quaderno di laboratorio

ISTITUTO TECNICO PER ATTIVITÀ SOCIALI“GIORDANO BRUNO”

PERUGIA

LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA

Realizzato da Massimo Trauzzola e Rossana Baglioni Realizzato da Massimo Trauzzola e Rossana Baglioni

Febbraio 2008

REPERTORIO DEI MODULIE DELLE UNITÀ DIDATTICHE

1. ALLA SCOPERTA DEI MICRORGANISMI1.1 IL LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA pag. 31.2 L’UBIQUITÀ DEI MICRORGANISMI pag. 10

2. OSSERVARE I MICRORGANISMI2.1 COLORAZIONE SEMPLICE CON BLU DI METILENE pag. 132.2 COLORAZIONE NEGATIVA CON NIGROSINA pag. 162.3 COLORAZIONE STRUTTURALE DELLE SPORE pag. 182.4 COLORAZIONE STRUTTURALE DELLA CAPSULA pag. 21

3. LA COLTIVAZIONE DEI MICRORGANISMI3.1 ALLESTIMENTO DI COLTURE BATTERICHE CON DIVERSETECNICHE DI SEMINA pag. 25 3.2 I BATTERI DELLO YOGURT pag. 313.3 EFFETTO DI DIVERSI FATTORI AMBIENTALI SULLA

2.5 COLORAZIONE DIFFERENZIALE DI GRAM pag. 23

3.3 EFFETTO DI DIVERSI FATTORI AMBIENTALI SULLA CRESCITA DEI MICRORGANISMI pag. 33

4. CRESCITA E CONTROLLO DELLA CRESCITA DEI MICRORGANISMI4.1 CONTA MICROBICA IN PIASTRA pag. 374.2 CONTA SU TERRENO LIQUIDO pag. 404.3 CONTA PER FILTRAZIONE SU MEMBRANA pag. 424 4 ANALISI MICROBIOLOGICA DELL’ACQUA POTABILE pag 46

5. CARATTERISTICHE METABOLICHE DEI MICRORGANISMI5.1 UTILIZZAZIONE DELL’AMIDO pag. 615.2 UTILIZZAZIONE DI CARBOIDRATI DIVERSI pag. 645.3 OSSIDAZIONE E FERMENTAZIONE pag. 675 4 UTILIZZAZIONE DI AMINOACIDI pag 70

4.4 ANALISI MICROBIOLOGICA DELL ACQUA POTABILE pag. 464.5 VALUTAZIONE DELL’AZIONE INIBENTE DI ALCUNI DISINFETTANTI DI USO COMUNE pag. 524.6 ANTIBIOGRAMMA pag. 56

6. INTERAZIONE MICRORGANISMI/UOMO6.1 PROTEINA C REATTIVA pag. 776.2 TITOLO ANTI-O-STREPTOLISINICO pag. 79

5.4 UTILIZZAZIONE DI AMINOACIDI pag. 705.5 ENTEROTUBE pag. 73

APPENDICETERRENI DI COLTURA pag. 81BIBLIOGRAFIA pag. 90

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1. ALLA SCOPERTA DEI MICRORGANISMI

U.D. 1.1 IL LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA

Non portare mai nulla alla bocca (matite, pennarelli), non mangiare, bere e fumare in laboratorio.

N d i i b i i i li t ti

• REGOLE GENERALI PER LA SICUREZZA

Non sedersi sopra i banconi e non appoggiarsi agli strumenti.Indossare il camice, i guanti e gli occhiali protettivi quando si eseguono operazioni pericolose. E’ compito di ciascuno mantenere i camici puliti e in buone condizioni. I capelli devono essere raccolti in modo da evitare contatti con superfici sporche o con la

fiamma del bunsen.Non lasciare mai senza controllo reazioni in corso o apparecchi in funzione. Non appoggiare recipienti o apparecchi sul bordo del bancone. Non portare in tasca forbici, tubi di vetro o oggetti taglienti e appuntiti. Il lavaggio delle mani deve essere effettuato durante e, in particolare, alla fine dell’attività

lavorativa dopo la manipolazione di materiale biologico. Le apparecchiature di laboratorio devono essere sistemate e ripulite in modo corretto dopo

l’uso.

Sull’etichetta dei reagenti sono riportati:

SIMBOLI DI PERICOLO

nome del prodottocomposizione chimicasimboli di pericolositàfrasi di rischio e sicurezza

SIMBOLI DI PERICOLO

Tossico: sostanza chimica chepuò causare danni acuti ocronici all’organismo

Infiammabile: qualsiasi sostanzaliquida, solida, vapore o gas che siinfiammi facilmente e brucirapidamente.

Materiale ossidante: sostanza ingrado di rilasciare ossigeno chepuò incrementare o accellerare lacombustione.

Corrosivo: sostanza chimica

Esplosivo: materiale che produce unistantaneo e improvviso rilascio dipressione, gas o calore quando sottopostoad un brusco shock, pressione otemperatura.

Irritante: materiale non corrosivo cheche provoca distruzione visibileo alterazione irreversibile deitessuti organici nel punto dicontatto.

causa effetti infiammatori reversibili suitessuti viventi attraverso l’azione chimicanel punto di contatto in funzione dellaconcentrazione e del tempo di esposizione.

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• TECNICHE DI ASETTICITA’

Le finalità di queste tecniche sono:a) ottenere e mantenere pure le colture di microrganismib) svolgere il lavoro in laboratorio di microbiologia con sicurezza

Una “coltura pura” è costituita solo da una specie di microrganismo.La contaminazione delle colture è a rischio in quanto i microbi si trovano ovunque, sullaq qpelle, nell’aria, sulle superfici dei piani di lavoro.Le regole fondamentali delle tecniche di asetticità sono:

- usare terreni e attrezzature sterili- lavorare vicini alla fiamma del bunsen- sollevare i coperchi delle piastre Petri solo parzialmente- tenere i tappi delle provette tra le dita e non appoggiati sul banconetenere i tappi delle provette tra le dita e non appoggiati sul bancone- flambare il collo della superficie esterna delle provette prima e dopo il prelievo- arroventare le anse e gli aghi da inoculo alla fiamma per l’intera lunghezza dell’astina

metallica, sia prima che dopo i prelievi- la fiamma del bunsen in uso deve essere ossidante, blu e alta circa 5 cm- quando il bunsen non si usa si deve lasciare la fiamma gialla, in modo da poterla

vedere facilmentesterilizzare la vetreria e il materiale monouso usati dopo l’uso dentro apposite buste- sterilizzare la vetreria e il materiale monouso usati, dopo l uso dentro apposite buste autoclavabili

- disinfettare il bancone di lavoro accuratamente - sistemare tutto il materiale utilizzato in modo corretto

INCUBAZIONE DELLE COLTURE

Scrivere sulla base della piastra Petri primadell’inoculo indicando il nome dell’operatore, ladata, il nome del microrganismo, in modo dariconoscere la piastra e sapere ciò che contiene.

Le colture pure in piastra devono essere sigillate connastro adesivo.

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• TECNICHE DI STERILIZZAZIONE

Sterilizzazione: trattamento termico, chimico e gassoso per eliminare ogni forma di vita. Può essere realizzata con:a- calore seccob- calore umidoc- filtrazione

CALORE SECCO

a) aria calda La stufa a secco, utilizza temperature molto alte e serve a sterilizzare la vetreria messa in contenitori metallici o ricoperta con carta di alluminio. I parametri d’uso della stufa sono:

160° per 60’150° per 120’140° per 180’

b) flambaturaAlla fiamma del bunsen, si può sterilizzare la superficie esterna delle provette, o delle beute.delle beute. La fiamma del bunsen esercita un’azione germicida nell’aria intorno alla fiamma per un raggio di circa 10 cm, creando una zona sterile.

c) arroventamentoAlla fiamma del bunsen, è anche possibile sterilizzare l’ansa o l’ago prima e dopo i prelievi.Pinze o spatole si sterilizzano dopo averle immerse in alcool e poi passate allaPinze o spatole si sterilizzano dopo averle immerse in alcool e poi passate alla fiamma.

TEMPERATURE DELLA FIAMMA DEL BUNSEN

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CALORE UMIDO

a) tindallizzazioneLa soluzione da sterilizzare viene esposta a vopore fluente ad una temperatura di 100° CLa soluzione da sterilizzare viene esposta a vopore fluente ad una temperatura di 100 C con un trattamento ripetuto per 3 giorni. Il trattamento è indicato per terreni nei quali possono crescere spore, le quali sfuggite al primo riscaldamento, vengono eliminate con il secondo e il terzo.b) vapore sotto pressionePer questa tecnica si usa l’autoclave che unisce l’azione del calore alla pressione. Il potere di penetrazione del vapore acqueo nel substrato viene aumentato. La sterilizzazione viene effettuata di solito a 121° per 15’La sterilizzazione viene effettuata di solito a 121° per 15’.Tabella di sterilizzazione in autoclave:

Temperatura Pressione (atm) tempo (minuti)

110 0,5 150

115 0,75 50

120 1 15120 1 15

125 1,35 6,5

FILTRAZIONE

a) filtri milliporeSi utilizza per le sostanze che non possono essere sterilizzate a caldo (zuccheri, latte, vitamine), si usano filtri porosi di acetato di cellulosa, capaci di trattenere i batteri di grandezza superiore ai loro pori.

b) membrane filtrantiPer filtrare campioni liquidi, al fine di trattenere i batteri in esso presenti, si utilizzano opportune membrane con l’apposito apparato di filtrazione.

c) cappa a flusso laminareServe per eseguire al suo interno manipolazioniServe per eseguire al suo interno manipolazioni microbiologiche per eliminare la contaminazione dei prodotti ma anche dell’operatore e dell’ambiente.

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• APPARECCHIATURA DA LABORATORIO

MICROSCOPIO

Strumento capace di fornire un'immagine ingrandita di un piccolooggetto osservato attraverso di esso.Il microscopio è composto di:

- una parte meccanica detta stativo

- una parte otticauna parte ottica

USO DEL MICROSCOPIO

- accendere la luce

- porre il vetrino sul tavolino traslatore, sistemare il preparato rivolto verso l’alto e in prossimitàdell’apertura centrale del tavolino

- avvicinare il tavolino all’obiettivo più piccolo (4x) mediante la vite macrometrica

f l i i i- mettere a fuoco con la vite micrometrica

- regolare l’intensità della luce

- regolare l’apertura del diaframma considerando che con l’obiettivo 100x il diaframma deve avere lamassima apertura

- spostare il preparato sul tavolino mediante il sistema di viti poste al di sotto di esso

- individuare un buon campo e quindi ruotare l’obiettivo successivo (10x) e passare poi al 40xmantenendo sempre il fuoco

bb l il li l i di li d i i l d l- abbassare leggermente il tavolino traslatore, mettere una goccia di olio da immersione al centro delvetrino, abbassare l’obiettivo 100x con cautela verso la goccia e mettere a fuoco

- descrivere quanto osservato

PRECAUZIONI D’USO DEL MICROSCOPIO

- non lasciare i vetrini sul tavolino traslatore

t li l’ li d ll’ bi tti 100X d l t tili d l t i b t di l l- togliere l’olio dall’obiettivo 100X dopo averlo usato utilizzando la carta imbevuta di alcool

- non far toccare gli obiettivi al preparato

- non forzare alcuna manopola e non svitare gli obiettivi o gli oculari

CAPPA A FLUSSO LAMINARELa cappa consente la protezione dell’operatore e dell’ambientedal rischio di contaminazione con batteri e permette di lavorare incondizioni di sterilità. Il flusso continuo di aria sterile, all’internodella cabina, impedisce la fuoriuscita verso l’esterno, di microbi. Lasterilizzazione viene realizzata facendo passare l’aria attraverso deifiltri. E’ opportuno accendere la cappa circa 20’ prima di iniziare alavorare per assicurare una completa sterilità all’interno della stessa.

