PROTEASEProtease có một ứng dụng nhỏ trong quy trình sản xuất rượu vang. vai trò của protease là phân giải protein để tránh hiện tượng protein kết tủa gây lắng cặn trong sản xuất rượu vang.

Protease phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật. Tuy nhiên, nguồn enzyme phong phú nhất là nguồn từ vi sinh vật, có hầu hết ở các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn,… Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghiệp và đời sống.Nhóm enzyme protease xúc tác quá trình thủy phân liên kết peptid ( -CO-NH)n trong phân tử protein, polypeptid đến sản phẩm cuối cùng là các acid amin. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thủy phân liên kết este và vận chuyển acid amin. 

1.1. Các enzyme thủy phân protein

          Protease thuộc enzyme nhóm 3 (enzyme phân giải) và

phân nhóm 3.4 (phân cắt các liên kết peptide). Dựa vào vị trí

cắt đứt liên kết trong chuỗi liên kết peptide, người ta chia

protease làm 2 nhóm: Endopeptidase và Exopeptidase

[67]. Protease xúc tác cho sự thủy phân liên kết peptide (-

CO-NH2-) trong phân tử protein và cơ chất tương tự. Nhiều

protease cũng có khả năng thủy phân liên kết este và vận

chuyển axit amin [3].

1.1.1. Exopeptidase

  Exopeptidase chỉ tác dụng ở gần điểm kết thúc của

chuỗi polypeptide, tại đầu N hoặc đầu C. Dựa vào vị trí tác

động trên mạch polypeptide, exopeptidase đươc phân chia

thành hai loại:

            a/ Aminopeptidase xúc tác thủy phân liên kết

peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra

một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide. Trong

quá trnh aminopeptidase xúc tác thủy phân liên kết peptide,

nếu giải phóng một amino acid gọi là aminopeptidase, giải

phóng một dipeptide đươc gọi là dipeptidyl-peptidase và giải

phóng một tripeptide đươc gọi là tripeptidyl-peptidase.

          b/ Carboxypeptidase xúc tác thủy phân liên kết

peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một

amino acid hoặc một dipeptide. Trong quá trnh exopeptidase

tác dụng tại đầu C, nếu giải phóng một amino acid gọi là

cacboxyl-peptidase hoặc giải phóng một dipeptide gọi là

peptidyl-dipeptidase.

1.1.2. Endopeptidase

          Endopeptidase tác động ở vùng bên trong của chuỗi

liên kết peptide, cách xa 2 đầu C và N. Dựa vào cơ chế tác

động của endopeptidase, người ta chia chúng thành 4 nhóm:

serine protease, cysteine protease, aspartic protease và

metallo protease.

          a/ Serine protease (EC.3.4.21) là nhóm peptidase

lớn nhất và đươc phát hiện ở mọi giới sinh vật như

eukaryote, prokaryote, archaea và virus. Những enzyme này

đều có chung một cơ chế xúc tác phản ứng thủy phân thông

qua hai bước chính [25]:

   Bước 1, acyl hóa: hZ nh thành liên kết cộng hóa trị

giữa nhóm -OH của serine với nguyên tử các bon trong nhóm

cacboxyl của phân tử cơ chất nhờ có hỗ trơ của nhóm

imidazole từ histidine. Kết quả phản ứng này là tạo ra một

hơp chất trung gian và một ion imidazolium (phản ứng cộng).

Hơp chất trung gian không bền này nhanh chóng bị thủy

phân thành một acyl-enzyme, vng imidazole và một amin

(phản ứng khử).

   Bước 2, khử acyl hóa: phức hệ acyl - enzyme bị thủy

phân bởi phân tử H2O theo chiều ngươc lại của bước một.

Trong đó, nhóm imidazole chuyển proton của gốc -OH từ

serine cho nhúm amin để tái sinh lại enzyme.

          Serine protease có 1 serine ở trung tâm hoạt động,

nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và

subtilisin. Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động

vật như chymotrypsin, trypsin, elastase. Nhóm subtilisin bao

gồm hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisin Carlsberg,

subtilisin BPN.

