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Proyecto CGPI 20050860 Relación entre los niveles de proteasa y quitinasa con la capacidad

entomocida en Paecilomyces fumosoroseus. Director del proyecto: Dr. Ramón Cruz Camarillo

1 INTRODUCCIÓN

1.1. INSECTICIDAS BIOLÓGICOS. ASPECTOS GENERALES

Entre las diferentes causas de la contaminación de los ecosistemas se encuentra el uso

inadecuado de plaguicidas químicos, que originan severos daños sobre los humanos y el ambiente.

Entre las plagas más difíciles de combatir están los insectos, que son considerados como tal cuando

han rebasado su hábitat natural, se encuentran en una situación en la que prácticamente no tienen

enemigos naturales, y si existen las condiciones ambientales adecuadas, su población se

incrementa rápidamente. Uno de los principales problemas que presenta el control de insectos por

medios químicos, es la adquisición de resistencia, por lo que su uso frecuente resulta ineficaz y con

un fuerte impacto ambiental negativo. Por tal razón, hay una demanda continua de métodos

alternativos para el control de plagas de insectos. Uno de estos métodos es la utilización de

bioreguladores naturales de tales insectos, que regulan poblaciones, ofrecen la posibilidad de ser

utilizados para un control selectivo, y dan tanto seguridad humana como ambiental. Entre los

organismos susceptibles a ser utilizados para el control biológico, se encuentran los hongos

microscópicos (Fernández-Tavizón, 1980; Ferron et al., 1991; Wraight et al., 2000).

1.2. HONGOS MICROSCÓPICOS EMPLEADOS COMO BIOINSECTICIDAS

1.2.1. Grupos taxonómicos con potencial insecticida. A diferencia de otros

agentes entomopatógenos, los hongos pueden infectar no solamente a través del intestino de los

insectos, sino también por penetración directa del integumento. Esta propiedad hace posible la

infección de insectos, independientemente de sus hábitos alimenticios, y su utilización en el control

de insectos de casi todos los órdenes taxonómicos (Deacon, 1994; García-Juárez et al., 1999; Smith

y Grula, 1983).

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Hasta este momento, se calcula que puede haber 1,500,000 especies de hongos, aunque

solamente están registradas cerca de 72,000, de las cuales, 750 han sido determinadas como

patógenos de insectos y otros artrópodos, incluidas en 90 géneros diferentes (Goettel et al., 1989;

Herrera y Ulloa, 1998; Moore-Landecker, 1996; Hawkesworth, 1988).

A pesar de la gran cantidad de especies reconocidas como entomopatógenas, sólo un 10%

de estas se reproduce de manera masiva en condiciones de laboratorio, y sólo el 1% se encuentra

en condiciones de investigación aplicada o de comercialización, debido principalmente a que no

existen estudios suficientes de las interacciones hospedante-patógeno. Dentro del 1% mencionado,

las siguientes especies son susceptibles de ser reproducidas a escala comercial, Aschersonia

aleyrodes, Beauveria bassiana, Hirsutella thompsonii, Metarhizium anisopliae, Paecilomyces

fumosoroseus, Nomuraea rileyi y Verticillium lecanii (Garza-González, 1995).

1.2.2. Mecanismos de acción de los hongos entomopatógenos. Los hongos

entomopatógenos varían considerablemente en sus modos de acción, virulencia y especificidad de

hospedante, aunque puede distinguirse un mecanismo básico de infección, que se inicia con la

adherencia de la unidad infectiva, usualmente un conidio, a la cutícula del insecto. Se piensa que el

éxito de una infección fúngica radica en gran parte en esta primera fase. Posteriormente, el conidio

germina y se inicia la penetración fúngica, la cual requiere una combinación de fuerza mecánica y

de una degradación enzimática de la cutícula. Dependiendo de la especie del hongo, se forma un

tubo de germinación que penetra directamente, o bien se forman estructuras especializadas de

infección tales como los apresorios, que son hinchamientos aplanados que se forman del tubo de

germinación de un conidio, y que se adhieren a la superficie del hospedante antes de penetrarlo con

una hifa infectiva, la cual se origina a partir de dicho hinchamiento. La penetración, aunque de

manera menos frecuente, puede ocurrir también vía heridas, a través de los órganos de los

sentidos, o por el tracto digestivo (Askary et al., 1999; Boucias y Pendland, 1991; Charnley y St.

Leger, 1991; Goettel e Inglis, 1997; Ulloa, 1991).

En el caso de la invasión por la cutícula intacta, la epicutícula es la primera barrera

encontrada y está constituida en su mayoría por proteínas; su penetración se favorece por la acción

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de los ganchos de infección, por debajo de los apresorios o bien por la entrada directa de los tubos

germinativos. Después de pasar la epicutícula, las estructuras penetrantes a menudo se expanden

lateralmente en las capas externas de la procutícula, produciendo placas de penetración; estas

expansiones pueden causar fracturas que favorecen la penetración. El paso del hongo a través de

la procutícula puede ser más o menos vertical, o involucrar una extensión lateral del micelio;

posteriormente, las hifas alcanzan la epidermis (figura 1). Una vez en el hemocele, el micelio se

ramifica a través del hospedante, formando cuerpos hifales y/o blastosporas. En esta fase de la

infección, es importante el estadio del insecto, ya que la penetración y desarrollo del hongo

frecuentemente ocurre en los estados entre muda y muda (Askary et al., 1999; Charnley y St. Leger,

1991; Goettel e Inglis, 1997), tal como lo observaron Zacharuk hacia 1981 y Fargues y Vey entre

1974 y 1977 (citados por Khachatourians, 1992).

Figura 1. Estructura de la cutícula de los insectos y mecanismo de penetración por los hongos entomopatógenos. En la mosquita

blanca (Homoptera: Aleyrodidae) se distinguen cuatro capas bien definidas. El mayor componente de la cutícula es de tipo proteico.

La esclerotización es la unión de la proteína con compuestos aromáticos como la N-acetildopamina, que endurece la cutícula. En los

insectos de cuerpo suave (i.e larvas), la exocutícula es delgada e indistinguible de la epicutícula. La membrana artroidal de las

articulaciones, así como aquella localizada entre los segmentos no tiene exocutícula. Otro componente importante de la cutícula es la

quitina. Tomado de Charnley y St. Leger (1991).

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La muerte del hospedante a menudo se debe a una acción combinada de toxinas fúngicas,

obstrucción física de la circulación sanguínea, disminución en el aporte de nutrimentos e invasión de

órganos. Después de la muerte del hospedante, las hifas usualmente emergen del cadáver y bajo

condiciones apropiadas de temperatura y humedad, producen conidios en el exterior del

hospedante. Estos conidios, dependiendo de la especie, pueden ser hidrofóbicos o hidrofílicos, y ser

dispersados por el viento o la lluvia. Bajo condiciones secas o frías, los insectos a menudo

permanecen intactos como momias rellenas de hongos. El hongo emerge y esporula una vez que el

cadáver está bajo las condiciones ambientales apropiadas (Bidochka y Khachatourians, 1994;

Charnley y St. Leger, 1991; Goettel e Inglis, 1997).

1.3. IMPORTANCIA DE LA MOSQUITA BLANCA COMO INSECTO PLAGA

La mosquita blanca (Homoptera: Aleyrodidae) es una plaga polífaga de una importancia

económica creciente alrededor del mundo, no solo en campos de cultivo, sino también en plantas

ornamentales de invernadero. Está constituida por diferentes géneros y especies, entre las más

importantes, Bemisia argentifolii, B. tabaci, Trialeurodes vaporariorum, Dialeurodes citri, y Parabemisia

myricae. Este insecto es una plaga cosmopolita que ataca cultivos y plantas silvestres, ocasionando

grandes pérdidas económicas. En México, se calcula que anualmente daña 700, 000 hectáreas de

cultivos de hortalizas, frutas y plantas ornamentales. El daño directo lo causan las ninfas y los

adultos al succionar la savia a través de su aparato bucal, por lo que son un vector de

enfermedades, y sus secreciones propician la proliferación de hongos fitopatógenos. Por otro lado,

la constante aplicación de insecticidas químicos para combatirla ha propiciado una mayor

resistencia a los mismos. En México afecta cultivos de algodón, soya, frijol, tomate rojo, chile, papa

y diversas hortalizas. También ataca plantas ornamentales, como la nochebuena (Ayala-Zermeño et

al., 1999; Greer, 2000; Mier et al., 1991; Mier et al., 1999).

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1.4. Paecilomyces fumosoroseusPaecilomyces fumosoroseusPaecilomyces fumosoroseusPaecilomyces fumosoroseus COMO AGENTE PARA EL CONTROL DE LA

MOSQUITA BLANCA

P. fumosoroseus es un hongo que puede ejercer un papel importante en la regulación de la

plaga de la mosquita blanca, a través de la aplicación de programas de control biológico, ofreciendo

así una alternativa a los insecticidas químicos en los programas de manejo de plagas. Las especies

pertenecientes a este género forman conidióforos ramificados, agrupados en paquetes llamados

sinemas o coremios. Además presentan fiálides engrosadas en la base y terminadas en un cuello

en forma de botella, y sus conidios son de color rosado. Los hongos pertenecientes a esta especie

se encuentran en forma natural en un amplio espectro de hospedantes, por ejemplo los áfidos rusos

del trigo (Diuraphis noxia), Homoptera: Aphididae y los trips del melón (Thrips palmi), Thysanoptera:

Thripidae (Ayala-Zermeño et al., 1999; Castaneiras et al., 1996; Mesquita et al., 1996; Samson,

1981).

1.5. PARTICIPACIÓN DE LAS QUITINASAS Y PROTEASAS FÚNGICAS, EN EL

MECANISMO DE ATAQUE A INSECTOS

Los insectos son artrópodos, por lo que poseen un esqueleto externo o cutícula que tiene

una variedad de funciones, aparte de su papel esquelético, de soporte y anclaje muscular. La

función defensiva de la cutícula es evidente, ya que sólo un grupo de entomopatógenos, los hongos,

han desarrollado la capacidad de invadir a los insectos por esta ruta. Debido a la complejidad

estructural de la cutícula, es necesaria su degradación enzimática para que el hongo pueda tener

acceso a los nutrimentos del interior del insecto (Glare y Milner, 1991; Hernández-Velázquez,

1995a).

Existen varias enzimas involucradas en el proceso de degradación de la cutícula, así como

en las demás fases de la infección. En este contexto se conoce la existencia de un grupo enzimático

formado por lipasas, proteasas y quitinasas principalmente. Para los fines del presente trabajo, la

información se centrará en las proteasas y quitinasas fúngicas. La producción de proteasa es una

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de las primeras respuestas bioquímicas de muchos organismos parásitos una vez establecido el

contacto con el hospedante. La quitinasa se produce en menores cantidades, debido a que el mayor

componente de la cutícula es de tipo proteico, el cual estructuralmente enmascara a la quitina

cuticular, por lo que la quitinasa comienza a producirse hasta que la proteína que rodea a la quitina

ha sido degradada. Otra de las funciones de estas enzimas, sobre todo en el caso de la quitinasa,

es la de proveer nutrimentos a partir de la cutícula de los insectos moribundos (Charnley y St. Leger,

1991; St. Leger et al., 1987c).

A finales de la década de los cincuenta, comenzó a desarrollarse un gran interés por

estudiar la degradación enzimática de la cutícula de los insectos, debido a la posibilidad de que la

virulencia de los hongos entomopatógenos pudiera estar correlacionada, al menos en parte, con su

actividad proteolítica, quitinolítica y lipolítica. Sin embargo los resultados obtenidos hasta el

momento han sido contradictorios, ya que algunos autores proponen que existe una correlación

positiva entre enzimas y virulencia, y otros mencionan que dicha correlación es negativa (tabla 1).

Es importante señalar que Paecilomyces fumosoroseus no ha sido muy estudiado en este sentido, por

lo que la evaluación de su producción de enzimas proteo-quitinolíticas podría ayudar a entender el

mecanismo de su acción entomopatógena. En el caso de encontrar una correlación positiva entre

los niveles de producción enzimática en los diferentes aislados, este hecho ayudaría a hacer una

selección de aquellos más promisorios, para ser estudiados después mediante bioensayos contra el

insecto blanco escogido (Charnley y St. Leger, 1991; St. Leger et al., 1986b).

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Tabla 1. Resultados sobre la participación de las quitinasas y proteasas fúngicas en el mecanismo de ataque a insectos Autor y año

Especies de hongos

Resultados reportados Citado por

Huber, 1958 B. bassiana, M..anisopliae, Cordyceps militaris

Señaló la capacidad de los hongos entomopatógenos para producir enzimas extracelulares, sin aclarar de que tipo, como las responsables de la degradación de las capas cuticulares.

St. Leger et al., 1986a

Claus, 1961 B. bassiana Propuso la intervención de una quitinasa en la degradación de la cutícula, tomando como base la composición de la misma.

Khachatourians, 1992

Gabriel, 1968 E. apiculata, E. thaxteriana, E. virulenta, E. coronata

Demostró la producción in vitro de enzimas lipolíticas, quitinolíticas y proteolíticas.


Mc. Cauley et al., 1968

M. anisopliae Observaron que la penetración del tubo de germinación va acompañada de la formación de una zona clara alrededor, que indica actividad enzimática.


Hedlund y Pass 1968 y Zacharuk-Ry, 1981

B. bassiana, M. anisopliae

Observaron la degradación de tejidos de insectos después de la invasión por hifas.


Tomiyama y Aoki 1969

Erynia blunkii Observaron la formación de una zona clara rodeando el lugar de penetración del tubo de germinación, en la polilla “diamante negro”


Grula et al., 1970-1980

B. bassiana La infección era dependiente de la actividad enzimática hacia el gusano de maíz. La degradación de la quitina del insecto es llevada a cabo por la quitinasa del hongo


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Tabla 1. Continuación.... Autor y año

Especies de hongos


Zacharuk 1970 M. anisopliae Observaron la desaparición de la capa de cera en la cutícula del gusano barrenador, bajo los apresorios del hongo, lo que sugiere la participación de una lipasa en el mecanismo de penetración .


Kucera, 1971 y Samsinakova et al, 1977

B. bassiana Demostraron la existencia de una proteasa, cuya producción era influenciada por la fuente de nitrógeno.


Mohamed et al, 1978

N. rileyi Propusieron que las proteasas extracelulares fúngicas están involucradas en el proceso de infección y de penetración hifal.


Pekrul y Grula, 1979

B. bassiana Reportaron la presencia de perforaciones circulares probablemente causadas por enzimas, sin mencionar de que tipo, en el punto de entrada del tubo de germinación en las larvas de Heliotis zea.


Smith y Grula, 1983

B. bassiana Demostraron la producción in vitro de una quitinasa inducible, empleando como substrato el integumento pulverizado del insecto. La actividad se midió utilizando el método de los azucares reductores. El muestreo se prolongó por 27 días.


Sosa-Gomez y Alves, 1983

M. anisopliae Encontraron una correlación negativa entre la capacidad de producción de enzimas del hongo, con los procesos de patogénesis y virulencia. Las enzimas que probaron fueron proteasas y una amilasa.

Sosa-Gómez y Alves, 1983

Coudron et al, 1986

B. bassiana, M. anisopliae, N. rileyi

Examinaron la producción de endo y exoquitinasa en aislados virulentos y avirulentos; los primeros tenían de 10 a 17 veces más actividad. No se hace mención de la manera en que se midieron las actividades enzimáticas.


St. Leger et al, 1986

M. anisopliae, V. lecanii, B. bassiana

Identificaron una endoproteasa, una quitinasa, y una N-acetil-β-glucosaminidasa en diferentes aislados de hongos.

St. Leger et al., 1986a


M. anisopliae Identificaron una serín-proteasa con dos actividades: Pr1 y Pr2. Ambas intervenían en los procesos de melanización y virulencia hacia Manduca sexta.

St. Leger et al., 1986b

St. Leger et al, a partir de 1986

M. anisopliae La proteasa del hongo participaba en la degradación de la cutícula, y en los procesos de infección hacia diferentes insectos como la langosta del desierto.

St. Leger et al., 1986-1999

Pendland y Kucera, 1982 a 1987

N. rileyi, M. anisopliae

Durante la fase de invasión el hongo producía proteasas, que eran inhibidas por compuestos presentes en la hemolinfa de los insectos.


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Tabla 1. Continuación... Autor y año

Especies de hongos


Clarkson y Charnley, 1996

Metarhizium Mencionaron a las enzimas extracelulares, principalmente proteasas, como parte del mecanismo de penetración a la cutícula del los insectos.

Clarkson y Charnley, 1996


B. bassiana Se purificó una serín-proteasa, de peso molecular de 35,000 Da. y un pH óptimo de 8.5.


Bidochka y Khachatourians, 1988

B. bassiana Observaron la producción de una serín-proteasa supuestamente regulada por represión catabólica, debida a la presencia de la NAG liberada al degradarse la cutícula de los insectos.

Bidochka y Khachatourians, 1988

Samuels et al, 1988

Erynia spp Demostraron la presencia de aminopeptidasas. Khachatourians, 1992

El-Sayedet et al, 1989

N. rileyi Se identificó una exoquitinasa, cuya actividad era 15-18 veces mayor en los patotipos virulentos, que en los avirulentos.


Goettel et al, 1989 M. anisopliae Reportaron la producción de la proteasa PR1 en los apresorios, durante el proceso de infección a M. sexta.

Goettel et al., 1989


M.anisopliae, V.lecanii, B bassiana, P.farinosus, Tolypocladium niveum

Demostraron la producción de proteasas semejantes a la PR1 de M. anisopliae en todos los aislados ensayados, lo que sugiere una adaptación para ser patógenos de insectos.

