proyecto de tesis 1
TRANSCRIPT
PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
I. GENERALIDADES
1. TÍTULO:
Optimización de la producción de jarabe de glucosa a partir de almidón de
achira (Canna edulis Ker) variedad morada mediante Bialfa T y Glucozyme,
aplicando el método de superficie de respuesta.
2. PERSONAL INVESTIGADOR
2.1 AUTOR: Samuel Ebert Villarreal Bermudez. Egresado de la Escuela de
Ingeniería Agroindustrial de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la
Universidad Nacional de Trujillo.
2.2 ASESOR: Rodolfo Vegas Niño. Profesor adscrito a la Sede
Descentralizada de Huamachuco de la Universidad Nacional de Trujillo.
2.3 CO-ASESOR: Daniel Salvador Rodríguez. Profesor adscrito a la Sede
Descentralizada de Huamachuco de la Universidad Nacional de Trujillo
3. TIPO DE INVESTIGACIÓN
3.1 DE ACUERDO A LA ORIENTACIÓN:
Aplicada
3.2 DE ACUERDO A LA TÉCNICA DE CONTRASTACIÓN:
Experimental
4. RÉGIMEN DE INVESTIGACIÓN:
Libre
5. SECCIÓN A LA QUE PERTENECE EL PROYECTO:
Escuela de Ingeniería Agroindustrial de la Facultad de Ciencias
Agropecuarias de la Universidad Nacional de Trujillo.
1
6. LOCALIDAD E INSTITUCIÓN DONDE SE REALIZARÁ EL
PROYECTO:
Universidad Nacional de Trujillo – Laboratorio Multifuncional – Sede
Descentralizada de Huamachuco – Av. Inca Garcilazo de la Vega 375
(Huamachuco)
Universidad Nacional de Trujillo – Laboratorio de Ingeniería Agroindustrial
Facultad de Ciencias Agropecuarias – Av. Juan Pablo II s/n. (Trujillo)
7. FECHA DE INICIO Y TÉRMINO:
7.1 FECHA DE INICIO : 15/03/10
7.2 FECHA DE TÉRMINO: 25/10/10
8. CRONOGRAMA DE EJECUCIÓN DEL PROYECTO
En la Tabla 1 se presenta el cronograma de ejecución del proyecto.
Tabla 1: Cronograma de ejecución
ActividadesMESES
1 2 3 4 5 6 7 8
Recopilación de información
X
Revisión de información XElaboración del proyecto X XPrueba experimental X XAnálisis de resultados X XPreparación y corrección de tesis
X X
Sustentación de tesis X
Semanas: 32
Horas/semana: 192
Total de horas: 6144
9. RECURSOS
2
9.1 RECURSOS DISPONIBLES
a) LOCALES:
El proyecto será ejecutado en las instalaciones del laboratorio
multifuncional de la UNT – Sede Descentralizada de Huamachuco,
laboratorio de Tecnología de Productos Agroindustriales de la Facultad
de Ciencias Agropecuarias y en los Laboratorios de la Facultad de
Ingeniería Química.
b) MATERIALES Y EQUIPOS
Materia prima: Almidón de achira variedad morada, extraída de los
rizomas del cultivo de achira (Canna edulis Ker), proveniente de la
serranía Liberteña, provincia de Sánchez Carrión, distrito
Sartimbamba.
Material enzimático: Enzima amilolítica liquida Bialfa T y enzima
amiloglucosidasa Glucozyme adquiridas de BIOCON (España).
Material de reacción:
Acido clorhídrico 1N
Glucosa anhidra
Hidróxido de sodio 1N
Hipoclorito de sodio
Licor de Fheling A
Licor de Fheling B
Sulfato de cobre
Azul de metileno
Fenolftaleina
EDTA u Oxalato de sodio
Agua destilada.
Materiales de laboratorio
3
Frascos de vidrio con tapa rosca 250 ml (140ºC)
Vasos de precipitación de 50, 500 y 1000 ml
Matraz de Erlenmeyer 250 ml
Buretas de 50 ml
Pipetas graduadas de 1, 2, 5 y10 ml y pipetas Pasteur
Fiolas de 50, 100 y 250 ml
Tubos de ensayo de 10 ml
Placa de Petri
Embudo de vidrio
Pisetas
Papel filtro
Equipos e instrumentos:
Balanza analítica marca RADWAG (± 0.0001)
Autoclave eléctrico capacidad de 50 L, marca FRAVIL
Estufa ECOCELL (hasta 250 ºC)
pH – metro digital INOLAB 720 SET marca WTW
Termómetros de mercurio (0-100 ºC)
Baño María marca LAUDA 30-95°C ± 0.2ºC
Refrigeradora marca COLDEX (hasta -10ºC)
Congeladora marca COLDEX (hasta -40ºC)
Centrifuga marca Hettich EBA20 (hasta 6.000 min-1)
Cocina eléctrica
Licuadora marca OSTER modelo 4655-50 (600 watts)
Material bibliográfico.- Libros, tesis, revistas científicas, internet.
C. Humanos
Tesista: Samuel Ebert Villarreal Bermudez
Asesor: Rodolfo Moisés Vegas Niño
Co-asesor: Daniel Salvador Rodriguez
10. PRESUPUESTO
4
En la Tabla 2 se presenta la relación de recursos no disponibles para la ejecución de
este trabajo de investigación.
Tabla 2: RECURSOS NO DISPONIBLES
Material Unidad CantidadCosto
unitario (S/)Costo total
(S/)A. Gastos de experimentación Rizomas de achira variedad morada kg 15 0,5 7,5Enzima Bialfa T ml 30 4 120Enzima Glucozyme ml 30 4 120Acido clorhídrico 1N ml 160 60 60Agua destilada L 25 1 25Azul de metileno al 1% ml 15 5 5Sulfato de cobre g 30 8 8Fenoltaleina ml 100 23 23Glucosa anhidra g 100 2 2Hidróxido de sodio 1N g 500 37,5 37,5Licor de Fheling A ml 160 45 45Licor de Fheling B ml 160 30 30Hipoclorito de sodio ml 150 1 1 EDTA ml 150 15 15 Campana de incubación Unidad 3 50 150
Sub - total 589B. Material de escritorio Papel bond A4 millar 4 25 100Lapiceros Unidad 4 1 4Cuadernos Unidad 1 2,5 2,5Fólder Unidad 6 0,5 3Resaltador Unidad 2 3 6Corrector Unidad 1 4,5 4,5CD-ROM Unidad 4 4 16Tinta de impresión negro/color Caja 3 45 135
sub- total 264C. Otros servicios Internet Horas 350 1 350Copias Unidad 1000 0,05 50Escaneos Unidad 35 1 35Costo de envió 240Movilidad local 300Compra de información 100Anillado Unidad 3 5 15Empastado Unidad 3 8 24
Sub-total 1114Total 1967
11. FINANCIAMIENTO:
Financiamiento propio
II. PLAN DE INVESTIGACIÓN
5
2.1 ANTECEDENTES
La hidrólisis enzimática de almidón es importante en la industria alimentaria por los
efectos fisicoquímicos y organolépticos que produce. Permite una disminución de la
viscosidad, mejora de la filtrabilidad, disminuye la tendencia a la cristalización,
clarificación y estabilización de los líquidos con vistas a su conservación, mejora en la
fermentabilidad, mejora de la estabilidad bacteriológica, mejora de la textura, aumento
del poder edulcorante entre otros (Wiseman, 1991).
La hidrólisis de almidón de yuca mediante acción enzimática es uno de los procesos
más estudiados. Díaz y col. (2000) estudiaron la acción de α-amilasa proveniente de una
cepa genéticamente modificada de Bacillus licheniformis. Las variables a analizadas
fueron: temperatura (80-90 °C), pH (5,5-6,5), concentración de almidón (30-40% p/p),
relación enzima-sustrato (0,583- 0,833 µl/g almidón) y la concentración de cofactor (50-
70 mg/l de CaCl2). Se obtuvo un equivalente de dextrosa (DE) hasta de 30 a las mejores
condiciones de trabajo. De todas las variables estudiadas, la temperatura y la
concentración de almidón tuvieron una mayor incidencia en las propiedades funcionales
de la maltodextrina.
Estudios de hidrólisis de torta de yuca (Manihot esculenta Crantz) y umarí (Poraqueiba
sericea Tulasne) han sido realizados utilizando enzimas comerciales alfa-amilasa
Fungamyl 5000 BG, proveniente de Aspergillus oryzae y amiloglucosidasa AMG 300 L
de Aspergillus níger. En el proceso hidrolítico se obtuvo productos con mayor
Equivalente de Dextrosa (ED) a una concentración de torta al 6% (p/p), tratamiento
térmico a 75ºC por 5 minutos, concentración de alfa amilasa de 0.1% p/p referida a la
torta. La acción de la amiloglucosidasa posterior a la alfa-amilasa demostró un aumento
del valor de ED, teniendo para la yuca un valor de 38.7 y para el umarí 37.7, a una
concentración para ambas enzimas de 0.1% p/p de la torta por 60 minutos (Paredes y
Vasquez, 2001).
6
Mera y Carrera (2005) también realizaron estudios de hidrólisis de almidón de yuca
empleando como medio enzimático, alfa-amilasa BAN 480 de Bacillus
amyloliquefaciens y amiloglucosidasa AMG 300 L proveniente de Aspergillus níger.
Después de realizado la hidrólisis el jarabe se filtró y fue sometido a concentración a
85ºC por 5 minutos obteniéndose un producto con un valor de Dextrosa Equivalente
(DE) cercano a 90% .