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AUTOCLAVEL’autoclave viene usata per sterilizzare terreni di coltura, soluzioni acquose e

lt di ifi t N l di t ili i i t il d ltcolture di rifiuto. Nel processo di sterilizzazione, viene usato il vapore ad altapressione, di solito 121°C. I microbi si eliminano meglio con il caldo umido checon quello secco della stufa, perché il vapore denatura le loro proteine.Assicurarsi prima di tutto che ci sia acqua sufficiente che copra la serpentina dirame in modo che non scaldi a secco durante il processo. Il coperchio deve essereperfettamente chiuso prima di iniziare il ciclo di sterilizzazione, quando questo ècompletato, si attende che l’autoclave sia raffreddata prima di aprirla. L’aperturaanticipata del coperchio può causare l’ebollizione dei liquidi nei recipienti.

PRECAUZIONI D’USO DELL’AUTOCLAVE

Esistono due fattori critici per la riuscita del processo:- tutta l’aria deve fuoriuscire dall’autoclave in modo tale che il vapore entri a contatto con la superficie diciò che deve essere sterilizzato. In caso contrario la temperatura resterebbe più bassa.

i t i li d i ill ti t i hi d it ti I t l d l’ i- i materiali non devono essere sigillati, tappi e coperchi devono essere appena avvitati. In tal modo l’ariacontenuta al loro interno può uscire liberamente.- il tempo deve essere sufficiente per permettere al vapore di penetrare nei contenitori.

TERMOSTATOApparecchio a circolazione d’aria calda, termoregolato, che permettedi mantenere costante la temperatura. Ha un intervallo di temperaturacompresa tra 20 e 80°C. Internamente ci sono dei ripiani forati perfavorire la circolazione dell’aria. Le colture batteriche, dopo lasemina nei terreni appositi, vengono poste ad incubare nei termostatidove la temperatura è impostata a 37° in quanto ottimale per il lorosviluppo.

BAGNOMARIAApparecchio che consente di mantenere terreni di colture a temperatura costantein bagni di acqua. Ha un intervallo di temperatura compresa tra 25 e 98°C.All’i t ti d i t tt il hi è ti ttAll’interno contiene dei portaprovette, il coperchio è a timpano per permettereall’acqua di condensazione di ricadere all’interno. Il bagnomaria si usa per tenerein incubazione test sierologici a 37°C e per l’agar fuso pronto per l’uso per lesemine in dispersione.

BILANCIA TECNICA

Strumento destinato alla misura dei pesi. Permette di pesare quantità finoa 2000 g circa, con sensibilità di 0.01 g.

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CENTRIFUGA

La centrifugazione è un metodo di separzione della fase liquida nelle sospensioni,per mezzo della forza centrifuga La centrifuga è costituita da un rotore parteper mezzo della forza centrifuga. La centrifuga è costituita da un rotore partemobile e girevole, con logge fisse per la collocazione delle provette. Sul pannellofrontale sono inseriti un orologio per regolare la durata della centrifugazione, unamanopola per regolare la velocità, un freno automatico per abbreviare i tempi diarresto. Prima di centrifugare è necessario che le provette nel rotore sianoequilibrati. Il rotore deve poi essere portato progressivamente alla velocitàdesiderata.

CONTACOLONIE DIGITALE QUEBECApparecchio per l’osservazione e il conteggio delle colonie cresciute in piastraattraverso l’impiego di una lente di ingrandimento (x1,5), un piano d’appoggiocentimetrato e illuminato. Un contatore digitale registra automaticamente i datiottenuti esercitando una lieve pressione, con una penna, sulla superficie dellap , p , ppiastra, in corrispondenza di ogni colonia.

STUFAApparecchio a circolazione d’aria calda utilizzabile siaper asciugare che per sterilizzare la vetreria. La temperatura diesercizio è compresa tra +50° e +290°C.

PHMETROStrumento che consente di misurare il valore del pH dellesoluzioni acide o basiche. Si basa sulla misura della differenza dipotenziale che si istaura fra due elettrodi immersi nellasoluzione da saggiare.

FRIGORIFEROApparecchio che serve a incubare a basse temperature e per la conservazione di

i i t i l Il f i if i f tti tt l b tt i t i i è l’campioni e materiale. Il frigorifero infatti permette la batteriostasi, cioè l’assenzadi crescita o di riproduzione della coltura. Gli aerobi possono essere conservatiper mesi in agar inclinato, gli anaerobi infissi in agar. La conservazione in frigoha degli svantaggi quali la breve durata di immagazzinamento, quindi l’obbligo ditrapianti frequenti e la facile inquinabilità delle colture.

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U.D. 1.2 UBIQUITÀ DEI MICRORGANISMI

OBIETTIVO:

Scoprire che i microrganismi hanno la capacità di popolare qualsiasi ambiente ed osservare icaratteri morfologici delle colonie che si sono sviluppate.

PRINCIPIO:

L’ubiquità dei microrganismi può essere messa in evidenza contaminando con diversi ambienti(acqua, latte, polpastrelli, aria, terriccio…) piastre di Petri riempite con Nutrient agar percontatto diretto o per esposizione.Poiché il terreno Nutrient agar possiede i nutrienti capaci di far crescere un gran numero di

i i i l l i bi ti di i à id i t d ll il di l imicrorganismi, la loro presenza in ambienti diversi sarà evidenziata dallo sviluppo di colonievisibili ad occhio nudo.

MATERIALI E STRUMENTI:

MATERIALI BIOLOGICIAcqua di pozzo (lago o fiume) latte fresco o pastorizzato yogurt polpastrelli delle ditaAcqua di pozzo (lago o fiume), latte fresco o pastorizzato, yogurt, polpastrelli delle dita,aria di una stanza, terriccio o torba….

TERRENI DI COLTURANutrient agar

VETRERIA, ...Piastre sterili monouso, contenitori sterili, spatole sterili monouso, pipette pasteurmonouso, beuta, provette, bacchette vetromonouso, beuta, provette, bacchette vetro

STRUMENTIBilancia, autoclave, bunsen, termostato, contacolonie o lente di ingrandimento

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METODICA (1a FASE) A CURA DELL’INSEGANTE

Preparare il terreno.11

Distribuire in provettoni con tappo metallico (18-20 ml per provettone).22

Sterilizzare in autoclave a 121°C per 15’.33

Piastrare in ambiente sterile.44

(2a FASE) A CURA DEGLI STUDENTI

a) una piastra con 0,1ml di acqua, una con 0,1ml di latte ed una con 0,1ml di yogurt per spatolamento

Seminare:

11y g p p

b) una piastra appoggiando delicatamente i polpastrelli sul terreno per qualche secondo

c) una piastra lasciandola aperta per circa 20-30’nella stanza prescelta

d) una piastra con 0,1 ml di sospensione di terriccio preparata prelevando 2/3 spatolate di terriccio, sciolto in 50 ml di acqua distillata sterile

- siglare le piastre con il proprio nome e il tipo di

- lasciare una piastra senza seminarla come prova in bianco

22 Incubare le piastre capovolte a 37° C per 48 h.

batteri seminati

11

(3a FASE) A CURA DEGLI STUDENTI

11 Osservare le colonie formatesi e descriverle in relazione a:

a) numero

b) forma puntiforme rotonda lenticolare irregolare rizoide filamentosa

c) margine

d) profilo

intero ondulato

d) profilo

e) superficie

piatto convesso umbonato

f) consistenza

liscia rugosa lucida

compatta sfaldabile

opaca

pastosa mucosaf) consistenza

g) colore

compatta sfaldabile pastosa mucosa

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Disegna ciò che hai osservato

2. OSSERVARE I MICRORGANISMI

U.D. 2.1 COLORAZIONE SEMPLICE CON BLU DI METILENE

OBIETTIVO:

Osservare la forma di diversi microrganismi utilizzando una colorazione semplice.

PRINCIPIO:I coloranti usati in microbiologia sono sostanze organiche nelle quali sono presenti gruppifunzionali detti “cromofori” associati alla produzione di colore. Si distinguono in colorantibasici (blu di metilene, violetto di genziana, safranina) e acidi (nigrosina, fucsina acida). Lacolorazione aumenta il contrasto con l’ambiente rendendo più visibili le cellule. Poiché i batterisono ricchi di acidi nucleici, si colorano molto bene con coloranti basici come il Blu dimetilene.


MATERIALI BIOLOGICIColture microbiche di Escherichia coli e Staphilococcus epidermidis

MATERIALI CHIMICIBlu di metilene, olio da immersione

VETRERIA, ...Vetrini portaoggetto, ansa, vaschetta per colorazione, spruzzetta, pinza di legno

STRUMENTIMicroscopio, bunsen

Blu di metilene 1%:aggiungere, in una bottiglia con contagocce, ad 1 g di blu di metilene 99 ml di acqua distillata. Agitare fino a completa dissoluzione.

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METODICA (1a FASE) fissazione

11 Prelevare con un ansa sterile un po’ di materialebatterico da una colonia isolata.

22Distendere il materiale su un vetrino dove era stataprecedentemente messa una goccia di acquadistillata.

33Essiccamento: lasciare asciugare a temperaturaambiente fino a completa evaporazione dell’acqua.

Fissazione: passare velocemente il vetrino, tenuto conuna pinza, sulla zona più calda della fiamma del beccob l l

(2a FASE) colorazione

bunsen, per almeno tre volte.

Dopo aver appoggiato il vetrino su una vaschetta perla colorazione, aggiungere qualche goccia di blu dimetilene.Attendere circa 3 minuti, quindi lavare con acquamediante una spruzzetta.Eliminare buona parte dell’acqua di lavaggio

11p q gg

inclinando il vetrino; asciugare delicatamente, primacon carta da filtro, poi all’aria.

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METODICA (1a FASE) osservazione al microscopio

11Osservare al microscopio con ogni tipo di obiettivo,procedendo per gradi, dagli obiettivi a secco a piccolo

11p p g , g pingrandimento, fino all’obiettivo ad immersione eregistrare i risultati ottenuti anche mediante un disegno.

I più comuni tipi morfologici dei batteri

cocchi streptococchi stafilococchi diplococchi

bastoncelli vibrioni spirilli

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U.D. 2.2 COLORAZIONE NEGATIVA CON NIGROSINA

OBIETTIVO:Osservare la forma di diversi microrganismi utilizzando una colorazione che, non richiedendofissazione, permette una visione senza artefatti della morfologia batterica.