St. Leger et al., 1991


M. anisopliae Reportaron 3 tipos de proteasas diferentes, durante el crecimiento en medios con cutícula de cucaracha. Cada enzima presentó varias isoformas, las cuales se caracterizaron de acuerdo a su especificidad hacia el sustrato y por sus patrones de inhibición. También mencionaron la presencia de una metaloproteasa.


Paterson et al., 1994

M. anisopliae Ocurría la inducción de la síntesis de una proteasa, al agregarse cutícula molida de los insectos al medio de cultivo. Si se usaban otras fuentes de carbono y nitrógeno no ocurría la síntesis de dicha enzima.

Paterson et al., 1994a y 1994b

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Tabla 1 Continuación... Autor y año

Especies de hongos


St. Leger et al. 1997

V. lecanii Propusieron que mediante un proceso de coevolución hospedante-parásito, los hongos han adquirido la capacidad de producir enzimas extracelulares, capaces de degradar sustratos de naturaleza diversa, mostrando preferencia por algunos de éstos, dependiendo del organismo que se encuentren parasitando.


Joshi et. al, 1997 M. anisopliae Identificaron los genes que codifican para la actividad PR1 de una serín-proteasa.

Joshi et al, 1997

Gillespie et al, 1998

Metarhizium No encontraron correlación significativa entre la capacidad de las proteasas para degradar un sustrato cromogénico, y el TL50 en ensayos con langostas.

Gillespie et al., 1998

Chul-Kang et al, 1998

M. anisopliae Llevaron a cabo el aislamiento de un gen que codifica una quitinasa.

Chul-Kang et al., 1998

Chul-Kang et al, 1999

M. anisopliae Reportaron las actividades de una endo y una exoquitinasa. Chul-Kang et al., 1999

Askary et al, 1999 V. lecanii Detectaron en algunos pasos del mecanismo de infección para invadir áfidos (Macrosphum euphorbiae), la participación de proteasas y quitinasas.

Askary et al., 1999

Bidochka et al, 1999

Verticillium Demostraron la presencia de proteasas, pectinasas y quitinasas en diversas especies de este género, lo que puede señalar una adaptación hospedante-parásito, de acuerdo con el organismo que se encuentren parasitando.

Bidochka et al., 1999


M. anisopliae Observaron la modificación del pH del medio al liberarse compuestos alcalinos de carácter proteico. Esto podría crear un ambiente óptimo para la acción de las proteasas.


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1.6. HIPÓTESIS DE TRABAJO

Los aislados de Paecilomyces fumosoroseus (Wize) Brown & Smith con mayor actividad de proteasa y

quitinasa, serán los más virulentos para la mosquita blanca, Trialeurodes vaporariorum (West.).

1.7. OBJETIVO GENERAL

Investigar la relación existente entre la capacidad proteolítica y quitinolítica de aislados del hongo

entomopatógeno P. fumosoroseus, con respecto a su virulencia contra la mosquita blanca

Trialeurodes vaporariorum.

1.8. OBJETIVOS PARTICULARES

1.8.1. Seleccionar dos aislados con alta, mediana y baja actividad de proteasa y quitinasa, dentro

de una colección de 18 aislados de P. fumosoroseus.

1.8.2. Evaluar la virulencia (como concentración letal media, CL50) hacia la mosquita blanca, de dos

aislados de P. fumosoroseus con alta, mediana y baja capacidad proteolítica y quitinolítica.

1.9. JUSTIFICACIÓN

P. fumosoroseus es un hongo potencialmente útil para el control de plagas agrícolas, ya que

permite plantear programas que limiten el uso de plaguicidas químicos, disminuyendo así el daño al

ambiente; sin embargo, su uso comercial todavía es limitado, sobre todo porque se sigue prefiriendo

el uso de insecticidas químicos que propician una disminución rápida de las poblaciones de

insectos, comparada con la velocidad de acción de los hongos entomopatógenos. Esto hace

necesaria la búsqueda de aislados que produzcan gran cantidad de enzimas proteo-quitinolíticas, y

que por lo mismo pudieran ser muy virulentos por atacar masivamente al insecto blanco,

compitiendo así con los plaguicidas químicos con respecto al tiempo de eliminación de la mosquita

blanca.

En el caso particular de este hongo, no se ha estudiado de manera amplia la producción de

estas enzimas, ni la relación que existe entre ellas y la virulencia hacia la mosquita blanca. Además,

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estos datos ayudarían a conocer mejor este microorganismo, y así producirlo a mayor escala

cultivándolo por ejemplo en medios ricos en materiales proteino-quitinosos.

Así mismo, en el caso de que hubiera una correlación positiva entre los niveles de proteasa

y quitinasa con la entomopatogenicidad, se haría más sencilla la selección de aislados promisorios

evaluando dichas enzimas, antes de realizar los bioensayos correspondientes contra los insectos de

interés.

1.10. METAS

1.10.1. Seleccionar el medio de cultivo más adecuado, para la evaluación en placa de proteasa

extracelular. Realizar el ordenamiento de los 18 aislados fúngicos, con base en los niveles de

producción de dicha enzima en el medio sólido seleccionado.

1.10.2. Llevar a cabo estudios cinéticos en cultivo sumergido de los dos aislados que presenten la

mayor, intermedia y menor producción de proteasa, para establecer los tiempos convenientes para

evaluar dicha actividad.

1.10.3. Evaluar la actividad proteolítica a los tiempos establecidos, de los 18 aislados cultivados en

medio líquido. Hacer la selección final de dos aislados que sean altos, medianos y bajos productores

de la enzima, para realizar posteriores bioensayos contra la mosquita blanca.

1.10.4. Seleccionar el medio de cultivo más adecuado, para la evaluación en placa de quitinasa

extracelular. y hacer el ordenamiento inicial de los 18 aislados fúngicos, con base en los niveles de

producción de dicha enzima en el medio sólido seleccionado.

1.10.5. Llevar a cabo estudios cinéticos en cultivo sumergido de los dos aislados que presentaron la

mayor, intermedia y menor producción de quitinasa, para establecer los tiempos convenientes para

evaluar dicha actividad.

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1.10.6. Evaluar la actividad quitinolítica a los tiempos establecidos, de los 18 aislados cultivados en

medio líquido. Hacer la selección final de dos aislados que sean altos, medianos y bajos productores

de la enzima, para realizar posteriores bioensayos contra la mosquita blanca.

1.10.7. Determinar la virulencia de P. fumosoroseus contra ninfas de mosquita blanca en su segundo

estadio, evaluando la concentración letal media (CL50). empleando en estos bioensayos los seis

aislados previamente seleccionados para cada enzima; dos con alta, dos con media y dos con baja

actividad.

1.10.8. Determinar la relación entre la producción de proteasa y quitinasa y la virulencia hacia el

insecto, mediante un tratamiento estadístico de los datos obtenidos en los bioensayos.

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2. METODOLOGÍA

2.1. MICROORGANISMOS Y SU CONSERVACIÓN

En la presente investigación se trabajó con 18 aislados de Paecilomyces fumosoroseus,

procedentes de distintas regiones de México (Tabla 2), todos ellos proporcionados por el Centro

Nacional de Referencia en Control Biológico (CNRCB) SAGAR, de Tecomán, Colima y depositados

en la Colección del Departamento de Microbiología y Parasitología de la Universidad Nacional

Autónoma de México.

Tabla 2. Cultivo y origen de procedencia de los diferentes aislados de P. fumosoroseusP. fumosoroseusP. fumosoroseusP. fumosoroseus, de la mosquita blanca (BemisiaBemisiaBemisiaBemisia sp.) No. asignado (UNAM*) Clave (CNRCB) Cultivo Origen

EH-503 MBP pepino Yucatán EH-504 MBP1 pepino Yucatán EH-505 MBCH chile habanero Yucatán EH-506 PFCAM chile habanero Campeche EH-507 MBPO1N nochebuena Colima EH-508 MBPO2N nochebuena Colima EH-509 MBPO3A nochebuena Colima EH-510 MBNS1 sandía Armería, Colima EH-511 MBAS2 sandía Armería, Colima EH-512 MBAS3 sandía Armería, Colima EH-513 MBAS4 sandía Armería, Colima EH-514 MBAS5 sandía Armería, Colima EH-515 MBASG sandía Armería, Colima EH-516 MBPO4 nochebuena Colima EH-517 MBTH -------------- Sinaloa EH-518 MBMAC -------------- Sinaloa EH-519 MBBRT berenjena Colima EH-520 PSMB tomate Nayarit

* Facultad de Medicina, Colección del Depto. de Microbiología y Parasitología, México, D. F.

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Los aislados fueron sembrados en tubos de ensayo y cajas de Petri con medio H o agar de

glucosa Sabouraud e incubados a 28 °C durante 7 a 15 días, para facilitar el desarrollo de sus

colonias. Los cultivos se guardaron en refrigeración para su mejor conservación. Los aislados fueron

resembrados cada seis meses, para evitar resiembras frecuentes que pudieran propiciar la

disminución de la virulencia. Paralelamente con las resiembras, hubo pruebas de pureza en placa, y

observaciones al microscopio para constatar que no había contaminación.

2.2. MEDIOS DE CULTIVO USADOS PARA LA PRODUCCIÓN DE PROTEASA Y QUITINASA EN

LOS EXPERIMENTOS DE EVALUACIÓN EN PLACA

Puesto que no existen antecedentes sobre un medio particular que resulte adecuado para la

producción de quitinasas o proteasas en P. fumosoroseus, se consideró necesario ensayar diferentes

medios sólidos, para hacer las evaluaciones de ambas enzimas en cajas de Petri.

La estrategia consistió en añadir al medio en estudio los inductores correspondientes, que

para el caso de la proteasa fue caseína de Hammersten al 1% (Merck, Darmstadt, Alemania), y para

la quitinasa, quitina (Sigma de México, MX) coloidal o desechos molidos de camarón coloidales a

13-14% (peso húmedo/volumen). En todos los casos el pH de los medios fue ajustado a 7 (tabla 3).

Todos los medios se esterilizaron en autoclave durante 15 min a 121°C. El medio sintético de

Castañeda (Chávez-Camarillo y Cruz-Camarillo, 1984), fue utilizado completo y también

suprimiendo el citrato y el glicerol.

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Tabla 3. Medios de cultivo utilizados para la evaluación en placa de quitinasa y proteasa, para seleccionar el medio más conveniente para cada caso

Medio Composición Agar agua (Vidal et al., 1996)

agar 23 g agua destilada 1000 ml

Medio sintético de Castañeda (Chávez-Camarillo y Cruz-Camarillo,1984)

citrato diamónico .625 g cloruro de sodio 0.25 g

fosfato monobásico de potasio 0.375 g

carbonato de sodio 0.375 g

sulfato de magnesio 0.275 g glicerol 6.25 ml

agar 23 g

agua destilada 1000 ml

Medio CM (Czapek modificado, Toriello y Mier, com. pers.)

glucosa 10 g fosfato de potasio 0.36 g fosfato de sodio 1.42 g cloruro de potasio 1 g sulfato de magnesio 0.6 g nitrato de amonio 0.7 g extracto de levadura 5 g agar 20 g agua destilada 1000 ml

Agar de glucosa Sabouraud (Goettel e Inglis, 1997)

glucosa 20 g peptona 10 g agar 15 g agua destilada 1000 ml

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Agar micológico (Bioxón, México)

peptona de soya 10 g glucosa 10 g extracto de levadura 2.5 g agar 15 g agua 1000 ml

Agar de glucosa extracto de levadura (Goettel e Inglis, 1997)

glucosa 35 g extracto de levadura 10 g agar 15 g agua destilada 1000 ml

Medio H (Goettel e Inglis, 1997)

sacarosa 10 g glucosa 5 g peptona 0.5 g extracto de levadura 5 g agar 15 g agua destilada 1000 ml

2.2.1. PREPARACIÓN DE LOS SUBSTRATOS QUITINOSOS COLOIDALES

Para inducir la síntesis de quitinasa, se añadió un substrato quitinoso a todos los medios

utilizados, fueran sólidos o líquidos. Uno fue la quitina coloidal y el otro desperdicio de camarón

también coloidal. A continuación está descrita la preparación correspondiente.

a) Quitina coloidal. Este sustrato fue utilizado para la evaluación de la producción de

quitinasas en placa; utilizando quitina comercial Sigma, molida en un molino Wiley con una luz de

malla de 40. Por cada 10 gramos de quitina se agregaron 100 ml de H3PO4 al 85%, mezclando

manualmente, luego, la mezcla fue mantenida en refrigeración durante 24 h. Pasado este tiempo,

18

fue añadida agua de suministro en exceso para propiciar la formación de la quitina coloidal,

eliminando la acidez colocándola en una gasa y lavándola hasta que el pH de la quitina alcanzó el

del agua de suministro. La pasta gelatinosa obtenida fue colocada en un frasco de boca ancha y

esterilizada en autoclave durante 15 min a 121 °C, después mantenida en refrigeración hasta su

uso (Chávez-Camarillo y Cruz-Camarillo, 1984).

b) Desperdicio molido y coloidizado de camarón. Este sustrato se utilizó para inducir la

síntesis de quitinasa tanto en placa como para los experimentos en cultivo sumergido; en estos

últimos también actuó como inductor de proteasas, ya que su composición proteico-quitinosa es

adecuada para inducir la síntesis de ambas enzimas. El procedimiento para prepararlo es el mismo

que para la quitina coloidal.

c) Quitina coloidal teñida. Al utilizar quitina o desperdicio de camarón coloidizados, los

resultados no fueron claros, debido probablemente a que el hongo producía simultáneamente

proteasa y quitinasa. Por esta razón, para evaluar la quitinasa, una preparación de la quitina

coloidal teñida con azul brillante de remazol fue utilizada. Primero se preparó quitina coloidal como

se describió en el inciso a, tiñéndola después con azul brillante de remazol, colocando para tal fin

en un vaso de precipitados 7 g de quitina coloidal y 0.23 g del colorante previamente disuelto en

agua y calentando la mezcla a ebullición durante 1 h. Posteriormente, la quitina fue lavada con

agua fría y después con agua caliente hasta que ya no hubo desprendimiento de color. Luego de

dejarlo escurrir, el material teñido se colocó nuevamente en un vaso de precipitados para favorecer

la fijación de color, agregando 0.075 g de dicromato de sodio y 0.075 g de tartrato de sodio y potasio

por cada 5 g de quitina coloidal teñida. La mezcla hervió por 10 min, para posteriormente lavarla con

agua fría y caliente. Luego de escurrila, se esterilizó en autoclave durante 15 min a 121°C,

conservando posteriormente en refrigeración hasta su uso (Gómez-Ramírez, 2000).

2.3. SELECCIÓN DE LOS MEDIOS MÁS ADECUADOS PARA EVALUAR LA PRODUCCIÓN DE

PROTEASA Y QUITINASA EN MEDIO SÓLIDO

19

Los diferentes aislados fueron sembrados en placas conteniendo los medios indicados en la

tabla 3, adicionados de agar y los inductores correspondientes. Luego se registró la aparición de los

halos de actividad enzimática durante un máximo de 7 días, midiendo la relación diámetro del halo

entre diámetro de la colonia. Un inóculo circular, colocado dentro de una hoquedad de la misma

forma, sirvió para propiciar la formación de una colonia redonda, que facilitase la evaluación

enzimática. Tanto la hoquedad como el inóculo, proveniente de la parte media de una colonia

fúngica de 7 a 11 días de crecimiento, fueron hechas con una pipeta Pasteur cortada en el centro y

con los bordes afilados. Ya inoculadas, las placas fueron incubadas a 28° C en la obscuridad. De

este modo, la secreción de quitinasa se manifestó en forma de halos transparentes en torno a la

colonia. En cambio los halos de proteasa podían tener distintos aspectos: pequeños y opacos, hasta

halos más grandes y transparentes con un borde opaco muy delgado.

La evaluación se hizo de dos maneras. Por un lado mediante una escala arbitraria

cualitativa, asignando cuatro a cinco cruces a aquel aislado con mayor actividad, en tanto que los

otros aislados recibirían tantas cruces correspondiendo a una comparación visual con el aislado más

activo. Por otro lado, el cociente entre diámentro de halo/diámetro de colonia, fue la otra opción para

evaluar. Los resultados obtenidos permitieron seleccionar el medio de cultivo más adecuado para la

producción de enzimas.

Una vez hecho el ordenamiento de los aislados con base en la producción de proteasa o

quitinasa y habiendo seleccionado el medio de cultivo apropiado, se realizaron estudios cinéticos en

cultivo sumergido para hacer un ordenamiento definitivo de acuerdo con una alta, media y baja

actividad proteolítica o quitinolítica para la realización de bioensayos de virulencia.

2.4. PREPARACIÓN Y CONTEO DEL INÓCULO

La preparación del inóculo tanto para los estudios cinéticos como para los bioensayos, se

realizó mediante cuentas directas de conidios. Para esto, los conidios fueron colectados a partir de

colonias esporuladas que habían sido cultivadas en agar de glucosa Saboraud o medio H,

agregando tween 80 al 0.05% estéril, y agitando vigorosamente la superficie de la colonia con ayuda

20

de un asa de siembra. Posteriormente, la suspensión obtenida fue filtrada a través de un embudo

con una placa de vidrio de porosidad media, o un embudo Büchner con papel filtro Whatman del No.

1, para retener las hifas que pudieran haberse desprendido de la colonia.

El conteo se hizo en una cámara de Neubauer usada comúnmente para cuantificar el

número de conidios por unidad de volumen o de peso. El procedimiento consistió en homogeneizar

primero la suspensión de conidios con un vortex durante un min, y llenando después las celdas del

hemocitómetro con la suspensión obtenida, lo que se dejó en reposo de 15 a 30 min, cuidando que

la preparación no se secara. La cámara de Neubauer se observó al microscopio con el objetivo 40 x.