Otro de los almidones que han sido estudiados para la obtención de jarabe es el camote
(Ipomoea batata L.). Enzimas como la amilasa de Bacillus lichiniformis, Termamyl LC
y amiloglucosidasa de Aspergillus níger, AMG-E provenientes de Novozymes han sido
aplicados sobre este tipo de sustratos. Se determinó que para una eficiente hidrólisis de
la cadena de almidón se debe trabajar a concentraciones de sustrato del 5 % (p/p). Para
la enzima Termamyl se recomienda dosificaciones de enzima de 450 mg por cada kg de
almidón. En el caso de amiloglucosidasa (AMG-E) se recomienda una relación de
0.45 L por cada kg de hidrolizado (Chávez, 2002).
Si bien es cierto la acción de un medio buffer ayuda a tener una acción hidrolitica más
estable al accionar de la enzima. Yoshishige y col. (2000) comprobaron que no es
necesariamente estricto. Evaluaron la capacidad hidrolítica de glucozyme DB sobre el
alimidón de trigo, encontrando que a condiciones de pH 5 por adición de HCl,
temperatura de 60 ºC durante un periodo de 5 h tienen los mismos efectos que un medio
buffer.
El sinergismo de la acciòn de dos enzimas para la hidrólisis total de la cadena de
almidón ha siendo utilizada en trabajos de investigación. Asi lo demuestra los estudios
de Kolpakova y col. (2009) quienes evaluaron la acción de Thermamyl 120L y
Glucozyme L400 en la degradación del almidón de grano de arroz. Los parámetros
evaluados para Thermamyl 120 L fueron: relación enzima/sustrato de 0.006 – 0.16
unidades por gramo de almidón, temperatura de incubación de 80-90 ºC por un tiempo
de 1.5 – 2.5h. Posteriormente se incorporó la enzima AMG (Glucozyme L400)
evaluando los intervalos de pH 4.3–4.6 durante 2.5–3 h., a una relación enzima/sustrato
de 4-6 unidades por gramo de almidón. La función de Termamyl es la de la degradación
parcial de almidón a maltosas, pero no reduce a monomeros, sin embargo Glucozyme
rompe los enlaces 1-4 y 1-6 de la cadena del almidón (Hiroto y col, 1998).
7
La aplicación de amilasas y glucoamilasas también han sido probadas en la hidrólisis
del grano de trigo (Triticum aestivum). La relación liquido:sustrato de 5:1 fué sometida
a 90 ºC con el propósito de gelatinizar el almidón para posteriormente adicionar de
amilasa a 60ºC por 2 h. Transcurrido el tiempo de la primera enzima se adicionó la
AMG (Glucozyme), a 55 ºC por 14 h logrando la hidrólisis total de la cadena de
oligosacaridos (Vadehra yDharamvir, 1986).
El tratamiento de gelatinización también fue realizado para el almidón de camote.
Temperaturas cercanas a 100ºC produce la lixiviación de la amilosa, siendo los gránulos
más grandes los que primero gelatinizan. La dosificación de Thermamyl 60 L a una
relación enzima/sustrato de 0.75g por cada 16 kg. de almidón gelatinizado a 80 ºC por
30 min y la posterior intervención de Glucozyme F6 con una dosificación de 9.4 g a
55ºC complemento el proceso de sacarificación (General Intitute for Developing New
Energy, 1983).
Otro ejemplo de sinergismo enzimático se reporta en el estudio de obtención de bebidas
a base de arroz. Miwako y col, 1993 evaluarón la acción de amilasa AD y Glucozyme
F6 estableciendo valores óptimos para la primera enzima de temperatura y tiempo de 90
ºC por 30 minutos. Posteriormente se evaluó la acción de Glucozyme F6,
estableciendose condiciones idoneas a pH 5, temperatura de 55 ºC y tiempo de 1 h.
La acción en serie de enzimas amilolíticas y glucoamilasas también queda demostrado
en estudios como los realizados por Vasquez y col, (2009) quienes evaluaron la
hidrólisis de almidón de papa (Solanum tuberosum). Demostraron que no es
recomedable la acción individual de ambas enzimas debido a que independientemente
logran rendimientos de degradación bajos y similares a 0.42 g de glucosa/g de almidón.
Sin embargo, la acción en serie de ambas enzimas pueden llegar a rendimientos de 0.82
g/g.
Dentro de las técnicas analíticas que permiten cuantificar la presencia de glucosa en un
medio con almidón es la cromatografía de exclusión por tamaño molecular (HPLC-
SEC). Ensayos llevados a cabo por Yasuyuki y col, (1987) asi lo demuestran. La acción
de enzimas amiloglucosidasas como Glucozyme 6000 han sido utilizadas para la
degradación de almidón de trigo a 50 ºC por 72 h.
8
2.2 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.2.1 ACHIRA
La achira pertenece a la familia de las Cannáceas. La planta presenta raíces
pequeñas de color blanco y de forma cilindrica sobre los rizomas. El tamaño de los
rizomas en pleno desarrollo fluctúa entre 5 a 15 cm de largo y de 4 a 10 cm de
ancho (Figura 1). Taxonomicamente la achira se clasifica de la siguiente manera
(Tabla 3):
Tabla 3: Clasificación taxonomía de la achira
Reino: VegetalSubreino: FanerogamasDivisión: Angiospermae.Clase: Monocotiledoneas.Orden: ScitamidalesFamilia: CannaceaeGénero: CannaEspecie: Canna edulis, Ker.
Fuente: Rodríguez y col. (2003)
Figura 1: Rizoma de achira (Canna edulis. Ker)
Evidencias arqueológicas no dejan duda de que esta planta tuvo su origen en el
área andina entre Colombia y Perú. En Huaca Prieta de Chicama (La Libertad) se
encontraron rizomas secos pertenecientes al nivel precerámico temprano.
Asimismo se encontraron vasijas moldeadas con forma de rizomas pertenecientes
a la cultura Chimú (Caicedo y col., 2003).
9
La achira es una planta que aporta múltiples beneficios para el ambiente y el
hombre, proporciona al suelo un promedio de 21 toneladas por hectárea de
biomasa al momento de la cosecha, conformada por las hojas, tallos y otras partes
vegetal contribuyendo a enriquecer y mejorar su fertilidad, estructura y textura. El
Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias de Quito (Ecuador)
determinó la composición de la achira considerando los siguientes intervalos:
materia seca (13,55 - 22,93%), proteína (2,61-8,17%), almidón (43,55-66,06%),
azúcares totales (1,96-10,89%) y azúcares reductores (1,21-10,53%). El intervalo
en los porcentajes se debe a la variedad de achira, las actividades agronómicas asi
como las condiciones edafoclimáticas. Se han realizado estudios en que el mayor
contenido en sólidos de achira es aquella que se cultiva en zonas de baja humedad
relativa (INIA, 1997a).
La achira no constituye fuentes ricas de saponinas triterpenoidales ni alcaloides
como sucede con quinua, alfalfa y soya. En comparación con ciertas raices
andinas como la mashua y la jicama, en la achira hay ausencia de compuestos
fenólicos (como taninos y compuestos polihidroxifenolicos) los cuales causan
empardeamiento en los alimentos; sin embargo hay presencia de polifenoloxidasa.
Estudios fitoquimicos hacen notar un abundante contenido de sesquiterpelactonas
de importancia por su accion citotoxica, antitumoral y analgésica (INIA,1997b).
En la Tabla 4 se presenta la composición promedio a nivel de componentes
macroestructirales de la achira.
Tabla 4: Composición de la achira por cada 100 g
Fuente:
Moreno, 2006
Componentes Cantidad ( base seca)
Agua 70 gCarbohidratos 25.7 gFibra 0.8 gCalorías 126 gCalcio 35 mgFósforo 33 mgProteínas 2.7 gLípidos 0.1 gAlmidón 16 gVitamina A 8 mgHierro 9.3 mg
10
Entre los aminoácidos, cabe destacar la presencia de fenilalanina y tirosina. En menor
proporción están presentes la isoleucina, valina, treonina y leucina. Valores
cuantitativos de dichos aminoácidos se detallan en la Tabla 5.
Tabla 5: Valores cuantitativos de aminoácidos presentes en la achira
AminoácidosPatrón
(mg/g proteína) AchiraHistidina 19 58,42Isoleucina 28 84,64Leucina 66 59,64Lisina 58 44,65Metionina + cisteina 25 2,96Fenilanina + tirosina 63 104Treonina 34 81,47Triptofano 11 Valina 35 84,28
Fuente: Espin, 1999
Entre los minerales cabe destacar la presencia de potasio. En menor proporción están
presentes el magnesio, fósforo, calcio y sodio. Componentes esenciales para fortalecer
los huesos (Espin, 1999)
2.2.2 ALMIDÓN DE ACHIRA
Canna edulis Ker es ampliamente cultivada en Sudamerica, Taiwan, Vietnam, Thailand
y China. El rizoma seco contiene un 70–80% de almidón, el cual es una materia prima
potencial para la producción industrial de almidón (Zhang y col., 2009)
El almidón de achira es de forma ovoide, de gran tamaño, de apariencia transparente y
sin coloración propia. Dentro de la diversidad de almidones, el de achira se identifica
con mayor facilidad por su considerable rapidez de sedimentación, proporcionada
principalmente por el mayor diámetro de partícula (Coca, 1998).
11
Los parámetros indicadores de la pureza y calidad del almidón de achira están
representados por tiempo de sedimentación de 6.2-16.5 minutos, tamaño de partícula
por granulometría 38 µm -75 µm y por microscopía 33.9 µm -97.6 µm, densidad 0.63 -
0.71g/cm3 y pH de 5.5 -6.2 (Arias y García, 1998).
El almidón de achira (Canna edulis ker) tiene mejores propiedades fisicoquímicas y
resiste más a los procesos estresantes (propios de los procesos industriales) que los
almidones provenientes del maíz o del trigo (CIAT, 1993).
Aprovechamiento del almidón de achira
En la industria alimenticia el almidón de achira es consumido como biscochuelos,
panecillos, como espesante en sopas instantáneas y coladas para niños, en la industria de
productos enlatados, en la elaboración de salsas, como relleno en productos dietéticos y
en la elaboración de gomas dulces. En la industria farmacéutica es muy utilizado como
rellenos en la elaboración de medicinas en pastillas. En la industria textil para lograr
adhesión de las fibras que constituyen las prendas. En la industria papelera y de
adhesivos, el almidón de achira no presenta toxicidad y no es obstáculo para el reciclaje
de papel (Fairlie, 1999).
