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Sesión básica sobre Proteinograma y reflejo clínico de algunas enfermedades en el espectro electroforético de las proteinas humanas en el suero.TRANSCRIPT
Sesiones de Residentes
Julio’11 PROTEINOGRAMA
martes 12 de julio de 2011Daniel E. PleguezueloMIR InmunologíaServicio de Inmunología Clínica
@dawelian
Introducción
características físicas:
- TAMAÑO- FORMA (3D)
- CARGA- PUNTO ISOELÉCTRICO
El Proteinograma es el resultado de la aplicación de la técnica de electroforesis a una solución con proteínas. Electroforesis es un método para separar sustancias al aplicar un campo eléctrico dependiendo de su tamaño, forma, carga y punto isoeléctrico
¿Pero cómo se mueven?
FUENTE DE ALIMENTACIÓN
INTENSIDAD CAMPO ELÉCTRICO
CARGA IÓNICAVsFRICCIÓN (TAMAÑO y VISCOSIDAD)
MOVILIDAD ELECTROFORÉTICA
VELOCIDAD
D
E
MIGRACIÓN
Las proteínas se separan en función de las características enumeradas anteriormente, y lo hacen así porque éstas definen una diferente velocidad de migración, que depende de la intensidad del campo eléctrico y de la movilidad electroforética. Esta última es directamente proporcional a la carga iónica que presente la proteína e inversamente proporcional a las fuerzas de fricción: tamaño y viscosidad.
Hardware
Para realizar la técnica se necesita un aparato que conste de un gel (medio en el que se moverán las proteínas), tampón o buffer (que proporciona los iones y el pH para la separacíón de las proteínas), fuente de alimentación con dos electrodos, uno positivo y otro negativo, un peine para fabricar los pocillos y estos pocillos, donde se depositarán las muestras.
Variantes de Electroforesis
NATIVO
SDS
ISOELECTROENFOQUE
CAPILAR
2D
Nativo
En la electroforesis nativa se aplica un campo eléctrico sobre un medio con un pH definido (básico). Las proteínas, depositadas en los pocillos, se desplazarán en función de sus características físicas anteriormente enumeradas y podrán ser diferenciadas gracias a una técnica de tinción.
SDS-PAGE
http://www.youtube.com/watch?v=IWZN_G_pC8U
SDS es un compuesto químico que destruye la estructura terciaria y cuaternaria de las proteínas, otorgando a las proteínas una carga negativa proporcional al tamaño de las mismas. Al aplicar el campo eléctrico, las proteínas se separarán por tamaño.
Electroforesis Capilar
En la electroforesis capilar el medio en el que se separan las proteínas no es un gel sino un capilar artificial. A él llega la muestra mediante fuerzas hidrostáticas y se separarán también en función de sus características físicas, a lo largo del capilar.
Isoelectroenfoque
pHdel medio
H+
H+
H+
H+H+
H+
H+
PUNTO ISOELÉCTRICO
Las proteínas pueden tener carga global positiva, negativa o cero. En el Isoelectroenfoque las proteínas se separan en función de su capacidad para adquirir protones, que serán incorporados a los residuos aminoacídicos. Esta capacidad para ganar protones en un medio con un gradiente de pH, hará que las proteínas se desplacen hasta un punto en el que la carga neta de cada proteína sea cero, lugar en el que detendrá su movimiento por haber alcanzado su punto de equilibrio eléctrico.
Isoelectroenfoque
pHdel medio
H+
H+
H+
H+H+
H+
H+
pH < pI Proteína +
pH > pI Proteína - PUNTO ISOELÉCTRICO
¿Hacia dónde se mueven las proteínas? Si el pH en el que se encuentra la proteína es inferior a su punto isoeléctrico, la proteína estará cargada positivamente y se desplazará perdiendo protones hasta equilibrar sus cargas y quedar fija en el punto isoeléctrico.Si el pH del medio es mayor que el que define el punto isoeléctrico, la proteína se cargará negativamente.