El número promedio de conidios fue calculado y el conteo fue válido cuando la desviación estándar

fue del 10-15% de la media (Goettel e Inglis, 1997).

Dado que con el método hemocitométrico no es posible distinguir entre conidios viables y no

viables (de modo que el inóculo pudiera ser preparado de acuerdo con los primeros), la viabilidad de

las esporas se determinó por las unidades formadoras de colonias (UFC). Preparando para ello, una

suspensión de conidios de 1 x 106 conidios/ml, y diluyendo a 105, luego 104, 103, y 102 conidios/ml.

De cada dilución se tomaron los µl necesarios para sembrar en cajas de agar dextrosa Saboraud, y

obtener aproximadamente 20 UFC por placa. Las cajas fueron incubadas luego en la obscuridad a

28°C durante 36 a 48 h.

Para calcular los conidios viables por unidad de volumen, y así inocular con la concentración

de conidos exacta, las cuentas totales estimadas con el hemocitómetro fueron multiplicadas por el

número de UFC obtenido en las cajas de Petri (Goettel e Inglis, 1997). Siempre se trabajó con una

viabilidad del 99%.

En el caso de los bioensayos, se utilizaron cultivos monospóricos conservados en medio H,

que provenían del pase uno a partir de un insecto infectado, esto con el fin de mantener la

virulencia. La extracción y el conteo de los conidios fue hecha de la manera antes descrita; sin

embargo, el conteo de conidios viables no fue realizada, ya que en la parte de la investigación que

correspondió a los ensayos enzimáticos la viabilidad de los conidios nunca fue inferior al 99%.

21

Para los bioensayos, la concentración inicial de inóculo fue ajustada a 4.7 x 106 conidios/ml,

que fue el promedio obtenido de un tubo de ensayo con medio H, de todos los aislados. A partir de

dicha concentración se hicieron diluciones decimales para probar diferentes concentraciones del

hongo.

2.5. CINÉTICAS DE PRODUCCIÓN DE PROTEASA Y QUITINASA EN CULTIVO SUMERGIDO

En virtud de que no se conocían las tendencias de producción enzimática de los18 aislados,

se decidió reducir el número a solamente seis, escogiéndose los dos productores altos de una u otra

enzima, dos intermedios y dos productores bajos, basándose en las evaluaciones en placa. Con

estos seis aislados se realizaron estudios cinéticos sobre la producción tanto de proteasa como de

quitinasa, para establecer en qué momento se alcanzaba la mayor actividad, y escoger dos tiempos

a los cuales fuera conveniente hacer evaluaciones con los 18 aislados en estudio. Sin embargo, los

trazos cinéticos obtenidos eran totalmente distintos y no fue posible determinar dos tiempos de

máxima producción enzimática, por lo que fue necesario hacer estudios cinéticos de la producción

de ambas enzimas en los 18 aislados en estudio.

Para ello, la producción de las dos enzimas se realizó en cultivo sumergido, utilizando

matraces de 125 ml con 25 ml del medio sintético de Castañeda, pero sin citrato ni glicerol, y

adicionado con desperdicios molidos de camarón previamente coloidizados al 13-14 % (peso

húmedo/volumen). Cada matraz fue inoculado con una suspensión de 106 esporas por ml, e

incubado a 28°C con una agitación de 150 rpm; tomando cada dia un matraz y centrifugando su

contenido a 10,000 rpm durante 15 min en una centrífuga Sorvall RC-5B; colectando el

sobrenadante con pipetas estériles de 10 ml y distribuyéndolo en alícuotas de 5 ml, congelándolas

para su ensayo enzimático posterior. Este procedimiento fue repetido durante 13 días seguidos. En

el momento de la cosecha de cada matraz, el pH de los cultivos, y el desarrollo microscópico del

hongo fue registrado.

22

2.5.1. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD PROTEOLÍTICA

Para la determinación de la actividad proteolítica se utilizaron las dos técnicas descritas a

continuación:

a) Uno fue el método de Kunitz (1947), basado en que la hidrólisis de la caseína origina la

liberación de péptidos solubles que absorben a 280 nm por contener tirosina, triptofano y

fenilalanina. El substrato utilizado para esta técnica fue caseína Hammersten (Merck) disuelta al 1%

en regulador de fosfatos 0.2 M a pH 7. Este ensayo consistió en mezclar 1 ml del sobrenadante a

ensayar con 1 ml de caseína, incubando después a 37 °C durante 15 min y deteniendo la reacción

con 3 ml de ácido tricloroacético al 30 %, para después dejar reposar durante 30 min en

refrigeración. Después se centrifugó a 10,000 rpm y los sobrenadantes fueron leidos a 280 nm. Los

testigos se prepararon colocando en el siguiente orden 1 ml de enzima, 3 ml de ácido tricloroacético

(TCA) y 1 ml de caseína, incubando, centrifugando y leyendo a 280 nm al igual que los problemas.

Las diferencias de lecturas entre problemas y testigos se interpolaron en una curva tipo de tirosina

(con límites de 0-300 µg/ml). La actividad fue expresada en unidades, siendo una unidad de

proteasa la cantidad de enzima que libera 1 µg de tirosina/min/ml (Chávez-Camarillo y Cruz-

Camarillo, 1984).

b) En virtud de que a lo largo de esta investigación hubo interferencias a 280 nm, causadas

por productos metabólicos secretados por el hongo (Clarkson y Charnley, 1996), se ensayó la

técnica de la azocaseína, que es un sustrato cromogénico. En este caso, la enzima hidroliza a la

azocaseína y libera péptidos coloreados de bajo peso molecular, los cuales alcanzan su máxima

absorbencia a 440 nm. Para este ensayo, la azocaseína fue disuelta al 2% en regulador de fosfatos

pH 7, eliminando por centrifugación, en caso de haberlos, aquellos grumos insolubles que pudieran

haberse formado. El ensayo consistió en colocar en un tubo de microcentrífuga 250 µl de sustrato y

150 µl de enzima, incubándolos a 25°C por 1 hora. Posteriormente se agregó 1.2 ml de TCA al

10%, para luego dejar reposar durante 15 min, y centrifugar a 10,000 rpm durante 5 min, agregando

después 1.4 ml de hidróxido de sodio 1.0 M a 1.2 ml del sobrenadantre obtenido, para desarrollar

23

color y así leer la absorbencia a 440 nm. Los testigos se prepararon de la misma manera que los

problemas, pero el TCA fue agregado antes que la enzima. En este caso la actividad está

expresada en unidades, siendo una unidad la cantidad de enzima que origina un cambio en la

absorbencia de 0.010 a 440 nm (Sarath et al., 1989).

2.5.2. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD QUITINOLÍTICA

Para la determinación de la actividad quitinolítica se utilizaron las técnicas que se describen

a continuación:

a) Método de los azúcares reductores. Esta técnica se basa en que la quitina, al ser

hidrolizada enzimáticamente da lugar a la formación de N-acetil-D-glucosamina (NAG), la cual

puede ser evaluada mediante su reacción con ácido 3,5, dinitrosalicílico, formando un compuesto

colorido con una máxima absorbencia a 535 nm.

Dado que las condiciones de reacción particulares para evaluar la quitinasa de P.

fumosoroseus, no fueron encontradas en la literatura, en la presente investigación se hicieron

ensayos variando temperaturas y tiempos de incubación, así como el pH de la reacción. La técnica

en general consistió en mezclar 1 ml del sobrenadante colectado con 1 ml del sustrato quitinoso. El

sustrato para este ensayo fue preparado al suspender 10 g de quitina coloidal (peso húmedo) en

100 ml de regulador de fosfatos 0.02M a pH 7, o bien en regulador citrato-fosfato, pH 5, incubando

la mezcla enzima-sustrato durante 1 h a 50°C. También la temperatura de incubación fue variada a

37 °C y los tiempos de incubación fueron de 1, 2, y 3 h. La reacción fue detenida al agregar 1 ml de

NaOH al 1%, para luego centrifugar a 10,000 rpm durante 15 min. Al combinar 1 ml de los diferentes

sobrenadantes (enzima), 1 ml de NaOH al 1% y después 1 ml del sustrato de quitina coloidal, en

ese orden, fueron preparados los testigos, que fueron sometidos a las mismas condiciones

experimentales que los problemas, esto es, el mismo tiempo y a la misma temperatura, así como la

centrifugación a 10,000 rpm durante 15 min. Luego fue tomado 1 ml de los sobrenadantes tanto de

los tubos problemas como de los testigos, para determinar los azúcares reductores (referidos como

NAG), añadiendo 1 ml del reactivo del ácido 3,5 dinitrosalicílico, y colocando los tubos en baño

24

maría a ebullición durante 5 min, diluyendo después con 2 ml de agua destilada, y enfriando al

chorro de agua de la llave, para leer la absorbencia del color desarrollado a 535 nm. Las lecturas se

interpolaron en una curva tipo de NAG (con límites de 0-5 µM/ml), para calcular la actividad como

unidades de enzima. Se consideró una unidad de quitinasa como la cantidad de enzima que libera 1

µM de NAG bajo las condiciones experimentales empleadas (Chávez-Camarillo y Cruz-Camarillo,

1984).

El ácido 3,5 dinotrosalicílico fue preparado disolviendo 5 g en 100 ml de NaOH 2N. A esta

mezcla se agregaron 150 g de tartrato de sodio y potasio disolviendo en caliente, aforando finalmete

a 500 ml con agua destilada y conservandolo en un frasco ámbar a temperatura ambiente.

b) Debido a que la actividad de quitinasa obtenida por el método de los azúcares reductores

fue muy baja en relación con el valor obtenido con la cepa de referencia Serratia marcescens WF,

para el ordenamiento final de los aislados se utilizó el método de evaluación de la producción de

quitinasa en medio liquido, usando quitina coloidal teñida como sustrato Este método tiene como

base la liberación del colorante unido a la quitina, cuando ésta es hidrolizada por la quitinasa

extracelular del hongo. Para la producción y la evaluación de la quitinasa fueron utilizados frascos

para antibióticos, conteniendo 10 ml del medio de Castañeda (sin citrato ni glicerol) con quitina

coloidal teñida al 2% (peso húmedo/volumen). Los frascos con el sustrato estéril (15 min a 121°C)

fueron inoculados con una suspensión de esporas equivalente a 106 UFC/ml, trabajando

simultáneamente con los 18 aislados. El cultivo, fue incubado en agitación a 28°C durante 13 días.

Cada 48 h se colectó un frasco para cada aislado, centrifugándo su contenido y leyendo después la

absorbencia del sobrenadante a 595 nm. Con este método fue posible llevar a cabo finalmente el

ordenamiento de los aislados fúngicos, de acuerdo con su nivel de producción de quitinasa. La

actividad se expresó en unidades, siendo una unidad la cantidad de enzima que origina un cambio

en la absorbencia de 0.010 a 595 nm (Gómez-Ramírez, 2000).

2.6. DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA TOTAL EN LOS SOBRENADANTES

25

Para calcular la actividad específica de proteasa en los sobrenadantes, se determinó la

cantidad de proteína soluble en los mismos, utilizando el método de Bradford (1976), el cual está

basado en la unión de un colorante a las proteínas. El complejo colorante-proteina tiene su máxima

absorbencia a 595 nm, y las lecturas son proporcionales a la concentración de proteína. Los datos

obtenidos son interpolados en una curva tipo de albúmina sérica bovina (0-22 µg/µl). Para este

ensayo, fueron mezclados 1 ml de sobrenadante con 1 ml de reactivo de Bradford (el cual es azul

brillante G disuelto en ácido fosfórico y metanol), agitando vigorosamente en un Vórtex, y leyendo la

absorbencia a 595 nm. En el caso de esta investigación, fue necesario hacer diluciones 1:5 de los

sobrenadantes, para obtener lecturas confiables.

2.7. BIOENSAYOS PARA DETERMINAR LA VIRULENCIA DE LOS AISLADOS

SELECCIONADOS

Una vez determinados los niveles de actividad enzimática de los 18 aislados de P.

fumosoroseus, doce de ellos se seleccionaron por haber exhibido actividad alta, media y baja de

proteasa y quitinasa (dos en cada caso). Con éstos, fueron realizados los bioensayos de virulencia

en ninfas de segundo estadio de mosquita blanca (Trialeurodes vaporariorum West), estadio en el

que esta especie de homóptero es mayormente susceptible al ataque de los conidios de P.

fumosoroseus (Vidal et al., 1996).

2.7.1. SELECCIÓN, MARCADO Y DESINFECCIÓN DE LAS NINFAS EN SEGUNDO ESTADIO

Se colectaron foliolos de frijol infestados con ninfas de mosquita blanca en varios estadios

de desarrollo. Los foliolos fueron revisados bajo un microscopio estereoscópico, con objeto de

seleccionar a las ninfas que se encontrasen en el segundo estadio (ver anexo del ciclo de vida de la

mosquita blanca). En este momento del desarrollo, estos insectos se caracterizan por tener forma

de escama aplanada; generalmente son transparentes y turgentes, con patas y antenas no

26

funcionales y miden aproximadamente 0.458 x 0.307 cm en promedio, seleccionado para todos los

experimentos 25 ninfas por foliolo que tuvieran dichas características, indicadoras de que los

insectos estaban sanos. Para poder reconocer y encontrar fácilmente las ninfas seleccionadas sobre

los foliolos, se hizo una pequeña marca (generalmente un punto diminuto) con un marcador

indeleble y punto fino al lado derecho de la ninfa seleccionada, así como una marca distintiva sobre

el foliolo (→) para poder determinar cual era el lado derecho del insecto (Vidal et al., 1996).

El siguiente paso en el desarrollo del bioensayo fue la desinfección de los foliolos, los cuales

fueron cortados previamente con un bisturí estéril en discos de 3.5 cm de diámetro, donde se

encontraban las ninfas seleccionadas. La disnfección consistió en sumergir los discos en alcohol al

70% por 2 seg, posteriormente pasarlos a agua destilada estéril durante 40 seg, y después

sumergirlos en una solución de hipoclorito de sodio al 2.5% por 20 seg. Seguido de esto, fueron

sumergidos tres veces en agua destilada por 40 seg cada vez (estas fueron las condiciones de

desinfección en las que no hubo muerte de las ninfas, ya que se ensayaron diferentes

concentraciones de hipoclorito de sodio y varios tiempos de desinfección). Cuando el proceso fue

completado, se secaron sobre papel filtro estéril e infectaron con los aislados seleccionados (Vidal et

al., 1996).

2.7.2. INFECCIÓN DE LAS NINFAS CON LOS AISLADOS SELECCIONADOS

Para hacer la infección de las ninfas dos con las concentraciones de conidios a probar,

obtenidas como se describió en la sección 2.4, los conidios fueron homogeneizados por agitación en

un Vórtex durante 1 min y colocados inmediatamente en cajas de Petri estériles de 5 cm de

diámetro, y en estas suspensiones de esporas se pusieron a flotar los discos por 1 min, teniendo

cuidado que el envés del foliolo con las ninfas tuviera contacto con los conidios. Posteriormente se

pasaron a cajas de Petri conteniendo medio KNOP (en g/l: KNO3, 0.125; CaNO3, 0.500; MgSO4,

0.125; KHPO4, 0.125; agar, 23) preparado con agua desionizada para evitar el marchitamiento

prematuro de los discos recortados de los foliolos (Vidal et al., 1996).

27

En el medio de cultivo, los discos fueron colocados de manera que las ninfas quedaran

arriba y el envés fuera visible, y el haz del foliolo permaneciera en contacto con el agar. Una vez

etiquetadas y selladas con parafilm, las cajas fueron incubadas a 26°C (+/- 1°C) a una humedad

relativa de 60%, y un fotoperiodo de 16:8 de luz-oscuridad, durante 24 horas, las tapas de las cajas

fueron reemplazadas por tapas con un orificio de 1 cm de diámetro, cubierto con filtros de papel

para cafetera eléctrica, para permitir el intercambio gaseoso y favorecer el crecimiento fúngico. Se

dejaron incubar por 9 días en las condiciones descritas, registrando, al término de los cuales el

número de ninfas que quedaron en segundo estadio, cuántas habían pasado al tercero o al cuarto y

cuántas habían llegado al estado adulto. En el caso de los adultos, fue necesario buscar la pupa

vacía junto a la marca hecha previamente, para determinar que el adulto realmente hubiese

emergido de las ninfas seleccionadas. Con objeto de verificar que P fumosoroseus fuera el agente

infeccioso responsable de la muerte de las ninfas, éstas fueron pasadas a un medio de agar-agua

(23 g/l) e incubadas a las condiciones señaladas durante 5-7 días.La fuente de nutrimentos fue el

propio cadáver de la ninfa.

El registro de los resultados se hizo de tres maneras:

a) Por porcentaje de ninfas que cambiaban de estadio; es decir, registrando las ninfas que

quedaron en segundo estadio, las que pasaron al tercero y las que pasaron a cuarto.

b) Por porcentaje de ninfas muertas, comprendiendo tres categorías: 1.- Mortalidad de

ninfas en estadio dos y tres. 2.- Mortalidad de ninfas sólo en cuarto estadio. 3.- Mortalidad total

(todos los estadios).

c) Por porcentaje de adultos emergidos

Los datos obtenidos se sometieron a análisis de varianza simple (ANOVA) a un nivel de

significancia del 5%; los tratamientos fueron cinco diluciones de conidios y un testigo; cada dilución

fue repetida tres veces. El análisis fue realizado para cada estadio ninfal por separado. Las

diferencias en promedios fueron analizadas posteriormente por medio de la prueba de Tukey

(Dowdy y Wearden, 1983).

28

Por otro lado, para cada aislado ensayado se calculó la CL50 (Finney, 1974), usando los

datos de porcentaje de ninfas 2, ya que éste es el estadio en el que las mosquitas son más

susceptibles al ataque fúngico, y puede tomarse como un indicador de que realmente murieron por

micosis.