PRINCIPIO:La Nigrosina è un colorante acido che non è in grado di penetrare all’interno dei batteri e formadunque un deposito scuro attorno alle cellule che vengono evidenziate per contrasto.

MATERIALI E STRUMENTI:MATERIALI E STRUMENTI:

MATERIALI BIOLOGICIColture microbiche di Lactobacillus bulgaricus e Streptococcus thermophilus

MATERIALI CHIMICINigrosina, olio da immersione

VETRERIA, ...Vetrini portaoggetto ansa vaschetta per colorazione spruzzetta pinza di legnoVetrini portaoggetto, ansa, vaschetta per colorazione, spruzzetta, pinza di legno


Nigrosina 2%:aggiungere, in una bottiglia con contagocce, a 2 g di nigrosina 99 ml di acqua distillata. Agitare fino a completa dissoluzione.

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METODICA (1a FASE) colorazione

11 Deporre una goccia di nigrosina su un vetrino portaoggetti.

22 Prelevare con un ansa sterile un po’ di materiale batterico da una colonia isolata e miscelarla con la nigrosina.

33Distendere uniformemente il materiale sul vetrinoasciugare all’aria non scaldare e non fissare allafiamma.

(2a FASE) osservazione al microscopio

11 Osservare al microscopio con ogni tipo di obiettivo,procedendo per gradi, dagli obiettivi a secco a piccoloingrandimento, fino all’obiettivo ad immersione eregistrare i risultati ottenuti anche mediante undisegno.

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U.D. 2.3 COLORAZIONE STRUTTURALE DELLE SPORE (secondo Shaeffer e Fulton)

OBIETTIVO:Osservare la presenza di endospore e spore libere.

PRINCIPIOPRINCIPIO:Le endospore, colorate a caldo con verde malachite, sono in grado di trattenere il coloranteanche dopo lavaggio, a differenza delle altre parti della cellula che assumono il colore delcolorante di contrasto (safranina).


MATERIALI BIOLOGICIColture microbiche di Bacillus subtilis

MATERIALI CHIMICIVerde malachite 5%, safranina, olio da immersione

TERRENI DI COLTURAAgar al manganese

VETRERIA, ...Vetrini portaoggetto, ansa, vaschetta per colorazione, spruzzetta, pinza di legno, piastresterili, beuta, provette

STRUMENTIMicroscopio, autoclave, termostato, bilancia, bunsen

Agar al manganese:

- Nutrient broth 8 gA 20- Agar 20 g

- MnCl2 1% 0,5 ml- Acqua 1000 mlUnire al brodo l’agar e scaldare, aggiungere poi 0,5 ml di MnCl2 1% in acqua.

Preparazione soluzione di safranina:1 g di safranina sciolta in 10 cc di alcool, aggiungere acqua fino a 100 cc.

18

METODICA (1a FASE) a cura dell’insegnante

Preparare delle provette con 16-18 ml di agar al manganese.

11


33 Piastrare in ambiente sterile e lasciar solidificare.

S i t i i ’ t d ll lt i44 Seminare per striscio un’ansata della coltura in esame.

55Incubare a 35° per 18-24 h.

19

METODICA (2a FASE) a cura dello studente

11 Allestire e fissare un vetrino con una delle colonie ottenute nella 1a FASE.

A i il t i t

22

Appoggiare il vetrino su un sostegno sopra unavaschetta contenente acqua la quale verrà portataall’ebollizione.Colorare abbondantemente con verde malachite,lasciare il vetrino esposto al vapore che si sviluppaper 3-5’ e aggiungere ancora il colorante facendoattenzione che il vetrino non rimanga a secco.(per evitare che il vetrino cada nella vaschetta

33 Lavare con acqua e colorare con safranina per 5’.

(ptrattenerlo con una pinza di legno)

33


Dopo aver lavato abbondantemente con acquaasciugare delicatamente.

11 Osservare al microscopio con ogni tipo di obiettivo,procedendo per gradi, dagli obiettivi a secco a piccoloingrandimento, fino all’obiettivo ad immersione eregistrare i risultati ottenuti anche mediante un disegno.

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U.D. 2.4 COLORAZIONE STRUTTURALE DELLA CAPSULA

OBIETTIVO:Osservare la presenza di batteri capsulati utilizzando una colorazione che, non richiedendofissazione, permette una visione senza artefatti della morfologia batterica.

PRINCIPIO:

La capsula dei batteri non ha alcuna affinità per i coloranti perciò per metterla in evidenza si faricorso a colorazioni negative.


MATERIALI BIOLOGICISospensione batterica (inoculo di terra)

MATERIALI CHIMICIInchiostro di china al 10%

VETRERIA, ...V t i i t tt t i i i tt h tt l i ttVetrini portaoggetto, vetrini coprioggetto, ansa, vaschetta per colorazione, spruzzetta,pinza di legno


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METODICA (1a FASE)

11 Deporre una goccia di inchiostro di china diluito al 10% su un vetrino portaoggetti.

22 Prelevare con un ansa sterile un po’ di materiale batterico da una colonia isolata.

33Sospendere il materiale sull’inchiostro di china e coprire con un vetrino coprioggetto.


Osservare al microscopio con ogni tipo di obiettivo

11Osservare al microscopio con ogni tipo di obiettivo,procedendo per gradi, dagli obiettivi a secco a piccoloingrandimento, fino all’obiettivo ad immersione eregistrare i risultati ottenuti anche mediante undisegno.

22

U.D. 2.5 COLORAZIONE DIFFERENZIALE DI GRAM

OBIETTIVO:

Questa colorazione consente la suddivisione di tutti i batteri in due categorie: i Gram+ e i Gram-.

PRINCIPIO:L di l i h i b tt i t t i di d d ll diffLa diversa colorazione che assumono i batteri con questa tecnica dipende dalle differenzeesistenti nella loro parete cellulare.La parete dei Gram+ è costituita in gran parte da uno spesso strato di peptidoglicano che nonpermette la decolorazione della cellula batterica (colorata precedentemente con il colorantebasico cristal violetto) da parte del decolorante. I Gram+ rimangono dunque colorati in violetto.I Gram- hanno una parete multistratificata che, per la sua composizione chimica, risultapermeabile all’agente decolorante. Questi batteri dunque si colorano con il colorante dicontrasto, la Safranina, assumendo una colorazione rosa.


MATERIALI BIOLOGICIColture microbiche di Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus eEscherichia Coli

MATERIALI CHIMICICristal violetto, liquido di Lugol, safranina, decolorante alcool-acetone, olio daimmersione

VETRERIA, ...Vetrini portaoggetto, ansa, vaschetta per colorazione, spruzzetta, pinza di legno


Le soluzioni coloranti vengono preparate come soluzioni idroalcooliche che sill ti i li d ll’ l l il l tallestiscono sciogliendo nell’alcool il colorante:

Sostanza colorante in polvere g 10Alcool etilico assoluto ml 100

Si lascia a contatto per qualche giorno ottenendo una soluzione satura. Questesoluzioni necessarie a mantenere a lungo i coloranti, non sono adatte ad essere usatedirettamente nelle colorazioni. Pertanto, con una diluizione in acqua, si ottengonosoluzioni idroalcooliche:Soluzione alcoolica madre del colorante ml 10Acqua distillata ml 90

23

METODICA (1a FASE) fissazione e colorazione

11

22

Prelevare con un ansa sterile un po’ di materiale batterico da una colonia isolata.

Distendere il materiale su un vetrino dove erastata precedentemente messa una goccia di22

33

p gacqua distillata.

Essiccamento: lasciare asciugare a temperaturaambiente fino a completa evaporazione dell’acqua.

Fissazione: passare velocemente il vetrino, tenutocon una pinza sulla zona più calda della fiamma del

44

a) colorare il preparato depositando, mediante unapipetta qualche goccia del 1° colorante (cristalvioletto), lasciare agire per 1’b) lavare con acqua distillata e poi coprire con illiquido di Lugol e lasciare agire per 1’, lavare ancoracon acqua

33 con una pinza, sulla zona più calda della fiamma delbecco bunsen, per almeno tre volte.

44 con acquac) decolorare con soluzione alcool-acetone esciacquare immediatamented) colorare con la soluzione di contrasto (safranina)per 1’, sciacquare accuratamente e asciugare ilvetrino.Dopo aver lavato abbondantemente con acquaasciugare delicatamenteg


11Osservare al microscopio con ogni tipo di obiettivo,procedendo per gradi, dagli obiettivi a secco a piccoloingrandimento, fino all’obiettivo ad immersione eregistrare i risultati ottenuti anche mediante un disegno.

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3. LA COLTIVAZIONE DEI MICRORGANISMIU.D. 3.1 ALLESTIMENTO DI COLTURE BATTERICHE CON DIVERSE

TECNICHE DI SEMINA

OBIETTIVO:

Acquisire la corretta manualità nelle varie tecniche di semina e la consapevolezza degli scopiper i quali la semina viene effettuata.


MATERIALI BIOLOGICIColture microbiche

TERRENI DI COLTURATerreni di coltura liofilizzati (Nutrient agar, TSA, TSB, Nutrient broth, Gelatina)Terreni di coltura liofilizzati (Nutrient agar, TSA, TSB, Nutrient broth, Gelatina)

VETRERIA, ...Piastre Petri sterili, pipette graduate sterili, provettoni, provette, tamponi faringei sterili,spatole sterili, anse, aghi, cilindri

STRUMENTIBilancia, autoclave, termostato, bunsen

UTILIZZO DEI TERRENI DI COLTURA DISIDRATATISolubilizzazione:Solubilizzazione:pesare il terreno e porlo in una beuta e aggiungere la metà del volume di acquadistillata richiesta. Agitare per solubilizzare poi aggiungere l’acqua rimanente lavandole pareti della beuta. Utilizzare sempre beute di volume almeno 2 volte e mezzo quellodella sospensione. Riscaldare per ottenere una completa solubilizzazione agitandocontinuamente fino ad arrivare all’ebollizione. La completa solubilizzazione dopoalcuni minuti di ebollizione, è indicata dalla trasparenza della soluzione.

25

11 Tecnica di trasferimento per striscio su piastra (a)

SEMINA IN TERRENO SOLIDO

11 Tecnica di trasferimento per striscio su piastra (a)

Operare in ambiente sterile, passare l’ansa alla fiamma e,dopo averla raffreddata, prelevare un po’ di patina battericada una piastra o da una provetta. Trasferire il materiale suuna piastra sterile strisciando l’ansa con movimenti ampi azig-zag senza incidere il terreno, non tornare sui punti giàseminati. Sterilizzare l’ansa dopo l’uso.

La crescita si manifesta con formazione di colonieconfluenti e isolate presenti sulla superficie dell’agar.