En Colombia hay empresas agroindustriales que ya aprovechan el almidón de achira
como sucedáneo del trigo especialmente en las regiones de Tolima y Cundinamarca
(Caicedo, 2003).
a) Morfología y estructuración de los granos de almidón
El almidón (C6H10H5)n es uno de los más importantes carbohidratos presentes en la
naturaleza (Peat, 1954), es una mezcla de dos polímeros de glucosa: la amilosa que es
esencialmente lineal, unida a través de uniones (1,4)-α-D-glucosidasa y conformada
entre 200-2500 unidades de glucosa y la amilopectina, consistente en cadenas lineales
ramificadas unidas por enlaces 1,6-α-D-glucosidasa (Swinkels, 1985).
12
En su forma natural, el almidón está presente como partículas discretas llamadas
gránulos, las cuales tienen regiones amorfas y cristalinas en su estructura. El
calentamiento del almidón en agua ayuda a disolver su estructura granular
(gelatinización) y permite desintegrar los gránulos causando que el polímero sea
accesible al ataque enzimático.
La relación amilosa/amilopectina, el tamaño y la forma de los gránulos de almidón
depende de la fuente botánica. El almidón de trigo contiene 25% de amilosa y 75% de
amilopectina, y los gránulos (5-40 um) presentan una distribución bimodal.
La amilopectina constituye alrededor del 75% de los almidones más comunes. Algunos
almidones están constituidos exclusivamente por amilopectina y son conocidos como
céreos. La amilopectina de papa es la única que posee en su molécula grupos éster
fosfato, unidos más frecuentemente en una posición O-6, mientras que el tercio restante
lo hace en posición O-3.
La achira produce los gránulos de almidón mas grandes (30-100 micras de diámetro)
comparado con especies vegetales conocidas como maíz, trigo, yuca y papa, las cuales
presentan entre 10-30 micras de diámetro. Por esta razón es digerido fácilmente por el
organismo; además de ser resistente a la esterilización. El almidón de achira tiene
mejores propiedades fisicoquímicas y resiste más a los procesos estresantes (propios de
los procesos industriales) que los almidones provenientes de otras fuentes como el de
maíz y trigo (CIAT, 1993).
b) Hidrólisis de almidón
Los almidones se convierten con facilidad en azúcares reductores mediante una
hidrólisis, ya sea por calentamiento con ácido, base o por acción enzimática (Kirk y col.,
2000). En la hidrólisis de almidón por medio ácido (HCl o H2SO4) se corre el riesgo de
generar productos de degradación tales como furfural o hidroximetilfurfural debido a la
intensidad del tratamiento. Ante ello se prefiere el uso de enzimas debido a su acción
específica, alta pureza y mayor eficiencia (Kearsley y Dziedzic, 1995).
13
La hidrólisis de almidón consiste en la adición de agua a los enlaces glucosidicos para
producir jarabe de glucosa, la cual está conformada por D-glucosa, maltosa y otros
polímeros de glucosa que tienen un amplio uso en la industria. El grado de hidrólisis en
el jarabe es medido por el Equivalente de Dextrosa (DE), la cual es una medida del
poder reductor de derivados de polisacáridos/oligosacáridos comparado con la D-
glucosa sobre una base de peso seco (Kearsley y Dziedzic, 1995).
El grado de hidrólisis enzimática del almidón es fuertemente afectada si el almidón esta
como materia prima o gelatinizada, tal como ha sido observado en el almidones
provenientes de guisantes, maíz, trigo y papa (Godon, 1994). El proceso de hidrólisis
enzimática comprende 3 etapas sucesivas cuando se trata de materiales amiláceos:
gelatinizacion, licuefacción y sacarificación. La primera consiste en un calentamiento
progresivo de la suspensión de almidón para romper puente de hidrogeno de las
regiones cristalinas y conseguir un hinchamiento de los gránulos de almidón por
absorción de agua, estado en que se tornan susceptibles al ataque mecánico, químico y
biológico. En la licuefacción se efectúa una hidrólisis parcial y finalmente; en la
sacarificación, se completa la hidrólisis hasta obtener un jarabe de glucosa (Keim,
1983).
c) Enzimas que degradan la cadena de almidón.
Las alfa-amilasas
Este tipo de enzimas lo producen microorganismos como Bacillus acido aldaricuas, B.
amyloliquefaciences, B. caldoliticus, B. cuagulanas, B. lichiniformis, B.
stearothermofilus, Bacteroides amylophilus, Clostridium acetobulicum, Lactobacillus
amylophilus, Micrococcus halobtus.
La alfa 1,4-D-glucan glucano-hidrolasa hidroliza los enlaces glucosídicos alfa-1,4 de los
polisacáridos que poseen 3 o más unidades de D-glucosa en unión alfa-1,4. El ataque se
hace en forma no selectiva sobre varios puntos de la cadena simultáneamente, aunque
los primeros productos de la hidrólisis son siempre oligosacaridos de 5-7 unidades de
glucosa, o un número múltiplo. Dependiendo del tiempo de contacto se obtiene como
producto de esta reacción un conjunto de oligosacaridos variados, en parte ramificados,
14
denominados dextrinas, de peso molecular variable. Si se prosigue la reacción las
cadenas rectas se acaban convirtiendo en maltosa y maltotriosa (Braverman, 1980).
Bialfa-T es una enzima amilolítica líquida (EC. 3.2.1.1) producida por fermentación
sumergida de Bacillus licheniformis. Esta enzima hidroliza la cadena de almidón
produciendo dextrinas solubles y oligosacaridos. Es una enzima de calidad alimentaria
debido a que cumple con los requisitos del Comité Mixto FAO/OMS de Expertos en
Aditivos Alimentarios (JECFA) y con el Código de Productos Químicos Alimentarios
(FCC).
Bialfa-T actúa bien a niveles bajos de pH, es muy activa entre pH 5 y 7. Es una enzima
termoestable, su actividad aumenta con la temperatura y alcanza un máximo en el
intervalo de 95-105ºC. En el caso concreto del uso para licuación de almidón, un pH de
5.5 es compatible con temperaturas tan altas como 108ºC durante cortos periodos. Es
conocido que la presencia de ciertos cofactores ayudan a la acción de la enzima. Bialfa-
T contiene calcio fuertemente ligado; pequeñas cantidades adicionales de calcio
estabilizan aún mejor la enzima a temperaturas superiores a 60ºC. Concentraciones de
calcio de 30 a 75 ppm son adecuadas para el uso de la enzima a temperaturas de hasta
110ºC (Biocon, 2008).
La concentración de almidón, expresado como materia seca, en un orden del 20-40% no
tienen especial efecto en la estabilidad de la Bialfa-T, sin embargo por debajo del 20%
la estabilidad de la enzima se ve afectada. Actualmente es utilizada en la producción de
jarabes, cerveceria y destilerias. Las dosificaciones recomendadas es de 0.5 a 1.0 g de
Bialfa-T por kilogramo de almidón (Biocon, 2008).
La amiloglucosidasa
La alfa-1,4-D-glucan glucohidrolasa es una exohidrolasa también conocida como
glucoamilasa, que hidroliza los enlaces glucosídicos alfa-1,4 y alfa-1,6 de la amilosa y
la amilopectina separando unidades de glucosa a partir del extremo no reductor de la
cadena (Braverman, 1980).
15
Las β-glucoamilasas de Aspergillus níger es una glicoproteína (peso molecular 97 000)
cuya actividad óptima se manifiesta a un pH de 5 (Robinson, 1991). La actividad
hidrolítica de esta enzima se encuentra entre 48 a 72 horas, a tiempos superiores se logra
la estabilidad del proceso y hace indispensable la inactivación de la enzima (Quintero,
1998).
Glucozyme es un enzima amiloglucosidasa (E.C. 3.2.1.3) producido por la fermentación
de una cepa seleccionada de Aspergillus niger. La enzima cataliza la liberación de
sucesivas unidades de glucosa a partir del final de las cadenas de almidón licuado. La
preparación enzimática se caracteriza por tener un nivel muy bajo de actividad
proteinasa y cumple las especificaciones de la JECFA y la FCC, siendo un enzima de
calidad alimentaria (Biocon, 2008).
En ensayos llevados a cabo a 60ºC y a diferentes pHs, Glucozyme tiene un óptimo de
actividad a pH 4,7; sin embargo la enzima puede trabajar en el intervalo de 3,5-6,0. Los
ensayos efectuados a pH 4,3 y a diferentes temperaturas muestran una actividad óptima
a 65-70ºC ;sin embargo para períodos prolongados se recomienda una incubación a
60ºC. Dosificaciones recomendadas para procesos de sacarificación de almidón
dextrinificado para la obtención de jarabes o etanol son 0.5 a 1.0 g por kilogramo de
materia seca de sustrato (Biocon, 2008).
c) Conversión de almidón a glucosa
La producción del jarabe de glucosa a partir de almidón por medio de procesos
enzimáticos involucra tres etapas (Mera y col, 2003):
La gelatinización son las modificaciones que ocurren cuando los gránulos de almidón
se trata con calor y en medio acuoso. Se caracteriza por el hinchamiento de los gránulos
por absorción del agua desapareciendo la estructura cristalina de la amilopectina y
formandose una pasta (pasta de almidón) que tiene una elevada viscosidad. Si se sigue
calentando, llega un punto en el que los gránulos se fragmentan disminuyendo la
viscosidad drásticamente. Agitar la mezcla contribuye a que se fragmenten los gránulos.
Posteriormente tiene lugar la formación del gel o gelificación, el cual se forma por
16
puentes de hidrógeno entre las moléculas de amilosa y amilopectinas desenrolladas
dejando espacios en donde queda agua atrapada (Sevilla, 2005).
La licuefacción, se inicia con la gelatinización de la materia prima la cual entra en
contacto con una amilasa que puede provenir de los géneros Bacillus o Penicillun que a
una temperatura de 35 ºC y un pH próximo a 7 rompe los enlaces L-D del almidón
dando lugar a las dextrinas solubles (Frazier y Westhoff, 1993).