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los resultados y su discusión serán abordados en dos grandes bloques para facilitar su

análisis. Primero serán referidos los datos de los aislados con base en su producción de proteasa, y

posteriormente los de la producción de quitinasa.

3.1. SELECCIÓN DE LOS MEDIOS MÁS ADECUADOS PARA EVALUAR EN MEDIO SÓLIDO, LA

PRODUCCIÓN DE PROTEASA

En esta primera fase de la investigación, se utilizaron los siete medios de cultivo señalados

en la tabla 3 adicionados con caseína al 1%, y sólo dos aislados de P. fumosoroseus, debido a que

en el momento en que se empezaron a instaurar las técnicas de evaluación enzimática en placa, no

se contaba aún con los 18 aislados que integrarían la colección. Como testigo positivo se utilizó

Serratia marcescens WF. También se incluyeron en los ensayos los hongos entomopatógenos:

Metarhizium anisopliae, M. anisopliae var. acridum y Verticillium lecanii, ya que en la literatura se les

reporta como buenos productores de proteasa (Rosato et al., 1981). La evaluación de esta enzima

se hizo tomando como base una escala en cruces, en la que no sólo se considera el tamaño sino el

aspecto de los halos de actividad enzimática.

La selección de los medios se basó en la observación de la presencia de halos más grandes

y transparentes, producidos exclusivamente por los aislados de P. fumosoroseus. En la tabla 4 puede

observarse que los mejores medios fueron el agar de glucosa Sabouraud, y el medio H adicionados

con caseína. En ambos casos se observaron halos transparentes, con el borde exterior opaco

alrededor de la colonia, lo cual no se observó en los otros medios, donde el halo, en caso de

presentarse, era completamente opaco. Por otra parte, los halos transparentes con bordes opacos

29

también fueron producidos por los dos aislados de M. anisopliae en agar de extracto de levadura,

medio H y medio sintético con citrato y glicerol, los tres adicionados con caseína. A todos estos

halos se les asignó el valor máximo de cinco. El medio de extracto de levadura y el sintético no

fueron considerados; los medios de interés, eran aquellos en los que P. fumosoroseus presentó los

halos que indicaban de mayor actividad.

Tabla 4. Evaluación de la producción en placa de proteasa por diversos aislados fúngicos

Medio + Aislados inductor (Observaciones hechas a las 24 y 48 h) Proteasa Verticillium lecaniiVerticillium lecaniiVerticillium lecaniiVerticillium lecanii Metarhizium anisopliae Metarhizium anisopliae Metarhizium anisopliae Metarhizium anisopliae

var acridum acridum acridum acridum MMMM. anisopliae . anisopliae . anisopliae . anisopliae var anisopliae anisopliae anisopliae anisopliae

Paecilomyces fumosoroseusPaecilomyces fumosoroseusPaecilomyces fumosoroseusPaecilomyces fumosoroseus Serratia marcescens WFSerratia marcescens WFSerratia marcescens WFSerratia marcescens WF

Vl EH-438 EH-495 EH-502 EH-465

EH-172

EH-506 EH-505

Caseína+ agua

++++ ++++ - ++++ - + ++ + +++

Medio sintético incompleto+Caseína

- - - - - - - - +++

Medio sintético completo+Caseína

- - - ++ +++++ +++++ + + +++

Medio CM+ Caseína

++ ++++ ++++ - - - + - +++

Agar de Glucosa Sabouraud+Caseína

- - - +++ - ++++ +++ ++++ +++

Agar micológico+Caseina

- - - - - + - - +++

Agar extracto de levadura+ Caseína

- - ++ ++ +++++ +++++ ++ ++ +++

Medio H+Caseína

- - - ++ +++++ +++++ ++++ ++++ +++

-= no hubo halo de degradación de caseína

Cada aislado fúngico es un caso diferente, ya que ninguno presentó producción de proteasa

en todos los medios. De acuerdo con St. Leger et. al, (1997) el número y tipo de proteasas son,

30

hasta cierto punto, dependientes de la cepa. Lo contrario sucedió con Serratia marcescens WF, ya

que presentó halos de proteólisis en todos los medios, y el aspecto de los mismos fue uniforme; lo

que señala que tiene una alta producción de proteasa, validando así el ensayo y poniendo de

manifiesto la importancia del medio utilizado para la producción de proteasas fúngicas, ya que esta

depende de la composición del medio y evidencía la presencia de sistemas de regulación muy

complicados. Con respecto a esto último, puede mencionarse que se observó la presencia de halos

tanto en medios relativamente pobres, como es el caso del agar-agua con caseína, como en medios

ricos como el H o el agar de glucosa-extracto de levadura. También puede destacarse, que en todos

los medios de cultivo se observó similar crecimiento de todas las especies fúngicas. Otro aspecto

fue que no se observó una posible represión catabólica por la presencia de glucosa o aminoácidos,

como lo señalaron Clarkson y Charnley (1996), ya que en varios medios con alto contenido de

glucosa, también se produjo la proteasa; aunque es posible que la enzima se haya formado una vez

que el carbohidrato fue consumido.

Este experimento permitió la selección del agar de glucosa Sabouraud y del medio H,

ambos adicionados con caseína al 1%, para la evaluación de proteasas en placa de los 18 aislados

de P. fumosoroseus.

3.2. PRODUCCIÓN DE PROTEASA EN MEDIO SÓLIDO POR 18 AISLADOS DE P. P. P. P.

fumosoroseusfumosoroseusfumosoroseusfumosoroseus

Cada uno de los 18 aislados se sembró en los dos medios seleccionados para la producción

de proteasa y se observó y midió el halo de hidrólisis de caseína a las 24 y 48 h (figura 2). Como

testigos se utilizaron a Serratia marcescens WF y M. anisopliae var acridum EH-502 (datos no

mostrados). En esta evaluación se utilizó tanto la escala en cruces como la relación diámetro de

halo/diámetro de colonia. Los resultados obtenidos están en la tabla 5. Estas escalas no son

estrictamente equivalentes, pues en la escala en cruces se considera además del tamaño del halo

el aspecto del mismo.

31

Figura 2. Aspecto de los halos de degradación de caseína en medio H y agar de glucosa Sabouraud adicionado con caseína al 1%. El aislado con el halo transparente con bordes opacos es EH-506, los otros dos son EH-508 y EH-517; este último presentó halos muy pequeños.

Tabla 5. Evaluación en placa de la producción de proteasa, de 18 aislados de P. fumosoroseusP. fumosoroseusP. fumosoroseusP. fumosoroseus Aislado de P. P. P. P. fumosoroseusfumosoroseusfumosoroseusfumosoroseus

Agar de glucosa Sabouraud+Caseína al 1% Medio H+Caseína al 1%

Escala en cruces

Relación colonia/halo 24 h


Escala en cruces



1 EH-503 + 0.46 1.13 + 1.05 0.9 2 EH-504 ++ 2.8 2.8 ++ 1.9 1.5 3 EH-505 ++ 1.94 1.72 ++++ 1.01 1.31 4 EH-506 ++++ 4.34 2.26 ++++ 3.61 2.95 5 EH-507 ++ 1.17 1.3 + 1.1 1.38 6 EH-508 ++++ 1.79 1.62 ++++ 1.63 1.59 7 EH-509 ++++ 2.3 1.04 ++++ 2 1.27 8 EH-510 + 0.47 1.11 + 0.68 1.18 9 EH-511 ++ 1.16 1.21 + 1.31 1.55 10 EH-512 ++++ 1.7 1.34 ++++ 1.9 1.2 11 EH-513 ++++ 1.9 1.5 ++++ 1.3 1.52 12 EH-514 ++++ 1.67 1.67 ++ 1.71 1.08 13 EH-515 ++++ 1.45 1.65 ++++ 1.8 1.37 14 EH-516 ++ 1.2 1.31 ++++ 1.34 1.4 15 EH-517 ++ 1.07 1.52 ++ 1.3 1.23 16 EH-518 ++ 1.84 1.61 ++ 1.84 1.57 17 EH-519 + 0.97 1.07 + 0.43 0.99 18 EH-520 + 0.14 0.43 + 0.32 1.36 Con los datos mostrados en la tabla 5, se hizo un ordenamiento preliminar de los aislados,

combinando los dos criterios de evaluación, ya que en algunos casos se obtenía un valor alto entre

la relación halo/colonia, pero el aspecto del halo era completamente opaco. En el medio H esto se

observó con los siguientes aislados: EH-516, EH-504, EH-517, EH-518, EH-505, EH-507 y EH-503,

los cuales presentaron a las 24 h una buena relación halo/colonia; sin embargo, por el aspecto del

halo se incluyeron entre los de mediana producción de proteasa. Es interesante observar que con

excepción de EH-510, EH-511 y EH-520, los demás aislados presentaron un descenso en el valor

de la relación halo/colonia, debido a que la colonia creció más rápidamente que el halo a las 48 h.

En el medio de agar de glucosa Sabouraud, a las 24 h también se observó que en algunos

casos se obtenían valores altos para la relación halo/colonia, pero el aspecto de los halos era

32

opaco; los aislados fueron, EH-504, EH-518, EH-507 y EH-514. Todos, a excepción del último,

presentaron el mismo aspecto en los dos medios, y EH-504, EH-518 y EH-507 fueron agrupadas

dentro de las medianas productoras. EH-514 se consideró como baja productora. En este caso,

también se observó que en la mayoría de los aislados, agrupados como tales, menos en EH-519,

EH-515, EH-517, EH-510, EH-520, EH-507 y EH-503, la relación halo/colonia disminuyó por el

crecimiento micelial. Estos resultados reflejan la variabilidad que puede existir entre los aislados de

una misma especie.

De manera general, pudo observarse que todos los aislados presentaron un crecimiento

algodonoso, aéreo, con la punta de las hifas fácilmente apreciable a simple vista en ambos medios

de cultivo. Tomando en cuenta el aspecto del halo y el valor de la relación halo/colonia, pudo

establecerse el ordenamiento señalado en la tabla 6. También, de acuerdo con el aspecto de los

halos en los dos medios de cultivo utilizados, se seleccionó el medio H, por ser en el que se observó

una mayor producción de proteasa en menos tiempo, para utilizarse sin agar en la siguiente fase,

referente a los estudios cinéticos de producción de proteasa en cultivo sumergido, de dos aislados

con alta, dos con media y dos con baja producción de proteasa.

Tabla 6. Ordenamiento preliminar de los 18 aislados de P. fumosoroseusP. fumosoroseusP. fumosoroseusP. fumosoroseus con base en la producción de proteasa en placa

Aislado Aspecto del halo Proteolíticos altos EH-506 Transparente, con el borde exterior opaco y muy delgado EH-509 Transparente, con un borde exterior opaco y muy delgado EH-515 Pequeña franja transparente y un grueso borde exterior opaco EH-513 Pequeña franja transparente y un grueso borde exterior opaco EH-512 Pequeña franja transparente y un grueso borde exterior opaco EH-514 Pequeña franja transparente y un grueso borde exterior opaco EH-508 Pequeña franja transparente y un grueso borde exterior opaco Proteolíticos medios EH-518 Opaco, con un valor de la relación halo/colonia alto EH-503 Opaco, con un valor de la relación halo/colonia alto EH-516 Opaco, con un valor de la relación halo/colonia alto EH-504 Opaco, con un valor de la relación halo/colonia alto EH-517 Opaco, con un valor de la relación halo/colonia alto EH-505 Opaco, con un valor de la relación halo/colonia alto EH-511 Opaco, con un valor de la relación halo/colonia alto EH-507 Opaco, con un valor de la relación halo/colonia alto

33

Proteolíticos bajos EH-520 Opaco, muy pequeño EH-510 Opaco, muy pequeño EH-519 Opaco, muy pequeño

3.3. CINÉTICAS DE PRODUCCIÓN DE PROTEASA EN CULTIVO SUMERGIDO

Una vez que se seleccionó el medio H con caseína al 1% para la producción de proteasa,

se pasó a la siguiente fase, que incluyó los estudios cinéticos en cultivo sumergido con dos aislados

altos, dos medios y dos bajos productores de proteasa, previamente seleccionados a partir de los

experimentos en placa (tabla 6).

Utilizando el medio H sin agar y adicionado con caseína al 1%, se hizo un estudio cinético

con EH-506, el aislado con mayor producción de proteasa en placa, para instaurar la técnica de

producción de enzima en cultivo sumergido con los seis aislados de P. fumosoroseus. Los

experimentos consistieron en inocular con 1 x 106 conidios/ml 13 matraces de 125 ml conteniendo

25 ml de medio. Cada 24 h se colectó un matraz y se centrifugó. Después se evaluó la actividad de

proteasa en los sobrenadantes por el método de Kunitz (1947). Se encontró que las absorbencias a

280 nm de los testigos del ensayo eran muy altas (datos no mostrados), lo que se atribuyó a algún

componente del medio de cultivo, ya que éste contiene peptona y extracto de levadura, de los

cuales el primero podría haber sido utilizado por el hongo, liberando algún aminoácido aromático

cuya absorción a 280 nm podría causar interferencia en los testigos. Por esta razón, se decidió

entonces cambiar el medio de cultivo H por medio sintético (tabla 3), sin citrato ni glicerol y

adicionado con desperdicio de camarón coloidal al 13-14%. Sin embargo, a pesar del cambio de

medio de cultivo, los testigos continuaban siendo altos, lo que se atribuyó entonces a productos

metabólicos del hongo, por ejemplo la beuvericina, que en su estructura tiene anillos aromáticos que

absorben fuertemente a 280 nm. La presencia de beuvericina en filtrados de cultivos de hongos

entomopatógenos ha sido reportada por Clarkson y Charnley (1996).

34

Con el medio sintético sin citrato ni glicerol adicionado con desperdicio de camarón coloidal,

se trabajó para la producción tanto de proteasa como de quitinasa, aunque en este punto se

describirán solamente los experimentos para proteasa. Los seis aislados con los que se trabajó

fueron: EH-506 y EH-509, que fueron los dos proteolíticos más altos en los ensayos en placa, los

dos medianos fueron EH-518 y EH-517, que dentro del ordenamiento estaban en el centro y los dos

aislados seleccionados como bajos proteolíticos fueron EH-519 y EH-510.

De manera general, en los aislados se observó que el sustrato quitinoso-proteico

desapareció entre las 96 y las 120 h de incubación. También se observó un aumento en el color de

los sobrenadantes a medida que transcurrió el tiempo (figura 3), este aumento de color se debió a

que el sustrato quitino-proteico utilizado contiene carotenos, los cuales son liberados durante la

hidrólisis del mismo por las enzimas del hongo. Este es un indicador indirecto de que sí se estaba

produciendo actividad de proteasa. Cabe mencionar además que en los cultivos de todos los

aislados se observó un cambio en el pH del medio, ya que se ajustó a 7 al inicio del experimento, y

a partir de las 24 h se observó un incremento hasta 8.

Figura 3. Aspecto de los sobrenadantes de los cultivos de P. fumosoroseus en un medio conteniendo desperdicio de camarón coloidal al 13-14%. El incremento en el color amarillo se debe a la paulatina liberación de sustancias carotenoides presentes en el desperdicio de camarón. De izquierda a derecha: tiempo cero a tiempo diez del ensayo.

La actividad proteolítica de los seis aislados puede ser observada en la figura 4. Es

importante notar que los trazos de las cinéticas son muy distintos, ya que cada aislado se comporta

de una manera diferente, esto hace que los tiempos de máxima producción sean diferentes para

cada aislado. Por ejemplo, EH-506 fue un aislado en el que tanto en las placas como en el cultivo

sumergido se presentó la actividad más alta; ésta se registró a los dos días, posteriormente a los

cinco días la actividad empezó a decaer, coincidiendo con la desaparición del sustrato en el medio;

dicha disminución de actividad podría deberse a un mecanismo de regulación observado con las

proteasas de B. bassiana (Shimizu et al., 1993), que se producen en menor cantidad cuando, al

hidrolizar cutículas de insectos dejan al descubierto la quitina de las mismas. En el caso de EH-509

se obtuvo una baja actividad comparada con los otros aislados, con un máximo de actividad a los

35

siete días. Es interesante mencionar que en la mayoría de los aislados ocurrió un aumento de la

actividad proteolítica a partir de los 10 días, debida probablemente a lisis celular, que libera

sustratos proteicos al medio, los cuales promovieron nueva síntesis de enzima y el consecuente

incremento en el crecimiento.

0

2

4

6

8

10

12

14

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Tiempo (d)

UP

/ml

EH-506

EH-509

EH-518

EH-519

EH-510

EH-503

Figura 4. Cinéticas de producción de proteasa en cultivo sumergido por los dos aislados altos, dos medios y dos bajos proteolíticos en medio sintético adicionado con desperdicio de camarón coloidal.

Los otros aislados con los que se trabajó fueron, EH-518, EH-519, EH-510 y EH-503, con

los cuales tampoco se observó alguna coincidencia en los tiempos requeridos para obtener la

máxima actividad, lo que refleja la gran variabilidad interespecífica de los distintos aislados. El caso

de EH-510 sí coincidió con el ordenamiento en placa, ya que estaba considerado de baja actividad,

comparada con la de EH-506, el aislado más proteolítico. Es importante mencionar que EH-510

mantuvo una actividad más o menos constante durante todo el experimento, presentando la máxima

actividad a las 72 h. Para EH-519 y EH-503 el comportamiento fue muy interesante, ya que a pesar

de haber presentado halos pequeños y opacos, indicio de baja producción de enzima, ahora

36

tuvieron actividades medias con respecto al aislado más proteolítico (EH-506). EH-519 presentó la

máxima actividad a las 96 h, mientras que EH-503 presentó dos puntos de máxima actividad; uno a

las 120 h y otro a las 264 h. Esta variación en las cinéticas de producción de enzima, señala

nuevamente la importancia del medio y las condiciones de cultivo utilizadas; además, el incremento

de actividad observado en el cultivo sumergido, con respecto a lo observado en las placas podría

deberse a que al pasar a medio liquido, el hongo tuvo mayor contacto con el sustrato, lo que pudo

comprobarse al microscopio, ya que se apreció cómo el micelio del hongo envolvía las partículas del

desperdicio de camarón, y cómo iba disminuyendo el tamaño y la cantidad de partículas durante el

transcurso del experimento. Esto coincide con lo reportado por St. Leger et al. (1986b), quienes

observaron que la degradación de la cutícula de los insectos estaba limitada a la vecindad de las

estructuras fúngicas de M. anisopliae.