22 Tecnica di trasferimento per striscio su piastra (b)22 Tecnica di trasferimento per striscio su piastra (b)

Sempre operando in ambiente sterile, passare l’ansa allafiamma e, dopo averla raffreddata, prelevare un po’ dipatina batterica. Trasferire il materiale su una piastra sterilestrisciando l’ansa con movimenti a zig-zag senza incidere ilterreno solo su metà piastra (1). Sterilizzare e raffreddare

3

2 p ( )l’ansa, ruotare la piastra e riprendendo dal punto interrotto,strisciare l’altra metà della piastra (2); ripetere l’operazioneun’altra volta in modo da ottenere tre strisci in tre diversedirezioni (3).

La crescita si manifesta con formazione di colonieconfluenti nella prima metà e isolate nella seconda metàd ll i i ll fi i d ll’

1

della piastra, presenti sulla superficie dell’agar.

26


11 Tecnica di trasferimento per striscio su piastra (c)11 p p ( )

Nel caso in cui si voglia ottenere una crescita compatta, sipuò effettuare lo striscio con tamponi sterili che vengonopassati più volte e in più direzioni sul terreno. Immergereun tampone in un brodo e trasferire il materiale su unapiastra sterile strisciando più volte sulla superficie. Ruotarela piastra e strisciare ancora; sterili are il tampone dopola piastra e strisciare ancora; sterilizzare il tampone dopol’uso.

La crescita si manifesta con formazione di una patina più omeno omogenea.

Tecnica dello spatolamento in piastra (d) 22Operando sotto una cappa sterile o accanto alla fiammadel bunsen, prelevare con una pipetta sterile 0,1 ml dibrodocoltura e trasferirlo al centro di una piastra conagar nutrient. Con una spatola sterile distribuirel’inoculo sulla superficie dell’agar in tutte le direzioni.l inoculo sulla superficie dell agar in tutte le direzioni.Rovesciare la piastra ed incubarla a 28°-32° per 24-48h.Deporre la spatola nell’apposito sacchetto per lasterilizzazione.

La crescita si manifesta con lo sviluppo di una patinapresente sulla superficie dell’agar.p p g

27


11 Tecnica della inclusione o diffusione in piastra (e)

Nell’inclusione usiamo pipette sterili graduate pertrasferire volumi precisi di inoculi nelle piastre.Successivamente si riempie la piastra con terreno dicoltura sterile mantenuto fuso a b.m. a 45°C. Se lasospensione da seminare è concentrata, si procede aduna diluizione come nella sezione 4.1.

La crescita si manifesta con lo sviluppo di colonieisolate presenti sulla superficie dell’agar ma soprattuttoin profondità.

Dil i i d i l i (f)22 Diluizione ed inclusione (f)22Diluire la brodocoltura quando è particolarmenteconcentrata procedendo ad una diluizione come nellasezione 4.1. Predisporre 4 piastre nelle quali verserete1 ml di ogni diluizione preparata mettendo nella primapiastra l’inoculo concentrato (conc. 100). Versare ilterreno sterile, mantenuto fuso a b.m., nelle piastreseminate, chiuderle e miscelare con un movimentorotatorio lasciar solidificarerotatorio, lasciar solidificare.

Le colonie crescono sia in superficie che in profonditàe se la semina è stata fatta bene, le colonie saranno inprogressiva diminuzione, di aspetto uniforme e piùpiccole dove il numero è maggiore.

Contaminazione

Bassa (+) Media (++) Alta (+++) Altissima (++++)

28


1111 Tecnica di isolamento e striscio su “slant”

Operare in ambiente sterile, passare l’ansa alla fiamma e,dopo averla raffreddata, prelevare un po’ di patina battericada una piastra. Aprire e flambare la provetta, trasferire ilmateriale strisciando l’ansa con movimenti a zig-zag senzaincidere il terreno partendo dal fondo della provetta.p pSterilizzare l’ansa dopo l’uso.

La crescita si manifesta attraverso la presenza di veli opatina di consistenza cremosa o secca.

22 Tecnica di trasferimento per striscio da slant a slant (o “becco di clarino”)

Sempre operando in ambiente sterile, passare l’ansa allafiamma e raffreddarla. Impugnare le due provette con unamano, togliere i tappi e flambare l’imboccatura alla fiamma.Prelevare un po’ di patina batterica dalla prima provetta,trasferire il materiale strisciando l’ansa con mo imenti atrasferire il materiale strisciando l’ansa con movimenti azig-zag senza incidere il terreno partendo dal fondo dellaseconda provetta. Flambare e tappare le due provette.Sterilizzare l’ansa dopo l’uso.

Anche qui la crescita si manifesta attraverso la presenza diveli o patina di consistenza cremosa o secca.

Tecnica per infissione in agar o gelatina33 Tecnica per infissione in agar o gelatina33

Si utilizza questa semina con un ago per inoculare terrenisolidificati in provetta. L’ago consente di inserire le cellulelungo una linea verticale e in profondità, per permettere losviluppo dei batteri anaerobi e favorire l’osservazione diforme mobili che si diffondono a partire dalla linead ll’i ldell’inoculo.

29

SEMINA IN TERRENO LIQUIDO

11 Tecnica di trasferimento da “slant” a brodo

Disporre le provette con il ceppo di EscherichiaColi e il brodo sterile da seminare vicino allafiamma. Sterilizzare e raffreddare l’ansa, togliere itappi dalle provette e flambarle. Prelevare conl’ansa un po’ di patina batterica dallo slant, inserire

Tecnica di trasferimento mediante pipetta22

l’ansa con l’inoculo nel brodo sterile e stemperare.Flambare e tappare le provette. Sterilizzare l’ansadopo l’uso.

Tecnica di trasferimento mediante pipetta22Disporre le provette con l’inoculo in brodo e ilbrodo sterile da seminare vicino alla fiamma,togliere i tappi dalle provette e flambarle.Prelevare con una pipetta sterile 1 ml di inoculodalla prima provetta e trasferirla nella seconda.Flambare e tappare le provette. Deporre la pipettanell’ apposito sacchetto per la sterilizzazione.nell apposito sacchetto per la sterilizzazione.

La crescita in brodo si evidenzia a occhio nudoattraverso:- intorbidamento del terreno;

33

- formazione di un sedimento sul fondo dellaprovetta che agitato sale verso l’alto;- formazione di fiocchi o granuli in sospensione.

33 Incubare i terreni seminati insieme ad alcuni non seminari, come controllo, a 37° per 24-48h

30

U.D. 3.2 I BATTERI DELLO YOGURT

OBIETTIVO:

Isolamento in coltura pura dei fermenti lattici nello yogurt

PRINCIPIO:Nello yogurt sono generalmente presenti due gruppi batterici: il Lactobacillus bulgaricus e loStreptococcus thermophilus, che trasformano il lattosio presente nel latte in acido lattico.Lo striscio, in MRS agar, permette l’isolamento dei lattobacilli, mentre l’M17 favorisce lacrescita degli streptococchi lattici e inibisce quella del Lactobacillus bulgaricus.Pur essendo improbabile, per l’acidità dello yogurt e per le norme igieniche di produzione econservazione la presenza di microrganismi contaminananti è tuttavia possibile verificareconservazione, la presenza di microrganismi contaminananti, è tuttavia possibile verificarel’eventuale presenza di batteri coliformi Gram- seminando in Levine EMB Blue agar checonsente di differenziare le colonie di E. coli in base alla presenza di riflessi verdi metallici ealla colorazione violacea con centro nero.


MATERIALI BIOLOGICIYogurt

MATERIALI CHIMICISol. di Ringer, reattivi per anaerobiosi, cartina indicatrice

TERRENI DI COLTURAMRS agar, M17 agar, EMB blue agarg , g , g

VETRERIA, ...Beute, cilindri, bacchette, provette, beuta da 100 ml, piastre sterili, ansa

STRUMENTIBilancia, autoclave, termostato, giara per anaerobiosi, bunsen

Soluzione di RingerSodio cloruro 9 g, Potassio cloruro 0,42 g, Calcio cloruro anidro 0,24 g, Sodio bicarbonato 0,2 g, acqua distillata 1 litro. Viene impiegata nella diluizione di 1:4 con acqua distillataacqua distillata.In alternativa soluzione di Ringer in tavoletteSciogliere 1 tavoletta in 500 ml di acqua distillata sterile.

31

METODICA

Preparere i terreni e la sol. di Ringer, sterilizzare dopoaver controllato il pH dei terreni (pH 6,2) con la cartinaindicatrice.

11

Piastrare i tre diversi terreni e raffreddare.22

33 Prelevare 10 g di yogurt sterilmente, diluirlo in 100 mldi Ringer sterile omogenizzando bene.

Per striscio seminare 3 piastre dei terreni diversi.Poiché i lattobacilli crescono bene in anaerobiosi44

Mettere in termostato a 37° per 2 o 3 giorni

Poiché i lattobacilli crescono bene in anaerobiosi,aggiungere sopra lo striscio un altro strato di MRS esolidificare. In alternativa usare la giara come all’unità3.3

44

Mettere in termostato a 37 per 2 o 3 giorni.Controllare la crescita e la presenza di colonie isolate,confermare il tipo di microrganismo per mezzo dellacolorazione di gram.

55

Coltura mista di Lactobacillus bulgaricus e Streptococcusthermophilus dello yogurt al microscopio elettronico

32

U.D. 3.3 EFFETTO DI DIVERSI FATTORI AMBIENTALI SULLA CRESCITA DEI MICRORGANISMI

OBIETTIVO: Verificare l’adattamento di alcune specie microbiche a condizioni differenti diossigenazione e di pH del mezzo di crescita.

PRINCIPIO:

Ogni specie microbica presenta esigenze nutrizionali e colturali diverse. Variando in modo controllato alcuni fattori ambientali si può valutare la risposta di ciascuna specie microbica in esame attraverso l’osservazione della crescita in coltura.


MATERIALI BIOLOGICIBrodocolture di Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccaromyces cerevisiae

MATERIALI CHIMICIReattivi per anaerobiosi (catalizzatori, indicatori), cartina indicatrice (test a)

Soluzioni di HCl 1 M (100 ml), HCl 0,1 M (100 ml), NaOH 1 M (100 ml) e NaOH 0,1 M (100 ml) (test b)

TERRENI DI COLTURAGlucose agar (test a)

TSB (test b)

VETRERIA, ...Beute, cilindri, bacchette, provette, beker 100 ml, piastre sterili con setto,ansa, piastre sterili, pipette sterili da 1 ml

STRUMENTIBilancia, autoclave, termostato, giara per anaerobiosi, phmetro, bunsen

33

METODICA test a) Influenza dell’ossigeno atmosferico sulla crescitaRi di bi bi bi f lt ti i

Sciogliere il terreno per una prova in doppio, più il controllo.11

Ricerca di aerobi, anaerobi e anaerobi facoltativi(1a FASE 1° parte)

22 Distribuire in provette, controllare il pH con la cartina indicatrice e autoclavare.

Piastrare e raffreddare il terreno.33

(1a FASE 2° parte)

Seminare in ciascuna metà della piastra, in manierasterile, mediante striscio, l’inoculo dei due ceppi11batterici. Una piastra va messa in termostato e l’altrain giara.

