes i

et senere stadie Bilag 2

. Disse to forsøg udføres med inspiration fra Dr. Arne Bøyums teori og metode,

som bygger på, hvorledes man, på grund af forskellen i densiteten af mononucleære celler og

densiteten af LymphoprepTM

, kan isolere de mononucleære ved hjælp af en række

centrifugeringsprocesser (ULR 2). Delingen af monocytter og lymfocytter sker ved, at PBMC

opbevares i 37° C i ½ time i en celle-kultur-flaske, hvor der er tilsat et M5-medie8. Monocytter har

den egenskab, at de vil klistre til celle-kultur-flaskens sider, mens lymfocytterne stadig vil flyde

rundt i væskeblandingen. En nærmere beskrivelse af denne metode fremgår af Bilag 2. Fra de

isolerede monocytter kan man, ved at dyrke cellerne under særlige betingelser i definerede

vækstmedier og ved tilsætning af en serie specifikke vækstfaktorer (cytokiner), stimulere

4 PBMC (Perifære Blod Monucleære Celler). Blodceller med kun én cellekerne.

5 Lymfocytter der har mødt dendritceller med antigen på.

6 Cytotoksiske lymfocytter er dræberceller bestående af centrale memory celler og NK-celler (Natural Killer cells).

7 Lymphoprep

TM gør cellerne adskillelige (ULR 2).

8 M5-medie: Et medie der indeholder forskellige proteiner, der gør det muligt for PBMC at overleve, samt fortynder.



~ 5 ~

monocytter således, at disse udvikler sig til modne dendritceller. Denne dendritcelle

fremstillingsmetode er baseret på metoder publiceret af Romani et al (1994) og Sallusto &

Lanzaveccia (1994)9. De modne dendritceller blandes med nogle af de lymfocytter, der tidligere i

forsøget blev frosset ned, og med et specielt præparat kan denne blanding stimuleres til at danne

CD4+-berigede lymfocytter10

. Til de CD4+-berigede lymfocytter induceres derefter tumor antigener

ved demethylering, således at tumor antigenerne vil blive præsenteret på de CD4+-berigede

lymfocytter, der da kan aktivere immunforsvaret til at bekæmpe den pågældende kræftsygdom.

Denne metode tager udgangspunkt i CytoVac’s metode til isolering af cytotoksiske lymfocytter.

Dr. Arne Bøyums metode er anvendt, da tidligere lignende forsøg har bekræftet metoden og

teoriens virkning i praksis, hvilket desuden er en stor fordel, da jeg med rimelig sikkerhed kan

forvente at isolere PBMC samt dele monocytter og lymfocytter. Forsøgene er udført som de første

faser i en lang forsøgsrække, der gerne skulle føre til en isolering af tumor specifikke memory T

celler. De efterfølgende forsøgsfaser, i hvilke metoden tager udgangspunkt i CytoVac’s metode til

isolering af cytotoksiske T lymfocytter bør også kunne udføres med rimelig sikkerhed, da CytoVac

har udført lignende forsøg. Teorien og metoden hertil er dog stadig forholdsvis ny, hvilket skaber en

vis usikkerhed.

Nedenfor ses en illustration af det beskrevne forløb:

9 Sallusto, F., Geginat, J. og Lanzaveccia, A.: “Central memory and effector memory T cell subsets: Function, generation

and maintenance” og Kalinski, P. m.fl.: ”IL-12-deficient dendritic cells, generated in the presence of prostaglandin E2, promote type 2 cytokine production in maturing human naive T helper cells”. 10

CD4+ er en T-hjælpecelle, som har en regulerende og koordinerende funktion i immunresponset. Den hovedfunktion er at aktivere andre lymfocytter, som kan bekæmpe en evt. infektion.



~ 6 ~

TEORI OG PROJEKTETS UDFØRSEL

I Immunforsvaret er der to overordnede typer CD8+ celler: CD8+ naive celler, der endnu ikke er

specificeret til at huske et bestemt antigen, og aktiverede CD8+ celler, der allerede er specificeret til

at huske et bestemt antigen. Aktiverede CD8+ T celler, er de celler, der har en direkte betydning for

bortskaffelsen af virusinficerede celler og tumorceller (ULR 1). Naive ikke aktiverede CD8+ T celler

har den funktion, at de primært i lymfeknuderne scanner peptider siddende på MHC klasse I

molekyler11

for tilstedeværelsen af fremmede virus eller tumor antigener12

. Efter at være blevet

aktiveret af de antigen-repræsenterende celler (der er de celler, der præsenterer antigenerne for T-

celler), differentierer de naive CD8+ T cellerne til cytotoksiske lymfocytter eller memory T celler. I

kroppen er der et maksimum for antallet af CD8+ T celler, og jo ældre vi bliver, jo større vil

populationen af CD8+ hukommelsesceller blive i forhold til populationen af CD8+ naive celler. I

min forskning vil jeg isolere CD8+ T celler fra en blodprøve (ud fra på forhånd kendte metoder – se

nedenfor). Herefter vil jeg forsøge at isolere de CD8+ naive celler fra CD8+ memory celler med

henblik på senere at præsenterer disse naive celler for tumor antigener (repræsenteret på CD4+-

berigede lymfocytter). Herved vil de CD8+ naive celler blive til tumor specifikke memory T celler,

der da vil kunne danne grundlag for udviklingen af en præventiv vaccine mod prostatakræft.