El desarrollo de amilasas termoestables han permitido mejorar la eficiencia del proceso
de licuefacción. Importantes avances de la tecnología del DNA recombinante para la
producción de enzimas industriales de este tipo permiten aumentar sus actividades
catalíticas y capacidad de operar a mayores temperaturas (Rutz y Janssen, 2007).
La sacarificación, se realiza utilizando como catalizador la glucoamilasa o pululanasa,
asi como una mezcla de enzimas, teniendo como sustrato dextrinas y como producto
final glucosa libre. La sacarificación puede llevarse a cabo a temperaturas bajas
(alrededor de 30ºC) siempre y cuando se trabaje con materiales y aparatos
perfectamente estériles. Por lo general, es mas conveniente trabajar a temperaturas entre
los 50–55 ºC debido a una mayor celeridad del proceso y menor probabilidad de
desarrollo de microorganismos mesófilos (Frazier y Westhoff, 1993).
2.2.3 JARABE DE GLUCOSA
La industria de los hidrolizados de almidón es una de las mayores potencialidades en el
campo de los productos alimenticios. Dada la amplia gama de productos que pueden
obtenerse a partir de esta materia prima, entre las cuales se tiene a las mermeladas,
caramelos, fruta confitada, almíbares para frutas en conservas, pastelería, helados,
compotas, jaleas y refrescos. No sólo la industria alimenticia es destinataria de los
diferentes jarabes o productos a partir del almidón, sino que otros procesos requieren en
buena medida de los mismos, y puede citarse como ejemplo la producción de sorbitol
para fines de producción de medicamentos. La glucosa neutraliza la insulina en las
personas diabéticas y es útil en el tratamiento de la obesidad. El jarabe de glucosa tiene
ventajas sobre la sacarosa, es de digestión más fácil y un 50 por ciento más dulce
(González y col., 2002).
17
Un factor importante en la producción de jarabes es lo que se conoce como los grados
de conversión dextrosa equivalente (DE). El grado de conversión dextrosa equivalente
(DE) es una medida del porcentaje de enlaces glicosídicos (entre glucosas) que han sido
hidrolizados. Después del tratamiento de una suspensión con ácidos el jarabe resultante
tiene un grado DE de 40. Después de tratar ésta suspensión con alfa y beta amilasas se
obtiene jarabes de maltosa de grados DE de 70 aproximadamente y con la glucoamilasa
de 92-95. Mientras más alto es el DE mayor es el dulzor del jarabe ya que el mismo
tiene mayor contenido de glucosa libre. Si se quiere jarabes de mayor dulzor parte de la
glucosa tiene que ser convertida en fructosa, un azúcar simple mucho mas dulce que la
glucosa. Esta conversión se logra enzimáticamente usando la glucosa isomerasa
(Borneo, 2009).
III. JUSTIFICACION
Las raíces andinas son herencia de nuestros antepasados y actualmente en su gran
mayoría no son consumidas por los pobladores del Perú. Estos cultivos ofrecen una
serie de ventajas ecológicas, están adaptadas a zonas donde otras especies no prosperan,
son resistentes a plagas, sequía y salinidad del suelo. Su aprovechamiento y/o
transformación permitirá su revaloración logrando un mayor valor agregado y una
alternativa de trabajo, ejemplo de ello es la achira (Canna edulis Ker).
La revalorización de la achira pasa en parte por el aprovechamiento de su rizoma. Su
transformación puede ser empleada en el sector alimentario como: almidón, dulces,
gomas, bizcochos, mazamorras, panes, galletas, keques, fideos, entre los más
importantes. En el Continente Sudamericano, Colombia aprovecha la achira en la
industria de la panificación. Sin embargo puede tener otros alcances como en la
industria farmacéutica, la cual puede ser utilizada para revestimiento de cápsulas o
como aditivo en cosméticos y maquillajes. En tecnología poscosecha el almidón o
jarabe obtenido de este último, puede ser empleado como recubrimiento comestible en
frutas.
En el Perú, la achira esta presente en jardines con fines ornamentales. Se aprovecha sus
hojas como envoltura de tamales. Sus rizomas constituyen un residuo agrícola que hasta
el momento no tiene transformación alguna. La transformación de este subproducto en
18
la obtención de aditivos o ingredientes alimentarios traerá consigo un ahorro económico
debido a que constituye una materia prima de bajo coste.
La industria en general y no sólo la alimentaria, están obligadas a realizar procesos
respetuosos con el medio ambiente. Ante ello los procesos catalizados por enzimas
cumplen con dicho requisito, debido a que son biodegradables y han desplazado a
proceso hidrolíticos en el cual hacen uso de ácidos o bases. Una de las principales
ventajas de las enzimas está asociado a su gran especificidad de acción que hace que no
se produzcan reacciones laterales imprevistas. Asimismo se pueden trabajar en
condiciones moderadas de presión, temperaturas y pH.
El consumo de edulcorantes naturales en el mundo se ha incrementado en los últimos
años y ocupa un alto porcentaje en el mercado total. Aunque la sacarosa continúa siendo
el edulcorante de mayor preferencia a nivel mundial, existe una tendencia a su
sustitución por otros (jarabe de glucosa), sobre todo los provenientes de materias primas
naturales proporcionando el mismo sabor dulce con reducción en calorías, útiles en el
control del peso y la glucosa sanguínea.
El jarabe de glucosa tienen una gama muy amplia de propiedades, lo que les permite ser
usados tanto en la industria confitera como en la industria farmacéutica; estas
propiedades son, la viscosidad (formador de cuerpos), higroscoposidad (humectancia),
aumento del sabor (transferencia), dulzura (formación balanceada), presión osmótica
(acción preservante), coloide protector (estabilizador de espuma), adhesividad (acción
aglutinante), solubilidad (emulsificación) y apariencia (brillo). Dentro de los múltiples
usos se tiene la producción de caramelos, frutas confitadas, helados, mermeladas, y
almíbares para frutas en conservas.
El proyecto de investigación propone la obtención de jarabe de glucosa a partir de un
residuo agrícola como es el rizoma de la achira, materia prima predominante en la
Sierra Liberteña y cuyo estudio contribuirá a la revaloración de un producto autóctono,
generando valor agregado en la obtención de un aditivo alimentario. En resumen, se
busca transformar un pasivo agricola en un activo agroindustrial.
19
IV. PROBLEMA:
¿Cuál será la relación liquido/sustrato (5 - 20), relación enzima/sustrato (bialfa: 0.01-1
g/kg ms y glucozyme: 0.01-1 g/kg ms) y tiempo de reacción (menores a 72h) que
óptimice la hidrólisis de almidón de achira con Bialfa T y Glucozyme en la mayor
producción de jarabe de glucosa utilizando el método de superficie de respuesta ?
V. HIPOTESIS:
Una relación líquido/sustrato de 7/1, relación enzima sustrato de Bialfa: 0.5 g/kg ms y
Glucozyme: 0.5 g/kg ms y tiempo de reacción de 48 y 60 h para Bialfa y Glucozyme
respectivamente permitirá obtener la mayor producción de jarabe de glucosa a partir de
almidón de achira.
VI. OBJETIVOS
6.1 OBJETIVO GENERAL
Determinar por metodología de superficie de respuesta los niveles óptimos de las
variables relación líquido/sustrato, relación enzima/sustrato y tiempo de reacción
para la hidrólisis con Bialfa T y Glucozyme en la producción de jarabe de glucosa a
partir de almidón de achira
6.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS
Determinar el rendimiento de obtención de almidón a partir del rizoma de
achira.
Determinar el rendimiento de obtención de jarabe a partir de almidón de achira.
Evaluar el efecto de la relación líquido/sustrato, relación enzima/sustrato y
tiempo de hidrólisis de almidón de achira por Bialfa T y Glucozyme.
20
VII. MATERIALES Y METODOS:
7.1 MATERIALES
7.1.1 MATERIAL DE PROCESO:
Materia prima.- Almidón de achira variedad morada, extraída de los rizomas
del cultivo de achira (canna edulis), proveniente de la serranía Liberteña,
provincia de Sánchez Carrión, distrito Sartimbamba.
Material enzimático.-Enzima amilolítico liquido Bialfa T y enzima
amiloglucosidasa Glucozyme adquiridas de BIOCON.
Alfa-amilasa proveniente de Bacillus lichiniformis y las condiciones
recomendadas para esta enzima son 5-7 de pH y 95-105o C de temperatura
La glucoamilasa se obtiene por fermentación del Aspergillus niger y las
condiciones recomendadas de pH de 3.5-6.0 y 60o C de temperatura.
7.1.2 REACTIVOS
Acido clorhídrico 1N
Glucosa anhidra
Hidróxido de sodio 1N
Hipoclorito de sodio
Licor de Fheling A y B
Sulfato de cobre
Azul de metileno al 1%
Fenolftaleina
EDTA u oxalato de sodio
7.2 METODOLOGÍA
7.2.1 Metodología experimental
Determinación de azucares reductores (Anexo 1).
Determinación de contenido de humedad (Anexo 2).
Determinación de contenido en cenizas (Anexo 3).
Determinación de fibra cruda (Anexo 04).
Determinación de pH (Anexo 05).
21
7.2.2 Obtención de almidón de achira
En la Figura 2 se muestra el diagrama de flujo para la obtención de almidón de
achira (Canna edulis Ker).
Figura 2: Flujograma de procesamiento del almidón de achira
22
Rizomas de achira
Clasificación
Lavado
Pelado
Sedimentado
Lavado
Almidón
Secado
Licuado
Eliminación de partículas: arena y tierra
Eliminación de afrecho
Eliminación de la cáscara
Eliminación de impurezas
Pudriciones
Molienda
Tamizado 2
Tamizado 1
Rizomas de achira
Clasificación
Lavado
Pelado
Sedimentado
Lavado
Almidón
Secado
Licuado
Eliminación de partículas: arena y tierra
Eliminación de afrecho
Eliminación de la cáscara
Eliminación de impurezas
Pudriciones
Molienda
Tamizado 2
Tamizado 1
Descripción del procesamiento del almidón de achira:
a) Clasificación: en esta etapa se seleccionará los rizomas que se encuentren en
perfecto estado sin ninguna parte en descomposición.
b) Lavado: en esta etapa se lavarán los rizomas con agua con el objeto de
eliminar las partículas de tierra y sustancias extrañas adheridas a su corteza.