          Serine protease có mặt trong rất nhiều loài

của Aspergillus và Bacillus. Các enzyme này bị ức chế bởi

Phenylmethylsulgonyl fluorid (PMSF) hoặc diisopropyl

fluorophosphat (DFP). Phần lớn enzyme này hoạt động tối

thích trong khoảng pH từ 7 – 11 và có trọng lương phân tử

khoảng 20.000 – 35.000 dalton.

          b/ Cysteine protease (EC.3.4.22) có 1 cysteine ở

trung tâm hoạt động. Cysteine protease bao gồm các

protease thực vật như papayin, bromelin, một vài protease

động vật và kư sinh trùng và ít thấy ở nấm. Phần lớn các

enzyme này hoạt động tối thích ở pH từ 5 – 8, có tính đặc

hiệu cơ chất rộng. Chúng mẫn cảm với các chất chứa

sulphydryl như là P-chloromercuri benzoate.

          c/ Aspartic protease (EC.3.4.23) có 2 axit aspartic ở

trung tâm hoạt động, là enzyme quan trọng thứ 2 trong số

các protease công nghiệp sau serine protease. Chúng chủ

yếu là các protease axit với một axit aspartic đươc coi như

chZ a khóa phân giải trong vùng tác động. Enzyme này hoạt

động tốt nhất ở khoảng pH từ 3 – 4, với trọng lương phân tử

từ 30.000 – 45.000 dalton. Aspartic protease rất phổ biến ở

nấm và không ổn định ở pH 7,0.

          d/ Metallo protease (EC.3.4.24) sử dụng ion kim loại

trong trung tâm hoạt động, enzyme này hoạt động tốt nhất ở

pH 5 – 9, mẫn cảm với các EDTA nhưng không bị ảnh hưởng

bởi các chất ức chế của serine protease hoặc thuốc thử

sulphydryl. Kẽm, Coban hoặc Canxi, Mangan hoạt hóa trở lại

khi bị EDTA làm bất hoạt [85]. Phần lớn các metallo protease

là enzyme có chứa Kẽm, cấu trúc phân tử protein luôn ổn định

bởi sự có mặt của Canxi. Đáng chú ư ở các enzyme này là

phần lớn ưa nhiệt và rất phổ biến ở Bacillus

thermoproteolyticus[58].

Endopeptidase là một trong những thành phần quan

trọng nhất của nhóm enzyme công nghiệp, chiếm khoảng

60% tổng số enzyme đă đươc sử dụng rộng răi [61], [28],

[34]. Trong số các loại protease từ vi sinh vật, protease vi

khuẩn là đáng kể nhất. Trong số các vi khuẩn thZ  Bacillus là

sinh vật đặc trưng sinh protease ngoại bào. Protease có một

số đặc điểm rất lư tưởng đối với công nghệ sinh học, vq vậy

chúng trở thành một trong những enzyme quan trọng nhất

trong sản xuất công nghiệp. Những protease này đươc ứng

dụng rộng răi trong các nghành công nghiệp như dươc phẩm,

thuộc da, tẩy rửa, thực phẩm và công nghiệp xử lư rác thải

[82].

1.2. Protease từ vi sinh vật

          Protease đươc tZm thấy ở nhiều nhóm vi sinh vật như

động vật nguyên sinh, vi khuẩn, nấm mốc, nấm men và

virus. Động vật 8%, thực vật 4%, nấm mốc và nấm men

50%, vi khuẩn 30%. Protein bị phân giải bởi nhiều vi sinh vật.

Những vi sinh vật này sử dụng cơ chất protein làm nguồn

cung cấp nitơ, các bon và năng lương cho sinh trưởng và

phát triển. Sự phân giải protein đươc bắt đầu bởi protease

đươc tiết ra từ vi sinh vật tiếp sau đó là peptidase ở bên

trong hay bên ngoài tế bào. Số lương và thành phần

protease đươc tiết ra từ vi sinh vật phụ thuộc vào từng loài,

từng chủng vi sinh vật, thậm chí các protese khác nhau cũng

có thể đươc sinh ra từ cùng một chủng dưới các điều kiện

nuôi cấy khác nhau [17].