På CD8+ naive celler og CD8+ memory celler, er en række proteiner repræsenteret. De to typer

CD8+ T-celler har proteinerne CD3,TCR, IL-7R og CCR7 til fælles og herudover har CD8+ naive

celler proteinet CD62L repræsenteret, og CD8+ memory celler har proteinet CD44 repræsenteret.

Illustration af en CD8+ naiv celle og en CD8+ memory celle med repræsenterede proteiner.

11

MHC molekyler (major histocompatibility complex molecules). 12

Dong, Chen og Martinez, Gustavo J.: “T cells: the usual subsets”



~ 7 ~

For at isolere de CD8+ naive celler fra CD8+ memory cellerne kan man forestille sig, at benytte

magnetiske ”microbeads” med påsatte CD44 antistof (ULR 3). Sådanne ”microbeads” kan anvendes,

for at man da ved magnetisk kraft kan tiltrække eller tilbageholde CD8+ memory cellerne, da kun

disse har CD44 proteinet repræsenteret, hvorved CD8+ memory cellerne og de CD8+ naive celler

vil adskilles. De CD4+-berigede lymfocytter, der præsenterer tumor antigener, kan dernæst blandes

med de isolerede CD8+ naive celler, som derved vil blive til tumor antigen specifikke memory

celler. Med udgangspunkt i CytoVac’s teori og metode til opformering af lymfoide effektor celler

uden for kroppen, er det tænkeligt, at de tumor antigen specifikke memory celler ligeledes vil kunne

opformeres uden for kroppen. Lykkes dette, kan man ud fra de opformerede tumor antigen

specifikke memory celler udvikle et lægemiddel, der skal kunne hindre tilbagefald til den

pågældende kræftsygdom (i tilfælde af at lægemidlet realiseres, vil de opformerede tumor antigen

specifikke memory celler naturligvis skulle stamme fra patienten selv). Desuden kunne det

undersøges, om hvorvidt det er muligt at udvikle en metode til at give patienter mange tumor

specifikke memory celler, således at vaccinen ville fungere som en præventiv vaccine. Er dette

muligt, vil man kunne hindre at sygdommen overhovedet opstår.

Da denne opgave omhandler ideer til eventuelle forsøg, mener jeg ikke, at det er relevant at opstille

et budget. Af samme årsag har jeg ingen formodning om, hvilken tidshorisont, der vil hører til

udførelsen af sådanne forsøg.

VIDERE ARBEJDE

Vil isolering samt opformeringen af tumor specifikke memory T celler uden for kroppen lykkes,

kan der ud fra CytoVac’s metoder eksperimenteres med udviklingen af et præparat, som den

pågældende kræftpatient vil kunne behandles med. Da CytoVac beskæftiger sig med prostatakræft,

vil det være oplagt, at forsøge at udvikle et præparat med tumor specifikke memory T celler fra en

prostatakræftpatient.

Lykkes det at udvikle et præparat med tumor specifikke memory T celler fra en

prostatakræftpatient, kan forskningen videreføres til klinisk forsøgsbehandling af

prostatakræftramte patienter13

. De kliniske forsøg vil da blive delt op i tre faser. I første fase vil der

fokuseres på præparatets virkning på den menneskelige organisme samt eventuelle bivirkninger.

Viser det sig, at præparatet har en positiv virkning på den menneskelige organisme uden skadelige

13

Sådanne forsøg skal godkendes af Lægemiddelstyrelsen og Etisk Råd.



~ 8 ~

bivirkninger, kan der i anden fase undersøges, hvilke doseringer af præparatet, der er nødvendige

for at opnå en god effekt på sygdommen. Dette kan desuden sammenlignes med andre eksisterende

behandlingsformer. Hvis der i anden fase opnås positive resultater, kan der i tredje fase fokuseres på

sammenligning af den eksperimentelle behandling og de eksisterende behandlingsformer, samt

undersøges hvordan den eksperimentelle behandling vil kunne anvendes i kombination med andre

behandlingsformer. Herudover vil det kunne fastslås, hvor meget bedre den eksperimentelle

behandling er end de kendte behandlingsformer.

På nuværende tidspunkt udfører CytoVac prækliniske forsøg på Kræftens Bekæmpelse i

København, mens de kliniske forsøg udføres i CytoVac’s faciliteter på Scion-DTU Forskerparken.

Det er muligt at udviklingen af et præparat baseret på tumor specifikke memory T celler kan

udføres i samme faciliteter på henholdsvis Kræftens Bekæmpelse og CytoVac’s faciliteter på Scion-

DTU.

Lykkes det at udvikle et præparat, der kan hindre tilbagefald til prostatakræft, kan mulighederne for

at overføre resultaterne til andre kræftformer undersøges. Herudover kan det undersøges, om

hvorvidt der er muligt at udvikle en metode til at give patienter mange tumor specifikke memory

celler, således at vaccinen ville fungere som en præventiv vaccine, hvormed man vil kunne

forhindre at sygdommen overhovedet opstår.

KONTAKTER

Dr. Alexei Kirkin:

Immunolog og cellebiolog. Forsker i CytoVac.

Dr. Alexei Kirkin kom fra Moskva i 1992, hvor han var leder af immunologiafdelingen ved

universitetet i Moskva.

Dr. Karine Djandzhougazian:

Proteinkemiker og biokemiker. Forsker i CytoVac.

Dr. Karine Djandzhougazian arbejdede i Moskva som seniorforsker ved Institut for Bioorganisk

Kemi, Det Naturvidenskabelige Akademi. Dr. Karine Djandzhougazian kom til Danmark i 1992 og

begyndte at arbejde på Panum Instituttet som gæsteprofessor ved Protein-laboratoriet.