34

Giara:

sistemare le piastre capovolte nella giara, inserirel’indicatore per anaerobiosi e il reattivo per eliminarel’ossigeno (il reattivo va attivato aggiungendo 10 mldi acqua nella bustina operando lontano dallafiamma per la presenza di idrogeno altamentei fi bil ) l i i t t t i iinfiammabile); la reazione viene portata a termine incirca 60’, dopodiché controllare la pressione nelmanometro (1 atm. circa). Dopo 2-3 ore controllarese l’indicatore per l’anaerobiosi è virato al rosso.

Riporre la giara e la seconda serie di piastre in termostato a 37° per 48 h. Dopo incubazioneaprire la giara sotto cappa controllare la crescita nelle piastre e registrare i risultati secondoaprire la giara sotto cappa, controllare la crescita nelle piastre e registrare i risultati secondola seguente scala:

- = assenza di crescita

+ = crescita scarsa+ crescita scarsa

++ = crescita normale

+++ = crescita abbondante

NB: il catalizzatore è situato nell’apposita sede posta sotto ilcoperchio della giara; tra un impiego e l’altro va asciugatoriscaldandolo in stufa a 160° per 90’.

35

METODICA test b) Influenza del pH del mezzo sulla crescitaSi verifica l’influenza del pH sulla crescita coltivando i batteri in terreni in cui viene variato il pH per aggiunta di acidi o di basi.viene variato il pH per aggiunta di acidi o di basi.(1a FASE 1° parte)

Sciogliere il terreno, distribuirlo in 4 beute.11

22 Preparare le soluzioni di HCl 1 M (100 ml), HCl 0,1 M(100 ml), NaOH 1 M (100 ml) e NaOH 0,1 M (100 ml) ecorreggere il pH in ognuna delle beute con i valori 3,0-4,5-7,0-9,0 controllandole con il phmetro.

METODICA

PHMETRO

Accendere il pHmetro almeno 10’ prima dell’uso ed effettuarela calibrazione. Selezionare il tasto pH e automatico, inserirel’elettrodo nel campione a pH 7. Pigiare il tasto cal e attendereche lo strumento si stabilizzi. Lavare e asciugare l’elettrodo ei t l’ i il i H 4 10 Eff tt l

33Distribuire 10 ml in ogni provetta in modo da ottenere 4provette per ogni prova Sterilizzare a 121° per 15’ e

ripetere l’operazione con il campione a pH 4 o 10. Effettuare lalettura dei vari campioni pigiando il tasto read o = lavandoaccuratamente l’elettrodo tra una lettura e l’altra.

provette per ogni prova. Sterilizzare a 121° per 15 ericontrollare infine il pH.

(1a FASE 2° parte)

Controllare la crescita nei tubi e registrare i risultati secondo la seguente scala:

44Seminare 1 ml delle due brodocolture in ogni provetta,incubare sia i tubi seminati che quelli non seminati a 36°per 24-48 h.

- = assenza di crescita+ = crescita scarsa++ = crescita normale+++ = crescita abbondante

36

4. CRESCITA E CONTROLLO DELLA CRESCITA DEI MICRORGANISMI

U.D. 4.1 CONTA MICROBICA IN PIASTRA

OBIETTIVO:

Determinare il numero complessivo di microrganismi presenti in un determinato campione (carica microbica totale): analisi quantitativa.

PRINCIPIO:

Ogni cellula microbica viva, inoculata in piastra per inclusione e incubata, si riproduce formando una colonia isolata. Contando le colonie sviluppatesi nel terreno si può risalire al numero di microrganismi presenti in un volume noto del campione.


MATERIALI BIOLOGICIColture batteriche

TERRENI DI COLTURAN t i tNutrient agar

VETRERIA, ...Beute, cilindri, bacchette, provette, piastre sterili, ansa, pipette sterili da 1 ml


37

METODICA Conta dei batteri mediante semina per inclusione in piastra (previa diluizione in serie)

Preparare il terreno agar nutrient e sterilizzarlo.11

Partendo dalla sospensione in esame, prepararediluizioni scalari 1:10, 1:100, 1:1000 come segue:prelevare, con una pipetta sterile, 1 ml delcampione in esame e porlo in una provetta

9 l di l i fi i l i il

22

Numerare 4 piastre 10° campione non diluito10 1 f tt di dil i i 1 10

contenente 9 ml di soluzione fisiologica sterile.Ripetere l’operazione per le successive diluizionicambiando opportunamente la pipetta ogni volta.

3310-1 fattore di diluizione 1:1010-2 fattore di diluizione 1:10010-3 fattore di diluizione 1:1000

quindi seminarci 0,1 ml di ogni diluizione.

44 Versare il terreno sterile mantenuto fuso a b.m.nelle piastre seminate, chiuderle e miscelare conun movimento rotatorio, lasciar solidificare.

Incubare a 37° per 48h poi contare al contacolonie,le colonie ben isolate quando sono comprese tra 100e 300.

Le colonie crescono sia in superficie che inprofondità e se la semina è stata fatta bene, le

55pcolonie saranno in progressiva diminuzione, diaspetto uniforme e più piccole dove il numero èmaggiore.

38

Predisporre una tabella per i risultati

n. colonie n. colonie n. colonie n. colonie

10° 10-1 10-2 10-3

Campione 1

Campione 2

Dalla conta si risale al numero di batteri/ml nelle sospensione in esame mediante la seguente formula:

p

Campione 3

N= n*1/d*1/V

N= numero di germi/ml del campione puron= numero di colonie nella piastra1/d= reciproco della diluizione dell’inoculo in quella piastra1/V= reciproco della frazione di volume considerato (1ml) utilizzato per l’inoculo1/10 di mldi ml

39

U.D. 4.2 CONTA SU TERRENO LIQUIDO

OBIETTIVO:

Determinare il numero complessivo di microrganismi presenti in un determinato campione(carica microbica totale): analisi quantitativa. (Tecnica classica)

PRINCIPIO:

La crescita in terreni liquidi viene rivelata dall’intorbidamento del terreno e/o sviluppo di gas. Ilnumero dei batteri presenti nel campione viene calcolato mediante una stima su baseprobabilistica basata sulla determinazione dell’indice MPN (Most probable number) cherappresenta il numero più probabile di microrganismi presenti in un volume noto di campione diacqua.


MATERIALI BIOLOGICIColture batteriche

TERRENI DI COLTURABrodo lattosato

VETRERIA, ...Beuta, cilindri, bacchette, provettoni, pipette sterili da 10, 1, 0,1 ml


40

METODICA Conta dei batteri su terreno liquido (es: ricerca dei batteri coliformi)

11 P ili 3 i di 3 i 10 l di11 Preparare e sterilizzare 3 serie di 3 provettoni con 10 ml di terreno.

22

10 ml di Brodo lattosatoconcentrazione normalecon campanella di durham

10 ml di Brodo lattosato concentrazione normalecon campanella di durham

10 ml di Brodo lattosato concentrazione doppia con campanella di durham

Seminare.

Campione

10 ml 1 ml 0,1 ml

33

RISULTATI

Prova negativa Prova positiva

Incubare a 37° per 24-48 ore.

Assenza di gas nella campanella Presenza di gas nella campanellaAssenza di gas nella campanella Presenza di gas nella campanella

Per il calcolo dell’MPN si rileva il numero di prove positive per ogni serie di provette seminate(3 per serie) e, sulla base della sequenza ottenuta, si risale al numero più probabile tramiteapposita tabella (vedi tabella su U.D. 4.4)

41

U.D. 4.3 CONTA PER FILTRAZIONE SU MEMBRANA

OBIETTIVO:

Determinare il numero complessivo di microrganismi presenti in un determinato campione (carica microbica totale): analisi quantitativa. (Tecnica delle membrane filtranti)

PRINCIPIO:

Filtrando volumi determinati di liquidi attraverso membrane sterili, con una porosità inferiore a1 μm, e ponendo tali filtri sulla superficie di terreni agarizzati in piastra, dopo incubazione, siotterranno colonie isolate che possono venire contate.

MATERIALI E STRUMENTIMATERIALI E STRUMENTI:

TERRENI DI COLTURAPCA, ENDO broth MF, Faecal coliform broth, Azide maltose agar

VETRERIA, ...Pipette sterili da 1-10ml, provette, provettoni, beute, campanelle di Durham, piastrep , p , p , , p , psterili, filtri sterili con membrana da 0,2 μm

STRUMENTI

Apparato per la filtrazione, autoclave, contacolonie, bilancia, termostato, cappa sterile,pompa da vuoto, bunsen

42

METODICA Procedimento A (Conta batterica totale)(1a FASE)

Sterilizzare dentro una busta per autoclave l’apparatodi filtrazione (composto dall’imbuto, il porta filtro, labeuta codata), pinze di metallo, un cilindro da 100ml, 5 matracci da 100 ml, pipette graduate da 10 ml.

11

Sterilizzare e piastrare 6 piastre con il terreno PCA.Sterilizzare una beuta contenente 500 ml di acquadistillata per le diluizioni del campione.22

33Sotto la cappa sterile preparare le diluizioni del campione di acqua.

(2 campioni 1:10) Prelevare 10 ml di campione e metterlo in tre matracci da 100ml, portare a volume con acqua sterile. Un matraccio servirà per la diluizionesuccessiva .

(2 campioni 1:100) Prelevare 10 ml di campione dal matraccio 1:10 e metterlo in(2 campioni 1:100) Prelevare 10 ml di campione dal matraccio 1:10 e metterlo indue matracci da 100 ml, portare a volume con acqua sterile.

Montare l’apparato di filtrazione inserendo tral’imbuto e il porta filtro l’apposito filtro sterile,collegarlo ad una pompa da vuoto e filtrare icollegarlo ad una pompa da vuoto e filtrare icampioni di acqua partendo da quelli più diluiti. Dopola prima filtrazione si toglie il filtro e lo si deponesulla superficie della piastra di PCA. Si procede cosìper tutti e sei i campioni (campioni 100 –10-1- 10-2).

44

Mettere le piastre capovolte in termostato per 24h; una piastra a 22° e l’altra a 37° per ogni diluizione.55

43

METODICA

Procedimento B (Individuazione coliformi totali)

11 Filtrare 100 ml di campione e seminarlo in piastre con Endo broth agarizzato.

Incubare a 36° per 24h.

11

Procedimento C (Identificazione coliformi fecali)

Filtrare 100 ml di campione e seminarlo in piastre con Faecal coliform broth agarizzato.Incubare a 44° per 24h.

11Filtrare 100 ml di campione e seminarlo in piastre con Azide maltose agar.Incubare a 36° per 48h.