Isoelectroenfoque
Proteínas en el Suero
Bandas del espectroelectroforético (abajo) y representación gráfica (arriba). La primera banda por la izquierda corresponde a la fracción de albúminas. La segunda a la de Alfa1, la tercera a Alfa2, la cuarta y quinta a Beta1 y Beta2 y la última por la izquierda a la fracción gamma.
Proteínas en el Suero
Albúmina
Deshidratación
Enfermedades HepáticasSíndrome Nefrótico
EmbarazoMalnutriciónHemorragiasEnteropatíasMalabsorcion
LESQuemaduras
analbuminemia
• Albúmina• Pre-Albúmina
Fracción Alfa-1
Reacción de Fase AgudaInfección, Inflamación, Fiebre, Neoplasias
EmbarazoDéficit de Alfa-1 Antitripsina
Enfermedades Hepáticas
• Alfa-1 Antitripsina• Alfa-1 Glicoproteína Ácida• Alfa-1 Fetoproteína• Alfa-1 Lipoproteína (HDL)• Transcortina• Proteína Fijadora de Tiroxina
RFA, 90%
CHC
Fracción Alfa-2
Reacción de Fase AgudaInfección, Inflamación, Fiebre, Neoplásicas
Insuficiencia adrenalTratamiento con esteroides
DM avanzadaSíndrome Nefrótico
EII
MalnutriciónAnemia Megaloblástica
Enteropatías pierde-proteínasEnfermedades HepáticasEnfermedad de Wilson
• Haptoglobina• Alfa-2 Macroglobulina• Ceruloplasmina• Alfa-2 Lipoproteína (VLDL)• PCR*
Cu, RFA
SdNFoRFA
Fracción Beta-1 y 2
HipotiroidismoCBP
Ictericia ObstructivaDiabetes Mellitus
Enfermedad de CushingPAN
Transferrina: Anemia FerropénicaTransferrina: Embarazo (3T)
HipocolesterolemiaEnfermedades Renales(malnutrición proteica)
• Transferrina
• Hemopexina
• Beta- 1Lipopróteína
• C4
• Fibrinógeno• Beta-2 Microglobulina
• Beta-2 Glicoproteína
• Fibronectina
• C3• Lactógeno Placentario
↓HbHLA, IRn
RFA
RFA
SAF
SdNFo
RFA
Fracción Gamma
AmiloidosisInfecciones crónicas granulomatosas
LLCCirrosis
Enfermedad de HodgkinLinfomas
Mieloma MúltipleConectivopatías
Macroglobulinemia de Waldenstrom
AgammaglobulinemiaHipogammaglobulinemia
GAMMA-1:• IgA• IgA s• IgD
GAMMA-2:• IgM• IgG• IgE
Reacción Inflamatoria
Reacción Inflamatoria
Sd. Nefrótico & Cirrosis
Sd. Nefrótico & Cirrosis
Gammapatías
Monoclonal Policlonal
Gammapatías
Déficit Alfa-1 Antitripsina
Enfermedad de Wilson
Normal Enf. Wilson
Bisalbuminemia
Bisalbuminemia
Referencias
O’CONNELL T et Al. Understanding and Interpreting Serum Protein Electrophoresis. American Family Physician. January 1, 2005. Volume 71, Number 1. http://www.aafp.org/afp/2005/0101/p105.html
DYE ELECTROPHORESIS. Purdue University Van Project. http://www.chem.purdue.edu/teacher/table_of_contents/Gel%20Electrophoresis/DYE_ELEC.5.11.96.pdf
Enrique García Lara. El laboratorio en el estudio de las proteínas. Distrito Sanitario Cádiz-Lajanda. http://www.dscadizlajanda.com/images/archivos/proteinas.pdf
David E. Grafin. Gel electrophoresis of proteins. Essential cell biology. Volume 1. Oxford University Press 2000.