~ 9 ~

Brit Hovgaard Jensen:

Forskerspirer koordinator på Herlufsholm Skole. Lektor i samfundsfag og dansk.

LITTERATURLISTE

Bøger, blade og plakater:

- Bruun-Jensen, Kjeld: Anatomi og fysiologi 2, Forlaget Pons, 2. udgave, 3. oplag, 2007 (bog).

- CytoVac: CytoVac, Prospekt for kapitaludvidelse i CytoVac A/S, CytoVac, 2010 (blad).

- Dong, Chen og Martinez, Gustavo J.: “T cells: the usual subsets”, 2010, Nature Publishing

Group (plakat).

Artikler:

- Kalinski, P. m.fl.: ”IL-12-deficient dendritic cells, generated in the presence of

prostaglandin E2, promote type 2 cytokine production in maturing human naive T helper

cells”, 1997, J. Immunol. 159:28

- A. Klebanoff, Christopher m.fl.: “Central memory self/ tumor-reactive CD8+ T cells confer

superior antitumor immunity compared with effector memory T cells”,

http://www.pnas.org/content/102/27/9571.full, 2005, vol. 102, Nr. 27, side 9571

- J. Obar, Joshua og Lefrançois, Leo: “Memory CD8+ T cell differentiation”, Annals of the

New York Academy Sciences, 2010, side 251-252

- Sallusto, F., Geginat, J. og Lanzaveccia, A.: “Central memory and effector memory T cell

subsets: Function, generation and maintenance”, 2004, Annu. Rev. Immunol. 22:745

- Yang, Shicheng m.fl.: „A Simplified Method for the Clinical-scale Generation of Central

Memory-like CD8+ T Cells After Transduction With Lentiviral Vectors Encoding Antitumor

Antigen T-cell Receptors”, http://www.immunotherapy-journal.com, 2010, vol. 33, Nr. 6,

side 648-649

Internetsider:

ULR 1 http://www.kennmadsen.dk/immunologi.htm

ULR 2 http://www.axis-shield-density-gradient-

media.com/Biological%20Separations%20Lymphoprep.pdf

ULR 3 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_929_1129_CD44_MicroBeads.aspx

http://www.pnas.org/content/102/27/9571.full

http://www.immunotherapy-journal.com/

http://www.kennmadsen.dk/immunologi.htm

http://www.axis-shield-density-gradient-media.com/Biological%20Separations%20Lymphoprep.pdf

http://www.axis-shield-density-gradient-media.com/Biological%20Separations%20Lymphoprep.pdf

http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_929_1129_CD44_MicroBeads.aspx



~ 10 ~

ULR 4 http://protocolsonline.com/featured-articles/phosphate-buffered-saline-pbs/

ULR 5 http://products.invitrogen.com/ivgn/product/0870112DK?CID=AFLBC-Invitrogen-

0870112DK

ULR 6 http://humrep.oxfordjournals.org/content/11/7/1487.full.pdf+html

http://www.denstoredanske.dk/Natur_og_milj%C3%B8/Biokemi_og_molekyl%C3

%A6rbiolo

Forsidebilleder:

- http://www.google.dk/imgres?q=kanyler+og+spr%C3%B8jter&hl=da&gbv=2&tbm=isch&t

bnid=W7mskHBTL_SpjM:&imgrefurl=http://www.danplejeonemed.dk/index.aspx%3Ftype

%3DProductCollection%26pc%3D38488&docid=AH9P4R4UxmXYM&w=230&h=281&ei

=U0N7TqXtMoKQ4gST4_yqDQ&zoom=1&biw=1366&bih=425&iact=rc&dur=115&page

=1&tbnh=109&tbnw=91&start=0&ndsp=18&ved=1t:429,r:1,s:0&tx=51&ty=66

- http://www.google.dk/imgres?q=immunforsvaret&hl=da&gbv=2&tbm=isch&tbnid=M-

MB4yQygTWWBM:&imgrefurl=http://fordyb-

dig.weebly.com/immunforsvar.html&docid=dky_G6u4_uWdCM&w=359&h=237&ei=Wjx

7Tsy2AuL74QTUwJn7Dw&zoom=1&biw=1366&bih=425&iact=rc&dur=120&page=3&tb

nh=77&tbnw=116&start=44&ndsp=20&ved=1t:429,r:10,s:44&tx=59&ty=42

- http://www.google.dk/imgres?q=blodceller&hl=da&gbv=2&tbm=isch&tbnid=RjfzH-

AONv5i2M:&imgrefurl=http://sverigesradio.se/sida/artikel.aspx%3Fprogramid%3D2195%

26artikel%3D3963354&docid=d54W8FfCBEUz6M&w=209&h=251&ei=FEV7TsPqN4b64

QTghLnkDw&zoom=1&iact=rc&dur=408&page=2&tbnh=98&tbnw=82&start=18&ndsp=

21&ved=1t:429,r:15,s:18&tx=42&ty=75&biw=1366&bih=425

http://protocolsonline.com/featured-articles/phosphate-buffered-saline-pbs/

http://products.invitrogen.com/ivgn/product/0870112DK?CID=AFLBC-Invitrogen-0870112DK

http://products.invitrogen.com/ivgn/product/0870112DK?CID=AFLBC-Invitrogen-0870112DK

http://humrep.oxfordjournals.org/content/11/7/1487.full.pdf+html

http://www.denstoredanske.dk/Natur_og_milj%C3%B8/Biokemi_og_molekyl%C3%09%A6rbiolo