Esta etapa se realizará eficientemente, debido a que la eliminación de la
arena es muy difícil de separar en otras operaciones del proceso y
pueden aparecer en el producto final siendo los precursores de un
color poco agradable. El lavado se realizará con agua proveniente
de la red pública hasta que los rizomas tengan un buen aspecto.
c) Pelado: en esta operación los rizomas serán pelados manualmente y sus
cáscaras eliminadas. La operación de pelado se realizará en solución de agua
con ácido cítrico al 0.1% p/p con el propósito de evitar el empardeamiento del
producto (Rodríguez y col., 2003)
d) Licuado: en esta operación los rizomas previamente pelados y cortados se
introducen a la licuadora con agua con la finalidad de liberar el almidón
presente en las células. La proporción en volumen de rizoma: agua será de 2:1.
e) Sedimentación: esta operación se realizará adicionando agua con la finalidad
de precipitar los gránulos de mayor tamaño, asi como eliminar cualquier
partícula extraña que se encuentre en suspensión. La proporción en volumen
de agua:almidon será de 3:1.
f) Tamizado 1: en esta etapa el almidón se pasará a través de una coladera
casera con la finalidad de eliminar residuos de fibra y trazás de cáscara.
g) Lavado: el agua en suspensión del paso anterior será eliminada, luego se
agregará nuevamente agua, esta operación se repite de 6 a 7 veces con la
finalidad de eliminar impurezas y obtener un almidón con mejores
condiciones.
h) Secado: Después del último lavado se realizará la operación de secado, para
eliminar parte de la humedad del almidón. El secado se realiza en exposición a
los rayos solares hasta llegar a una humedad final entre 8 a 10% en base
húmeda.
i) Molienda: el almidón secado en la etapa anterior pasa por una pequeña
molino tipo hélice, con el propósito de suavizarlo.
23
j) Tamizado 2: en esta etapa el almidón se pasará a través de un tamiz de malla
Nº 100 (Escala ASTM) con la finalidad de eliminar residuos de fibra y obtener
un producto morfologicamente homogéneo. Finalmente el almidón se pesará y
envasará en bolsas negras para su posterior uso, a fin de evitar la
contaminación por agentes ambientales y microbiológicos.
7.2.3 Obtención de glucosa a partir de almidón de achira En la Figura 3 se muestra el procesamiento jarabe de glucosa a partir de
almidón de achira.
Figura 3: Diagrama de flujo para la obtención de glucosa a partir de almidón de
achira (Canna edulis ker) mediante hidrólisis enzimática
Descripción del procesamiento jarabe de glucosa a partir de almidón de achira:
24
DILUCIÓN
GELATINIZACION
LICUEFACCIÓN
SACARIFICACIÓN
CENTRIFUGACIÓN
FILTRACIÓN
ALMIDÓN
GLUCOSA
DILUCIÓN
GELATINIZACION
LICUEFACCIÓN
SACARIFICACIÓN
CENTRIFUGACIÓN
FILTRACIÓN
ALMIDÓN
GLUCOSA
a) Dilución: En frascos de 250 ml de capacidad se introducirá agua destilada a pH
5.5 (obtenida con HCl) y almidón de achira. Se dispondrá la muestra logrando
tener relaciones líquido/sustrato (L/S) en el intervalo de 5 a 20 p/p teniendo en
consideración la humedad de la harina.
b) Gelatinizacíon: Esta etapa consiste en un calentamiento progresivo de la
suspensión con el propósito de romper los puentes de hidrógeno de las regiones
cristalinas de la cadena de almidón y conseguir un hinchamiento de los gránulos
por absorción de agua. Se realizará a 121 ºC por 10 min mediante autoclave,
logrando además la esterilización del medio permitiendo que las enzimas (las
que serán adicionadas posteriormente) tengan una mejor actividad sin tener que
competir con un microorganismo por el sustrato.
c) Licuefacción: Una vez terminada la etapa de gelatinización las muestras
previamente enfriadas y ajustandas a pH 5.5 se adicionará la enzima α-amilasa
(Bialfa T). Las recomendaciones de dosificación establecidas por el proveedor
establece en el intervalo de 0.5-1 kg de enzima por tonelada de almidón. La
muestra se someterá a incubación a temperatura de 95°C por un tiempo de 60 h
con agitación a 80 rpm. El producto de este tratamiento serán mayoritariamente
dextrinas, la cual será evaluada a lo largo de este periodo de tiempo.
d) Sacarificación: Determinada las condiciones óptimas de trabajo de Bialfa T se
proseguirá con la fase de sacarificación para lo cual se acondicionará el medio a
pH 4.7 por adición de HCl. Posteriormente se agregará la enzima glucoamilasa
(Glucozyme) teniendo en consideración las recomendaciones del proveedor, que
también coincide con los intervalos de Bialfa T: 0.5-1 kg de enzima por tonelada
de almidón.. Esta solución se incubará a temperatura de 60 ºC por un tiempo
límite de 72 h y a 80 rpm. El producto final mayoritariamente serán monómeros
de glucosa los cuales serán cuantificados a lo largo de este periodo de tiempo
e) Centrifugación: La solución de jarabe de glucosa obtenida será sometida a
centrifugación (2000 rpm x 10 minutos), con la finalidad de obtener dos fases,
un sobrenadante rico en jarabe de glucosa y la otra sólidos que no han sido
hidrolizados por acción de las enzimas.
f) Filtración: Se realizará con el propósito de retener por medio de papel de filtro
material resuspendido al momento de vaciar el contenido de los tubos de la
25
centrifuga. Al producto final se le medirá la cantidad de azúcares reductores y su
contenido en sólidos.
7.3. DISEÑO EXPERIMENTAL
La secuencia experimental a seguir se muestra en la figura 4:
Donde:
L1/S1: Relación líquido sustrato (5 a 20 p/p).E1/S1: Relación enzima/sustrato (0.01-1 g Bialfa T/kg almidón).E2/S2: Relación enzima/sustrato (0.01-1 g Glucozyme /kg almidón).T1: Tiempo de reacción de Bialfa T (1 a 60 h)T2: Tiempo de reacción de Glucozyme (1 a 72 h)
Figura 4: Diseño experimental para la optimización en la obtención de jarabe de
glucosa a partir de almidón de achira.
26
DILUCIÓN
GELATINIZACIÓN
LICUEFACCI N
SACARIFICACIÓN
CENTRIFUGACIÓN
FILTRACI N
ALMIDÓ
GLUCOSA
Ó
Ó
SACARIFICACIÓN
N
Ó
N
Controles: Temperatura, pH, agitación.Evaluación: Dextrosa Equivalente (DE)
Controles:-Temperatura-Tiempo
Controles:-Relación de peso-pH
Evaluación: -Dextrosa Equivalente (DE)-Humedad-Cenizas-Fibra
Variable de Respuesta
Controles: Temperatura, pH, agitación.Evaluación: Dextrosa Equivalente (DE)
Controles:-rpm-Tiempo
L1/S1
E1/S1
t1
E2/S2
t2
DILUCIÓN
GELATINIZACIÓN
LICUEFACCI N
SACARIFICACIÓN
CENTRIFUGACIÓN
FILTRACI N
ALMIDÓ
GLUCOSA
Ó
Ó
SACARIFICACIÓN
N
Ó
N
DILUCIÓN
GELATINIZACIÓN
LICUEFACCI N
SACARIFICACIÓN
CENTRIFUGACIÓN
FILTRACI N
ALMIDÓ
GLUCOSA
Ó
Ó
SACARIFICACIÓN
N
Ó
N
Controles: Temperatura, pH, agitación.Evaluación: Dextrosa Equivalente (DE)
Controles:-Temperatura-Tiempo
Controles:-Relación de peso-pH
Evaluación: -Dextrosa Equivalente (DE)-Humedad-Cenizas-Fibra
Variable de Respuesta
Controles: Temperatura, pH, agitación.Evaluación: Dextrosa Equivalente (DE)
Controles:-rpm-Tiempo
Controles: Temperatura, pH, agitación.Evaluación: Dextrosa Equivalente (DE)
Controles:-Temperatura-Tiempo
Controles:-Relación de peso-pH
Evaluación: -Dextrosa Equivalente (DE)-Humedad-Cenizas-Fibra
Variable de Respuesta
Controles: Temperatura, pH, agitación.Evaluación: Dextrosa Equivalente (DE)
Controles:-rpm-Tiempo
L1/S1
E1/S1
t1
E2/S2
t2
L1/S1
E1/S1
t1
E2/S2
t2
7.3 DISEÑO ESTADISTICO
La herramienta a utilizar es el método de superficie de respuesta (RSM). El
propósito inicial de esta técnica es diseñar un experimento que proporcione
valores razonables de la variable respuesta, para luego determinar el modelo
matemático que mejor se ajuste a los datos obtenidos estableciéndose los valores
de los factores que optimizen el valor de la variable respuesta.
En el experimento se eligió primero los factores o variables independientes.
Tanto Bialfa T como Glucozyme han sido estudiadas considerando como valores
óptimos de temperatura y pH: 95ºC, 5.5 y 60ºC, 4.7 para cada enzima
respectivamente; por tanto dichas variables quedan pre-establecidas (Biocon,
2003). Posteriormente se seleccionarón los intervalos de valores de cada factor,
los mismos que se muestran en la Tabla 6 y que han sido tomados en base a la
revisión bibliográfica.
Tabla 6: Variables e intervalos planteados en el modelo estadístico.