Procedimento D (Individuazione Streptococchi fecali)

p

Valutazione:

a) Per la conta batterica totale si prendono in considerazione tutte le colonie presenti sulla membrana dopo incubazione. Riportare il valore alle diluizioni eseguite. (valori guida: 10 colonie a 36°C 100 colonie a 22°C/1 ml)guida: 10 colonie a 36 C, 100 colonie a 22 C/1 ml)

b) Per i coliformi totali contare le colonie rosse e tutte le colonie che presentano riflesso metallico (fucsina); queste ultime possono essere presumibilmente classificate come colonie di Escherichia coli. Altre colonie eventualmente presenti non vanno conteggiate. Riportare il valore a 100 ml di campione.

c) Per i coliformi fecali contare le colonie in grigio, grigio-blu e blu. Altri tipi di colonie l i i Ri il l 100 l di ieventualmente presenti non si contano. Riportare il valore a 100 ml di campione.

d) Per gli streptococchi fecali contare solo le colonie rosso, rosso-scuro, puntiformi (diametro max 1 mm) con contorni netti e cupoliformi. Ogni altro tipo di colonia non deve essere conteggiato. Riportare il valore a 100 ml di campione.

44

METODICA

Risultati: 22°C 36°C 44°C

Carica batterica totale 100 ………./ml ………./ml

10-2 ………./ml ………./ml

10-1 ………./ml ………./ml

C lif i t t li /100mlColiformi totali ………./100ml

Coliformi fecali ………./100ml

Streptococchi fecali ………./100ml

45

U.D. 4.4 ANALISI MICROBIOLOGICA DELL’ACQUA POTABILE

OBIETTIVO:

Valutare se il campione in esame corrisponde ai requisiti di potabilità dal punto di vistamicrobiologico.

PRINCIPIO:

Ricerca e quantificazione delle varie specie che rappresentano indicatori batterici diinquinamento e più precisamente:

• carica microbica totale

lif i t t li f li• coliformi totali e fecali

• streptococchi fecali


MATERIALI CHIMICICartine indicatrici

TERRENI DI COLTURAPCA, Lactose broth, Brillant green bile broth, Azide dextrose broth, Ethyl violet azidebroth

VETRERIA, ...Pipette sterili da 10-1-0,1 ml, provette, provettoni, beute, campanelle di Durham, piastresterili

STRUMENTI

Centrifuga, bagnomaria, autoclave, contacolonie, bilancia, termostato, bunsen

PRELIEVO DEI CAMPIONIIl prelievo viene effettuato con bottiglie sterili in vetro o in plastica con tappo a vite, chiusi da fogli di carta di alluminio.Il prelievo sarà effettuato dopo aver fatto defluire l’acqua per alcuni minuti. I campioni vanno sottoposti all’esame quanto prima, in ogni caso l’intervallo di tempo fra il prelievo e l’analisi non dovrà superare le 24h.

46

ANALISI MICROBIOLOGICA ACQUA POTABILE

CARICA MICROBICA TOTALE

Semina in PCA per inclusione con eventuali diluizioni scalari

Incubare a 36°C per 48h Incubare a 22°C per 72h

COLIFORMI TOTALI E FECALI STREPTOCOCCHI

Osservare e contarele colonie, ricavare

il valore mediodelle piastre allastessa diluizione

Osservare e contarele colonie, ricavare

il valore mediodelle piastre allastessa diluizione

Test presuntivo in Lactose broth Test presuntivo in Azide dextrose broth

Incubare a 36°C per 24/48h Incubare a 37°C per 48h

SCHEMA DI

Produzione di gas? Intorbidamento del brodo?

Test negativo

Test negativo

Test Test

no no

si si

SCHEMA DI LAVORO

positivo positivo

Inoculo in Brillant green Bile broth Inoculo in EVA broth

Incubare a 36°C per 24/48h Incubare a 44°C per 24h Incubare a 37°C per 48h

Intorbidamento e precipitato

color porpora?

Test negativo

no

si

Produzione di gas? Test negativo

no

si

Produzione di gas?Test negativo

no

si

Test positivo

Test positivo

Test positivo

Conta con metodo MPNdei coliformi totali

Conta con metodo MPNdei coliformi fecali

Conta con metodo MPNdegli streptococchi

47

METODICA (1a FASE)

a) CARICA MICROBICA TOTALE a 36° e 22°

Trasferire con pipette sterili, 1 ml del campione di acquain 4 piastre, se il campione è molto contaminatoprocedere a diluizioni (1:10, 1:100, 1:1000) con acquadist. sterile (vedi modulo 4.1/4.2).

a) CARICA MICROBICA TOTALE a 36 e 22

11

dist. sterile (vedi modulo 4.1/4.2).

Piastrare con PCA mantenuto fuso in b.m.ruotare delicatamente le piastre peromogenizzare il campione nel terreno.22

33 Incubare 2 piastre a 36° per 48h e le altre 2 a 22° per 72h.

Osservare le colonie cresciute con il contacolonie, ricavare il valore medio su ognicoppia di piastre, esprimere il risultato come colonie su agar/ml a 36° e 22°C.

48

METODICA b) COLIFORMI TOTALI E FECALI (test presuntivo)c) STREPTOCOCCHI FECALI (test presuntivo)

11Preparare e sterilizzare (per i coliformi):3 provettoni con campanella di durham contenentiognuno 10 ml di Brodo lattosato a concentrazionedoppia.6 provettoni con campanella di durham contenentiognuno 10 ml di Brodo lattosato a concentrazionenormalenormale.

Preparare e sterilizzare (per gli streptococchi):3 provettoni con campanella di durham contenentiognuno 10 ml di Azide dextrose broth a concentrazione22 gdoppia.6 provettoni con campanella di durham contenentiognuno 10 ml di Azide dextrose broth a concentrazionenormale.

22

33Seminare 10 ml di campione nei 3 provettoni contenentiil Brodo lattosato e 3 con l’Azide dextrose broth aconcentrazione doppia.

Seminare 1 ml di campione nei 3 provettoni contenentiSeminare 1 ml di campione nei 3 provettoni contenentiil Brodo lattosato e 3 con l’Azide dextrose broth aconcentrazione normale.

Seminare 0,1 ml di campione nei 3 provettonicontenenti il Brodo lattosato e 3 con l’Azide dextrosebroth a concentrazione normale.

Incubare a 36° per 24-48 h tutti i test, leggere dopo 24h considerando positive solo le colture che hannocrescita con sviluppo di gas e intorbidamento del

I b di l i bi i i l44

terreno. Incubare di nuovo solo i tubi negativi per altre24 h.

49

METODICAb) COLIFORMI TOTALI E FECALI (test di conferma)c) STREPTOCOCCHI FECALI (test di conferma)

Preparare e sterilizzare:

11 tanti provettoni con campanella di durham quante sono le prove positive con 4 ml di Brillant green bile broth (per i coliformi) e altrettante con 5 ml di EVA broth (per gli streptococchi).

Seminare 1 ansata di ogni brodocoltura positiva

Incubare a 36° per 24h i coliformi totali,

22Seminare 1 ansata di ogni brodocoltura positivadelle prove presuntive nei tubi contenenti il Brillantgreen e 3 ansate in quelli contenenti EVA broth.

33 a 44° per 24h i coliformi fecali, a 36° per 48h gli streptococchi.

33

Osservare i risultati, la determinazione numerica dei batteri ricercati viene espressa rispetto al numerodi tubi positivi (intorbidamento e produzione di gas per i coliformi, sedimento color porpora per gli

hi) i l i d i b i MPN/ l di i i è distreptococchi) e esprimere la concentrazione dei batteri come MPN/ml di campione, cioè di numeropiù probabile.

50

Numero tubi positivi su MPN

per 100 ml

Limiti fiduciari

3 da 10 ml 3 da 1 ml 3 da 0,1 ml inferiori superiori

0 0 1 3 <0,5 9

Tabella MPN

0 1 0 3 <0,5 13

1 0 0 4 <0,5 20

1 0 1 7 1 21

1 1 0 7 1 23

1 1 1 11 3 36

1 2 0 11 3 361 2 0 11 3 36

2 0 0 9 1 36

2 0 1 14 3 37

2 1 0 15 3 44

2 1 1 20 7 89

2 2 0 21 4 47

2 2 1 28 10 1502 2 1 28 10 150

3 0 0 23 4 120

3 0 1 39 7 130

3 0 2 64 15 380

3 1 0 43 7 210

3 1 1 75 14 230

3 1 2 120 30 380

3 2 0 93 15 380

3 2 1 150 30 440

3 2 2 210 35 470

3 3 0 240 38 1300

3 3 1 460 71 2400

3 3 2 1100 150 4800

Parametri microbiologicidalla Gazzetta Ufficiale – maggio 1985

Caratteristiche di qualità delle acque destinate al consumo umano

Parametro ed unità di misura Valore guida Valore limite osservazioni

Coliformi fecali/100 ml - 0 Non più del 5% dei campioni esaminati nell’arco dell’anno e non più di 2 campioni prelevati nello stesso punto possono eccedere tale limite. Comunque mai superiore a 5/100 ml.

Coliformi totali/100 ml - 0

C t i l i /1 l 36°C 10 Alt i h b tt i h i hi d Conteggio colonie su agar/1 ml a 36°C

a 22°C

10

100

-

-

Alte cariche batteriche richiedono indagini e accertamenti appropriati.

Streptococchi fecali/100 ml - 0

51

U.D. 4.5 VALUTAZIONE DELL’AZIONE INIBENTE DI ALCUNI DISINFETTANTI DI USO COMUNE

OBIETTIVO:

Confrontare l’attività inibente di alcuni disinfettanti utilizzati comunemente per usi sanitari edomestici.

PRINCIPIO:

Il potere antibiotico di alcuni composti chimici può essere valutato indagando la loro capacitàdi inibire la crescita di microrganismi. Il metodo utilizzato è quello della diffusione in agarbasato sull’uso di dischetti di carta da filtro sterili imbevuti del composto da saggiare. Idischetti, disposti sulla superficie del terreno agarizzato, seminato con un ceppo microbicostandardizzato, permettono la diffusione del disinfettante nel terreno. Dopo incubazione si

à i t l di h tt l di i ibi i d ll it h à di t t tosserverà intorno al dischetto un alone di inibizione della crescita che avrà un diametro tantopiù grande quanto più efficace sarà il disinfettante.


MATERIALI BIOLOGICICeppi di Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Bacillus subtilis

MATERIALI CHIMICIAlcool denaturato, tintura di iodio, acqua ossigenata 10 volumi, amuchina, ammoniacae candeggina di uso commerciale.

TERRENI DI COLTURATSB, TSA

VETRERIAVETRERIA, ...Beute, cilindri, bacchette, provette 16x100, piastre sterili, beker, dischi di carta da filtrosterili con diametro di 6 mm, tamponi sterili, pinze, ansa

STRUMENTIBilancia, autoclave, termostato, contacolonie, bunsen

52

METODICA (1a FASE 1° parte)

Preparare delle provette contenenti 5 ml di TSB, sterilizzarlo per gli inoculi dei ceppi batterici.

11

22preparare, sterilizzare e piastrare il TSA doppio volume (40 ml a piastra).

(1a FASE 2° parte)

Seminare i brodi prelevando circa 4-5 ansate di ogni ceppo batterico.11

22 Incubare per 18 h a 37° C.

53


11Standardizzare l’inoculo confrontando la torbiditàdella brodocoltura con quella dello standardMacFarland, (tale standard corrisponde circa a 108

batteri/ml) usare brodo sterile per eventualidiluizioni della brodocoltura.