http://www.denstoredanske.dk/Natur_og_milj%C3%B8/Biokemi_og_molekyl%C3%09%A6rbiolo

http://www.google.dk/imgres?q=kanyler+og+spr%C3%B8jter&hl=da&gbv=2&tbm=isch&tbnid=W7mskHBTL_SpjM:&imgrefurl=http://www.danplejeonemed.dk/index.aspx%3Ftype%3DProductCollection%26pc%3D38488&docid=AH9P4R4UxmXYM&w=230&h=281&ei=U0N7TqXtMoKQ4gST4_yqDQ&zoom=1&biw=1366&bih=425&iact=rc&dur=115&page=1&tbnh=109&tbnw=91&start=0&ndsp=18&ved=1t:429,r:1,s:0&tx=51&ty=66





http://www.google.dk/imgres?q=immunforsvaret&hl=da&gbv=2&tbm=isch&tbnid=M-MB4yQygTWWBM:&imgrefurl=http://fordyb-dig.weebly.com/immunforsvar.html&docid=dky_G6u4_uWdCM&w=359&h=237&ei=Wjx7Tsy2AuL74QTUwJn7Dw&zoom=1&biw=1366&bih=425&iact=rc&dur=120&page=3&tbnh=77&tbnw=116&start=44&ndsp=20&ved=1t:429,r:10,s:44&tx=59&ty=42





http://www.google.dk/imgres?q=blodceller&hl=da&gbv=2&tbm=isch&tbnid=RjfzH-AONv5i2M:&imgrefurl=http://sverigesradio.se/sida/artikel.aspx%3Fprogramid%3D2195%26artikel%3D3963354&docid=d54W8FfCBEUz6M&w=209&h=251&ei=FEV7TsPqN4b64QTghLnkDw&zoom=1&iact=rc&dur=408&page=2&tbnh=98&tbnw=82&start=18&ndsp=21&ved=1t:429,r:15,s:18&tx=42&ty=75&biw=1366&bih=425







~ 11 ~

BILAG

Bilag 1: Udskillelse af mononucleære celler fra humant blod

INTRODUKTION TIL FORSØGET

Formålet med dette forsøg er at isolere samt tælle PBMC fra to forskellige bloddonationer. Desuden

vil der i forsøget blive lavet to frysemedier til de isolerede PBMC fra hver af bloddonationerne,

således at disse kan holdes i live og opbevares i længere perioder i -80 °C. Isoleringsprocessen vil

udføres ved hjælp af forskellige centrifugeringsteknikker, og de isolerede PBMC vil blive talt i en

tællemaskine. Forsøget udføres med henblik på senere at kunne isolere tumor specifikke memory T

celler.

De to bloddonationer, der vil blive anvendt i forsøget, er to forskellige blodtyper. Bloddonation 1 er

af blodtypen AB positiv, og bloddonation 2 er af blodtypen B positiv. Arbejdet med de to

bloddonationer vil udføres som to sideløbende forsøg.

Forsøget udføres i en sterilbænk for at hindre bakteriers indtrængen. Desuden skal laboranten

anvende kittel og handsker under hele forsøget samt løbende desinficere sine hænder. De to

bloddonationer må på intet tidspunkt komme i kontakt med hinanden. Derfor desinficeres

arbejdsredskaberne løbende, og pipetter skiftets ud, efter de har været anvendt én gang.

ANVENDTE MATERIALER

Materialer og laborantens hænder vil blive desinficeret med 70 % hospitalssprit (ethanol).

Laboranten skal anvende kittel samt handsker, der løbende bør udskiftes.

Til forsøget anvendes en saks til at klippe hul på slangerne på bloddonationerne, en 100 mL

plasticflaske med skruelåg indeholdende DPBS14

, BD Falcon filtre, LymphoprepTM

, 50 mL rør med

skruelåg, stativer til at holde rørene lodret stående og PBS15

EDTA pH 7,5 der forinden forsøget er

blevet opbevaret ved 4 °C. Henholdsvis 5 mL pipetter og 25 mL pipetter anvendes til overførsler og

frasorteringer af væsker. Pipetterne er sat på en 4 Gilson BIO pipetting AID, der fylder og tømmer

pipetterne. Herudover anvendes en centrifuge, hvor hastighed, temperatur, tid og opbremsningskraft

kan justeres.

Når cellernes skal tælles anvendes tælleglas, en tællemaskine samt microtubes. I frysemediet indgår

bl.a. AIM V16

og DMSO17

. Når de isolerede celler skal fryses, opbevares de i en fryseboks og fryses

i en fryser med en temperatur på -80 °C. Antallet af anvendte rør samt mængden af anvendte

væsker osv. fremgår nærmere af forsøgsbeskrivelsen.

I forsøgets 2. fase (”Videre arbejde med forsøget – Deling af monocytter og lymfocytter”) vil

yderligere anvendes et M5-medie samt eppendorfrør.

14

DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline) anvendes som fortyndingsmiddel. 15

PBS (Phosphate Buffered Saline). Det anvendte PBS er forud for forsøget blevet opbevaret I 4° C (ULR 4) 16

AIM V (AIM5): AIM V består af forskellige proteiner, som fungerer som føde for cellerne (ULR 5). 17

DMSO (Dimethylsulfoxide): Dette gør det muligt for cellerne at overleve i -80 °C (ULR6).