1.2.1. Protease từ nấm men và nấm mốc

          Nấm là nhóm có khả năng tạo ra nhiều loại protease

hơn vi khuẩn. Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hơp một

lương lớn protease đươc ứng dụng trong công nghiệp thực

phẩm, ví dụ như: Aspergillus oryzae, Aspergillus tericola,

Aspergillus fumigatus, Penicillium chryfogenum,…Đặc

biệt Aspergillus oryzae là loại nấm mốc có khả năng tổng

hơp cả 3 loại protease: protease axit, protease kiềm và

protease trung tính. Tỷ lệ cấu tử enzyme có thể thay đổi tùy

thành phần môi trường, ví dụ: Aspergillus oryzae khi nuôi

trong điều kiện bZ nh thường thZ sinh tổng hơp chủ yếu

protease kiềm, ctn khi nuôi trong môi trường giảm bớt gluxit

thZ chủ yếu tạo protease axit [3], [43]. Các loại nấm mốc

thuộc chi Rhizopus có khả năng tổng hơp chủ yếu các

protease axit có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5-3,0

[3]. Một số nấm khác như Aspergillus cadidates, Penicillium

camberti, Penicillium roqueforti,... cũng có khả năng tổng

hơp protease làm đông tụ sữa, đươc sử dụng trong làm pho

mát.

          Bên cạnh đó, nguồn enzyme trong nấm men cũng rất

phong phú và đa dạng, là đối tương đươc con người biết đến

từ rất sớm. Một số loại nấm men sinh enzyme như: Candida

albicans và Candida tropicalis là những vi sinh vật khi nhiễm

vào cơ thể vật chủ gây nhiều bệnh cơ hội khi hệ thống miễn

dịch của cơ thể vật chủ bị tổn thương, enzyme ngoại bào của

chúng (aspartic protease) đươc xem giống như yếu tố virus

[91].

1.2.2. Protease từ xạ khuẩn

          Sự tổng hơp protease của xạ khuẩn ít đươc nghiên cứu

hơn vi khuẩn và nấm mốc. Tuy nhiên người ta đă tZm đươc 1 số

chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hơp protease cao

như Streptomyces griceus, S. fradiae, S. rimosus,… [4], [13].

Các chế phẩm protease từ xạ khuẩn đươc biết nhiều là

Pronase (Nhật) đươc tách chiết từ Streptomyces grieus.

Enzyme này có đặc tính đặc hiệu rộng, có khả năng thủy

phân tới 90% liên kết peptide của nhiều protein thành

amino acid. Ở Liờn Xụ (cũ), người ta cũng tách đươc chế

phẩm tương tự từStreptomyces grieus có tên là Protelin. Ở

Mỹ, chế phẩm đươc sản xuất có tên là M-Zim dùng trong

sản xuất da. Protease từ Streptomyces fradiae cũng có hoạt

tính elastase cao, do đó chúng đươc dùng trong công

nghiệp chế biến thịt.

1.2.3. Protease từ vi khuẩn

          Serine protease là nhóm enzyme đươc dùng nhiều

nhất trong thương mại, chủ yếu là trung tính và kiềm, đươc

sinh ra từ các vi khuẩn thuộc chiBacillus, đại diện của nhóm

này là Bacillus subtilis [43]. Ngoài ra các serine protease

cũng đươc sinh ra từ cỏc nhúm vi khuẩn khác nhau

như: Thermus caldophilus, Aeromonas, Escherichia và 1 số

giống thuộc Chlostridium. Các protease trung tính hoạt động

trong giải pH hẹp (từ 5 đến 8) ít bền nhiệt, sản phẩm phân

giải của các protease này ít bị đắng hơn so với các protease

động vật do tốc độ cắt trung bZ nh, vq thế rất có giá trị trong

công nghệ thực phẩm [4]. Các protease trung tính từ vi

khuẩn có tính đặc hiệu cao với mối liên kết giữa hai axit amin

kỵ nước. Nhiệt độ tối ưu thấp rất có lơi cho việc phân giải

thức ăn. Một số metallo protease cần có các ion kim loại cho

quá trnh hoạt động. Các protease kiềm của vi khuẩn hoạt

động trong môi trường có pH cao, tính đặc hiệu cơ chất rộng,

nhiệt độ hoạt động tối ưu ở 60oC, vq thế rất thích hơp cho

công nghiệp chất tẩy rửa.

1.2.4. Protease từ virus

          Protease từ virus có vai tr quan trọng trong quá trnh

lắp ráp các thành phần của virus. Chúng có thể là serine

protease, aspartic protease, cysteine protease nhưng không

có metallo protease. Tất cả các protease của virus đều là

endoprotease. Aspartyl protease của Retrovirus tham gia

vào quá trnh lắp ráp hạt virus, tạo ra các đơn vị đồng nhất

thể hiện như tiền thân của các protein vỏ. Ngày nay người ta

nghiên cứu rất nhiều về protease của virus, cũng như các

chất ức chế hoạt động của chúng nhằm chữa các bệnh nguy

hiểm do virus gây ra như ung thư và AIDS…