De manera general, las altas y bajas en la actividad de proteasa podrían explicarse con lo

propuesto por St. Leger et al. (1987c) y Chul-Kang et al. (1998) para M. anisopliae donde sugieren

que esto puede estar reflejando la actividad conjunta de diferentes proteasas, algunas de las cuales

pueden estar desapareciendo y/o apareciendo, conforme el hongo va degradando el sustrato.

Varias proteasas semejantes a las de M. anisopliae han sido descritas en otros hongos

entomopatógenos, y es probable que se encuentren también en P. fumosoroseus; esto ha sido

comprobado por Shimizu et al. (1993), que reportan que las proteasas de B. bassiana, P.

fumosoroseus y M. anisopliae comparten antígenos comunes. Otra posible explicación es que

existan fenómenos de regulación complejos en los aislados, así como la producción y acumulación

en los sobrenadantes de compuestos metabólicos que absorben fuertemente a 280 nm como lo

señalan Clarkson y Charnley (1996), lo que provocaría cierta interferencia en las mediciones de la

actividad, distorsionando o alterando la tendencia de los trazos.

Debido a que los trazos de las cinéticas de producción de proteasa mostraron variación en

los tiempos de máxima producción ,no pudieron establecerse los dos tiempos apropiados para

trabajar con la colección completa, y hacer su comparación, por lo que se decidió realizar estudios

cinéticos con toda la colección, considerando siete tiempos, para obtener una mayor información,

que permitiera hacer el ordenamiento definitivo de los 18 aislados. Así mismo se decidió cambiar el

37

procedimiento para evaluar la actividad enzimática, substituyendo el método de Kunitz (1947) por el

de la azocaseína, para evitar la interferencia de los metabolitos fúngicos en los testigos, y tener un

ordenamiento más confiable.

3.4. ORDENAMIENTO DE LOS AISLADOS FÚNGICOS CON BASE EN LA PRODUCCIÓN DE

PROTEASA EN MEDIO LIQUIDO

En esta fase de la investigación se trabajó nuevamente con todos los aislados de P.

fumosoroseus, utilizando azocaseína como sustrato para evaluar la actividad. Para el desarrollo de la

técnica se hicieron ensayos de la reacción de la azocaseína con la enzima. a los 15, 20 y 30 min. Se

observaron resultados adecuados a este último tiempo.Con esta técnica se eliminó totalmente la

interferencia de los metabolitos fúngicos en los testigos.

Se utilizó el medio sintético, sin citrato ni glicerol y adicionado con desperdicio de camarón

al 13-14% (peso húmedo/volumen). Las muestras se colectaron a las 24 h y después cada 48 h

hasta completar siete muestras. En este caso, una unidad de proteasa es la cantidad de enzima que

origina un cambio en la absorbencia de 0.010 a 440 nm (Sarath et al., 1989).

Las máximas actividades se registraron a las 120 o 168 h para la mayoría de los aislados,

aunque otros la presentaron a las 312 h. El aislado EH-506, produjo 39.8 UP/ml a las 120 h, y fue el

más proteolítico. El aislado que presentó la actividad más baja fue el EH-509. EH-515 no presentó

actividad a las 72 h. En general, se observaron dos tendencias en la producción de la enzima; en

algunos aislados se alcanzó un máximo de actividad y luego se registró un descenso de la misma,

por ejemplo en EH-506, EH-514, EH-508, EH-510 o EH-503. Para los aislados EH-518 y EH-519 la

tendencia fue que se alcanzó un máximo de actividad, la cual se mantuvo más o menos estable.Los

resultados reflejan la variabilidad intraespecifica de los aislados (figuras 5, 6 y 7).

38

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

24 72 120 168 216 264 312

Tie m po (h)

UP

/ml

EH-503

EH-504

EH-505

EH-506

EH-507

EH-508

Figura 5. Cinética de producción de proteasa de seis aislados de P. fumosoroseus utilizando azocaseína.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

24 72 120 168 216 264 312

Tiem po (h)

UP

/ml

EH-509

EH-510

EH-11

EH-512

EH-513

EH-514


0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

24 72 120 168 216 264 312

T ie m p o (h )

UP

/ml

EH-515

EH-516

EH-517

EH-518

EH-519

EH-520


39

En las figuras anteriores, los datos se expresaron con base en la concentración enzimática.

Sin embargo, para fines comparativos se considera más adecuado hacer la comparación con base

en la actividad específica, en donde la actividad se expresa basándose en la concentración de

proteína de las muestras. En las figuras 8, 9 y 10, puede observarse la actividad específica de la

proteasa de todos los aislados, la cual, en algunos casos como el de EH-511 presentó un punto

máximo y luego, cayó, aunque de manera general, la actividad específica observada mostró una

tendencia relativamente estable.

0

50

100

150

200

250

300

350

400

0 24 h 72 h 120 h 168 h 216 h 264 h 312 h

Tiempo (h)

Act

ivid

ad e

spec

ífica

UP

/g

EH-503

EH-504

EH-505

EH-506

EH-507

EH-508

Figura 8. Actividad específica de proteasa de seis aislados de P. fumosoroseus.

0

50

100

150

200

250

0 24 h 72 h 120 h 168 h 216 h 264 h 312 h

Tiempo (h)

Act

ivid

ad e

spec

ífica

UP

/g

EH-509

EH-510

EH-511

EH-512

EH-513

EH-514

Figura 9. Actividad específica de proteasa de seis aislados de P. fumosoroseus.

40

0

50

100

150

200

250

0 24 h 72 h 120 h 168 h 216 h 264 h 312 h

Tiempo (h)

Act

ivid

ad e

spec

ífica

UP

/g

EH-515

EH-516

EH-517

EH-518

EH-519

EH-520

Figura 10. Actividad específica de proteasa de seis aislados de P. fumosoroseu.s

De acuerdo con estos resultados, se hizo un nuevo ordenamiento de los aislados, en el

cual EH-506 y EH-518 presentaron la actividad específica más alta, por lo que se seleccionaron

como los aislados de mayor producción de proteasa, en tanto que EH-509 y EH-503 presentaron la

actividad específica más baja, y EH-519 y EH-504 presentaron una actividad específica media.

Estos fueron los aislados que se seleccionaron para la siguiente fase de la investigación, que fue la

realización de bioensayos sobre mosquita blanca para poder establecer una correlación entre

virulencia y actividad enzimática.

3.5. BIOENSAYOS PARA DETERMINAR LA VIRULENCIA HACIA LA MOSQUITA BLANCA, DE

LOS AISLADOS SELECCIONADOS POR SU PRODUCCIÓN DE PROTEASA

Una vez que se seleccionaron los dos aislados con alta, media y baja actividad de proteasa,

se pasó a la siguiente fase de la investigación, que consistió en hacer bioensayos con ninfas de

mosquita blanca, para determinar la virulencia de cada aislado. Es importante señalar que los

experimentos se hicieron con aislados monospóricos para tener una población fúngica

genéticamente homogénea para poder evaluar su acción sobre los insectos.

41

Los bioensayos se realizaron por triplicado y en fechas distintas y los resultados

presentados son el promedio de las tres réplicas de los experimentos. Al cabo de 10 días de

incubación, que es el tiempo aproximado que tardan las ninfas en alcanzar el estado adulto, se

cuantificaron las ninfas que habían quedado en estadio dos, así como aquellas que habían pasado

a los estadios tres y cuatro, o que alcanzaron a llegar al estado adulto. En general, se observó que

las ninfas que habían permanecido en el estadio dos tenían un aspecto deshidratado, eran de color

amarillo obscuro, y muchas veces sólo permanecía su exoesqueleto sobre el foliolo, ya que al

colocar el cadáver sobre el medio de agar-agua, pudo observarse que el interior de la ninfa había

desaparecido, y que en su lugar había crecimiento micelial, permaneciendo así como momias

rellenas de hongos, como lo señalaron Goettel e Inglis (1997).

En el caso de las ninfas en estadio tres y cuatro, su aspecto era el de ninfas sanas, ya que

se veían turgentes y transparentes, y eran relativamente pocos los casos en los que se observaban

deshidratadas o con crecimiento micelial; esto ultimo sucedió sobre todo en las cajas con las

concentraciones de conidios más altas (4.7 x 106 y 4.7 x 105 conidios/ml). Con algunos aislados,

como EH-518 y EH-504 (alto y medio productor de proteasa respectivamente), las ninfas se veían

turgentes, pero con zonas oscuras, señal de melanización. Esta respuesta de los insectos a la

invasión fúngica ya fue reportada por St. Leger et al. (1986a) para Manduca sexta inoculada con M.

anisopliae.

Todas las ninfas, sin importar su aspecto, se pasaron al medio de agar-agua, para

constatar que realmente habían sido infectadas con el hongo, lo que se observó después de 5 a 7

días de incubación. Así, se observó que prácticamente todas las ninfas desarrollaban crecimiento

micelial. Cabe mencionar que el aspecto de ninfas sanas al final del experimento era propio de

aquellas que habían sido infectadas con las concentraciones más bajas de conidios (4.7 x 103 y 4.7

x 102 conidios/ml), esto coincide con lo mencionado por Vidal et al. (1996), quienes señalaron que

las ninfas se infectan en estadio dos, pero la micosis se manifiesta hasta el estadio cuatro,

presentando un aspecto de ninfas sanas hasta antes de llegar a dicho estadio. Un caso

especialmente interesante fue el del aislado que presentó la mayor actividad proteolítica, EH-506,

ya que en los foliolos tratados con las concentraciones de conidios más altas (4.7 x 106 y 4.7 x 105),

42

las ninfas prácticamente desaparecieron, y solo quedó la marca de tinta indeleble que evidenciaba

que ahí había estado la ninfa, lo que podría ser explicado con lo publicado por St. Leger et al.

(1996b), que señala que las proteasas inician la degradación cuticular de los insectos y permiten

que el hongo colonice al hospedante. Sin embargo el crecimiento micelial del aislado en cuestión

sobre el foliolo fue más bien ralo y escaso; mientras que con otros aislados con menos producción

de proteasa, por ejemplo EH-519, las ninfas se cubrieron completamente de micelio.

Algunas ninfas presentaron la tonalidad violeta-liláceo característica del crecimiento de P.

fumosoroseus, ya observada anteriormente en los experimentos en placa utilizando desperdicio de

camarón (figura 11).

Figura 11. Ninfa cuatro infectada con el aislado EH-509, en la cual se puede observar en la parte baja la tonalidad violeta liláceo (V), al término del tiempo del bioensayo.

3.5.1. PORCENTAJE DE CAMBIO DE ESTADO DE LAS NINFAS DE MOSQUITA BLANCA

TRATADAS CON LOS AISLADOS SELECCIONADOS POR SU PRODUCCIÓN DE PROTEASA

Para cuantificar la virulencia de los aislados de P. fumosoroseus, se tomó en cuenta la

concentración letal media (CL50) de cada aislado, que es la cantidad de conidios que se necesita

para matar a la mitad de los insectos a probar. Este valor se determina probando cinco

concentraciones diferentes de conidios y tomando en cuenta la mortalidad total. En este caso se

calculó tomando en cuenta sólo la mortalidad de ninfas en estadio dos, ya que era el estadio en el

que se tenía la certeza de que las ninfas estuviesen muertas, y utilizando las cinco concentraciones

de conidios. También se tomaron en cuenta las ninfas que permanecían en un estadio determinado:

así las ninfas que permanecieron en estadio dos (que no cambiaron al estadio inmediato), fueron

aquellas que murieron rápidamente después de haber sido infectadas (figura 12), esto sucedió con

las concentraciones más altas de conidios (4.7 x 106 y 4.7 x 105 conidios/ml). Sin embargo, las

ninfas que pasaron al estadio tres y cuatro lo hicieron porque no resultaron tan susceptibles al

ataque fúngico, lo cual se observó sobre todo en las concentraciones de conidios más bajas (4.7 x

102 y 4.7 x 103 conidios/ml).

43

Figura 12. Ninfa dos muerta. Obsérvese la tonalidad ámbar (A) que se presentaba, muchas veces era solamente el exoesqueleto lo que se apreciaba sobre el foliolo de frijol, a los diez días de la infección.

Para las ninfas de estadio dos, pudo establecerse de manera general con todos los

aislados, que las concentraciones de conidios más bajas (102 y 103 conidios/ml) resultaron inocuas,

ya que el porcentaje de ninfas encontradas después de 10 días de incubación fue semejante al del

testigo. Al incrementarse la concentración de conidios, a partir de 104 dicho cambio se limitó, por lo

que la diferencia de ninfas dos encontradas entre las concentraciones de conidios fue altamente

significativa (α=0.05) para todos los aislados, y casi en todos los casos las concentraciones de

conidios que limitó el cambio de estadio estuvo en el intervalo de 105 y 106 conidios/ml (figura 13 y

anexo de análisis estadístico).

0

10

2030

4050

6070

8090

100

EH-506 EH-518 EH-519 EH-504 EH-503 EH-509

Aislado

Nin

fas

que

perm

anec

iero

n en

es

tadi

o do

s (%

)

testigo

4.70E+06

4.70E+05

4.70E+04

4.70E+03

4.70E+02

Figura 13. Comparación del porcentaje de ninfas que permanecieron en segundo estadio al ser infectadas con diferentes concentraciones de conidios de aislados de P. fumosoroseus con alta (EH-506 y EH-518), media (EH-519 y EH-504) y baja (EH-503 y EH-509) actividad proteolítica, a los diez días de la infección. El aislado más virulento fue EH-506, (el cual mostró también la actividad proteolítica más

alta), pues un mayor número de ninfas permanecieron en el estadio dos, lo que muestra que como

la ninfa está ya infectada no puede pasar al siguiente estadio. Esto ocurrió aún con una

concentración baja de conidios (102 conidios/ml), donde el 36% en promedio de ninfas dos no

cambiaron de estadio (F5,12;0.05= 6.20, p<0.05; dt 5,12; 0.05=65.6). La alta virulencia de este aislado

(CL50, 1.1 x 103 conidios/ml) está demostrada por la baja concentración de conidios (103) que es

44

necesaria para matar el 50% de las ninfas infectadas. En comparación, cuando se usó la

concentración más baja de EH-504, el aislado menos virulento (102 conidios/ml) quedaron muy

pocas ninfas dos, lo que significa que la infección no fue mortal y permitió a la ninfa su cambio a

estadio tres.

Para poder calcular la CL50 de los aislados, se tuvo que comprobar que existía una

diferencia significativa (α=0.05) en el porcentaje de cambio de estadio de la ninfa dos infectada al

siguiente estadio tres, al estadio cuatro y al adulto (ver anexo de análisis estadístico) del ciclo de

vida de la mosquita blanca. Si la infección es mortal para la ninfa dos, ésta no cambia al estadio

tres, mas si la infección no es mortal, el ciclo de vida del insecto continúa y la ninfa dos cambia a

estadio tres. Como la prueba de CL50 se refiere a la concentración que mata el 50% de los insectos,

se tienen que utilizar diferentes concentraciones de conidios (106, 105, 104, 103, 102). Por lo tanto,

fue necesario preparar, para cada uno de los seis aislados seleccionados, cinco concentraciones

diferentes de conidios, e infectar con ellos ninfas dos. Luego se tuvo que verificar que había

diferencia significativa (α=0.05) en cuanto al cambio de estadio de ninfa dos a tres, para cada

aislado y cada concentración. Al haber significancia (α=0.05) en este cambio de estadio de ninfa

con las diferentes concentraciones, ya se pudo calcular la CL50 (ver anexo análisis estadístico).

Además, se calculó la CL50 en este estadio dos, ya que se tenía la certeza de que al cabo de los

diez días de duración del experimento, si la ninfa dos no había cambiado a ninfa tres era porque

estaba muerta ya que el cambio de estadio de ninfa dos a tres es aproximadamente entre tres y

cuatro días (ver anexo del ciclo de vida de la mosquita blanca). Por esto, no hay resultado para EH-

504 (figura 14), ya que no existió significancia (α=0.05) para cambios de estadio dos a tres en todas

las concentraciones estudiadas, con excepción de la concentración de 104 conidios (ver anexo de

análisis estadístico). Esto significa que este aislado es el menos virulento de todos, ya que en el

mismo tiempo, con las mismas concentraciones de conidios usadas para todos los aislados, el EH-

504 no fue capaz de matar el 50% de los insectos. Es importante mencionar que para este aislado

las ninfas presentaron manchas más obscuras, señal de que tuvieron una fuerte respuesta inmune

al ataque fúngico, fenómeno que ya ha sido reportado tanto para la langosta del desierto

Schistocerca gregaria (Bateman et al., 1996; Gillespie et al., 2000), como en otros insectos (Gillespie

et al., 1997).

45

En general, las CL50 observadas para los aislados proteolíticos estudiados fueron más bajas

que las reportadas por Vidal et al. (1997), utilizando P. fumosoroseus pero en otra especie de

mosquita blanca (Bemisia tabaci), ya que señalan haber obtenido CL50 que van desde 1.79 x 108

conidios/ml hasta 9.9 x 108 conidios/ml, mientras que con los aislados de México estudiados, la CL50

fluctuó entre 1.1 x 103 y 7.4 x 104 conidios/ml, lo que evidencia la gran variabilidad que puede haber

entre aislados de una misma especie fúngica (Brownbride et al., 2001; Vidal et al., 1997) pero

provenientes de diferentes regiones geográficas.