Variables independientes
Variables Intervalos
Primera etapa X1: Relación líquido sustrato. 5-20X2: Relación enzima sustrato (g Bialfa T/kg almidón)
0.01-1
X3: Tiempo de hidrólisis de Bialfa (h)
1-60
Segunda etapa X4: Relación enzima sustrato (g Glucozyme/kg almidón)
0.01-1
X5: Tiempo de hidrólisis de Glucozyme (h)
1-72
Variable dependiente (respuesta)
Y: Glucosa generada -
La forma de la función que determina la relación entre los factores y la variable
respuesta es, en general, desconocida, por lo que el primer objetivo de la RSM
consistirá en establecer experimentalmente una aproximación apropiada de la
función. Para ello, se propone un modelo de ecuación, generalmente polinómico,
en los “k” factores X1, X2, ..., Xk y se seleccionará un conjunto de tratamientos
sobre los que realizar las observaciones experimentales, las mismas que serán
27
utilizadas tanto para obtener estimaciones de los coeficientes en el modelo
propuesto (a través del método de mínimos cuadrados) como para obtener una
estimación de la variación del error experimental (se realizarán 2 observaciones
por cada tratamiento). Se realizarán, entonces, contrastes sobre las estimaciones
de los parámetros y sobre el ajuste del modelo y si el modelo se considera
adecuado.
Los polinomios que serán utilizados como funciones de aproximación son los de
órdenes uno y dos, que nos proporcionan, respectivamente los siguientes
modelos (Figueroa, 2003):
a) Un modelo de primer orden (lineal) sin interacciones o productos cruzados
b) El modelo lineal de primer orden con interacciones:
c) El modelo cuadrático o de segundo orden:
Donde ε representa el ruido o error observado en la respuesta
Se trabajará con un diseño experimental que comprende dos etapas. La primera,
que buscará la zona óptima en la fase de licuefacción por acción de Bialfa-T y
la segunda que comprende el proceso de hidrólisis por acción de Glucozyme.
Planteamiento Experimental:
A) Diseño experimental para la primera etapa de hidrólisis de almidón: la
28
licuefacción (acción de bialfa)
Se trabajará con un Diseño factorial 23+6 puntos axiales + 3 puntos centrales. Se
considerará como factores o variables independientes la relación liquido/sustrato
(L/S), la relación enzima/sustrato (E1/S1) y tiempo de hidrólisis (t1). En la
Tabla 7 se muestran los valores que serán utilizados en este planteamiento.
Tabla 7: Intervalo de los valores para cada nivel.
Nivel -1.68 -1 0 +1 +1.68
Relación E1/S1
(g bialfa /g materia seca)0.01 0.21 0.51 0.79 1
Relación L/S1 (g/g) 5 8 13 17 20
t1 (horas) 1 13 31 48 60
Para esta fase de la hidrólisis se tomará como variable respuesta la mayor
presencia de extremos reductores la cual será expresada como g glucosa /g
materia seca. La codificación de los factores se muestra en la Tabla 8.
Tabla 8: Valores codificados máximos y mínimos de los factores.
Ensayo RelaciónE/S1 (g/g)
Relación L/S(g/g)
t1
(horas)Rendimiento
(g glucosa /g ms)
Código real Código real Código real1 -1 0.21 -1 8 -1 13 2 +1 0.79 +1 17 +1 483 -1 0.21 -1 8 -1 13 4 +1 0.79 +1 17 +1 48 5 -1 0.21 -1 8 -1 13 6 +1 0.79 +1 17 +1 487 -1 0.21 -1 8 -1 13 8 +1 0.79 +1 17 +1 489 -1.68 0.01 0 13 0 3110 +1.68 1 0 13 0 31
11 0 0.51 -1.68 5 0 31
12 0 0.51 +1.68 20 0 31
13 0 0.51 0 13 -1.68 1
14 0 0.51 0 13 +1.68 60
15 0 0.51 0 13 0 31
16 0 0.51 0 13 0 31
17 0 0.51 0 13 0 31
B) Diseño experimental para la segunda etapa de la hidrólisis del almidón:
la sacarificación (acción de glucoamilasa)
29
Se trabajará con un Diseño factorial 22+4 puntos axiales + 2 puntos centrales. Se
considerará como factores o variables independientes la relación enzima/sustrato
(E2/S2) y tiempo de reacción (t2). En la Tabla 9 se muestran los valores que serán
utilizados en este planteamiento.
Tabla 9: Intervalo de los valores para cada nivel.
Nivel -1.41 -1 0 +1 +1.41
Relación E2/S2
(glucoamilasa)0.01 0.15 0.51 0.86 1
t2 1 15 37 58 72
Para esta fase se tomará como variable respuesta la generación de monómeros de
glucosa, la cual será expresada como g glucosa /g materia seca y que constituye
el producto final, el jarabe de glucosa. La codificación de las variables
independientes se muestra en la Tabla 10.
Tabla 10: Valores codificados máximos y mínimos de los factores
Ensayo Relación E/S2 (g/g)
t2
(Horas)Rendimiento
(g glucosa /g m.s)
Código real Código real1 -1 0.15 -1 152 +1 0.86 +1 583 -1 0.15 -1 154 +1 0.86 +1 585 -1.41 0.01 0 376 +1.41 1 0 377 0 0.51 -1.41 18 0 0.51 +1.41 729 0 0.51 0 3710 0 0.51 0 37
Validación experimental del modelo estadístico
Se tomarán valores óptimos y se realizarán tres experimentos. Los resultados
experimentales se compararán con el obtenido por el modelo estadístico.
Análisis de varianza (ANVA)
Para validar el modelo estadístico, se realizará un ANVA (Tabla 11) para las
respuestas y verificando si las variables son significativas (si p<0.05 o no si
30
p>0.05). Estos resultados indicarán la concordancia entre los valores
experimentales y previstos para el modelo.
Tabla 11: ANVA para la respuesta Y
Fuente de
variables
Grados
de
libertad
GL
Suma de
cuadrados
SQ
Media de
cuadrados
QM
F calc. p - valor
Regresión
lineal: RL k-1
QMRL/QMResResiduos:
Resn-k
Total n-1
En donde:
k : coeficiente de la regresión lineal.
n : número total de ensayos.
: respuesta estimada : respuesta de la media
VIII. BIBLIOGRAFIA:
31
AENLLE, P. 2009. Estructura del almidón .disponible en www.virtual.unal.edu.co (no cuadra esta referencia, la direccion electronica no coincide)
AGUDELO, I.; MONTENEGRO, J.; GURNI, A.; SCHIMPF, J. y VIGNALE, N. 2009. Análisis micrográfico de rizomas de Canna coccinea Mill. (Cannaceae). Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas, Vol. 8, Nº 4, pp. 312-316. Sociedad Latinoamericana de Fotoquímica, Chile.
ARIAS, R. y GARCÍA, H. (1998). Características fisicoquímicas y determinación de los parámetros de calidad del almidón de achira. En: Almidón de Achira, producción y uso industrial. Editorial Corpoica y Pronatta. Programa Nacional de Maquinaria y Poscosecha. Santa Fé de Bogotá.
BASSOLS, G. 2009. Análisis micrográfico de rizomas de Canna coccinea mill., Universidad Nacional de Jujuy, Facultad de Ciencias Agrarias. ( no cuadra esto)
ASOCIACIÓN DE BIOTECNOLOGÍA VEGETAL AGRÍCOLA, AGRO – BIO. Productos derivados de OGMs. Disponible en http://www.foodproductiondaily.com/ (accesada el 12/11/2009)
BENAVIDES, M.1985. Estudio sobre la obtención de glucosa a partir de harina de arroz mediante hidrólisis enzimática. Tecnología Nº 153, Colombia.
BIOCON, 2009. Bialfa-T. Disponible en: http://www.biocon.es/es/productos-documentos.php?id=29 (accesada el 02/01/2010)
BORNEO, R. (2009). Conversion de almidón en jarabes. Ciencia y tecnologia de los cereales. Disponible en: http://cytcereales.blogspot.com/2009/07/conversion-de-almidon-en-jarabes.html (accesada: 2/01/2010).
BOX, G. y WILSON, K. 1951. On the experimental attainment of optimum conditions. Journal of the Royal Statistical Society, B 13, 1-45
BRITO, B. y ESPÍN, S. 1999. Variabilidad en la composición química de raíces y tubérculos andinos del Ecuador. En Raíces y Tubérculos Andinos: Avances de la Investigación Tomo 1. Centro Internacional de la Papa. Lima, Perú. P. 13-23.
CAICEDO, D; ROZO, W. y RENGIFO, B. 2003. Alternativa agroindustrial para áreas de economía campesina. Disponible en: www.produmedios.com (accesada el 08/10/2009).
CAICEDO, D.; WILCHES, L. y BENÍTEZ, G. 2003. La achira alternativa agroindustrial para áreas de economía campesina. Editorial Produmedios. Primera Edición Colombia.
CALIXTO, M. y ARNAO, I. 2004. Modificación enzimática del almidón nativo de Amaranthus caudatus Linneo. Revista de la Sociedad Química del Perú, 70, Nº1 (28).
32
CHÁVEZ, P. 2002. Elaboración de jarabe de glucosa partiendo de almidón de camote (Ipomoea batata L). Trabajo de investigación para optar el Título de Ingeniero Agroindustrial. Honduras. Disponible en: http://zamo-oti-02.zamorano.edu/tesis_infolib/2002/T1511.pdf (accesada el 05/01/2010).
COCA, A. 1998. Utilización de los almidones en la industria panificadora. En: Almidón de Achira y Uso Industrial, Santa Fe de Bogotá. (pagina web??)
CAICEDO, G. (2003). El cultivo de la achira. Boletín Regional Nº6. Editorial Corpoica y Pronatta, Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria.
CAICEDO, G; ROZO, L. y RENGIFO, G. (2003). La Achira: alternativa agroindustrial para áreas de economía campesina. Editorial Corpoica y Pronatta, Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria.
DENPUN, K. 1960. Purification of starch by surface-active agents. Effect of surface-active agents on the saccharification of starch treated with these agents. Patente Nº DKOGAN ISSN 0416-9662.
DÍAZ, M.; FIIELLA, M. y VELÁSQUEZ; M. 2000. Estudio de la modificación vía enzimática de almidón de yuca para la obtención de maltodextrinas. Revista???