~ 12 ~

FORSØGETS UDFØRSEL

1. Del: Filtrering samt fortynding af blodet

Bloddonation 1 filtreres langsomt gennem et BD Falcon filter ned i en 100

mL flaske indeholdende 50 mL DPBS. Blodklumper og fibrinogen vil

således blive adskilt fra blodet, og blodet fortyndes i DPBS. Samme

procedure udføres med bloddonation 2.

Billede 1: Efter filtreringen ses fibrinogen værende tilbage i BD Falcon filteret.

56 mL LymphoprepTM

fordeles ligeligt i fire rør. Med en 25 mL pipette

overføres 30 mL fortyndet blod fra bloddonation 1 til hvert af de fire rør.

Overførslen skal ske langsomt samt for lavt tryk, således at blodet ikke

blandes med LymphoprepTM

, men lægger sig som et lag ovenpå. Inden

overførslen skal cellerne være grundigt fordelt i DPBS blandingen.

Rørene sættes i et stativ med låg på. Samme procedure udføres med

bloddonation 2.

Billede 2: Pipetten med det fortyndede blod holdes så vinkelret på røret som muligt for at mindske trykket.

2. Del: Centrifugering 1 med henblik på adskillelse af plasma, thrombocytter og øvrige

celler

De fire rør indeholdende LymphoprepTM

og fortyndet blod fra bloddonation 1 placeres forsigtigt i

centrifugen overfor de fire rør indeholdende LymphoprepTM

og fortyndet blod fra bloddonation 2.

Centrifugen indstilles til en hastighed, så prøverne kommer under et tryk på 200g i 20 min samt til

stuetemperatur (20 °C). Centrifugen indstilles desuden til at bremse langsomt op, for at undgå at

væskelagene blandes sammen. Centrifugens hastighed er indstillet så den ønskede opdeling af

væskerne, der har forskellig densitet, opnås.

Efter centrifugeringen vil væsken være delt i tre lag. Nederst er

thrombocytterne, midterst er de mononucleære celler, og øverst er

plasmaet. Plasmaet fjernes forsigtigt fra rørene med en 25 mL pipette. 50

mL plasma gemmes i et rør og opbevares i 4 °C. Denne procedure udføres

for én bloddonation af gangen.

Billede 3: Tredelingen af LymphoprepTM

og det fortyndede blod fra bloddonation 1 efter

centrifugeringen.

3. Del: Centrifugering 2 med henblik på, at opnå en klarere adskillelse af thrombocytter

og de øvrige celler

De i alt otte rør (fire indeholdende PBMC fra bloddonation 1 og fire indeholdende PBMC fra

bloddonation 2), hvorfra plasmaet er fjernet, placeres overfor hinanden i centrifugen. Centrifugen

indstilles til en hastighed der vil give 450g i 20 min samt til stuetemperatur. Efter centrifugeringen

vil væsken i hvert rør være opdelt i tre lag, hvor det øverste lag af plasma vil være betydeligt

mindre, end det var efter centrifugeringen i forsøgets 2. del.

1

2

3



~ 13 ~

4. Del: Cellerne vaskes i PBS

Fra de fire rør indeholdende PBMC fra bloddonation 1 adskilles det midterste lag, indeholdende

PBMC, fra thrombocytterne og plasmaet ved brug af en 25 mL pipette. Der suges med pipetten fra

skillelinjen mellem de to øverste lag. Væsken overføres forsigtigt til to rør, der hver indeholder 50

mL PBS, hvor den fordeles ligeligt. De resterende thrombocytter smides ud. Det har ingen

betydning, at noget af plasmaet bliver ført med PBMC over i rørene med PBS, da plasmaet vil blive

skilt fra PBMC senere i forsøget. Samme procedure udføres med bloddonation 2.

5. Del: Centrifugering med henblik på at adskille celler og supernatant

De to rør indeholdende PBS samt PBMC og plasma fra bloddonation 1 placeres overfor de to rør

indeholdende PBS samt PBMC og plasma fra bloddonation 2. Centrifugen indstilles til en

hastighed, så prøverne kommer under et tryk på 300g i 12 min samt til en temperatur på 4 °C.

Efter centrifugeringen, vil der i hvert af de fire rør være to væskelag, hvor

det nederste lag er PBMC, og det øverste lag er supernatanten.

Supernatanten fjernes forsigtigt med en 25 mL pipette og smides ud. To

nye rør med 50 mL PBS findes frem. PBMC fra bloddonation 1 overføres

til det ene rør med PBS, og PBMC fra bloddonation 2 overføres til det

andet rør med PBS. Da cellerne kan klæbe sig til rørets sider, overføres 5-6

mL af de 50 mL PBS til rørene med PBMC for højt tryk ved brug af

pipetten, hvorefter væsken føres tilbage til røret indeholdende PBS.

Billede 4: I spidsen af røret ses de mononucleære celler. Den gule væske ovenpå er supernatanten.

6. Del: Centrifugering med henblik på at adskille celler og supernatant

Eftersom der nu arbejdes med kun to rør, indstilles centrifugen til en hastighed, så prøverne

kommer under et tryk på 200g i 12 min. samt til 4 °C. Efter centrifugeringen fjernes supernatanten

igen fra de bundfældede celler, hvorefter cellerne fra de to bloddonationer på samme vis overføres

til to nye rør med 50 mL PBS. Denne centrifugering gentages i alt tre gange.

7. Del: Optælling af cellerne

Når supernatanten efter tredje centrifugering er sorteret fra de to rør, overføres PBMC fra

henholdsvis bloddonation 1 og bloddonation 2 til hvert sit rør indeholdende 30 mL DPBS. Da

cellerne sider forholdsvist godt fast til rørenes sider, overføres 5-6 mL DPBS med pipette til røret

med PBMC for højt tryk for at løsrive PBMC. Herefter føres væsken tilbage til røret med DPBS.