Para los otros aislados proteolíticos ensayados (EH-518, EH-519, EH-503 y EH-509), pudo

observarse (figura 13) una tendencia de concentración-respuesta, esto es, que a mayor

concentración de conidios, hubo una mayor cantidad de ninfas que no pasaron de estadio porque

murieron más rápidamente por la acción fúngica. Al descender la concentración de conidios, bajó

también la cantidad de ninfas que quedaron en estadio dos, permitiendo el cambio al estadio tres

del ciclo de vida de la mosquita blanca, lo que indica que no murieron de la infección. En cuanto a la

CL50, se observó que hay una relación parcial entre cantidad de enzima y virulencia, ya que

solamente el aislado considerado como altamente proteolítico (EH-506) fue también el más virulento

(0.11 x 104 conidios/ml) de todos los estudiados (figura 14). Solamente hubo diferencia significativa

(α=0.05) en la CL50 de este aislado al compararlo con los otros cuatro estudiados. Este fenómeno

coincide con lo señalado por Jackson et al. (1985) para 18 aislados de otro entomopatógeno, V.

lecanii, ya que no observaron una relación directa entre la virulencia hacia áfidos y la actividad de

proteasa del hongo. Esto también ha sido observado para M. anisopliae por Bateman et al. (1996),

ya que señalan que no hay una correlación significativa entre el tiempo letal medio (otra

determinación de la virulencia de aislados) y la actividad enzimática en la infección de este hongo en

la langosta. Estos fenómenos demuestran la complejidad de la relación hospedante/parásito, donde

intervienen factores tanto del hospedante (insecto), del parásito (hongo) y del ambiente.

Probablemente el análisis de los genes relacionados con la virulencia fúngica den la respuesta a por

qué ciertas actividades de proteasa (Pr1 para M. anisopliae, St. Leger et al., 1995) son

determinantes para el ataque a insectos, pero no necesariamente en grandes cantidades.

46

EH-506 EH-518 EH-519 EH-504 EH-503 EH-5090

10

20

30

4050

60

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Núm

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l

EH-506 EH-518 EH-519 EH-504 EH-503 EH-509

Aislado

Figura 14. Comparación de la virulencia promedio de la concentración letal media expresada en conidios/ml para ninfas dos al ser infectadas con diferentes concentraciones de conidios de aislados de P. fumosoroseus con alta (EH-506 y EH-518), media (EH-519 y EH-504) y baja (EH-503 y EH-509) actividad proteolítica, a los diez días de la infección.

El siguiente estadio ninfal cuantificado fue el de ninfa tres, ya que si las ninfas dos lograban

pasar de estadio, éste era el siguiente, o bien podían pasar luego al estadio cuatro o hasta adulto.

De manera general, se observó que sólo un porcentaje relativamente pequeño de insectos llegaron

al estadio tres (figura 15), ya que la mayoría o murieron en el estadio dos, o bien alcanzaron el

estadio cuatro, dependiendo de la concentración de conidios que se estuviera trabajando. En el

caso de las ninfas tratadas con los aislados EH-506 y EH-518 (altos productores de enzima) sólo un

porcentaje pequeño de ninfas llegó al estadio tres, y no con todas las concentraciones de conidios

(figura 16). Al estudiar el aislado EH-504, (producción media de proteasa), no se observaron ninfas

tres y para los aislados con menor producción de proteasa (EH-503 y EH-509), se observaron

porcentajes bajos de ninfas tres en todas las concentraciones de conidios ensayadas (5 al 33%).

47

Figura 15. Ninfa tres infectada. Nótese el color ambarino del exoesqueleto (CA); en la mayoría de los casos se observaban momias rellenas de hongos.

0

10

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40

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EH-506 EH-518 EH-519 EH-504 EH-503 EH-509

Aislado

Nin

fas

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)

testigo

4.70E+06

4.70E+05

4.70E+04

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4.70E+02

Figura 16. Comparación del porcentaje de ninfas que permanecieron en tercer estadio al ser infectadas con diferentes concentraciones de conidios de aislados de P. fumosoroseus, con alta (EH-506 y EH-518), media (EH-519 y EH-504) y baja (EH-503 y EH-509) actividad proteolítica, a los diez días de la infección. Con EH-504 no hubo ninfas de tercer estadio, ya que todas pasaron a ninfas cuatro.

El último estadio de desarrollo antes de llegar a ser adultos, es el de ninfa cuatro. Este caso

también fue cuantificado, ya que las ninfas que lograron cambiar, en su mayoría alcanzaban este

estadio (figura 17). Para los aislados probados, el porcentaje de cambio observado fue inverso al de

las ninfas dos; ésto es, que a mayor concentración de conidios (106 y 105), había una menor

cantidad de ninfas que alcanzaban el cuarto estadio, ya que éstas murieron poco después de tener

contacto con el hongo, y a medida que la concentración de conidios disminuyó, la cantidad de ninfas

que llegaron al último estadio aumentó (figura 17). Como era de esperarse, el aislado más

proteolítico, EH-506, no permitió que una gran cantidad de ninfas llegaran al último estadio, lo que

indica la alta virulencia de este aislado, ya que mata una gran cantidad de ninfas dos, aun con las

concentraciones más bajas de conidios, lo que no sucedió con el resto de los aislados. Por el

contrario, uno de los aislados con actividad proteolítica media (EH-504), no impidió que una gran

cantidad de ninfas (más del 50% para todas las concentraciones de conidios) llegaran al último

estadio; lo que sugiere que los conidios de este aislado son prácticamente inocuos para las ninfas

de mosquita blanca.

48

0

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20

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EH-506 EH-518 EH-519 EH-504 EH-503 EH-509

Ais lado

Nin

fas

que

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n cu

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)

testigo y adultos

4.70E+06

4.70E+05

4.70E+04

4.70E+03

4.70E+02

Figura 17. Porcentaje de ninfas que alcanzaron el cuarto estadio al ser infectadas con diferentes concentraciones de conidios de aislados de P. fumosoroseus, con alta (EH-506 y EH-518), media (EH-519 y EH-504), y baja (EH-503 y EH-509) actividad proteolítica, a los diez días de la infección. Las barras de color verde indican el porcentaje de emergencia de adultos cuantificado como pupas vacías de ninfas cuatro.

Con los otros aislados con que se trabajó, se observó una clara tendencia al aumento de

ninfas cuatro, conforme descendían las concentraciones de conidios utilizadas; en este caso, con

excepción de EH-503, todos los aislados tuvieron diferencias significativas (α=0.05) entre la

cantidad de ninfas cuatro obtenidas para cada concentración de conidios utilizada, es decir, que

mientras menos conidios, más ninfas cuatro.

Es interesante que todos los aislados probados exceptuando a EH-504, mostraron una alta

actividad patogénica cuando fueron utilizados en concentraciones superiores a los 104 conidios/ml.

En el caso de EH-504, sin embargo, prácticamente todas las concentraciones fueron inocuas. Esto

podría ser explicado parcialmente por la susceptibilidad de los insectos hacia cierta cantidad de

esporas en los diferentes estadios ninfales, como lo señalaron Brownbride et al. (2001) para las

ninfas de T. vaporariorum en segundo estadio al ser infectadas con Aschersonia aleyrodis. Otro

aspecto a tomar en cuenta es que los aislados de alta capacidad proteolítica mostraron también alta

virulencia (expresada como CL50). Este comportamiento puede atribuirse parcialmente a dicha

enzima, como lo señalan St. Leger et al. (1986b-1996a) para M. anisopliae. Sin embargo, en el caso

de los otros aislados, no pudo observarse una disminución proporcional de la virulencia (expresada

49

como CL50), al utilizar aislados con producción media o baja capacidad proteolítica, lo que podría

explicarse tomando en cuenta que la interacción hospedante-parásito es una relación sumamente

compleja, que involucra muchos otros factores y no sólo la producción de enzimas. En estos

términos, las variaciones de virulencia para M. anisopliae fueron explicadas por Gillespie et al.

(1998) al observar que puede haber diferencias entre la cantidad, tipo y carga de las enzimas, así

como el grado de endurecimiento de la cutícula del hospedante, dependiendo de la cercanía en

tiempo de la muda, lo que influye en la degradación cuticular del insecto por aislados de una misma

especie, y así las propiedades de las enzimas que degradan la cutícula pueden no ser las óptimas

para todos los hospedantes, lo que es probable que suceda en otros hongos entomopatógenos

tales como P. fumosoroseus.

3.5.2. PORCENTAJE DE MORTALIDAD POR ESTADIOS PARA LAS NINFAS TRATADAS CON

LOS AISLADOS SELECCIONADOS POR SU PRODUCCIÓN DE PROTEASA

Otra manera de analizar los datos obtenidos, consistió en tomar en cuenta las ninfas

muertas al final de los 10 días de incubación y ordenarlas en tres grupos de acuerdo con lo

propuesto por Vidal et al. (1996). La razón de tomar en cuenta los datos de mortalidad total, en

lugar de los datos de mortalidad por micosis fue que al terminar los 5 días de incubación de las

ninfas en agar agua, prácticamente todas las ninfas desarrollaban un crecimiento fúngico, por lo que

los porcentajes de mortalidad por micosis fue de casi el 100% para todos los aislados (datos no

mostrados).

El primer grupo de mortalidad fue el que comprendió a las ninfas de segundo y tercer

estadio; estas últimas se consideraban muertas al presentar crecimiento micelial. Para el caso de

los aislados proteolítcos seleccionados, los porcentajes obtenidos fueron muy semejantes a los

observados con las ninfas dos en la evaluación del porcentaje de cambio de estadio, ya que la

mortalidad para ninfas dos y tres, en las concentraciones altas de conidios, se presentó un mayor

número de muertes, mientras que con las concentraciones más bajas, el porcentaje de muertos fue

muy semejante al obtenido para el testigo (figura 18), lo que señala que es necesaria una cierta

cantidad de conidios para que los insectos sean susceptibles al ataque fúngico y dicha

50

susceptibilidad aumenta conforme aumenta también la cantidad de conidios. Nuevamente, el aislado

con el que se observó una mayor mortalidad fue con EH-506, el proteolítico más alto, ya que con

una de las concentraciones de conidios más bajas (103), se observó un porcentaje de mortalidad de

más del 60%. En el caso de EH-504, se observó una mortalidad baja de ninfas dos en todos las

concentraciones de conidios probadas, lo que indica que dichas concentraciones fueron inocuas

para las ninfas tratadas con este hongo. En el resto de los aislados pudo observarse que conforme

disminuía la cantidad de inóculo, disminuía también la cantidad de muertos.

0

1020

304050

6070

8090

100

EH-506 EH-518 EH-519 EH-504 EH-503 EH-509

Aislado

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nfas

dos

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es (%

)

testigo

4.70E+06

4.70E+05

4.70E+04

4.70E+03

4.70E+02

Figura 18. Comparación del porcentaje de ninfas que murieron en segundo y tercer estadio al ser infectadas con diferentes concentraciones de conidios de aislados P. fumosoroseus, con alta (EH-506 y EH-518), media (EH-519 y EH-504), y baja (EH-503 y EH-509) actividad proteolítica a los diez días de la infección.

La mortalidad observada en el testigo de EH-519 es semejante a la observada en algunas

de las concentraciones de conidios, aunque esto probablemente se debió al manejo de los foliolos o

bien al proceso de desinfección, por lo que fue necesario hacer un procedimiento estadístico, que

fue la corrección de Abbott (1925), para que los datos fuesen válidos.

El siguiente grupo de mortalidad que se tomó en cuenta fue la registrada sólo para ninfas

en cuarto estadio, tomando como ninfas muertas a aquellas que presentaran crecimiento micelial o

51

esporulación al cabo de los 10 días de incubación. Para los aislados seleccionados, los porcentajes

más altos de ninfas cuatro muertas se obtuvieron con las concentraciones más bajas de conidos

(102 y 103 /ml), mientras que los porcentajes más bajos fueron los que se observaron en las

concentraciones más altas, esto es, que a mayor concentración de conidios/ml hubo una menor

cantidad de ninfas que llegaba a estadio cuatro. En el caso de los aislados EH-506 y EH-509 (alta y

baja producción de proteasa respectivamente) no hubo ninfas cuatro muertas, ya que la mayoría de

las ninfas que se encontraban tenían un aspecto turgente y transparente como si estuvieran vivas;

mientras que para el resto de los aislados las ninfas cuatro muertas no rebasaron el 60%; tomando

como 100% las 75 ninfas infectadas con cada concentración de conidios a probar Sin embargo, las

diferencias entre las concentraciones de conidios y la cantidad de ninfas cuatro muertas en cada

una de ellas no fueron significativas. En el caso del testigo tratado sólo con agua destilada, no se

observaron ninfas cuatro muertas. Al pasar las ninfas problema al agar agua, pudo observarse

crecimiento micelial en prácticamente todas.

El último grupo de mortalidad tomado en cuenta, fue la total, que incluyó la de todos los

estadios (segundo, tercero y cuarto). En este caso, los aislados EH-519 y EH-503 (media y baja

producción proteolítica respectivamente), no presentaron diferencias significativas (α=0.05) entre las

concentraciones de conidios/ml y la mortalidad total registrada en cada una de ellas. En todos los

aislados, con excepción de EH-504 (con actividad de proteasa media), la mortalidad total no rebasó

aproximadamente el 30% para todas las concentraciones de conidios (figura 19). Contrario a lo que

podría esperarse, EH-506 (actividad proteolítica alta), no fue el aislado que produjo una mayor

mortalidad total, ya que no hubo ninfas cuatro muertas. Otro caso interesante es el de EH-503, que

con una baja producción de proteasa pero alta producción de quitinasa, también mostró una

mortalidad total muy alta. En EH-506, EH-518 y EH-509 se pudo observar una tendencia a la

relación concentración respuesta, ya que a mayor cantidad de conidios, mayor mortalidad total.

52

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2 0

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EH- 5 0 6 EH - 5 1 8 EH- 5 1 9 EH - 5 0 4 EH- 5 0 3 EH - 5 0 9

A is la d o

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4 .7 0 E+ 0 6

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4 .7 0 E+ 0 3

4 .7 0 E+ 0 2

Figura 19. Comparación del porcentaje de mortalidad total de ninfas infectadas con diferentes concentraciones de conidios de aislados de P. fumosoroseus, con alta (EH-506 y EH-518), media (EH-519 y EH-504) y baja (EH-503 y EH-509) actividad proteolítica.

3.5.3. PORCENTAJE DE EMERGENCIA DE ADULTOS DE LAS NINFAS TRATADAS CON LOS

AISLADOS SELECCIONADOS POR SU PRODUCCIÓN DE PROTEASA

Otro dato registrado fue el porcentaje de emergencia de adultos, ya que se consideró al

principio de los bioensayos que a mayor cantidad de adultos presentes, la virulencia sería menor,

pues las ninfas habrían logrado alcanzar su estado adulto. Sin embargo, fueron muy pocos los

adultos encontrados al ensayar todos los aislados, aún en las concentraciones más bajas. Pudo

observarse que las ninfas cuatro ya estaban en la fase de pseudopupa, en la cual ya se podían ver

los ojos y alas del adulto a través de la cutícula de la ninfa, lo que indicaba que en cuestión de horas

el adulto emergería.

Se observó con EH-506 (actividad proteolítica alta), la ausencia de adultos, sin embargo,

algunas ninfas cuatro estaban ya en la fase de pseudopupa, a punto de eclosionar como adulto. En

el testigo se observó la mayor presencia de adultos, lo que confirmó que las ninfas seleccionadas

para los bioensayos habían sido insectos sanos que pudieron completar su desarrollo.

3.6. SELECCIÓN DE LOS MEDIOS MÁS ADECUADOS PARA EVALUAR, EN PLACA, LA

PRODUCCIÓN DE QUITINASA

53

En esta fase de la investigación, se trabajó también con los siete medios de cultivo

señalados en la tabla 3, a los cuales se les agregó desperdicio de camarón coloidal al 13-14% (peso

húmedo/volumen), o quitina coloidal a la misma concentración, resultando un total de 15 medios que

contenían inductores para quitinasa. Al igual que ocurrió en el caso de la proteasa, en el momento

que comenzó a instaurarse la técnica de evaluación en placa, no se contaba con los 18 aislados que

integrarían la colección de trabajo, por lo que se iniciaron las evaluaciones en placa con solo 2

aislados de P. fumosoroseus, esperando hacer una selección del medio más adecuado para las

posteriores evaluaciones con los 18 aislados. Como testigo positivo se utilizó nuevamente a Serratia

marcescens WF, debido a que es un extraordinario quitinolítico, y también se incluyeron a las mismas

especies fúngicas, usadas para la evaluación de proteasa, ya que se les reporta también como

quitinolíticos (Rosato et al., 1981). La evaluación se hizo con una escala en cruces, basándose en el

tamaño relativo de los halos transparentes alrededor de la colonia.

