proteİnlerİn denatÜre jel elektroforezİ İle ayrilmasi ve molekÜler aĞirliklarinin tayİnİ
DESCRIPTION
ÇEVRE BİYOTEKNOLOJİSİ DERSİ. PROTEİNLERİN DENATÜRE JEL ELEKTROFOREZİ İLE AYRILMASI VE MOLEKÜLER AĞIRLIKLARININ TAYİNİ. ELEKTROFOREZ. Proteinler, elektrik yükü, büyüklük, şekil gibi özelliklerine göre ayrılırlar. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
1
PROTEİNLERİN DENATÜRE JEL ELEKTROFOREZİ İLE
AYRILMASI VE MOLEKÜLER AĞIRLIKLARININ
TAYİNİ
ÇEVRE BİYOTEKNOLOJİSİ DERSİÇEVRE BİYOTEKNOLOJİSİ DERSİ
2
Proteinler, elektrik yükü,
büyüklük, şekil gibi
özelliklerine göre ayrılırlar.
Elektroforez işleminde, ortam
pH’sına göre, (+) ya da (-)
olarak yüklenen kolloid
taneciklerin, bir elektrik
alanında, kendi net yüklerine
zıt yük taşıyan anot veya
katoda doğru farklı hızlarda
sürüklenmeleri.
ELEKTROFOREZ
3
Karışım içinde bulunan protein sayısını tespit
etmek( kağıt ve jel elektroforezi)
Saflaştırılmış proteinin saflık derecesini
belirlemek
( SDS-PAGE)
Saflaştırılmış proteinin molekül ağırlığını tayin
etmek (SDS-PAGE) amacıyla kullanılır.
ELEKTROFORETİK YÖNTEMLER
4
SDS - PAGE SDS:Sodyum Dodesil Sülfat-anyonik deterjan
(-) yüklü SDS, proteinlerin kuarterner, tersiyer ve sekonder yapılarını bozar, katları açılan peptid zincir, SDS ile sarılarak misel görünümü kazanır..
Zincirde yer alan her 2 AA artığına 1 molekül SDS bağlanır ve proteinlerin hepsi (-) yüklenir
5
POLİAKRİLAMİD JELProteinlerin ayrılmasında en çok kullanılan destek matriksi olan poliakrilamid, porlu bir jel ortaya koyar. Bu jel, filtre gibi işlev görür ve küçük moleküllerin sebestçe hareketine izin verirken daha büyük makromoleküllerin geçişini kısıtlar.
Belli por büyüklüğünde bir jel hazırlayarak proteinlerin molekül büyüklüğüne göre ayırmak mümkündür.
6
Por Büyüklüğünün Belirlenmesi Poliakrilamid jelin oluşumunda, “akrilamid” monomerleri bir çapraz bağlayıcı yardımı ile kovalent olarak bağlayan uzun zincirlere polimerize olur. Yapıyı birarada tutan esas bileşen çapraz-bağlayıcı, (cross-linker) dir. En yaygın olarak kullanılan çapraz bağlayıcı, kısaca bis adı verilen “N,N’-metilen-bis akrilamid” dir. Akrilamid jelde por büyüklüğü, akrilamid ve bis içeriğini ifade eden % T ve % Cbis terimleri ile belirlenir. % T, total akrilamid %’si (w/v), % Cbis ise bis’in monomere oranı (w/w) olup aşağıdaki formüllere göre hesaplanır.
Akrilamid (g) + Bis (g)% T = x 100
Hacim (ml)
Bis (g) % Cbis = x 100
Akrilamid (g) + Bis (g)
Bu formüllere göre, % 20 T ve % 5 Cbis içeren bir jelde % 20 (akrilamid +bis) ve total akrilamidin % 5’i oranında bis bulunur. % T arttıkça por çapı küçülür.
7
Elektoroforezde Kullanılan Tampon Sistemleri
Elektroforezde göç hızı proteinin net yüküne bağlı olduğundan, hızı sabit tutabilmek için, çözeltinin pH’ını sabit tutmak gerekir. Bu nedenle elektroforezde çeşitli tampon çözeltiler kullanılır.
Elektroforezde kesiksiz ve kesikli olmak üzere 2 tampon sistemi kullanılır.
Kesiksiz sistemde tek bir ayırıcı jel vardır, tanklarda ve jelde aynı tampon kullanılır.
Kesikli sistemde ise, farklı tamponlarda hazırlanmış iki jel kullanılır.
I. Seçici olmayan, büyük porlu bir jel: Yükleme jeli (stacking jel)II. Daha selektif, küçük porlu bir jel: Ayırma jeli (seperating jel).
8
Stok ÇözeltilerMonomer
Tampon
% 10 SDS
H2O
TEMED
APS
Örnek uygulama tamponu
Tank tamponu
Boya çözeltisi
Fazla boyayı alma çözeltisi
Su ile doyurulmuş n-butanol çözeltisi
9
Jellerin Hazırlanması
10
Protein Örneklerinin Hazırlanması
11
Yükleme ve Elektroforez İşlemi
12
Jelin Analizi
Elektroforetik ayırım bittikten sonra jel, aşağıdaki
işlemlerden birisi ile analiz edilir.
Boyama (Coomassie Blue veya gümüş boyama)
Otoradyografiyi takiben densitometri
Elektroforez ile bir membrana nakletme
(elektroblotting) ve daha sonra nükleik asit
hibridizasyonu, otoradyografi, immunodeteksiyon
gibi teknikler uygulanır.
13
Jellerin Boyanması
14
Jellerin Boyanması
15
Moleküler Ağırlığı Tayini
Molekül ağırlığı bilinmeyen protein örneği, molekül ağırlığı bilinen standart
proteinlerle birlikte, aynı jel üzerinde yanyana elektroforetik olarak ayrılır.
Boyama sonrasında jelde gözlenen bantların karşılaştırılması ile proteinin
molekül ağırlığı hakkında bir fikir elde edinilebilir. Ayrıca bu tip bir ayrışımın
sonuçlarını matematiksel olarak değerlendirmek de olasıdır. Jeldeki göç hızının
bir fonksiyonu olan relatif göç hızı (Rf değeri), jelin üst kısmından bandın
bulunduğu yere kadar olan uzaklığın, jelin üst kısmından işaret boyasının
olduğu yere kadar olan uzaklığa oranıdır.
Polipeptidin molekül ağırlığının logaritması ile Rf değeri arasında doğrusal
ilişki vardır. Dolayısı ile standart polipeptidlerin Rf değerleri (ordinata) ve
molekül ağırlığının log10 değerleri (absise) yerleştirilerek bir standart grafik
hazırlanır.
Molekül ağırlığı bilinmeyen proteinin Rf değeri bulunur ve grafikte bu değere
karşılık gelen noktadan aşağıya bir dik indirilerek molekül ağırlığının
logaritmik değeri belirlenir. Bu değerin antilogaritması moleküler ağırlığını
verir.
16
A
Yükleme jeli (boyama sırasında kopabilir)
Ayırma jeli
İşaret boyasına ait bant
x (cm)A bandı için Rf =
y (cm)
X
Y
Moleküler Ağırlığı Tayini
17
Moleküler Ağırlığı TayiniStandartnümune
Sürüklenme hızı
Molekül ağ.(log)
nümuneprotein
18
Moleküler Ağırlığı Tayini
19