Proceduren udføres for begge bloddonationer.

10 L fra hvert af de to rør med hhv. DPBS samt PBMC fra bloddonation 1 og DPBS samt PBMC

fra bloddonation 2 overføres til hver sit eppendorfrør, hvor det igen resuspenderes (eventuelle

”klumper” af celler splittes). Herefter overføres de 10 L til hvert sit tælleglas indeholdende 10 mL

DPBS. Forinden denne overførsel blandes cellerne i røret med DPBS grundigt, for at undgå at

størstedelen af cellerne er bundfældet inden overførslen. Resten af blandingerne med DPBS og

PBMC fra de to bloddonationer sættes til side og gemmes til del 8.

4

4



~ 14 ~

Tælleglassene sættes nu ind i en tællemaskine, hvor henholdsvis lymfocytter og monocytter bliver

talt.

Billede 5 og 6:De mononucleære celler i tælleglasset bliver talt i en tællemaskine.

Heraf forekom følgende data:

BLODDONATION 1 (blodtype AB +)

Lymfocytter

Monocytter

PBMC18

Nedenfor ses skitser for data for henholdsvis bloddonation 1 (til venstre) og bloddonation 2 (til

højre):

Forklaring af kurverne ovenfor: Kurverne viser koncentrationen pr. mL af monocytter og lymfocytter. Til venstre for

den stiplede, lodrette akse ses koncentrationen pr. mL af lymfocytter. Til højre for den stiplede, lodrette akse ses

koncentrationen pr. mL af monocytter.

18

PBMC (Peripheral Blood Mononuclear Cells).

BLODDONATION 2 (blodtype B +)

Lymfocytter

Monocytter

PBMC

5 6



~ 15 ~

8. Del: Udvikling af frysemedie til de isolerede celler

For at det udskilte PBMC fra de to bloddonationer kan opbevares i længere perioder, laves et

frysemedie, hvori PBMC skal kunne opbevares ved -80 °C. Der laves to separate frysemedier til de

to ”portioner” PBMC fra hver af de to bloddonationer. I det følgende beskrives fremstillingen af

frysemediet til de mononucleære celler fra bloddonation 1. Samme procedure udføres for

udviklingen af et frysemedie til PBMC fra bloddonation 2.

De 50 mL plasma fra bloddonation 1, der i forsøgets 2. del blev adskilt fra thrombocytterne og

PBMC og som efterfølgende blev opbevaret i 4° C, findes frem. 2,7 mL af plasmaet overføres til et

nyt, rent rør, eftersom noget af plasmaet kan være klumpet sammen. Kun det rene serum (pHUS19

)

overføres til det nye rør, da det kun er dette, der skal bruges til frysemediet. Efterfølgende tilsættes

2,7 mL AIM V med en 5 mL pipette samt 600 L DMSO til røret indeholdende pHUS med en

1000 L pipette.

Blandingerne af DPBS og PBMC fra de to bloddonationer, der ikke blev overført til tælleglas i del

7, centrifugeres endnu engang med en hastighed så prøverne kommer under et tryk på 200g i 12

min. med en temperatur på 4 °C.

Efter centrifugeringen skilles supernatanten fra PBMC fra bloddonation 1, hvorefter 5 mL af

frysemediet tilsættes røret med PBMC. Frysemediet og cellerne blandes grundigt, hvorefter

blandingen fordeles i fem microtubes (1 mL af frysemediet med de mononucleære celler fra

bloddonation 1 pr. microtube). De fem microtubes sættes i en fryseboks indeholdende isopropanol

væske (C3H8O)20

. Fryseboksen kan nu opbevares i en fryser, med en temperatur på -80 °C.

19

pHUS (phosphate Human Serum): Medvirker til at der i frysemediet er et miljø, der minder om det cellerne lever i i kroppen. 20

C3H8O får cellerne til at fryse langsomt, når de skal fryses til -80 °C.



~ 16 ~

Bilag 2: Videre arbejde med forsøget i bilag 1: Deling af monocytter og lymfocytter (udført 2

uger senere)

I det følgende vil det videre arbejde med forsøget i bilag 1 beskrives. Her lægges fokus på

adskillelse af monocytter og lymfocytter i nedfrosset PBMC. Forsøget er udfør med PBMC fra

bloddonation 11531 og 11541.

1. Del: Optøning af PBMC

Et vandbad med en temperatur på 38,5° C gøres klar. PBMC fra

bloddonation 11531 og PBMC fra bloddonation 11541 hentes fra fryseren

og rystes nede i vandbadet i 1,5-2 minutter (den tid det ca. vil tage for

PBMC at tø). Eftersom der indgår DMSO i det frysemedie, som PBMC

befinder sig i, overføres det optøede PBMC fra hver donation til hver sit

25 mL rør, hvor det blandes med 9 mL M5-medie. M5-mediet fortynder PBMC, således at cellerne

ikke dør pga. det DMSO, som indgår i frysemediet. Ved overførslen af PBMC til 25 mL røret med

M5-mediet, suges noget af M5-mediet langsomt op i pipetten hvor PBMC befinder sig. Dette er

nødvendigt, da PBMC skal vænne sig til det nye miljø. Føres PBMC direkte ned i røret med M5-

mediet, risikeres det, at PBMC dør af chok.

Billede 7: De to microtubes med PBMC røres rundt i vandbadet for at tø.