En la tabla 7 puede observarse que los mejores medios para la producción de quitinasa por

P. fumosoroseus fueron, el agar-agua adicionado con desperdicio de camarón, y el medio sintético

con la misma adición. En ambos casos se observó la solubilización de las partículas del sustrato

alrededor de las colonias. Es interesante mencionar que en los otros medios, en los que se

encontraban otras fuentes de carbono o nitrógeno, además de la quitina coloidal o el desperdicio de

camarón coloidal, no se observó actividad. Además el crecimiento micelial en aquellos medios

donde se presentó actividad quitinolítica, fue ralo y escaso; mientras que en los medios que tenían

otras fuentes de carbono y nitrógeno, el crecimiento fue más abundante y con un aspecto más

algodonoso, lo que fue debido probablemente a que el hongo no precisaba usar el sustrato

quitinoso, ya que en términos energéticos es más fácil para el organismo utilizar los otros

nutrimentos presentes en el medio, o bien, se observó algo semejante a los señalado por Askary et

al. (1999) para V. lecanii en el sentido de que las características de crecimiento están relacionadas

con las actividades enzimáticas y la virulencia. Otro aspecto a considerar es que el microorganismo

de referencia, S. marcescens WF creció en todos los medios, y en todos ellos produjo halos grandes y

transparentes de actividad quitinolítica, lo que validó el experimento. Una vez que se seleccionaron

el agar-agua con desperdicio de camarón, y el medio sintético adicionado con desperdicio de

camarón, como los mas propicios, se trabajó con ellos para la evaluación en placa de la quitinasa de

54

los 18 aislados de P. fumosoroseus. Con los resultados obtenidos se hizo un ordenamiento preliminar

de los aislados y se seleccionó un solo medio de cultivo, para utilizarlo, sin agar, para los estudios

cinéticos posteriores en cultivo sumergido.

55

Tabla 7. Evaluación de la producción de quitinasa en placa por diversos aislados fúngicos, utilizando distintos medios de cultivo Medio + Aislados inductor (Observaciones hechas a las 48 y 72 h) Quitinasa Verticillium lecaniiVerticillium lecaniiVerticillium lecaniiVerticillium lecanii Metarhizium anisopliae Metarhizium anisopliae Metarhizium anisopliae Metarhizium anisopliae

var acridumacridumacridumacridum M. anisopliae M. anisopliae M. anisopliae M. anisopliae var anisopliaeanisopliaeanisopliaeanisopliae

Paecilomyces fumosoroseus Paecilomyces fumosoroseus Paecilomyces fumosoroseus Paecilomyces fumosoroseus S. marcescensS. marcescensS. marcescensS. marcescens WF

Vl EH-348 EH-495 EH-502 EH-465 EH-172

EH-506 EH-505

Desp. camarón + agua

+++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++++

Quitina+agua

++ ++ ++++ ++++ - - ++++ - +++++ Medio sintético incompleto+ desp. camarón

+++ ++++ +++ +++ ++++ ++++ +++ +++ +++++

Medio sintético incompleto+ quitina

++ ++++ ++ ++ - - +++ ++ +++++

Medio sintético completo+ desp. camarón

+++ ++++ - - +++ +++ +++ ++ +++++

Medio sintético completo+ quitina

+ + - - - - +++ + +++++

Medio CM+ Desp. camarón

- - - - ++ ++ - - +++++

Medio CM+quitina

- - - - - - -- - +++++

Agar de Glucosa Sabouraud+ desp. camarón

- - - - - - - - +++

Agar de Glucosa Sabouraud+ quitina

- - - - - - - - +++

Agar micológico+ desp. camarón

+ + - - - - - - +++

Agar extracto de levadura+ desp. camarón

- - - - - - - - +++

Agar extracto de levadura +quitina

- - - - - - - - +++

Medio H+desp. camarón

- - - - - - - - +++

Medio H+quitina - - - - - - - - +++ - = no hubo halo de hidrólisis del sustrato quitinoso

56

3.7. PRODUCCIÓN DE QUITINASA EN MEDIO SÓLIDO POR 18 AISLADOS DE P. fumosoroseusP. fumosoroseusP. fumosoroseusP. fumosoroseus

En esta fase de la investigación, ya se había reunido la colección completa de aislados de

P. fumosoroseus, de modo que los 18 aislados se sembraron en agar-agua y en el medio sintético sin

citrato ni glicerol, ambos adicionados con desperdicio de camarón y agar. Los halos de hidrólisis se

evaluaron a las 48 y 72 h. Como testigos se utilizaron a S. marcescens WF y a M. anisopliae EH-465

(datos no mostrados). En este caso, se utilizó para evaluar la actividad una escala en cruces y la

relación diámetro de halo de quitinólisis/diámetro de colonia. Los resultados obtenidos están en la

tabla 8.

Tabla 8. Evaluación en placa de la producción de quitinasa de 18 aislados de P. fumosoroseusP. fumosoroseusP. fumosoroseusP. fumosoroseus Aislado de P. P. P. P. fumosoroseusfumosoroseusfumosoroseusfumosoroseus

Agar agua + desperdicio de camarón al 13-14 %

Medio sintético de Castañeda+ desperdicio de camarón al 13-14 %

Escala en cruces



Escala en cruces



EH-503 +++ 1.4 1.2 ++++ 4.7 1.4 EH-504 + 1.7 1.3 ++ 1.4 1.9 EH-505 +++ 2.8 1.5 ++++ 4 5.2 EH-506 +++ 2.8 1.8 ++++ 4.3 1.4 EH-507 + 2.4 1.4 ++ 2.3 1.7 EH-508 + 1.8 2.25 +++ 4.25 2 EH-509 + 2.4 2.4 ++++ 2.5 1.7 EH-510 + 3 1.3 + 1.2 1.6 EH-511 +++ 4 1.5 ++ 2.8 1.6 EH-512 +++ 1.8 2.3 ++ 2.4 1.5 EH-513 - 0 0 ++++ 4.25 1.3 EH-514 + 1.9 1.1 ++++ 4.25 1.8 EH-515 +++ 2.4 1.1 ++ 2.7 1.3 EH-516 + 3 1.3 ++++ 4 2 EH-517 +++ 1.6 1.2 ++ 2.5 1.2 EH-518 + 3 1.4 +++ 2.6 1.25 EH-519 + 1.6 1.4 +++ 2.3 1.5 EH-520 + 2.8 1.5 ++ 1.4 2.7

En general, el crecimiento micelial observado en ambos medios de cultivo fue ralo y

compacto (figura 20), además en la mayoría de los aislados se observó con el paso del tiempo, la

formación de un pigmento violeta-liláceo en el revés de la colonia, debido probablemente a la

acumulación de productos metabólicos, como puede ser el caso de pigmentos. El testigo S.

57

marcescens WF mostró un gran halo de hidrólisis desde las 24 h y M. anisopliae EH-465 presentó

también un gran halo a partir de las 48 h.

Figura 20. Aspecto de los halos de quitinasa de aislados de P. fumosoroseus en medio sintético sin citrato ni glicerol y adicionado con desperdicio de camarón al 13-14% (peso húmedo/volumen).

En el medio agar-agua con desperdicio de camarón, siete de los 18 aislados mostraron una

buena producción de quitinasa; otros diez presentaron una baja actividad en tanto que el aislado

EH-513, no presentó ninguna actividad. En el caso de la escala numérica basada en la relación de

diámetro de halo/diámetro de colonia, no se observaron aislados con producción media; sin

embargo el aspecto del halo sí permitió ordenar los aislados en intermedios, altos y bajos

quitinolíticos. Cabe mencionar que la relación halo/colonia fue más alta a las 48 que a las 72 h,

para 16 de los 18 aislados, lo que puede deberse a que en cierto momento el crecimiento micelial

fue más rápido que el crecimiento del halo de hidrólisis.

Por otro lado, en el medio sintético adicionado con desperdicio de camarón, pudo

observarse una buena producción de quitinasa de casi todos los aislados, sin embargo, la relación

58

halo/colonia disminuyó a las 48 h con excepción de EH-505, en el cual se observó un aumento en el

diámetro del halo con respecto al diámetro de la colonia.

Tabla 9. Ordenamiento de los 18 aislados de P. fumosoroseusP. fumosoroseusP. fumosoroseusP. fumosoroseus con base en su producción de quitinasa en placa

Aislado Aspecto del halo Quitinolíticos altos EH-506 Transparente, relación halo/colinia alta EH-509 Transparente, relación halo/colinia alta EH-510 Transparente, relación halo/colinia alta EH-505 Transparente, relación halo/colinia alta EH-513 Transparente, relación halo/colinia alta EH-519 Transparente, relación halo/colinia alta Quitinolíticos medios EH-516 Ligeramente opaco, relación halo/colinia alta EH-514 Ligeramente opaco, relación halo/colinia alta EH-508 Ligeramente opaco, relación halo/colinia alta EH-518 Ligeramente opaco, relación halo/colinia alta EH-504 Ligeramente opaco, relación halo/colinia alta EH-512 Ligeramente opaco, relación halo/colinia alta EH-515 Ligeramente opaco, relación halo/colinia alta EH-520 Ligeramente opaco, relación halo/colinia alta EH-511 Ligeramente opaco, relación halo/colinia alta Quitinolíticos bajos EH-507 Opaco, difícil de apreciar, relación halo/colonia alta EH-503 Opaco, difícil de apreciar, relación halo/colonia alta EH-517 Opaco, difícil de apreciar, relación halo/colonia alta

A partir de los datos obtenidos en estos experimentos, se escogió el medio sintético

adicionado con desperdicio de camarón al 13-14% (peso húmedo/volumen) como el más propicio

para emplearse en la siguiente fase del trabajo, que incluyó estudios cinéticos de la producción de

quitinasa en cultivo sumergido, por los dos aislados más quitinolíticos, los dos intermedios y los dos

más bajos productores de la enzima.

3.8 CINÉTICAS DE PRODUCCIÓN DE QUITINASA EN CULTIVO SUMERGIDO

Tomando como base los datos mostrados en la tabla 9, se procedió luego a realizar

estudios cinéticos utilizando el medio sintético sin citrato ni glicerol y adicionado de desperdicio de

camarón al 13-14%, escogiendo los seis aislados siguientes: como altos EH-506 y EH-509; como

59

medianos EH-514 y EH-516; y como bajos EH-503 y EH-517. En la figura 21 se muestran las

respectivas cinéticas de producción de quitinasa por los aislados referidos.

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Tiempo (d)

UQ

/ml

EH-516

EH-506

EH-509

EH-503

EH-514

EH-517

Figura 21. Cinéticas de producción de quitinasa en cultivo sumergido determinado por el método del DNS para dos aislados altos, dos medios y dos bajos quitinolíticos, en un medio sintético adicionado con desperdicio de camarón coloidal.

De manera general, pudo observarse que el sustrato quitino-proteico desapareció

aproximadamente a las 120-144 h en todos los casos, también pudo observarse una elevación del

pH del cultivo, el cual había sido ajustado a 7 y aumentó a 8, y así permaneció hasta el final del

experimento.

En los resultados mostrados en la figura 21 puede observarse una actividad quitinolítica

muy baja; en la que ninguno de los aislados alcanza al menos 1 UQ/ml. Una unidad de quitinasa es

la cantidad de enzima necesaria para producir 1µM de NAG/ml al cabo de una hora de incubación.

Esto hace dudar de que los ensayos previos en placa hubieran mostrado realmente una actividad de

quitinasa. Probablemente los halos encontrados mostraban la acción conjunta de proteasa y

quitinasa, y quizá mas de la primera que de la segunda. Cabe aclarar que en estos ensayos se

incluyó a S. marcescens WF y este microorganismo dio altos valores de quitinasa (datos no

mostrados); lo que indicó que no se estaban haciendo mal las determinaciones. Por lo tanto hubo

que considerar que el ensayo con DNS es poco sensible para evaluar muy bajas cantidades de

quitinasa; por esa razón se decidió usar la técnica propuesta por Gómez-Ramírez (2000), para

60

seleccionar cepas quitinolíticas de Bacillus thuringiensis, las cuales poseen también muy baja

actividad. Dicha técnica sirvió para realizar el ordenamiento de los aislados.

3.9 ORDENAMIENTO DE LOS AISLADOS FÚNGICOS CON BASE EN LA PRODUCCIÓN DE

QUITINASA

Debido a que los valores de la actividad de quitinasa obtenidos con el método de los

azucares reductores fue muy baja y esto dificultaba un adecuado ordenamiento de los aislados con

base en su capacidad para producir dicha enzima, se decidió utilizar el método de la quitina coloidal

teñida con azul brillante de remazol, ya que es más sencilla y sensible, y permite detectar de

manera confiable la actividad quitinolítica por muy baja que ésta sea. Otro inconveniente fue que a

partir de los resultados obtenidos en los estudios cinéticos evaluando con el método del DNS, no

pudieron establecerse dos tiempos de máxima actividad, debido a la gran variabilidad de resultados

entre aislados de una misma especie, por lo que se hizo un estudio cinético de la producción de

enzima, colectando los sobrenadantes de los cultivos a las 24 y luego cada 48 h hasta completar 13

días, para obtener mayor información y hacer un ordenamiento más confiable.

La absorbencia de los sobrenadantes colectados se leyó directamente a 595 nm y

posteriormente se hizo la conversión a UQ/ml, en este caso 1UQ/ml es la cantidad de enzima

necesaria para provocar un cambio de 0.010 en la absorbencia. Los resultados obtenidos están en

las figuras 22, 23 y 24, donde puede apreciarse que los tiempos de máxima producción de quitinasa

fueron a las 264 y 312 h en la mayoría de los aislados, lo que coincide con lo señalado por Chul-

Kang et al. (1998), quienes reportan que M. anisopliae produce las actividades mas altas de

quitinasa al final de crecimiento, al cultivar el hongo en quitina coloidal como única fuente de

carbono y de nitrógeno. Así mismo, puede observarse que los dos aislados con mayor actividad

fueron EH-503 y EH-509. Debido a que el sobrenadante obtenido es de color azul, no se pudo

determinar la cantidad de proteína para luego calcular la actividad específica, ya que el reactivo de

Bradford (1947) tiene también su máxima absorbencia a 595 nm.

61

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

24 72 120 168 216 264 312

Tie m po (h)

UQ

/ml

EH-503

EH-504

EH-505

EH-506

EH-507

EH-508

Figura 22. Cinética de producción de quitinasa de seis aislados de P. fumosoroseus utilizando quitina coloidal teñida.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

24 72 120 168 216 264 312

Tie m po (h)

UQ

/ml

EH-509

EH-510

EH-511

EH-512

EH-513

EH-514


01020

3040506070

8090

100

24 72 120 168 216 264 312

Tie m po (h)

UQ

/ml

EH-515

EH-516

EH-517

EH-518

EH-519

EH-520


62

De acuerdo con estos resultados, los dos aislados con actividad quitinolítica más alta fueron

EH-503 y EH-509, los medios EH-510 y EH-511, y los más bajos EH-520 y EH-516. Estos seis

aislados se seleccionaron para la siguiente fase de la investigación, que fue el establecer una

correlación entre la producción de enzimas y la virulencia, mediante la realización de bioensayos.

3.10. BIOENSAYOS PARA DETERMINAR LA VIRULENCIA HACIA LA MOSQUITA BLANCA DE

LOS AISLADOS SELECCIONADOS POR SU PRODUCCIÓN DE QUITINASA

De la misma manera que con los aislados seleccionados por su actividad proteolítica,

aquellos dos con alta, media y baja actividad de quitinasa, se pasó a la siguiente fase de la

investigación, que fue la realización de los bioensayos con mosquita blanca. En este caso, no pudo

contarse con el cultivo monospórico de EH-510 (producción media de quitinasa), por lo que dicho

aislado no se incluyó en las pruebas de virulencia. Para los aislados ensayados, de manera general,

se observaron las momias rellenas de hongos para las ninfas que quedaron en estadio dos al final

del tiempo de incubación del experimento, y para los estadios tres y cuatro, la mayoría de las ninfas

tenían un aspecto sano. Sin embargo, al pasarlas al agar-agua presentaban signos evidentes de

micosis. En el caso del aislado EH-511 (producción media de quitinasa), pudo observarse la

presencia de adultos muertos colonizados por el hongo.

3.10.1. PORCENTAJE DE CAMBIO DE ESTADIO DE LAS NINFAS DE MOSQUITA BLANCA

TRATADAS CON LOS AISLADOS SELECCIONADOS POR SU PRODUCCIÓN DE QUITINASA

En el caso de estos aislados también se tomó en cuenta la CL50 para cuantificar la virulencia

de P. fumosoroseus sobre las ninfas en estadio dos. Al igual que con los aislados seleccionados por

su producción de proteasa, las ninfas estadio dos infectadas con las concentraciones de conidios

más altas (4.7 x 106 y 4.7 x 105), murieron rápidamente después de tener contacto con el hongo;

mientras que las que fueron tratadas con las concentraciones más bajas de conidios lograron

alcanzar los estadios tres o cuatro, lo que señaló que las ninfas no resultaron tan susceptibles al

ataque fúngico producido por dichas concentraciones de conidios.

Para las ninfas en estadio dos, los aislados que mostraron resultados congruentes con la

hipótesis de trabajo fueron EH-503 y EH-509, ya que eran los aislados con la mayor actividad

63

quitinolítica, y fueron los que limitaron el cambio de estadio de las ninfas cuando se usaron las

concentraciones de conidios de 105 y 106 (ya que las ninfas dos infectadas morían inmediatamente

después de tener contacto con el hongo (figura 25). En cuanto a los testigos tratados sólo con agua

destilada, prácticamente todas las ninfas lograron cambiar a estadio tres, cuatro o llegar a adulto.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

EH-503 EH-509 EH-511 EH-516 EH-520

Aislado

Nin

fas

que

perm

anec

iero

n en

est

adio

do

s (%

)

testigo

4.70E+06

4.70E+05

4.70E+04

4.70E+03

4.70E+02

Figura 25. Comparación del porcentaje de ninfas que permanecieron en segundo estadio al ser infectadas con diferentes concentraciones de conidios de aislados de P. fumosoroseus, con alta (EH-503 y EH-509) media (EH-511) y baja (EH-516 y EH-520) actividad quitinolítica, a los diez días de la infección. En todos los aislados seleccionados por su actividad quitinolítica pudo observarse también

la tendencia lineal de concentración-respuesta; esto es, que a mayor cantidad de inóculo, mayor

cantidad de ninfas que morían y quedaban en el estadio dos.