(2a FASE 2° parte)

Seminare, con un tampone sterile in manierauniforme, ripetendo l’operazione più volteruotando la piastra di 60°, i ceppi batterici.11

Segnare sul fondo delle piastre la posizione in cuideporre i dischi imbevuti indicando con un numero ilcomposto da saggiare. Testare, per ogni ceppo batterico,i disinfettanti più un dischetto imbevuto con acquasterile come controllo. Con le pinze sterili deporre i

221

2

3

4

33Incubare le piastre a 37° per 24 h.

p pdischi sulla superficie dell’agar dopo averli imbevuti deicampioni di disinfettante.

54

METODICA (3a FASE)

La misura degli aloni di inibizione viene fatta su un contacolonie o su fondo scuro, conun millimetro, compilare poi una tabella con i risultati segnando con + o con – lapresenza o l’assenza di alone.

C 1 C 2Ceppo 1 Ceppo 2

1 alcool denaturato

2 tintura di iodio

3 acqua ossigenata 10 volumi

4 amuchina

5 ammoniaca

6 candeggina

55

U.D. 4.6 ANTIBIOGRAMMA

OBIETTIVO:

Stabilire lo spettro di sensibilità di un determinato ceppo microbico a diversi antibiotici.

PRINCIPIO:

Come nella precedente esperienza (U.D. 4.5), la valutazione della sensibilità del ceppomicrobico in esame a diversi antibiotici, si effettua misurando il diametro dell’alone diinibizione che si è formato intorno a dischetti contenenti quantità prestabilite e controllate diantibiotico (tecnica di Kirby-Bauer). L’interpretazione dei risultati la si ottiene consultandoapposite tabelle che permettono di stabilire se il ceppo microbico è resistente, intermedio osensibile ad un determinato antibiotico.


MATERIALI BIOLOGICIColture microbiche di Escherichia Coli, Enterobacter aerogenes

MATERIALI CHIMICIStandard MacFarland, dischi di antibiotici

TERRENI DI COLTURATERRENI DI COLTURATrypticase Soy broth, Mueller Hinton agar

VETRERIA, ...Piastre sterili, ansa, provette 16x100, tamponi sterili, pinze mettalliche, beker 100 ml,righello

STRUMENTIBilancia autoclave termostato bunsenBilancia, autoclave, termostato, bunsen

Standard MacFarland:Standard MacFarland:0,5 ml di Bario cloruro 0,048M + 99,5 ml di Acido Solforico 0,35 N (0,99 ml/100mldi acido solforico, 0,117 g/10 ml di Bario Cloruro).Tale standard corrisponde circa a 108 batteri/ml). La soluzione è stabile per circa 6mesi. Agitare prima dell’uso.

56

METODICA (1a FASE)

Preparare il brodo.11

22 Distribuire 4-5 ml di brodo in ogni provetta.

Preparare il terreno Mueller Hinton agar a doppio volume.33

Distribuire in provettoni con tappo metallico (40 ml per provettone).44


57


11 Piastrare il terreno Mueller Hinton agar in ambiente sterile.

(2a FASE 1 parte)

(2a FASE 2° parte)

11 Con l’ansa, inoculare un ceppo microbico in ogni provetta contenente il brodo TSB.

22 Incubare le provette a 37° per 18h.

58

METODICA (3a FASE 1° parte)(3 FASE 1 parte)

11Standardizzare l’inoculo confrontando la torbidità dellabrodocoltura con quella dello standard MacFarland, (talestandard corrisponde circa a 108 batteri/ml) usare brodosterile per eventuali diluizioni della brodocoltura.

(3a FASE 2° parte)

Immergere un tampone sterile nella brodocolturae seminare sulla superficie del terreno inmaniera uniforme, ripetendo l’operazione piùvolte ruotando la piastra di 60°.

11

Entro 15’ applicare sulla piastra seminata i dischidi antibiotici mediante pinze sterili (selezionaregli antibiotici in relazione al tipo di batteri).Disporre i dischi ad una analoga distanza traloro.

22

33Incubare le piastre a 37° per 16-18 h.

59

METODICA (4a FASE)

Misurare con un centimetro il diametro deglialoni di inibizione sul fondo della piastra postasopra una superficie luminosa. Interpretare irisultati in base allo schema di lettura.

11

22Antibiotico

Diametro alone di inibizione

Resistente Moderat. sensibile Sensibile

Ampicillina (AM) (enterococchi, t b tt i)

<11 12-13 >14enterobatteri)

Ampicillina (AM) (stafilicocchi) <20 21-28 >29

Amikacina <14 15-16 >14

Amoxicillina (Gram-) <11 12-13 >14

Amixicillina (Gram+) <20 21-28 >29

Acido nalidixico (NA) <13 14 18 >19Acido nalidixico (NA) <13 14-18 >19

Eritromicina (E) <13 14-17 >18

Fosfomicina (FFL) <10 11-14 >15

Gentamicina (GM) <12 ------- >13

Neomicina <12 13-16 >17

Rifampicina <11 12-18 >19Rifampicina <11 12-18 >19

Penicillina G (P) (Stafilococchi) <20 21-28 >29

Penicillina G (P)

(Altri microrganismi)

<11 12-21 >22

60

5. CARATTERISTICHE METABOLICHE DEI MICRORGANISMI

U.D. 5.1 UTILIZZAZIONE DELL’AMIDO

OBIETTIVO:

Verificare la capacità dei microrganismi di utilizzare l’amido quale fonte di glucosio per ilproprio metabolismo

PRINCIPIO:

La capacità dei batteri di idrolizzare l’amido, trasformandolo in destrine, maltosio e glucosio,dipende da una proprietà genetica dei batteri stessi: quella di produrre l’enzima amilasiUtilizzando un terreno di coltura in cui è presente amido, è possibile rilevarne la presenza, doposemina e incubazione, con il reattivo di Lugol, che si colora in blu. Non danno invececolorazione blu i prodotti di idrolisi dell’amido.L’aggiunta del Lugol sulla coltura determinerà una colorazione blu se il batterio in esame nonpossiede l’amilasi, giallo-bruna o rossa se il batterio è amilasi +


MATERIALI BIOLOGICIColture microbiche di Escherichia coli e Bacillus subtilis

MATERIALI CHIMICILiquido di Lugol

TERRENI DI COLTURAStarch agar (Nutrient agar, Amido solubile)

VETRERIAVETRERIA, ...Beuta, treppiede, piastre sterili monouso, ansa, provette, portaprovette

STRUMENTIBilancia tecnica, autoclave, termostato, bunsen

Liquido di Lugol:(soluzione iodo-iodurata) composto da 1 g di Iodio, 2 g di ioduro di potassio e 200 ml ( ) p g , g pdi acqua. La soluzione deve essere fresca perché con il tempo si decolora e acidifica per alterazione dello iodio.

61

METODICA (1a FASE)

Preparare il terreno: soluzione al 10% di amido solubile in Nutrient agar fuso in ragione di 20ml di soluzione per 100ml di Nutrient agar.11

Distribuire in 2 provettoni con tappo metallico (18-20 ml per provettone).22


(2a FASE)

11 Piastrare in ambiente sterile.

Seminare solo metà di 2 piastre, una piastra con Escherichia coli e l’altra piastra con Bacillus subtilis.22

Incubare a 37° per 48 h.33

62

METODICA (3a FASE)

11 Aggiungere una goccia di Lugol sulla metà piastra seminata e una goccia sulla metà non seminata.

22Una colorazione chiara denota che l’amido è stato idrolizzato, mentre la colorazione blu-azzurro rivela

di id22 ancora presenza di amido.

63

U.D. 5.2 UTILIZZAZIONE DI CARBOIDRATI DIVERSI

OBIETTIVO:Saggiare la capacità dei microrganismi di utilizzare carboidrati diversi (Glucosio, Lattosio,Saccarosio) a scopi fermentativi.

PRINCIPIO:

I microrganismi metabolizzano diversi carboidrati attraverso processi fermentativi che portanoalla produzione di acidi e/o gas.La produzione di acidi si può rilevare utilizzando un terreno come il Phenol red broth base checontiene un indicatore di pH, il rosso fenolo, che è rosso in ambiente alcalino, arancio in

bi i ll i bi idambiente neutro e giallo in ambiente acido.La produzione di gas può essere rilevata con le campanelle di Durhan.


MATERIALI BIOLOGICIColture microbiche di Escherichia coli e Alcaligenes faecalis

MATERIALI CHIMICISoluzioni al 10% di glucosio, lattosio, saccarosio

TERRENI DI COLTURAPhenol red broth base

VETRERIA, ...Bunsen, beuta, treppiede, ansa, provettoni, portaprovettoni, palloncini tarati, siringhe efiltri sterili campanelle di Durhamfiltri sterili, campanelle di Durham


64

METODICA (1a FASE)

11 Preparare il terreno.

Distribuire in provette con tappo a vite (10 ml per provetta;

22

33

p pp ( p p ;3 provette per ogni microrganismo in esame più una provetta di controllo che non verrà inoculata).

Mettere in ogni provetta una campanella di Durhan.

44 Sterilizzare in autoclave a 121°C per 15’.

(2a FASE)

i d i l di l i di b id

11Aggiungere ad ogni provetta 1ml di soluzione di carboidrato, utilizzando una siringa munita di filtro sterile (3 provette per i 3 carboidrati diversi per ogni microrganismo in esame).

Con l’ansa inoculare con lo stesso ceppo microbico le 3 provette

33

22 Con l ansa, inoculare con lo stesso ceppo microbico le 3 provette con i 3 carboidrati diversi. Ripetere per ogni batterio in esame.

Incubare a 37°. Dopo 4h fare la prima lettura; la seconda dopo 24h.

65

(3a FASE)

i iglucosio saccarosio lattosio

11 Osservare il colore del terreno e la presenza di gas all’interno delle campanelle(dopo 4 e 24 ore) e riportare i risultati nella seguente tabella:

microrganismo

E. coli

A. faecalis

gas gas gas pHpHpH

glucosio saccarosio l tt i

22 Caratteristiche colturali dei due batteri

microrganismo

E. coli

A. faecalis

glucosio saccarosio lattosiogas gas gas pHpHpH

+ + - - + +

- - - - - -

66

U.D. 5.3 OSSIDAZIONE E FERMENTAZIONE

OBIETTIVO:Saggiare la capacità dei microrganismi di metabolizzare i diversi carboidrati (Glucosio,Lattosio, Saccarosio) mediante due processi: la fermentazione e l’ossidazione aerobia.

PRINCIPIO:I processi per metabolizzare i carboidrati sono due: la fermentazione, che avviene in condizionidi anaerobiosi, e l’ossidazione aerobia.I microrganismi che fermentano, producono una reazione acida (colorazione gialla) in entrambele condizioni, quelli che ossidano producono una reazione acida solo in condizione di aerobiosi.I microrganismi non fermentanti e non ossidanti danno reazione alcalina (colorazione blu) inaerobiosi e nessuna modificazione di pH in anaerobiosiaerobiosi e nessuna modificazione di pH in anaerobiosi.Il terreno contiene blu di bromotimolo come indicatore di pH; con la degradazione delcarboidrato si ha una variazione del pH verso l’acidità e il conseguente viraggio del terreno daverde a giallo.