2. Del: Optælling af PBMC (1. absorption)

To tælleglas fyldes med hver 10 mL DPBS. De to 25 mL rør med PBMC og M5-medie

resuspenderes i røret, hvorefter 100 µL fra hver donation overføres til hver sit eppendorfrør, hvor

det igen resuspenderes. Herefter overføres de to gange 100 µL til hver sit tælleglas med 10 mL

DPBS.

PBMC skal nu tælles i tællemaskinen.


BLODDONATION 11541

Lymfocytter

Monocytter

PBMC

BLODDONATION 11531

Lymfocytter

Monocytter

PBMC

7



~ 17 ~

Nedenfor ses skitser for data for henholdsvis bloddonation 11531 (til venstre) og bloddonation

11541 (til højre):

Forklaring af kurverne ovenfor: Kurverne viser koncentrationen pr. mL af monocytter og lymfocytter. Til venstre for

den stiplede, lodrette akse ses koncentrationen pr. mL af lymfocytter. Til højre for den stiplede, lodrette akse ses

koncentrationen pr. mL af monocytter.

3. Del: 1. Centrifugering med henblik på at adskille PBMC og supernatant samt vask af

PBMC i PBS

De to 25 mL rør hvorfra der i del 2 blev taget 100 µL centrifugeres i 7 min. for 20° C med en

hastighed, så prøverne kommer under et tryk på 300 g.

Efter centrifugeringen skilles supernatanten i de to rør fra bundfaldet (PBMC). Det DMSO, der

måtte være tilbage blandt cellerne, vaskes nu væk med PBS. Omkring 13 mL PBS overføres til

hvert af de to rør med det bundfældede PBMC, og blandingen resuspenderes.

4. Del: 2. Centrifugering med henblik på at adskille PBMC og supernatant, samt adskille

monocytter og lymfocytter

De to blandinger af PBS og PBMC centrifugeres i 7 min. for 20° C med en hastighed, så prøverne

kommer under et tryk på 300 g. Efter centrifugeringen skilles supernatanten i de to rør fra

bundfaldet (PBMC).

Omkring 5 mL M5-medie overføres til hvert af de to rør med de bundfældede celler, og der

resuspenderes. Blandingerne overføres efterfølgende til hver sin celle-kultur-flaske, som opbevares

i 37° C i ½ time. Monocytterne har den egenskab, at de vil klistre til flaskens sider, mens

lymfocytterne stadig vil flyde rundt i væskeblandingen.

5. Optælling af lymfocytter (2. absorption)

Celle-kultur-flaskerne findes frem efter ½ times opbevaring ved 37° C. Lymfocytterne skilles fra

monocytterne, ved at væsken suges op fra røret (monocytterne vil sidde tilbage, klistret til flaskens

sider). Lymfocytterne fra de to celle-kultur-flasker overføres til hver sit 25 mL rør. Efterfølgende



~ 18 ~

overføres 100 µL af lymfocytterne fra de to rør til hver sit eppendorfrør, hvor der resuspenderes.

Derefter overføres de 100 µL lymfocytterne fra de to rør til hvert sit tælleglas indeholdende 10 mL

DPBS, og lymfocytterne tælles i en tællemaskine. Heraf forekom følgende data:

Nedenfor ses skitser for data for henholdsvis bloddonation 11531 (til venstre) og bloddonation

11541 (til højre):

Forklaring af kurverne ovenfor: Eftersom monocytter nu er fraskilt, ses kun koncentrationen pr. mL af lymfocytter.

BLODDONATION 11531

Lymfocytter

BLODDONATION 11541

Lymfocytter



~ 19 ~

Bilag 3: Cytotoxic test

INTRODUKTION TIL FORSØGET

Formålet med dette forsøg er at undersøge, hvorledes aktiverede lymfocytter angriber og nedbryder

tumorceller. I dette forsøg arbejdes der med isolerede, aktiverede lymfocytter fra fire forskellige

donorer: Donor 89, donor 90, donor 91 og donor 92. De aktiverede lymfocytter er forinden forsøget

blevet opbevaret i 37° C i hver sin flaske.

Forud for forsøget er tumorceller (celler fra en cellelinje isoleret fra en brystkræft patient) fordelt i

24 brønde.

Forsøget udføres i en sterilbænk for at hindre bakteriers indtrængen. Desuden skal laboranten

anvende kittel og handsker under hele forsøget samt løbende desinficere sine hænder. De fire

bloddonationer må på intet tidspunkt komme i kontakt med hinanden. Derfor desinficeres

arbejdsredskaberne løbende, og pipetter skiftets ud efter at have været anvendt én gang.

ANVENDTE MATERIALER

Materialer og laborantens hænder vil blive desinficeret med 70 % hospitalssprit (ethanol).

Laboranten skal anvende kittel samt handsker, der løbende bør udskiftes.

Henholdsvis 5 mL pipetter og 25 mL pipetter anvendes til overførsler og frasorteringer af væsker.

Pipetterne er sat på en 4 Gilson BIO pipetting AID, således at pipetterne kan fyldes og tømmes

automatisk. Desuden anvende henholdsvis 25 mL og 50mL rør, eppendorfrør, M5-medie, DPBS og

24 brønde med isolerede brystkræft tumorceller, der forinden forsøget er blevet opbevaret i 37° C.

Herudover anvendes en centrifuge, hvor hastighed, temperatur, tid og opbremsningskraft kan

justeres. Når cellernes skal tælles, anvendes tælleglas samt en tællemaskine.