Las concentraciones letales medias observadas (figura 26), fueron también las esperadas

de acuerdo con los niveles enzimáticos para casi todos los aislados seleccionados, lo que coincide

con lo reportado por Jackson et al. (1985), en cuanto a que existe una correlación entre la

producción de quitinasas extracelulares y la virulencia de V. lecanii hacia el áfido Macrosiphoniella

sanborni. La excepción fue EH-511 que presentó la CL50 más baja (0.069 x 105) de todos los

aislados ensayados, esto es, que mata la mitad de los insectos con una cantidad menor de conidios;

y por consiguiente fue la más virulenta. Estos datos muestran la relevancia de la determinación de la

virulencia por la variabilidad que puede haber entre aislados de una misma especie.

64

EH-503 EH-509 EH-511 EH-516 EH-5200

20

40

60

80

100

120

Núm

ero

de c

onid

ios

x 10

3 /m

l

EH-503 EH-509 EH-511 EH-516 EH-520

Aislado

Figura 26. Comparación de la virulencia promedio de la concentración letal media expresada en conidos/ml para aislados de P. fumosoroseus con alta (EH-503 y EH-509), media (EH-511), y baja (EH-516 y EH-520) actividad quitinolítica.

Al igual que con los aislados seleccionados por su producción de proteasa, las CL50

obtenidas para los aislados seleccionados por su capacidad quitinolítica fueron más bajas que las

reportadas por Vidal et al. (1996) para aislados de P. fumosoroseus, lo que muestra la mayor

virulencia de los aislados estudiados.

En el caso de las ninfas tres, los porcentajes de insectos que quedaron en ese estadio

fueron semejantes, ya que con ninguna concentración de conidios las ninfas tres alcanzaron el 35%

de cambio (figura 27). De hecho, con el aislado EH-520 no se presentaron ninfas tres, con las

concentraciones de conidios probadas, siendo éste el aislados menos virulento. En el único aislado

en el que pudo observarse una relación concentración-respuesta fue en EH-509, ya que a mayor

concentración de conidios, menos ninfas tres; sin embargo, en ninguno de los casos se observaron

diferencias significativas (α=0.05) entre el número de insectos obtenidos al tratar las ninfas con

diferentes concentraciones de conidios (ver anexo de análisis estadístico). Es importante mencionar

que en los testigos se pudo observar un porcentaje bajo de ninfas tres, ya que la mayoría

65

alcanzaron el final del ciclo de vida de la mosquita blanca, esto es, ninfa cuatro a punto de cambiar

a adulto.

0

10

20

30

40

50

EH-503 EH-509 EH-511 EH-516 EH-520

Aislado

Nin

fas

que

perm

anec

iero

n en

es

tadi

o tr

es (%

)

testigo

4.70E+06

4.70E+05

4.70E+04

4.70E+03

4.70E+02

Figura 27. Comparación del porcentaje de ninfas que permanecieron en tercer estadio al ser infectadas con diferentes concentraciones de conidios de aislados de P. fumosoroseus, con alta (EH-503 y EH-509) media (EH-511) y baja (EH-516 y EH-520) actividad quitinolítica, a los diez días de la infección. Por otro lado, en las ninfas que alcanzaron el cuarto estadio, que es el último antes de que

los insectos lleguen a adultos, pudo observarse la tendencia descrita para los aislados

seleccionados por su actividad de proteasa, es decir, que a mayor cantidad de inóculo, menor

cantidad de ninfas llegaban a cuarto estadio, y conforme disminuía la concentración de conidios

aumentaba la cantidad de ninfas que podían llegar hasta el estadio cuatro (figura 28). A este

respecto, todos los aislados con excepción de EH-503, tuvieron diferencias significativas (α=0.05)

entre la cantidad de ninfas cuatro para cada concentración utilizada (ver anexo análisis estadístico).

66

010

2030

40

50

6070

80

90

100

EH-503 EH-509 EH-511 EH-516 EH-520

Aislado

Nin

fas

que

alca

nzar

on e

l cua

rto

esta

dio

(%)

testigo y adultos

4.70E+06

4.70E+05

4.70E+04

4.70E+03

4.70E+02

Figura 28. Comparación del porcentaje de ninfas que alcanzaron el cuarto estadio al ser infectadas con diferentes concentraciones de conidios de aislados de P. fumosoroseus, con alta (EH-503 y EH-509) media (EH-511) y baja (EH-516 y EH-520) actividad quitinolítica, a los diez días de la infección. La barra de color verde indica la cantidad de adultos emergidos cuantificados como las pupas vacías en estadio cuatro de las ninfas seleccionadas.

De manera general, pudo observarse claramente una relación entre la virulencia y la

capacidad de producción de la enzima si únicamente se toman en cuenta los aislados con alta y

baja producción de quitinasa, ya que los primeros tienen una CL50 menor que los segundos, lo que

coincide con lo que señalan El-Sayedet et al. (citado por Khachatourians, 1992), para Nomuraea

rileyi. Sin embargo, esto no se cumple con el aislado que tenía una producción media de quitinasa,

ya que éste presentó la mayor virulencia (expresada como CL50) de todos los aislados estudiados

por su producción de quitinasa (figura 26), lo que señala nuevamente la variabilidad que puede

existir entre aislados de una misma especie fúngica.

3.10.2. PORCENTAJE DE MORTALIDAD POR ESTADIOS DE LAS NINFAS TRATADAS CON


Los porcentajes de ninfas de mosquita blanca que murieron durante los experimentos se

registraron de la siguiente manera: la mortalidad de ninfas en estadio dos y tres, la mortalidad de

ninfas en estadio cuatro y la mortalidad total de los tres estadios.

67

En el caso de la mortalidad de ninfas en estadio dos y tres, los resultados obtenidos fueron

muy semejantes a los del porcentaje de cambio de las ninfas dos, ya que casi en todos los aislados

se observó una relación directa concentración-respuesta, pues a mayor cantidad de conidios, mayor

mortalidad; solamente en la concentración de 104 de EH-516 ( producción baja de quitinasa), se

observó un valor de mortalidad semejante al del testigo (figura 29). En todos los aislados, hubo una

diferencia significativa entre la mortalidad de las ninfas tratadas con cada concentración de conidios.

En todos los casos la concentración que provocó un mayor número de ninfas muertas en estadio

dos y tres fueron 106 y 105 conidios/ml.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

EH-503 EH-509 EH-511 EH-516 EH-520

Aislado

Mor

talid

ad d

e ni

nfas

dos

y tr

es (%

)

testigo

4.70E+06

4.70E+05

4.70E+04

4.70E+03

4.70E+02

Figura 29. Comparación del porcentaje de mortalidad de ninfas dos y tres al ser infectadas con diferentes concentraciones de conidios de aislados de P. fumosoroseus, con alta (EH-503 y EH-509) media (EH-511) y baja (EH-516 y EH-520) actividad quitinolítica a los diez días de la infección.

El siguiente grupo de mortalidad fue la registrada para ninfas en estadio cuatro, tomando

como ninfas muertas las que presentaban crecimiento micelial (figura 30) o esporulación al término

de los 10 días de incubación del bioensayo. Para las ninfas tratadas con los aislados seleccionados

los resultados fueron muy interesantes, ya que con excepción de EH-503 (producción alta de

quitinasa), no hubo una gran cantidad de ninfas cuatro muertas, ya que la mayoría de las ninfas

habían muerto muy poco tiempo después de haber sido infectadas, y habían quedado en estadio

68

dos. Al pasar las ninfas que alcanzaron el estadio cuatro y que aparentemente estaban sanas a

agar-agua, se observó crecimiento micelial prácticamente en todos los casos (figura 31). Gillespie et

al. (1997), trabajando con otro hongo, M. anisopliae, observaron que al infectar ninfas dos de

langosta (Orthoptera: Acrididae), la infección se desarrolla hasta el cuarto estadio del insecto. Este

mismo fenómeno se pudo observar infectando T. vaporariorum con los aislados de P. fumosoroseus

estudiados.

Figura 30. Ninfa cuatro con hifas (H) emergiendo del cadáver.

Figura 31. Adulto infectado (AI) emergiendo de una ninfa cuatro aparentemente sana, pero que fue pasada a agar-agua al término del bioensayo para constatar que había sido susceptible al ataque fúngico. La mortalidad total fue la última evaluada, y para los aislados seleccionados, con excepción

de EH-503 (mayor actividad quitinolítica), se presentó una tendencia directa entre la cantidad de

inóculo y la mortalidad total, ya que a mayor cantidad de conidios era mayor la mortalidad total

encontrada (figura 32). Para todos los aislados, las concentraciones de 105 y 106 conidios/ml fueron

las que provocaron la mayor cantidad de muertos y sí hubo diferencia significativa (α=0.05) entre las

concentraciones de conidios y el número de ninfas muertas (ver anexo de análisis estadístico).

0

10

20

3040

50

6070

80

90

100

EH-503 EH-509 EH-511 EH-516 EH-520

Aislado

Mor

talid

ad to

tal (

%) testigo

4.70E+06

4.70E+05

4.70E+04

4.70E+03

4.70E+02

Figura 32. Comparación del porcentaje de mortalidad total de las ninfas de mosquita blanca al ser infectadas con diferentes concentraciones de conidios de aislados de P. fumosoroseus, con alta (EH-503 y EH-509), media (EH-511), y baja (EH-516 y EH-520) actividad quitinolítica, a los diez días de la infección.

69

3.10.3. PORCENTAJE DE EMERGENCIA DE ADULTOS DE LAS NINFAS INFECTADAS CON


El porcentaje de emergencia de adultos fue otro dato registrado, pero al igual que con los

aislados seleccionados por su capacidad proteolítica, el porcentaje de adultos observado también

fue muy bajo, y en algunos casos emergían, pero infectados por el hongo (figura 33). Sin embargo,

pudo observarse que las ninfas cuatro estaban en la fase de pseudopupa, último subestadio antes

de llegar a adulto; en este momento se observaban ya a través de la cutícula de la ninfa las

características del adulto, como los ojos y las alas. Debido a que este estadio (ninfa cuatro) es muy

corto, es probable que con unas horas más de incubación del bioensayo se observara una mayor

cantidad de insectos en ese estadio. En el grupo donde se observaron más fue en los testigos, lo

que nuevamente confirmó que las ninfas que se seleccionaron para los experimentos estaban sanas

y llegaron hasta el fin de su desarrollo.

Figura 33. Adulto con la micosis desarrollada emergiendo al final del tiempo de incubación del bioensayo. 3.11. RELACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE PROTEASA Y QUITINASA CON LA

VIRULENCIA DE P. fumosoroseusP. fumosoroseusP. fumosoroseusP. fumosoroseus

Los aislados que presentaron la mayor virulencia (EH-506 y EH-511, figuras 34 A y 35 A) en

el modelo estudiado, presentaron un máximo de actividad de proteasa a las 120 h de la cinética

enzimática (con 40 UP/ml para EH-506 y 15 para EH-511). El máximo de la actividad de la quitinasa

llegó a 40 UQ/ml en ambos casos, sin embargo, en el primer caso, el aumento se dió a las 312 h de

la cinética y en EH-511 a las 168 h (figuras 34 B y 35 B).

70

EH-506 EH-503 EH-5160

20

40

60

80

100

120

Núm

ero

de c

onid

ios

x 10

3 /m

l

EH-506 EH-503 EH-516

Aislado

0102030405060708090

100

24 72 120 168 216 264 312

Tiem po (h)

UP

/ml

0102030405060708090100

UQ

/ml

Prot. EH-506

Quit.EH-506

Prot-EH-503

QuitEH-503

ProtEH-516

QuitEH-516

Figura 34. Relación entre la actividad de proteasa y quitinasa con la virulencia de P. fumosoroseus. A) El aislado con una alta virulencia es EH-506 (CL50 de 1.1 x 103 conidios/ml), el de la virulencia media es EH-503 (CL50 de 20 x 103 conidios/ml) y el de baja EH-516 (CL50 de 110 x 103 conidios/ml). B) La actividad de proteasa de EH-506 se presentó a las 120 h. En el caso de los aislados que mostraron una virulencia media (EH-503, figura 35 A con

una CL50 de 25 x 103 conidios/ml y EH-509, figura 36 Acon una CL50 de 27 x 103 conidios/ml), la

actividad de proteasa estuvo siempre por debajo de 10 UP/ml y no se observó ningún aumento de

actividad, en cambio, la producción de quitinasa en EH-503 fue mayor, pero hasta las 264 h, con 90

UQ/ml (figura 34 B). Esta tendencia se puede apreciar también con EH-509, ya que presentó una

gran cantidad de quitinasa (71 UQ/ml), a las 216 h del experimento (figura 35 B). El otro aislado con

virulencia media fue EH-518, figura 36 A (CL50 de 14 x 103 conidios/ml), presentó un máximo de

actividad de proteasa a las 120 h, con 20 UP/ml, y una actividad de quitinasa muy alta (62.3 UP/ml),

figura 36 B, pero también hasta las 312 h del cultivo al igual que los otros aislados con virulencia

A

B

71

media (EH-503 y EH-509). Es interesante mencionar que EH-518 comenzó con una actividad de

quitinasa relativamente alta a las 24 h con respecto a los otros aislados (20 UQ/ml), la cual

descendió a las 72 h y luego comenzó a incrementarse nuevamente hasta el final del experimento

(figura 36B).

72

EH-511 EH-509 EH-5190

1020304050

607080

Núm

ero

de c

onid

ios

x 10

3 /m

l

EH-511 EH-509 EH-519

Aislado

0

10

20

30

40

50

60

70

80

24 72 120 168 216 264 312

Tie m po (h)

UP

/ml

0

10

20

30

40

50

60

70

80

UQ

/ml

Prot. EH-511

Quit.EH-511

Prot-EH-509

QuitEH-509

ProtEH-519

QuitEH-519

Figura 35. Relación entre la actividad de proteasa y quitinasa con la virulencia de P. fumosoroseus. A) El aislado con una alta virulencia es EH-511 (CL50 de 6.9 x 103 conidios/ml), el de la virulencia media es EH-509 (CL50 de 27 x 103 conidios/ml) y el de baja EH-519 (CL50 de 74x103 conidios/ml). B) La máxima actividad de quitinasa de EH-511 se presentó a las 168 h. El aislado que mostró la menor virulencia (EH-516), con una CL50 de 110 x 103 conidios/ml

(figura 34 A), no presentó ningún aumento de actividad de proteasa temprano, sino tardío, hasta las

312 h de la cinética, con una baja actividad, de 17 UP/ml, sin embargo, sí mostró un pico de

actividad de quitinasa a las 120 h, pero llegando a un máximo de 25 UQ/ml hasta el final de la

cinética a las 312 h (figura 34 B). El otro aislado que presentó una virulencia baja fue EH-520 (CL50

de 76 x 103 conidios/ml, figura 36 A), el cual tuvo un máximo de actividad de proteasa baja (15

UP/ml) hasta las 216 h de la cinética y en el caso de la quitinasa, la mayor actividad se observó

hasta las 312 h del experimento, con apenas 27 UQ/ml (figura 36 B).

A

B

73

EH-518 EH-520 EH-5040

10203040506070

80

Núm

ero

de c

onid

ios

x

103 /

ml

EH-518 EH-520 EH-504

A is lad o

0

10

20

30

40

50

60

70

24 72 120 168 216 264 312

Tiempo (h)

UP

/ml

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

UQ

/ml

Prot. EH-518

Quit.EH-518

Prot-EH-520

QuitEH-520

ProtEH-504

QuitEH-504

Figura 36. Relación entre la actividad de proteasa y quitinasa con la virulencia de P. fumosoroseus. A) El aislado con una alta virulencia es EH-518 (CL50 de 14 x 103 conidios/ml), el de la virulencia media es EH-520 (CL50 de 76 x 103 conidios/ml) y el de baja EH-504 (la CL50 no pudo ser calculada). B) La máxima actividad de quitinasa de EH-518 fue alas 120 h

Un caso interesante fue el de EH-504 (figura 36 A), ya que no fue lo suficientemente

virulento como para matar a la mitad de las ninfas en el tiempo que duró el experimento, por lo que

la CL50 no pudo ser calculada. La actividad de proteasa fue relativamente baja (11 UP/ml) y se

mantuvo sin aumentos durante toda la cinética, mientras que la actividad de quitinasa casi alcanzó

las 50 UQ/ml, pero tardíamente a las 312 h del experimento (figura 36 B).

A

B

74

Estas figuras (34, 35 y 36) muestran la aparición de las dos enzimas relevantes en el inicio

del mecanismo de patogenicidad de hongos entomopatógenos, actuando a diferentes tiempos, lo

que ya ha sido demostrado para este tipo de organismos, pero en otras especies como Metarhizium

y Beauveria (Bidochka y Khachatourians, 1988; Charnley y St. Leger, 1991; Smith y Grula, 1983).

Estos resultados sugieren la importanica de la aparición temprana de un máximo de actividad de

proteasa o quitinasa, y una alta actividad de quitinasa más tardíamente en la virulencia de P.

fumosoroseus en el insecto, T. vaporariorum.

4. CONCLUSIONES

Se llegó a las siguientes conclusiones:

Los resultados obtenidos con diferentes aislados de P. fumosoroseus en la infección de la

mosquita blanca T. vaporariorum, sugieren que los aislados más virulentos son los que presentan un

máximo de actividad inicial de enzima, ya sea proteasa o quitinasa en los primeros tiempos de la

cinética (entre 120 y 168 h), por lo que en el modelo estudiado, se observó una relación entre

virulencia y actividad enzimática.

Existe una gran variabilidad en la virulencia de los aislados de una misma especie, lo que

sugiere la participación de otros factores de virulencia, pero también señala la importancia de la

proteasa y la quitinasa para la penetración fúngica, o sea el inicio del mecanismo de patogenicidad.

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