FAIRLIE, T; MORALES, B. y HOLLE, M. 1999. Centro Internacional de la papa comercio para el desarrollo sostenible de la ecoregión andina. raíces y tubérculos andinos investigación .primera edición, lima 1999. Centro internacional de la papa. Epígrafe Editores S.A Lima.
FALDER, R. 2004. Enciclopedia de los alimentos. Se encuentra disponible en . http://www.mercasa.es/nueva/revista/pdf88/enciclopedia.pdf (accesada el 12/12/2009).
FIGUEROA, P. 2003.Optimización de una superficie de respuesta. Mosaicos Matemáticos No. 11. Departamento de Matemáticas Universidad de Sonora-Mexico. Pp: 17-23.
FRAZIER, W. y WESTHOFF, D. 1993. Microbiología de los alimentos. 4ta Edición. Editorial Acribia S.A. Zaragoza España Pp. 431-438.
GENERAL INSTITUTE FOR DEVELOPING NEW ENERGY, JAPAN. 1983. Alcohol production from raw sweet potato. Patente Nº JP 58138385 .
GODON, B. (1994). Bioconversion of Cereal Products. Editorial VCH Publishers, New York. USA. Pp.219
González, J.; Rodríguez , I.; Fernández, J.; Delgado, M. (2002). Alternativas de producción de siropes edulcorantes en empresa de glucosa y derivados del maíz. TECNOLOGÍA QUÍMICA V. XXII, Nº 1.
33
HIROTO, C.; KAZUHISA, M y TOSHIO, T.1998. Trehalose-containing crystalline sugar powders, their manufacture, and their compositions for foods, cosmetics, and pharmaceuticals. Patente Nº JP 10168093. INSTITUTO NACIONAL DE INVESTIGACIONES AGROPECUARIAS (INIA-Ecuador). 1997a. Caracterizacion fisico-quimica de 30 morfotipos de melloco (Ullucos tuberosus) y 9 de achira (Canna edulis) de los bancos de germoplasma del INIAP y CIP del Ecuador. Informe Tecnico Anual Disponible en http://mail.iniap-ecuador.gov.ec/isis/view_detail.php?mfn=3686&qtype=query&dbinfo=PADIPR&words=ACHIRA (Accesada el 19/01/2010).
INSTITUTO NACIONAL DE INVESTIGACIONES AGROPECUARIAS (INIA-Ecuador). 1997b. Evaluación fitoquímica cualitativa de la presencia de terpenoides, esteroides, compuestos fenólicos y alcaloides en 10 materiales promisorios de jicama, mashua, miso y achira. Informe Tecnico Anual. Disponible en: http://mail.iniap-ecuador.gov.ec/isis/view_detail.php?mfn=3689&qtype=search&dbinfo=PADIPR&words=COMPUESTOS%20FENOLICOS. (Accesada el 05/01/2010).
JIMÉNEZ, T. RAVENTÓS, M. y MADRILLEY, C. 2000. Sustitutos de la sacarosa: Edulcorantes intensivos (II). Alimentación, equipos y tecnología. V. 19 Nº. 2. Pp: 185-199
KEARSLEY, M. y DZIEDZIC, S. 1995. Handbook of Starch Hydrolysis.Products and Their Derivatives. Editorial Chapman Hill, Cambridge, UK. Pp 296
KILIK, D.; TURHAN, A. y OZBEK, B. 2006. Enzymatic hydrolysis of starch by using a sonifier. Chemical Engineering Communications, V. 193, Cap. 9, Pp:1117-1126
KIRK, R.; SAWYER, R. y EGAN, H. 2000. Composición y análisis de alimentos de Person. 3ra Edición. Compañía Editorial Continental S.A. México. Pp. 773.
KOLPAKOVA, V.; CHELNOKOVA, E. y BAKHITOV, T. 2009. Fast, effective method for preparing quality sugar-containing product from rye grain starch utilizing use of enzymes. Patente Nº 2347816.
MARY, K y SHAWN, O. 2004. Las formas de almidón.Bioquímica.Cuarta edición. Editorial Thomson S.A. México. Pp 812
MERA, I y CARRERA, C. 2005. Obtaining glucose from yucca (Manihot Sculenta Starch). Facultad de Ciencias Agropecuarias V.3 Nº.1 Universidad del Cauca Colombia
MIWAKO, S., YOSHIHIDE, N. y YOSHIHARU, T. 1993. Beverages containing enzyme-treated unpolished rice. Patente Nº JP 05137545.
MONTES, H, C; ORTEGA L, J; MAGAÑA, P, I., 1998. Enzimas con aplicación industrial. Se encuentra disponible en.http://www.cinvestav.mx/Portals/0/Publicaciones%20y%20Noticias/Revistas/Avance%20y%20perspectiva/sepoct02/5%20HORCASITAS.pdf (Accesada el 08/11/2009).
34
MONTGOMERY, D. y MYERS, H. 1995. Response surface methodology: Process and product in optimization using designed experiments. Editorial John Wiley & Sons, New York, NY. Pp 728.
PAREDES, R. y VÁSQUEZ, J. (2001). Hidrólisis enzimática de desechos del Umarí (Poraqueiba Sericea Tulasne) y de la yuca (Manihot Esculenta Crantz) Revista Amazónica de Investigación Alimentaria, V.1, Nº 1, Pp. 22 – 29.
PEAT, S. 1954. Starch and its Derivatives. Editorial John Wiley & Sons, New York, Cap. 2. Pp.5.
QUINTERO, R. y GARIBAY, G. 1998. Biotecnología alimentaria. Primera edición. Editorial LIMUSA, México. Pp. 280
ROBINSON, D. 1991. Bioquímica y valor nutricional de los alimentos. Primera Edición. Editorial ACRIBIA S. A. Zaragoza, España. Pp. 375
RODRIGUES, M. y IEMMA, A. 2005. Planejamento de Experimentos e Optimizaçao de Processos, uma estratégia sequencial de planejamentos. Brasil.
RODRÍGUEZ, G.; GARCÍA, H.; CAMACHO, J. y ARIAS, L. 2003. El almidón de achira o sagú: manual técnico de elaboración.Disponible en: http://www.agronet.gov.co/www/docs_si2/Almidon%20de%20achira%20o%20sagu.pdf (accesada el 25/10/2009).
RUIZ, R. y VÁSQUEZ, J. 2001. Hidrólisis enzimática de desechos del umarí (Poraqueiba sericea tulasne) y de la yuca (Manihot esculenta crantz). Revista Amazónica de Investigación Alimentaria, V.1, Nº 1, Pp. 22- 29.
RUTZ, D. y JANSSEN, R. 2007. Biofuel technology handbook. Editorial WIP Renewable energies. Alemania. Pp 149.
SCHLEGEL, G.1993. General microbiology. 7ma edición. Editorial Cambridge University Press. Pp. 234-244, 446-464
SEMINARIO, J. 2004. Origen de las raíces andinas: contribuciones al conocimiento y a la capacitación. Serie: Conservación y uso de la biodiversidad de raíces y tubérculos andinos. Universidad Nacional de Cajamarca, Centro Internacional de la Papa, Agencia Suiza para el Desarrollo y la Cooperación. Lima, Perú, Pp: 376.
SEVILLA, M. 2005. Estructura y función de los hidratos de carbono: azúcares, almidón, glucógeno, celulosa. Disponible en: http://www.ual.es/docencia/jfernand/ATA/Tema5/Tema5-HidratosCarbono.pdf (Accesada el 07/11/2009).
SUMIHISA, I.; TAKASHI, Y.; YUKINOBU, G. y IKUO, T. 1993. Separation of monoglucosylrutin from rutin with rhamnosidase.Patente Nº JP 05199891.
35
SHARIFFA, N.; KARIM, A.; FAZILAH, A. y ZAIDUL, S. 2009. Enzymatic hydrolysis of granular native and mildly heat-treated tapioca and sweet potato starches at sub- gelatinization temperature. Food Hydrocolloids. V. 23, Cap 2. Pp 434-440.
SWINKELS, J. 1985. Composition and properties of commercial native starches. Starch/Starke. V. 37. Cap 1, Pp:1-5.
VADEHRA y DHARAMVIR.1986. A process for the conversion of starch based agricultural products into alcohol.Patente Nº IN 158345.
VÁZQUEZ, M; DELGADO, R. y CASTRO, J. 2009. Modelling of the enzymatic hydrolysis of potato (Solanum tuberosum) using response surface methodology. Starch/ Stärke V. 61, Cap 10, Pp 601 – 609.
VILCHEZ, S. 2005. Nuevos tratamientos de lana con enzimas. Tesis Doctoral Departamento de Ingenieria Química y Metalurgica.Universidad de Barcelona.
WISEMAN, A.1991. Manual de biotecnología de los enzimas. Primera Edición. Editorial Acribia S.A., Zaragoza, España. Pp 454.
YASUYUKI, M.; YOSHINORI, K.; YOSHIKI, Y.; TOSHIO, T.; FUMIO, H. y HIROSHI, N.1987. Manufacture of seasonings by using enzymes immobilized on chitosan beads.Patente Nº JP 62278960.
YOSHISHIGE, Y.; SATOSHI, T.; NORIMASA, Y. y TSUNEYA, Y.2000. Heat-resistant carbohydrate-degrading enzyme inhibitors from wheat bran, their manufacture, and their uses. Patente Nº JP 2000186044.
YUKIO, S.; MICHIO, A.; KEIMEI, K. y KAZUHITO, S.1990. Effective production of α -cyclodextrin and/or ,α -glucosylglycyrrhizin with cyclodextrin glucanotransferase. Patente Nº JP 02255095.
ZAMORA, A. 2008. Carbohidratos o glúcidos: estructura química Se encuentra disponible en: http://www.scientificpsychic.com/fitness/carbohidratos1.html (Accesada el 14/11/2009).
ZHANG, J.; CHEN, F.; LIU, F. y ZHENG-WU, W. 2009. Study on structural changes of microwave heat-moisture treated resistant Canna edulis Ker starch during digestion in Vitro. Food Hydrocolloids V. 24 : Pp 27–34
ZUDAIRE, M .2009.Aprovechamiento de residuos industriales de los alimentos. Disponible en http://www.estudio-tla.com.ar/aprovechar-los-residuos-industriales-de-los-alimentos/. (Accesada el 15/12/2009).