FORSØGETS UDFØRSEL

1. Del: Optælling af de aktiverede lymfocytter fra de fire donationer

De fire flasker med aktiverede lymfocytter findes frem. Hver flaske rystes forsigtigt, da nogle af

cellerne kan have samlet sig i ”klumper”. Fra hver flaske overføres 20 mL aktiverede lymfocytter til

fire 50 mL rør. Efter denne overførsel skal de resterende aktiverede lymfocytter i dunkene tilbage til

opbevaring i 37° C.

10 mL DPBS overføres til fire tælleglas (10 mL i hvert tælleglas), og der sættes låg på disse. De

aktiverede lymfocytter i 50 mL rørene resuspenderes, og 100 µL af hver af de fire 50 mL rør

overføres til hvert sit eppendorfrør, hvor der igen suspenderes (for at forhindre at cellerne klumper

sammen). De aktiverede lymfocytter i eppendorfrørene overføres nu til hvert sit tælleglas

indeholdende 10 mL DPBS.



~ 20 ~

De fire tælleglas indeholdende aktiverede lymfocytter og DPBS sættes på skift i tællemaskinen.


Nedenfor ses skitser af data fra henholdsvis bloddonation 89 (til venstre) og bloddonation 90 (til

højre)

Forklaring af kurverne ovenfor: Koncentrationen af de aktiverede lymfocytter ses til venstre for den stiplede, lodrette

akse.

Nedenfor ses skitser af data fra henholdsvis bloddonation 91 (til venstre og bloddonation 92 til

højre)

Forklaring af kurverne ovenfor: Koncentrationen pr. mL af de aktiverede lymfocytter ses til venstre for den stiplede,

lodrette akse.

BLODDONATION 89

Lymfocytter

BLODDONATION 90

Lymfocytter

BLODDONATION 91

Lymfocytter

BLODDONATION 92

Lymfocytter



~ 21 ~

2. Del: Centrifugering med henblik på at adskille de aktiverede lymfocytter og

supernatanten

De aktiverede lymfocytter i de fire 50 mL rør resuspenderes. Der

ønskes at anvende i alt 2 mio. aktiverede lymfocytter fra hver

bloddonation i det videre forsøg. Derfor overføres følgende

voluminer fra hver bloddonation til hvert sit 25 mL rør:

Billede 8: De aktiverede lymfocytter fra de fire bloddonationer er her overført til 25 mL rør.

De fire 25 mL rør indeholdende aktiverede lymfocytter af

ovenstående voluminer centrifugeres i 7 min. for 20° C med en

hastighed, så prøverne kommer under et tryk på 300 g.

Billede 9: Centrifugen med de fire 25 mL rør indeholdende aktiverede

lymfocytter fra fire forskellige bloddonationer.

3. Del: Fordeling af aktiverede lymfocytter i brønde med brystkræft tumor-celler

Efter centrifugeringen hældes supernatanten fra de bundfældede

aktiverede lymfocytter, og 4 mL M5-medie tilsættes hvert rør med

bundfældede celler, og der resuspenderes. De 24 brønde

indeholdende brystkræft tumorceller findes frem fra opbevaringen

ved 37° C, og fra 16 af brøndene sorteres 1 mL af tumorcellerne fra,

således at der er plads til de aktiverede lymfocytter.

Billede 10: 24 brønde med brystkraft tumor celler.

Ikke alle 24 brønde skal tilføres aktiverede lymfocytter. På billede 10

ses to blå streger tegnet på æsken med de 24 brønde. Mellem de to blå

streger ses de 16 brønde, der skal have tilført hver 1 mL aktiverede

lymfocytter. Til hver vandrette række tilføres aktiverede lymfocytter

fra én af de fire bloddonationer, således at hver bloddonation har sin

række. Brøndene uden for de blå streger vil være rene brystkræft

tumorceller til sammenligning.

Billede 11: 1 mL aktiverede lymfocytter tilsættes hver brønd.

Bloddonation nr. Volumen/ mL

89 2

90 1,31

91 2,6

92 5,4

8

9

10

0

11



~ 22 ~

Så snart de aktiverede lymfocytter er tilsat brøndene med brystkræft tumorceller, sættes æsken med

brønde til opbevaring i 37° C, hvor de står i 2 timer. I de to timer retter de aktiverede lymfocytter

sig imod tumor cellerne, hvilket efter de to timer vil kunne ses i mikroskop.

4. Del: Aktiverede lymfocytter angriber tumor celler

Efter to timer findes brøndene med henholdsvis tumorceller og aktiverede lymfocytter frem. Låget

tages af æsken, og æsken med brøndene sættes under et mikroskop. I mikroskopet vil det kunne ses,

hvordan de aktiverede lymfocytter angriber tumorcellerne fra flere sider og ”rusker” i dem (slår

dem ihjel). På billede 12 ses tumorceller, hvor der ikke er tilført aktiverede lymfocytter. Disse kan i

løbet af få timer opformere og sprede sig. På billede 13 ses tumorceller, hvor der er tilsat aktiverede

lymfocytter. Tumorcellerne kan være svære at se, men ”klumperne” af lyse pletter er aktiverede

lymfocytter, der angriber tumorceller. Tumorcellerne befinder sig altså et sted bag klumperne. På

tidspunktet, hvor billederne er taget (ca. to timer efter tilsætningen af aktiverede lymfocytter), er

nogle af tumorcellerne formentlig allerede blevet dræbt.

12 13

projekt forskerspirer 2011 · julie lolk wolff-sneedorff projekt forskerspirer 2011 herlufsholm...

Documents