pseudomonas aeruginosa strains with lipopolysaccharide defects exhibit reduced intracellular...

9
Pseudomonas aeruginosa Strains with Lipopolysaccharide Defects Exhibit Reduced Intracellular Viability after Invasion of Corneal Epithelial Cells DAVID EVANS, TRACY KUO, MARY KWONG, RAJANA VAN AND SUZANNE FLEISZIG * a Morton D. Sarver Laboratory for Cornea and Contact Lens Research, School of Optometry, University of California at Berkeley, Berkeley, CA 94720, U.S.A. and b Touro University College of Osteopathic Medicine, Mare Island, Vallejo, CA 94592, U.S.A. (Received 2 April 2002 and accepted in revised form 4 September 1999) Pseudomonas aeruginosa is a leading cause of infectious keratitis. Many ocular isolates of this bacterium invade corneal epithelial cells in vitro and in vivo. Antibiotic survival assays have shown that a complete core lipopolysaccharide is required for full epithelial invasion by P. aeruginosa. In this study, we show that P. aeruginosa mutants with defects in their lipopolysaccharide core and O antigen exhibited reduced viability after internalization by corneal epithelial cells. Restoration of lipopolysaccharide core and O antigen expression by complementation with the plasmid pLPS1 restored intracellular survival. P. aeruginosa strains with a complete lipopolysaccharide survived and replicated within the cells. The data suggest that lipopolysaccharide is involved in the intracellular survival and/or replication of P. aeruginosa, indicating an additional mechanism by which this important virulence factor may contribute to the pathogenesis of corneal infection. # 2002 Elsevier Science Ltd. Key words: P. aeruginosa; cornea; invasion; intracellular survival; replication; LPS. 1. Introduction Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic Gram- negative bacterial pathogen that causes a sight- threatening corneal infection commonly associated with extended wear of soft contact lenses (Wang et al., 1998; Cheng et al., 1999). Many clinical isolates of P. aeruginosa can invade and replicate within corneal epithelial cells (Fleiszig et al., 1995), and intracellular P. aeruginosa have been demonstrated in animal models of corneal infection (Fleiszig et al., 1994). Lipopolysaccharide (LPS), a major component of the outer membrane of Gram-negative bacteria, is one of the virulence factors essential for P. aeruginosa to cause corneal disease (Preston et al., 1995). In general, LPS is thought to make multiple contributions to the pathogenesis of diseases caused by P. aeruginosa (Cryz et al., 1984; Knirel, 1990; Rocchetta, Burrows, and Lam, 1999). In addition to mediating in¯ammation, LPS can protect the bacterial surface from harmful host factors in the extracellular environment, such as complement and antimicrobial peptides (Hancock et al., 1983; Knirel, 1990; Rautemaa and Meri, 1999). Of speci®c relevance to corneal disease, LPS in¯u- ences adherence of P. aeruginosa to corneal cells and contact lens materials (Fletcher et al., 1993; Gupta et al., 1997). LPS is also thought to be involved in P. aeruginosa invasion of corneal epithelia, since mutations that affect the LPS core have been found to reduce the number of bacteria that can be recovered from infected corneal epithelial cells (Zaidi et al., 1996). Therefore, LPS not only facilitates colonization of the eye, it may also contribute to the pathogenesis of P. aeruginosa corneal infections by allowing the bacteria to hide from, and thus evade, host defenses such as complement, antibodies, phagocytes, or anti- microbial drugs such as aminoglycoside and b-lactam antibiotics, that do not readily enter mammalian cells. It has been assumed that the role of LPS in P. aeruginosa invasion of corneal epithelial cells involves promoting the actual internalization event. However, the antibiotic survival assays which measure bacterial invasion do not readily distinguish between the ability of the bacteria to enter cells and their ability to survive and/or replicate within the cell after they have entered. Research with Brucella abortus (Riley and Robertson, 1984; Allen et al., 1998), Salmonella typhi (Baker et al., 1999), and Yersinia enterocolitica (Skurnik et al., 1999) has shown that their LPS can play a role in intracellular survival, at least within professional phagocytes. In this study, we tested the hypothesis that the role of LPS in corneal epithelial cell invasion by P. aeruginosa includes protection against bacterial killing in the intracellular environment after internalization. This hypothesis was tested by comparing the intracellular survival of wild-type invasive P. aeruginosa with a series of well characterized LPS mutants. Exp. Eye Res. (2002) 75, 635±643 doi:10.1006/exer.2002.2072, available online at http://www.idealibrary.com on 0014-4835/02/$35.00/0 # 2002 Elsevier Science Ltd. * Author for correspondence. E-mail. ¯[email protected]. edu

Upload: david-evans

Post on 10-Oct-2016

212 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

���������� ������� ������� ��� ����� ���������� ������������� ������� ������� � �� ����� ��� ����� �������� �� ������

����� �� �� �

����� ������ ��� ��� ��� ����� ����� ��� ��� ������� ���������

������� �� ���� � ������ ��� ����� �� ������ ���� �������� ������ �� ���������� ��������� ���������� � ��������� ��������� �� !"#$� ������ �� �%�&�� ��������� �����'� �� ���������� ���������

��� (����� )���*�� �� !+ #� ������

�������� # ����� #$$# �� ������� �� ������ ���� ! ������ �� , �

���������� ������� �� � ������ ���� � �� ������ ���������� ���� ����� �������� � ���� �������������� ������ ���������� ���� �� ����� ��� �� ����� ��������� �������� ������ ���� ����� ���� � ���������� ���������������� �� �������� �� ��� ���������� �������� �� � �������� �� ���� ������ �� ���� ����� ������� ������� ���� �� ��� �� ����� ���������������� ��� ��� � ������ ��������� ��������������� � ��� ��������� ����� �� ������ ���������� ����� !���������� � ���������������� ��� ��� ������� ���������� �� �������������� ���� ��� ������� �"#$% �������� ������������ ���������� ������� ������� ���� � ������� ���������������� �������� ��� ��������� ������ ��� ����� &������ ����� ���� ���������������� �� �������� �� ��� ������������ �������� ���'�� ���������� � � �������� �������� �� ���������� �������� �� ���� ���� ��������� �������� ���� ������������ �� ��� ����������� � ������ �� ������ � ())( *������� $���� "���

��� ����� � �������� �����+ ��������+ ������������ ��������+ ����������+ "#$�

�� ����������

���������� ������� �� �� ������������ ,���-������� �������� ������� ���� ����� � ����-���������� ������ �� ����� ������� ������������� �������� ���� � �� � ����� ������ ./�� �� ����%001+ 2��� �� ���� %0003� ���� ������ �������� � � ������� �� ������ ��� �������� ������ ���������������� ���� .4���� � �� ���� %0053� ��� ������������� ������� ���� ���� ������������ �� ������������ � ������ �� ����� .4���� � �� ���� %0063�

"��������������� ."#$3� � ��7�� �������� � �������� �������� � ,���-������� �������� �� ��� � ��� �������� ����� ��������� �� � ������� �� ���������� ������� .#������ �� ���� %0053� �� ������� "#$�� ������ �� ���� �������� ������������ �� �������������� � �������� ����� �� � ������� .2�� �� ���� %016+ 8������ %00)+ !������� 9������� ���"��� %0003� �� �������� �� �������� ��:���������"#$ �� ������ ��� �������� ��� �� ��� ���� ������ ����� �� ��� ������������ ������������ ��� ����������� ��� ������������ �������� .;������ ���� %01<+ 8������ %00)+ !������� ��� ����� %0003�

� ����= �������� �� ������ �������� "#$ ��:�-���� �������� � � ������� �� ������ ���� �������� ���� ��������� .4������ �� ���� %00<+ ,������ ���� %00>3� "#$ �� ���� ������ �� �� �������� ��� ������� �������� � ������ ���������� ����

��������� ���� � �� ��� "#$ ��� ���� ���� ���� ������� ��� ������ � ������� ���� �� �� �������� ��� �� ���� ������ ���������� ���� .?���� �� ����%00@3� &���� ���� "#$ ��� ���� ��������� ����� ������ ��� ���� �� ��� ���� ��������� �� ��� ����������� � � ������� ������ �� ������ �� ������� ���������� �� ���� ���� ��� ���� ������ ���� �� �������� �� ���������� ����������� ��������� �� ����-�������� ���� ��� �� ������������ ��� �-���������������� ���� �� ��� ������� ����� ��������� �����

�� ��� ���� ������� ���� ��� ���� � "#$ ��� ������� �������� � ������ ���������� ������������ �������� ��� ����� ��������� ����� ������;������� ��� ��������� �������� ������ ����������� �������� �������� �� ��� ������� ����������������� ��� ������� � ��� ������� �� ����� ���� �������� ������� �� ������� ���'�� �������� ������ ��� ���� ��� ���� ���� �������� !������ ���� ����������� .!���� ��� !��������� %016+ ����� �� ����%0013� �������� ����� .9���� �� ���� %0003� ��������� ������������ .$������ �� ���� %0003 ��� ��������� ����� "#$ �� ���� � ���� �� ������������ ����������� ����� ������ ��� �������� ��������� �� ���� �������� ������ ��� ���������� ���� ��� ���� � "#$ �������� ���������� ��� �������� �� � �������������� ��������� ������ �������� ������ �� ��������������� ����������� � ��� ��������� ������ &������������� ��� ������ �� ������� ��� �������������������� � ����-���� �������� � ������� ���� ������� � ���� �������� �� "#$ ��������

��� ��� ��� .())(3 � � @<5A@6<���B%)�%))@'�����())(�()>(� ��������� ������ �� ����B''������������������ ��

))%6-61<5')('C<5�))') � ())( *������� $���� "���

� ������ �� ������������� *-����� :��� �D��������������������

�� ��������� ��� �������

�����

*���������� ���� ������� ���� ��� ��������� ������� ������� �805> .�������� �53 ���#�2%! .�������� �<3� ��� � ������ � "#$ �������������� ��� ����� ������� ���� ��� ������� �� ��&���� �� ������ ���� �������� ��� �������� .%1 ��3������� ���� �� ��������� ��� ��� .&$�3 ������ ��<>�2� #������-������ ������� ���� ���� ����� ������� ��������� �� &$� ������������ ���� �����-����� %)) � ���%� 9������ ���� ��������� ����������� ��������� ������ .�*�3 .2�����&�� 4�����$�����=� #��������� #�� E�$���3 �� � ����������� � ������������� % � %)1 � ���% ���������� ������������������ .�F@5)3� ���� ������� �� �*� �� �=��� ����������� � % � %)@ �� % � %)> � ���%�9������� ������������ ���� ��=���� �� �����������

���� �������

#������ ������� � ������ ������ ���������� �������� �������� ��� ���������� �� �������� ����������.4���� � �� ���� %0053� 2���� ���� ���� �� %) � ������.2������ G�� H���� GH� E�$���3� 4�� ��� �� �����-������� ���� ���� ������� ��� ���� (6-���� ������������ ������ ��� ���� �� (A< ���� ����� ��:�����

�������� ��!�!� "���

� ������� �������� � ������ ���������� ���� ������������� ������������ �������� ���� ������=��

���� ��� ������� ������� 9������ ��������� ��()) �� �*� ���� ����� �� ��� ���� � � (6-���������� ������ ����� �������� ��:���� ������������� ���������� ����� 4������� � < �� ������������� ( � %)5 � �������� �� � % �� �� <) ������������ ���� ( � %)@ � ������� �� <>�2� �������� ������� �� �������� .()) � ���%3 �� % �� ��<>�2 �� ���� ������������ ������� �� ������������������ .�������� �����3 .4���� � �� ���� %0053� &������ ������������ ��������� ���� ��� ������� ������������ �� �������� �� �� ���������� < �� .� ������ 6 �� �������� ���������3 �� ����� ��� ���������-��� ������� ���� ������ ��� ���� .������������ �������������3� ���������� � ������� ��� ����� �� ������������ ���������� ������� �� ��� ���� ���� �������� � ���������� � ������� �� ��� ������ &������� � �������� ������������ �������� ����������� �������� ���� ���� ������ ��� �����*� .5)) ��3� ��� ���� ����� ���� &����� I-%)).)�(5J �'�3 �� �*� .() ���3 �� ���������� ��������.4���� � �� ���� %0053� &�� ������ � ������ �����-������� ������� �� ��� ������� ��� ������=�� �� �������������� ��� ������ ������ ���� &$� �������2���������� � ��� �� ����� �� ������� � � ������� �������� � ��� % �� � ����������������� .�������� �����3 ��� 6 �� � ����������������� .������������ �������� �����3 ���� ���- ����� �� ����� ��� ��� � ��������� �� ��������

�� ����� ����� ������� ���� ���� �� ��� ���� ����� ����������� ��� ����������� ���� �������� ������� ����� 2������� ���� ��� ����� �� ������ ��������� ���� �� ����=��� �� ������ �� ��� ���������� � ����-���� ��� ������ ������� ������ % ���

&�9"* �

#� ��������� ����� �� #�� ������ ���� �� ���� �����

� ������� ������ "#$ ������������ !� ������'�������

�805> #����� ������+ ������� "#$ .�������� �53 2���� � #�)%.K������ ��� 8��������� %0>>+8��������� 2���� ��� ���� �� %0>03

�8%)%( F� ����� "#$ ���+ � ������ ��=����� F��������� � �805>.K������ ��� 8��������� %0>>+8�������� �� ���� %0>03

�8%)%( � �"#$% .���� ��&$� � ���������� %)) � ���%3

"#$ ��� � � ������ �������� .�������� �53 �"#$% ������� ��� ��� ���.,������ �� ���� %00<3

�8%)%( � �"�4!% .���� ��&$� � ���������� %)) � ���%3

F� ����� "#$ ���+ � ������ ��=���� ������� ������ �� �"#$%.,������ �� ���� %00<3

#�2%! #����� ������+ ������� "#$ .�������� �<3 .!��� ��� ������� %01<3#�255> 2������� "#$ ���+ G� � ������� F��������� � #�2%!

.!��� ��� ������� %01<3#�2@%% 2��� L � ������ �������� #�2%!�

��� M�����N "#$F��������� � #�2%!.!��� ��� ������� %01<3

#�2@)5 F� ����� "#$ ���+ � ������ ��=����� F��������� � #�2%!.!��� ��� ������� %01<3

#�2%!���B B��� F� ����� "#$ ���+ � ������ ��=���� �������� � ��� �� #�2%!.2���� �� ���� %0063

�� ������ ������� �� ������ ������� $F$A#�,* ���� ����� ������� � � ������ ������� ���� ��������-����= ��������� ��������.F������ �� ���� %0063

��� �� ����� � ���

< �� ��������� ������� �� �*� ����� �� ������������������ ��� ���� ��� ������� ���� ������� ������������ �������� .���� ��� �����3�

���������

F��� ��� ��������� �� ����� $�F� $��������� ������-���� � ��� �� ������ ������� ��� ����� ������ ����� ���� �G�O� �� $������N� �-������ ������ � )�)5 ���� ��������� ����=����

�������

��� ������� ���� �������� ��� $��� .$�� "�������� E�$���3 ������ ��������� �������

�� ������

$���%���� #� ��������� ��!�!�� �� ��������� ������� ��������� ������ #�� ����� &���� '��!��!��� ������ ����������

F� ��� �� ��� "#$ ��� ���� ���� �� ��������������� ��� ��������� �� ��� ���� ������������������� &��� ��� ����� �� ������� ����-����� ������� ������ �805> .� ���� � � ������������� #�)% P�������� �5Q3� ���� �8%)%( .� "#$-��� ��� � ������ �� ����� ������ � �805>3 ������� � < �� ��������� � ���� ���� ������� ��������� % �� � �������� ��������� �� ���� ������������������� .4�� %3� &���� ���� ����=����� ���������������� ������� ������ ���� ��������� �����805> .>5)�5@ �3 ���� ���� ��� "#$ �������8%)%( .0>�<% �3 .� � )�)))%� �-����3� � �������� ���� ����� � ��������� ���� ����������805> ��������� ������������� ������ ��� ���������� .������������� (5- ���3� &��� ���������� ���������� �� ���� �������� �� �*� ������� .���� ��������3� �� ����� �������� "#$ ������ ������� ������� ������� ���� ���� ��� ������ ���������������

&�� ��������� ������ ����� �� ����� ����������� ��������� �� ������ � ��� ��������� ���� � ������������ ������� ����� �� ��� =��� �������� ��������� .4�� (3� $����������� �� ��� ���� ���� ����������� ������� ����� ��� �� ����=��� �� ����� ���������� ������ ������� �805> ��� ��� "#$ �������8%)%(� &�� ���� �� ���� �� ������ �������������� �805> ��� �8%)%( =��� ����� ������������� ������� <) ��� ��� % �� ��������� � ������� ���� ����� &���� �� ��� ��������� � ���������� � % �� ��������� ������ ��� ���� �� ����� ������� � "#$ �� ������������ ���������

�� ������� � �� ���������� �� ���� ��� "#$������ ������� �� � =������ �� ����-���� �805> � ���% �� �������� ����� �� ��������� �� 4�� ( .� � )�%>(��-����3� � ��� ��������� ������ �805> �������� ������������ ���������� ����� ��� ������� �� �������� ������������� ���-��� ���- ��� .������ 4��� ( ��� <3� ����� ���������� ����� �� 4�� (� �805> ���������� ���

������� �������������� �� ��� ����� < �� �� ������-��� ��� �� ��� ��� ����������� ����=��� ���������������� ���� .� � )�(1@� �-����3� $����� �8%)%( ��������� �������������� �� ��� ������������

�������������� �( #�� '�(���� �� #� ���������������� �������� ��!�!�

&�� ������� �"#$% ��� ���� ����� �� ������� ���"#$ ��� ��� �-������ ���������� �� �8%)%(.,������ �� ���� %00<3� &��� ������� ������� � �������� �"�4!% �������� �� %1�( �� *�!% ��-���� � FG� ����� ��� � ������� ������ #��%��� ��� ������� ������ ��� �������� ��� �������������������� � ������ �8%)%( ����������� ���� ���������� �"#$% �� ��� ������ ������� �"�4!% .,���-��� �� ���� %00<3 ���� �������� 2��������������� ��� "#$ ������ �8%)%( ���� �"#$% �������� ���������� �� ������� ��������������� ��� ��������� ����������� ������� �� �������� ������ ��� ��� .4�� <.�3�� � )�)<<� �-����3� !���������� � ������������ �����-��� �� �"#$% ��� ��� �� ��� �������� � �������FG�� ���� �������������� ���� ��� ������ ��������"�4!% ��� ��� ������� ���� ������ .4�� <.933�

'�(���� �� ��� #�� ��� � "�������� ���� ������� �������� ��!�!�

&�� ����-���� ������ #�2%! ��� ������� ��#�2%!���B B��� � ���������-��=��� ��� ������ � #�2%! .2���� �� ���� %0063 ���� ��� �� ���������"#$ ���� ��� ���� ��� ������� � ������ .4�� 6.�33�&���� ��� �� ����=��� �� ����� �� ����� ������� �������� ���� �� � % �� ����� .� � )�>1� �-����3� � ������������ ��� ������ #�2%! �������� ������ ��������� ����+ ��� ������ �� ������������ ���������������� ������� ���- ��� ����- ��� �� �� ���������������� .������ 4�� 6.�3 ��� .933� �� ����������� "#$ ������ ����������� ���� ��������� ������ ������� ����� ��� < �� ����������� ������ .� � )�))%6��-����3� &���� ������� ���� � ���������-��=��������� �������� ����� �������� �� ������ �805>��� ��� ��������-������� "#$ ������� �8%)%(�

$��� ��� ���� ������� � ���� �� "#$ �� �����-������� ��������� �� ����� �� ��������� ��� ������������� � "#$ ��� ��� ��� � ������� ���� ��� ����������� �� �8%)%( ��� #�2%!���B B���� &� �� ���#�2%! ��� ������� �� � ������ � ����� "#$ ����������������� � ���� ������ .4�� 6.933� $����� #�255>���� ��� � ������� "#$ ���� ��� ���� ��� ������� �������� �������� ��� ��������� ������ ��� ���������������� ����� ��� �� � ������ ������ ���� ��� ������#�2%!� 4�� �������� �� ��� ���������� ����� ��4�� 6.93� #�2%! ��������� ������������� ����- ����������� #�255> ��������� ���� �� ������������� ���- ��� .� � )�)))0� �-����3� $����� #�2@%% ������� M�����N "#$ ���� ��������� ��������� ���� � #�2%! .!��� ��� ������� %01<+ F������ �� ����%0063 �������� ��������������� ��� ������� ���

-� �.��/(0��� ������� ����� ������ �������� ��

����=��� ���������� .� � )�@@1� �-����3� &����������� ���� � ���� �� ���� ��� "#$ ��� ��� ������� �� ������������ ��������� ������������� ��������������� � #�2@)5� � ���-�� ����� ������ �������� � ������� ��� ������������� �����- ��� ���������� ���� � #�2%! .� � )�)%6� �-����3� &���������� �������� ������ ��� ����������� ��������

�� ��� ����������� ��� ������ $������������ ��������������� ������� � #�2@)5 �������� ��������������� >5 J .� � )�)(6� �-����3� ���������� ������� �� ������� ������ �� ��������� ������� ������ ���������� ����� ���� "#$ ������ �� ������� ��� ������� ����� �� ���� ����� ��� �� ������ ���� ������-����� "#$ ������� ������ �� ���� ������

4�,� %� ������������ �������� � � ������� ������ �805> .�3 ��� ��� "#$ ������ �8%)%( .93 ������ ������ ���������� ����� ��� � < �� �������� ������� F� ������ ������� ��� % ��� 6 �� �������� ���������� � ��� ��� �������� ������ ��:�� ����������� ���'�� ���������� � ������������ ��������

��! �� ����� � ���

�� ��������

��� ���� ���� ������� ������������ ���� �� "#$-������ .����-����3 ��� "#$-���� ������� � � ������� ������ ������ ���������� ����� $���������� � ������� "#$ �������� .������� ��� ��� �������3 ������� ��� �������� ������ ������ ���������� ������� � ����� ������� ���� �� ��� ��"#$ �������� ���� � ������ ������ �� ���������������������

�8%)%(� #�2@)5� ��� #�2%!���B B��� ���� ��������� �� ������� ����� "#$ �� ���� � ������ �� ������������ �� ������ �������� ��� ���� ��� ���� ��� ����� "#$ ��� ���� ����� � ������� ��������������� �� $F$A#�,* ��� ���� ��� �������� ���������� ����-���� ��� .2���� �� ���� %006+ F������ �� ����%0063� ��� ����� � ����� ������� ���� ������������������ �� ����� ������� �� ������� ������ ���������������� ����� ������� ������� �8%)%( ���#�2@)5 ��� ��������� ����=���� ��� ���� � �����-������� ��������� � ��� ���������-��=��� ��� ���������� ������� "#$ �������� �� ��� ������� ������ ������ �� "#$ �� ��� �� ����� ������� ���� ��� ����������� ��������������� �� ������������ ������� 4������������������������� � ��� "#$ �� ��� �� �������8%)%( �� ��� ������� �"#$%� ���� �������� �������� "#$ ��� ��� � ������ ���������� .,������

�� ���� %00<3� �������� ������������ ��������� ��� ��������� �� �������� ������ ������ ���������� �����

"#$ � ,���-������� ������� �� ���� �� � �������7�� ��������� &�� ��������� ������� �� ����� ����������� ����� �� ���������� ���� �� �������� ����� ����� �������� ��������� "���� � �� ������� �� ������� ��� ������ ���� �� ������ �������� ����������� ����� �-������ ���� ����� ������� ������������ ���� ��� ������������ ����������� � ����������� &�� ������������ � ������� � #�2%! ������� ������ � ������� ��� �� �-������� �� ������������ �� ����������� � ��� �������� ����� � �������� �������� � "#$� 9��� ��� ������� � � �������"#$ ��� ��� ��� ������� � �-������ ���� ���� ����������� �� ��� ������� � ������� �� ����� ����� ������������ ���������� ���� � ��� ������ &�� ���� ������������������ ������ ��� #�2@)5� ���� �� �� ������� ���� ��� ��� ��� �-������� &��� ������ ������� ������������� ������ ����� 9��� #�255> .�-��������=����� ����� ���3 ��� #�2@%% .����������-������� ��� ��� M�����N "#$3 ���� �������� ������������ ������ ����� ��� ������� ������ ��������� ��� =������ �� #�2%! ���� ��� ������ "#$� &�� ����������� �������� ���� �-���� ����� ��� �� � ��������������� ���� "#$ ���� ���� �� � ������ ����������.4�� 63� #�2%! ��������� ������������� ����- ����

4�,� (� ������������ �������� � � ������� ������� �805> ��� ��� "#$ ������ �8%)%( ������ ������ ���������� ���� � ���� ����� �������� ������ .% ��3� F� ������ ������� ��� % ��� 6 �� �������� ���������� � ��� ��� �������� ������ ��:�� ����������� ���'�� ���������� � ������������ ��������

-� �.��/(0��� ������� ����� ������ �������� ��"

#�255> ��������� ������������� ���- ���� �����

#�2@%% ������ �� ����=��� ������� �� ��������&�� ������������ �������� ��� ���������� � ������

#�255> ��� ������� �� ���� �������� ���������� �� �

"#$ ������ � � ����� ����� ���� � ������� "#$

��� ��� ��=���� �� � ������� ������� ��� ���������

������ ;�"� ����� ��� ��� �� � =������ �� ��� ����-���������� .E���� �� ���� ()))3�

O��� ������ �� ����� � ��� ������ ���� ����� ����� �

� ������� ���� ��������� ����� &�� �� ����� ����

4�,� <� ������������ ��������'���������� � ��� �������������� � �8%)%( ���� �"#$%� ���� �������� � ������� "#$ ������ �������� �5 �������� �� ������� �� ��� ����-���� �805> ��� ��� "#$-���� ������ �8%)%( .�3 ��� �8%)%(����������� ���� ������� ����� ������ ."#$-����3 .93�

�#$ �� ����� � ���

� ����-���� ��� "#$ ������ ������� ��� ������ ������ ������� � �������� �������� �� ��� ��������� -

����� � ����� �������� �� ����� ��� �� � �����

������� � ��������� ����� ���� �������� ���������������� �� ������������ ������ �������� �� �����

������� ������������ ������ ���������� ���� ������������ "#$ ������� ���� ������� ���� "#$-������

������ �������� �������� ������� ��� �� ������� ��

������� ��� ������������ ����� ����� � ��� ��������� "#$ ������ ������� � ��� ��������� ������

4�,� 6� ������������ �������� ����� ������� ��� ����-���� ������ #�2%! ���� .�3 � ��������� ��=��� "#$ ��� ��� ������� �� ����� ������� #�2%!���B B���� ��� .93 ����� ����� "#$-�� ����� ����������� � ���� ������� #�255>� #�2@%%� ���#�2@)5� &���� ��� ����������� ���� ���������� ��� �������� ������������ ����� � #�2%! � ��� � % �� �������� ������

-� �.��/(0��� ������� ����� ������ �������� �#%

&�� ���� � "#$ �� ������� ������� �� ����������������� ������� �� �� �� ����� ��� ��� ���� � "#$ ���� ����� ����� ���������� #�255> ��� #�2@)5 ������ �����-��������� ���� ���� ��� ����=��� �������� �� ���� �������� � ������ �� ����������� �������� ������� ���� ���� ����� ���������� �� �� ����������� � �������� �< ����= ��������� ��������.F������ �� ���� %0063� ��� #�255> �������� ������������ �� ������ ���� ����� #�2@)5 �� ��������������������� &���� �-������ �� ��� ��� �� =������ ������ � ������� �����-���������� ����� �����-������� ������ ���� �������� � �� ����� ���� &����� ����� ������ ���� ����� ��� "#$ ������� ����� ��� ��������� ������ ������ ������������ ��������������� �� � ������ ������� �� � ������-�������� ����� ��������� .!������� ��� �����%0003� �� �� ������ ���� ��� ���� � ��� "#$ ��� �������������� �������� ��:��� ��� �������� � ��������� � ��� ������� �� ���������� ����� ���-����� �������� ��� ������� �� ��� ���� ����� ������ ��� �� ��� "#$ ��� ����� ����� �������� ��������� � � ������� .����� �� ���� ()))3� �� � ������� �������"#$ ��� �� ��� ��� ��������� � ��� ����� �������� � � ������� �� =������ �� ����� ������������� �������������� ��������� �������� �� ��������� !� ������� � �� ��������.�3 �������� ������� �� ��� ���� ����������� � �� ����� �������� �������.�3�

/��� ��� ������� ���� ���� < �� �� ������ ��������� ���� ����� �� ������� ������������ ������������� ���� ���� �� �������� ��� ���� � =������ �������� ���� ���� ���� ���� % �� �� ������ ����.4�� %3� &���� ���� �� ��� ������� �� ���� �������4������� ��� ������������ ������� ���� ���� ���� ������� �� ����� ����������� �� ��� ��� ��� �� ������� ��������� #������ ���� ���� ��� ������� ���� ������ ���� �� � ��������� ���� ������ �� �������������� ��� ���� ���� ���� ���� � �� ����� ��������������� �������� �� ����� ��������� �� �������������������� $������� � ����� �������� ������ ����� ����� ����� ��� ������������ �������� ������� � ������������ ����� ���� ���������� �� ���� ����������� ������������ �� � ����� ����� ������� ����������� ���� ���� �� ����� �� ��� ����������������������� �� ����������� �� ����������� ���������-��� ���������� ���� ������� ��7������� �� ����� ���;� ���������� �� ����� ������������� ������ ��� ������ ������ �� ������� ����� ��� ��� ������������� ������ ���� ���� � ������� ��� �������������� �� ����� �� ����� � ��� ����� .4���� � �� ����%0063�

#������� ������� ���� �������� ������� ����������� "#$ �� �������� �� ��� ��������� ����� � � ������� �� ������ ���������� ���� ���� ���������� ���� < �� �� ������ ���� .?���� �� ���� %00@3�������� �� ���� ���� "#$ �� �������� �� ��������������� �������� � ��� ��������� ����� �� ���� %��� < �� �������� ������� �� ���� ��� ���� �� =�� ���������� ���� �� "#$ �� � ������� ��������� ������� ��� % �� ������� "#$ ������ �������� ��� ����� ��

�� ������ ���� ��� �������� ������ ������ �� ����������� ������� ���� � ������� ��������� �������� ����������� � "#$ ����� ���� ������� ����������� ������� ���� ����� ������� ����� �������� ��������� ���� ���� �� �� �������� �� � ������� ����������� ��� =��� ���� � ��� �����+ �� �� �������� � ��� :������ �������� ��� )�" ��� ���� �� ���������������� ����� �� ������ ���������� ���� �������� ���� �������� �� ������������ ��������'������-���� .4���� � �� ���� ())%3� ������� "#$-����������������� ��������.�3 �� � ������� ��� �������� ��� ��� =��� ���� � ��������-��� ������ ��� ������������� �� ���� ����� ����� ���� �� ����� ��������������� ���� � ��� ���� � "#$ ���� ������� ��������������� �������� � ������� � ��� ��� �������������� ����� ������

�� ��������� ��� ���� ����� ������� ���������� ���� "#$ ���������� �� ��� �������� � � �������� &�� ����������� � "#$ �� �������������������� ��� �� ������� ������ �� ��� ��������� � "#$-��� �� ����� ������� � � ������� �� ������������ � �� ������ ��������� ��� ����� � ��������� ������ .,������ �� ���� %005+ #������ �� ����%0053� �������� ��� ������������ �������� ������������ ���������� ���� ���������� � ��������� ���������������� �� � ������� �� ������ �� �������&���� ��� �������� �� ���� "#$ ��� �� ��������������� ��������� ���� � ������� �������� ������ �������������

���������������

/� ����� ���� �� ������� ��� �������� �� F� ,����� 9� #����;������ ������ $����� 9������ ��� E�$���� ��� F� K�����9� ,������� E��������� � O������� 2��������������� O��E�$��� �� ��������� �������� ��� "#$ ������� ��� ����������� �� ���� ������ ��� �� ���� �� ������ &��� ������� ������������ �� � ������� ���� ��� ��� G������� ���������� � ;������ 9�������� �F� E�$��� .*H%)((%3� ��� � 4�����!������ ,���� ��� ��� E��������� � 2��� ������ 9��������2�� E�$��� �� $�K4� /� ���� ���� �� ������� ��� ������ ������ 2����� 9���� L "���� ��� 2�9�O����� �� ������������ ������� ��������

���������

������ 2� ��� ������ ,� "� ��� 4���� &� �� .%0013�&���������-������� ������ ����� ���� ���������� ���������� ��� ������� ������ ������������ �����-���� �(��� ���� ��� %))1A%@�

9����� $� K�� ,���� K� $� ��� ������� !� .%0003� &���������� ����� �������� ��������� ��� ���9 � ��������������� ����� �� #��-�� ���������� E0<> �������������� 9 ��������� ��� ����������������� &���%������� �� � <@>A>1�

2���� 8� ;�� "���� $� "�� ;������� ;� /�� 9�������� /� ;��������� #� ,� ;�� ,�������� �� K� �� ��� 8�7������ ��.%0003� ������� � �����-����-��������� ����������������� ��� ��� ������� ���������� #���� � �� %1%A5�

2����� �� K�� !������� 8� $�� 2����� 2� "� ��� ,������� K� 9�.%0063� &�� ���������� ������� ��� ��� ����������������������� �������� �� ��� ��������� � �

�#& �� ����� � ���

������� ���������������� ���� * ������� ����<5))A>�

2�� � $� K�� K��� #���� &� "�� 4�R ���� *� ��� ,��������� !� .%0163�!��� � ���������������� �� �������� � ������������������ �(��� ���� ��� 5)1A%<�

F������� &�� F�8������ &� !�� ������� ;�� ������� *��!������� K� 2�� $���������� ��� $������ F� #� ��� "���K� $� .%0063� 2�������� ����� � ����������������-��=���� ������� � ���������� ������� ������� ��� ��������� �<� �5� ��� �@� �(��� ���� ���1)0A%>�

4���� �� $� �� K�� ������ $� 8�� O��� !� ��� !������� !�.())%3� 4���� � �������� � ��� :������ ����������������� � ���������� �������� ����� � ���� ����������� ����� �� ������ ���������� ����� �(��� ���� � � 60<%A>�

4���� �� $� �� K�� ?����� &� $�� 4������� *� "�� #������� �� K� ���#���� ,� 9� .%0063� ���������� ������� ������������� ���������� ���� ����� ������������ �� ������ �(��� ���� ��� <615A0(�

4���� �� $� �� K�� ?����� &� $� ��� #���� ,� 9� .%0053����������� ������� �������� ��� ������������������� ������ ���������� ���� �� ������ �(��� ���� ��� 6)>(A>�

4������� *� "�� 4���� �� $� �� K� ��� 9������� G� �� .%00<3�"��������������� �� �������� � ���������� ��%����� �� ��� ����� ��� ����� ������� �!���+�������� ,�� ��� ��� %0<)A@�

,������� K� 9�� 2����� �� K�� G����� �� G� ��� ;������ �� ��.%0053� ��������� � � ���������� ������� ��������� �� � ������-����� ����� � �� ������ �(��� ���� ��� 6%@@A0�

,������� K� 9�� ;������ 8� ��� #���� ,� 9� .%00<3� $��������� ���������������� � ���� ����� �� ����������������� #�)% �������� ��� �� ��� ������������-������� * ������� �� � %@)5A%%�

,����� $� 8�� �������� $�� ,������ �� ��� ;� ����� "� F�.%00>3� ���������� ������� ��������������������� ������-< ��� ����� ����� ������ ������������������� �(��� ���� � � (>6>A5<�

;����� !� *� /�� ��������� "� ��� 2���� "�� F������� !� #��$������ F� #� ��� #���� ,� 9� .%01<3� ����������������� �������� ��� �������� ���� ���� =������B ����� � �����-���������� ���-������� ������� ��=���� ������������������ � ���� ������ �(��� ���� ���%>)A>�

K������� 8� 4� ��� 8��������� �� �� .%0>>3� &�� ���������������� � ��� ���������������� ��� ����������

������� ������ #�� ��� � ������������� ����������� ������� &������� � � %)<A%@�

8������ H� �� .%00)3� #����������� ������� � ��������%�� �������� ��� ��! &������� ��� (><A<)6�

8��������� �� ��� 2���� "� 2� ��� ���� �� 4� ;� .%0>03� &����������� ��� �������� � ���������������� ������������� ������� #�� ��� ����� ���� ���������� * &������� � � <0)A1�

������ ,�� 9���� ,�� ,������� K� 9� ��� "� ������� ��.()))3� ���������� � ��� ���������������� ��������� ��� ��� �������� � ��� I� �������� ������ ������������ �������� * ������� �!�� @0@A>)<�

#������� �� K�� 4���� �� $� �� K�� ?����� &� $�� ,������� K� 9��$��������� O� F�� O����� �� "� ��� #���� ,� 9� .%0053�!���� ��� ��������� ������ �� ��������� ����������������� �������� ����� ����� ������ �� ������ ������ �(��� ���� ��� <60>A5)%�

!�������� !� ��� ����� $� .%0003� 2���������-������������������ � �������� &���� �(��� �� >15A06�

!����� "� 8� ��� !��������� F� 2� .%0163� 9����������������� � ����� ��� ������ ������������������������ ������ ������� ������ ������ ��� ����������� � ������ ������ �(��� ���� ��� (<%A@�

!������� ;� "�� 9������� "� "� ��� "��� K� $� .%0003�,������ � �-������ ������������ �� ������������������ &������� &���� ���� ��! ��� 5(<A5<�

!���� #� $� ��� ������� #� �� .%01<3� $������� � ��� ��������������� ��� ��� ���������������� � ������%���� ������� #�2%! ��� ��� �� ����� �������� �� * ������� ���� <(0A<>�

$������� ��� O����� !�� 9�������� K� �� ��� �������� ��.%0003� &�� ���������������� ����� ��� � ������������������ �������� � B< �� �������� �� �������� �������� � ���� �� ����� �������� ��������� &���� &������� ��� %66<A@(�

E����� K� *�� 2 ������� 2�� 4������� �� 4� ��� E����� !� ��.()))3� ������=����� ��� �������� ����� � ��������� ����� ���������������� ���B ���� � ���������������� �� �������� ��� ������������ �����-��������� �(��� ���� �!� 5>%@A(<�

/��� �� ,�� /�� 2� 2� ��� "��� K� ;� .%0013� 9������������� ����B � ������������ ������ +���������������� %(@A<(�

?����� &� $�� 4���� �� $� �� K�� #������� �� K�� ,������� K� 9���� #���� ,� 9� .%00@3� "��������������� ����� ��� ��� ����� �� ������ ��� ������ ��� �������� � ���������� �������� �!��� +�������� ,�� ��� ���0>@A1@�

-� �.��/(0��� ������� ����� ������ �������� �#