36
ANEXO 1
DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES EN ALIMENTOS
(MÉTODO LANE EYLON)
FUNDAMENTO:
Este método se basa en determinar el volumen de la solución de prueba que se requiere
para precipitar totalmente todo el cobre presente en una cantidad de solución de Fheling
y se emplea en productos que contienen más del 10 % de azúcares reductores.
Equipos y materiales
Cocina eléctrica
Matraz Erlenmeyer de 100ml
Bureta de 50 ml
Fiolas de 100, 250 ml
Balanza analítica
Papel de filtro.
Reactivos
Solución de Fheling “A”
Solución de Fheling “B”
Glucosa anhidra
NaOH 20%
Azul metileno
HCl concentrado 6.35 N
Preparación de la muestra de azúcar
37
Se pesará 15 g de muestra problema en una fiola de 250 ml, luego se enrazará con agua
destilada, se agitará y posteriormente se filtrará en papel de filtro. El filtrado constituirá
la solución A.
Azúcares reductores iniciales
Se dispondrá la solución “A” en una bureta
Azucares totales
Se tomará de la solución “A” 10 ml y se dispondrá en una fiola de 100 ml.
Posteriormente se adicionará 10 ml de agua destilada y se mezclará suavemente.
Se adicionará 5 ml de HCl 6.35N.
Se colocará la muestra en baño Maria hasta una temperatura de 70 ºC.
Se adicionará 5 ml más del HCl 6.35 N.
Se retirará del baño María y se dejará reposar durante 30 min.
Se agregará 3-4 gotas de Fenoltaleina y se neutralizará con NaOH al 20 % hasta
viraje color rosado
Posteriormente se dejará enfriar y se aforará a 100 ml.
Titulación
Se dispondrá de 10 ml de solución de Fheling (5 ml de Fheling A y 5 ml Fheling
B) en un matraz
Se adicionará 15 ml de agua destilada, se mezclará y se llevará a ebullición por
2 min.
Transcurrido ese tiempo se adicionará 4 gotas de azul de metileno al 1% dando
una coloración azul.
Se titulará hasta viraje (color rojo ladrillo) y se anotará el gasto (si es menor a 15
ml se tomará menos cantidad de muestra de solución “A”).
Cálculos:
Azúcares reductores iniciales
38
G1 = gasto de la solución no hidrolizado (ml)
F = factor de azúcar reductor
W = peso inicial de muestra (g)
Azúcares reductores totales
W =peso inicial de muestra (g)
V = ml de alícuota tomada de solución “A”
G2 = gasto de solución hidrolizada
F = factor de azúcar reductor
DETERMINACIÓN DEL FACTOR DE FEHLING
Método
Se dispondrá 5 ml de solución Fheling A y 5 ml de solución
Fheling B en una fiola de 250 ml, añadiendo posteriormente 20
ml de agua destilada y algunas perlas de vidrio (por
triplicado).La solución preparada anteriormente llevar a
ebullición durante 2 min (recipiente 1).
En una bureta de 50 ml se añadirá una solución de glucosa al
0.5% p/p dejando caer dicha solución en el recipiente 1.
Se seguirá agregando pequeñas cantidades de solución de
glucosa hasta observar un precipitado rojo y el liquido
sobrenadante sea prácticamente incoloro.
39
Se tomará en cuenta el volumen de solución de glucosa
gastado en la titulación final y se calculará el titulo del licor de
Fehling expresado en mg. de glucosa anhidra.
Cálculos:
f = (ml de sol. Gastados * % sol. Glucosa * 10 ml de sol.
Fehling) / 1000
Como el titulo del licor de fehling (f) se realizará por triplicado, se
tomará el valor promedio de los valores obtenidos.
ANEXO 2
DETERMINACIÓN DE HUMEDAD (H)
FUNDAMENTO
Se determina por evaporación del agua de la muestra en estufa a 105 ºC hasta peso
constante. La desecación ha de hacerse a esta temperatura para evitar errores por
volatilización de componentes distintos al agua o por descomposición térmica de la
muestra. Los resultados se expresan en base húmeda.
Materiales
Material de vidrio de uso habitual en el laboratorio
Balanza analítica de 0.1 mg de precisión
Estufa a 105 ± 3 ºC
Desecador con silica gel, pinzas.
Procedimiento
Se pesará según la característica de la muestra, 1-2 g si las muestras son sólidas ó 4 g
para muestras líquidas en un recipiente de peso conocido, el cual se ha secado
previamente en la estufa hasta alcanzar peso constante. A continuación, se colocará el
recipiente con la muestra en la estufa durante 24 h. Posteriormente, con la ayuda de una
pinza se colocará la muestra en un desecador que contiene gel de sílice y se pesará.
40
Cálculos
El contenido en humedad (expresado como masa en gramos de agua por cada gramo de
muestra húmeda) se calculará de la siguiente forma:
Donde:
PRMH: peso del recipiente seco con la muestra húmeda inicial (g).
PRMS: peso del recipiente con la muestra seca (g).
PRS: peso del recipiente seco (g).
ANEXO 3
DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO EN CENIZAS (CC)
Fundamento
Gran parte de los productos alimenticios contiene cenizas que se determinan mediante
incineración a 575 ºC donde se calcina la materia orgánica. El producto resultante de la
incineración es materia inorgánica compuesta mayoritariamente por sales minerales.
Materiales
Mufla capaz de mantener 575 ºC
Balanza analítica de 0.1 mg de precisión
Desecador
Crisol de porcelana
Pinzas metálicas.
Procedimiento
En un crisol de peso conocido se colocará 5 g de muestra de humedad conocida. El
material será introducido previamente en una estufa a 100 ºC durante 24 h. Después se
llevará a un horno mufla a una temperatura de 200 ºC y se va subiendo poco a poco, a
intervalos de 100 ºC, hasta llegar a 575 ºC, donde se mantendrá a esta temperatura por
24 h. Transcurrido este tiempo, se retirará el crisol, se esperará a que se enfría en un
desecador con gel de sílice y se pesará.
41
Cálculos
El contenido en cenizas (CC) se expresará como gramos de cenizas en 100 g de muestra
en base seca.
Donde:
PRC: peso del crisol con cenizas (g)
PRS: peso del crisol seco (g)
PMH: peso de la muestra húmeda (g)
H: humedad
ANEXO 4
DETERMINACIÓN DE FIBRA CRUDA (AOAC, 1984)
Método gravimétrico, digestión ácida, alcalina e incineración de muestra
Fundamento
La fibra cruda es la pérdida de masa que corresponde a la incinerización del residuo
orgánico que queda después de la digestión con soluciones de ácido sulfúrico e
hidróxido de sodio en condiciones específicas. Es una medida del contenido de celulosa
y lignina en la muestra. El método es aplicable a granos, platos preparados, harinas,
alimentos para animales materiales que contienen fibra de los cuales la grasa ha sido
extraída para dejar un residuo adecuado o su contenido es mínimo.
Materiales
Aparato de calentamiento a reflujo
Balanza analítica
Crisoles de porcelana
Desecador
Dispositivo de succión al vacío
Embudo Büchner
Estufa a 103 ± 2ºC
Tamiz malla 1 mm
42
Mufla a 600 ± 15ºC
Placa calefactora
Reactivos
H2SO4 1,25% p/p; 200 ml
NaOH 1,25 % p/p: 200 ml
Eter de petróleo P.E. 40-60
Etanol 95 %
Procedimiento
Preparación de la muestra
Se homogeneizará la muestra y se dispondrá en una estufa a 103 ± 2ºC en
estufa hasta peso constante.
Se molerá la muestra y se pasará por un tamiz de malla 1 mm
Se extraerá con éter de petróleo si el contenido de grasa en la muestra es
superior al 1%.
Determinación
(Se realizará el análisis por triplicado).
Se pesará alrededor de 20 g de muestra preparada y será transferida al matraz
del aparato de calentamiento a reflujo
Se adicionará 300 ml de H2SO4 al 1,25 % p/p hirviente y perlas de vidrio
Se conectará el aparato de calentamiento a reflujo y se hervirá durante 30
minutos, agitando el matraz periódicamente.
Pasado este tiempo se desmontará el equipo y se filtrará a través de embudo
Büchner.
Se lavará con 50 ml de agua hirviente y se repetirá el lavado con 3 porciones
de 50 ml de agua o hasta que cese la reacción ácida.
Se retornará el residuo al aparato de calentamiento a reflujo y se agregará
200 ml de NaOH 1,25 % p/p hirviente.
43
Se conectará el aparato de calentamiento a reflujo y se hervirá exactamente
durante 30 minutos, agitando el matraz periódicamente.
Se desmontará el equipo y filtrará a través de embudo Büchner
Se lavará con 25 ml de H2SO4 al1,25 % p/p hirviente, con 3 porciones de 50
ml de agua hirviente y con 25 ml de etanol al 95%
Se removerá el residuo y será transferirlo al crisol, previamente pesado.
Se secará en estufa a 130 ± 2ºC por 2 horas, se dejará enfriar en desecador y
se pesará. (“m1”)
Finalmente se incinerará 30 minutos a 600 ºC ± 15ºC, se dejará enfriar en
desecador y se pesará. (“m2”)
Cálculos
% de fibra cruda en muestra molida
Donde: m1 = masa muestra digerida, g
m2 = masa muestra calcinada, g
m = masa muestra original
ANEXO 5
DETERMINACION DEL pH
Fundamento
Se determina la concentración de iones hidrogeno con un pH-metro calibrado.
Procedimiento
44
Se lavará bien los electrodos del pH-metro con agua desionizada, secándose con papel
absorbente.
Se calibrará el pH-metro a pH 7.0 y 4.0 con las correspondientes soluciones tampón. Se
lavará los electrodos con agua desionizada y finalmente se secará con papel absorbente.
Se introducirá los electrodos en la muestra liquida y se procederá a medir el pH.
45