MATERIALI BIOLOGICIMATERIALI BIOLOGICIColture microbiche di Escherichia coli e Alcaligenes faecalis

MATERIALI CHIMICISoluzioni al 10% di glucosio, lattosio, saccarosioolio di vasellina o paraffina

TERRENI DI COLTURAO/FO/F agar

VETRERIA, ...Bunsen, beuta, treppiede, ago per infissione, provette, portaprovette, palloncini tarati, siringhe e filtri sterili


67

METODICA (1a FASE)

11

22

Preparare il terreno.

Distribuire in provette con tappo a vite (5 ml per provetta; 6 provette per ogni microrganismo in esame:2 per il glucosio, 2 il i 2 il l i )22

33

2 per il saccarosio e 2 per il lattosio).

Preparare una beuta con della paraffina o dell’olio di vasellina.

44 Sterilizzare in autoclave a 121°C per 15’ sia il terreno che la paraffina.

(2a FASE)

11Aggiungere ad ogni provetta 0,5ml di soluzione di carboidrato, utilizzando una siringa munita di filtro sterile (2 provette per i 3 carboidrati diversi per ogni microrganismo in esame).

22Seminare per infissione con lo stesso ceppo microbico le 2provette con i 3 carboidrati diversi. Ripetere per ogni batterio inesame.

33 Coprire il terreno (una sola provetta per ogni zucchero) con 2 ml di paraffina liquida, infine tappare.

44 Incubare a 32°-35° per 48h esaminando le provette ogni giorno.

68

(3a FASE)

11 O l l i i i i di i i d i i b ll11 Osservare la colorazione in ciascuna coppia di provette e riportare i dati in tabella.

microrganismo

E coli

glucosio saccarosio lattosioaperta chiusa aperta chiusa aperta chiusa

22 Caratteristiche colturali dei due batteri

E. coli

A. faecalis

22 Ca atte st c e co tu a de due batte

microrganismo

E. coli

glucosio saccarosio lattosioaperta chiusa aperta chiusa aperta chiusa

AG AG AG AG- -

A = reazione acidaAG = reazione acida e produzione di gas- = nessuna reazione o reazione alcalina

A. faecalis - - - - - -

La produzione di gas si evidenzia con il distacco dal terreno e lo spostamento verso l’alto della paraffina.

69

U.D. 5.4 UTILIZZAZIONE DI AMINOACIDI

OBIETTIVO:Saggiare la capacità dei microrganismi di degradare un amminoacido il triptofano, dalla cuidemolizione si ottiene indolo e altri composti.

PRINCIPIO:Il test dell’indolo serve a caratterizzare alcuni microrganismi appartenenti agli Enterobatteri, lacui presenza in un campione può o meno indicare contaminazione fecale.L’indolo è un composto contenente azoto che si forma dalla degradazione del triptofano da partedi certi batteri.L d d i d i d l è l bil il i di K h dà l dLa degradazione ad indolo è svelabile con il reattivo di Kovacs cha dà luogo ad un compostocolorato di rosso.


MATERIALI BIOLOGICIColture microbiche di Escherichia coli e Enterobacter aerogenes

MATERIALI CHIMICIReattivo di Kovacs

TERRENI DI COLTURAAcqua triptonata o peptonata

VETRERIA, ...Bunsen, beuta, treppiede, ansa, provette, portaprovette


70

METODICA (1a FASE)

Preparare l’acqua triptonata.11

22 Distribuire in 2 provette con tappo a vite (5 ml per provetta).


(2a FASE)

11 Con l’ansa, inoculare un ceppo microbico per ogni provetta.

22 Incubare a 32°-35° per 24-48h.

71

(3a FASE)

11Aggiungere a ciascuna provetta alcune gocce del reattivo di Kovacse agitare delicatamente. Dopo alcuni minuti la formazione di unacolorazione rossa sulla superficie del terreno costituisce una prova positiva.

22 Riportare i dati ottenuti nella tabella.

microrganismo

l

Indolo

Caratteristiche culturali dei due batteri.

E. coli

E. aerogenes

microrganismo

E. coli

Indolo

+

+ = reazione positiva- = nessuna reazione

E. aerogenes -

72

U.D. 5.5 ENTEROTUBE

OBIETTIVO:L’enterotube è un sistema pronto all’impiego per l’identificazione rapida delleEnterobacteriacae che consente l’esame simultaneo di 15 differenti caratteristiche biochimichedei batteri.

PRINCIPIO:Gli enterobatteri vengono identificati in base alla valutazione dei risultati

di diverse prove biochimiche:di diverse prove biochimiche:- fermentazione del destrosio e produzione di gas- decarbossilazione della lisina- decarbossilazione dell’ornitina- fermentazione del triptofano e produzione di H2S- fermentazione dell’adonitolo- fermentazione del lattosio

fermentazione dell’arabinosio

inanaerobiosi

- fermentazione dell arabinosio- fermentazione del sorbitolo- fermentazione del glucosio (Voges-Proskauer)- fermentazione del dulcitolo e della fenilalanina- idrolisi dell’urea- utilizzazione del citrato

inaerobiosi


MATERIALI BIOLOGICIColture microbiche di Escherichia coli, Proteus, Enterobacter aerogenes, ...

MATERIALI CHIMICI

Rreattivo di Kovacs, α-naftolo (6% in alcool etilico), idrato di potassio (40g in 60ml diacqua)acqua)

TERRENI DI COLTURAKit enterotube

VETRERIA, ...Portaprovette, siringhe sterili

STRUMENTITermostato, bunsen

73

METODICA (1a FASE)

11 Accanto alla fiamma del bunsen svitare i cappuccidell’enterotube e con la punta dell’ago prelevareuna colonia isolata.

22Inoculare l’enterotube ruotando ed estraendo l’ago attraverso tutti gli scomparti del tubo

33

attraverso tutti gli scomparti del tubo.

Reinserire l’ago fino alla tacca e poi spezzarlopiegandolo. La parte di ago che rimane all’internoassicura l’anaerobiosiassicura l anaerobiosi.

Con lo spezzone dell’ago perforare la pellicola diplastica in corrispondenza dei fori degli ultimi 8scomparti al fine di creare un ambiente aerobio.Riavvitare i tappi.

44

Incubare a 35-37°C per 20-24 h possibilmente inposizione verticale su un portaprovette con loscomparto del destrosio rivolto verso l’alto.55

74

(2a FASE)

11 Registrare le reazioni (+ o -)11 Registrare le reazioni (+ o -)

tona ina lo S tolo

sio osio

olo

s-P olo

anin

a

aosio

e riportarle nella tabella:

citra

t

lisin

orni

tiin

dol

H2S

adon

it

latto

sar

abin

oso

rbito

Voge

s

dulc

itofe

nila

la

urea

dest

ro gas

reazionereazione

22Eseguire il test dell’indolo iniettando con una siringa 4gocce di reattivo di Kovacs direttamente sotto lapellicola di plastica dello scomparto H2S/indolo (ilreattivo vira al rosso se la prova è positiva).

33Eseguire il test di Voges-Proskauer iniettando con unasiringa 3 gocce di soluzione di α-naftolo e 2 di KOHdirettamente sotto la pellicola di plastica delloscomparto VP (il reattivo vira al rosso entro 10 minuti sela prova è positiva).

44 Registrare gli ultimi due dati.

75

(3a FASE)

11 Per identificare il batterio in esame confrontare i dati ottenuti con la tabella per l’dentificazione biochimica degli enterobatteri.

22 In alternativa, utilizzare i foglietti di identificazione allegati allaconfezione di Enterotube, contrassegnando per ogni reazione positiva inumeri corrispondenti.Per esempio:

Sommare i numeri contrassegnati, come indicato sopra. Il numero a 5 cifre ottenuto(ID value), consente la rapida identificazione del batterio in esame utilizzando ilsistema di identificazione con codifica computerizzata.

76

6. INTERAZIONE MICRORGANISMI/UOMO

U.D. 6.1 PROTEINA C REATTIVA (Test di agglutinazione indiretta)

OBIETTIVO:

Verificare la presenza di infezioni in atto sul soggetto in esame.

PRINCIPIO:

La proteina C reattiva compare nel siero umano in risposta ad una grande varietà di processiinfiammatori determinati da infezioni batteriche, nel reumatismo acuto, nell’infarto miocardico,nelle neoplasie maligne. La proteina C ha un forte potere antigene e produce negli animali dalaboratorio un anticorpo specifico chiamato “reactive protein antiserum” CRPA. La ricerca dellaPCR si esegue utilizzando l’antisiero CRPA.


MATERIALI BIOLOGICISiero, sieri positivo e negativo per PCR

MATERIALI CHIMICIKit PCR

VETRERIA, ...Vetrini per agglutinazione a fondo nero

77

METODICA

11

Il siero in esame deve essere limpido intero ediluito 1/20 (1 parte di siero e 19 parti disoluzione tampone pH 8,2).

I sieri di controllo positivo e negativo sonoprediluiti 1:20 e quindi pronti all’uso. Agitareprima dell’uso.

Agitare delicatamente prima dell’uso il reattivo al Latex con la proteina C reattiva.22

S i i f d di i i i i dSu un apposito vetrino a fondo nero, diviso in tre settori, si procede come segue:

I settore II settore III settore

1 goccia di siero in esame+

1 goccia di siero positivo+

1 goccia di siero negativo+

1 goccia di Latex test PCR 1 goccia di Latex test PCR 1 goccia di Latex test PCR1 goccia di Latex test PCR 1 goccia di Latex test PCR 1 goccia di Latex test PCR

33 Miscelare con l’apposita bacchetta equindi roteare delicatamente il vetrino33 quindi roteare delicatamente il vetrinoper 1’ circa.

44 Il test è positivo con la comparsa di agglutinazione visibile ad occhio nudotrascorsi da 1 a 3 minuti. Agglutinazioni posteriori non sono da considerare.

78

U.D. 6.2 TITOLO ANTI-O-STREPTOLISINICO (Test di neutralizzazione)

OBIETTIVO:

Determinare la presenza o meno nel siero in esame di anticorpi anti O-streptolisinici e valutarneil titolo.

PRINCIPIO:

La O-streptolisina è una emolisina prodotta da Streptococcus pyogenes beta emolitico. La O-streptolisina provoca sulla membrana delle emazie dei fori dai quali fuoriesce l’emoglobina. Glianticorpi che si fissano alla tossina, (reazione di neutralizzazione) impediscono l’evento. Comesistema rivelatore della presenza o meno di anticorpi nel siero si usano le emazie. Se i globulirossi più il siero in esame vengono lisati dall’aggiunta di O streptolisina non si è verificata unarossi più il siero in esame, vengono lisati dall’aggiunta di O-streptolisina non si è verificata unareazione di neutralizzazione, dunque nel siero non sono presenti anticorpi anti O-streptolisinici.Viceversa l’assenza di lisi segnala la presenza di anticorpi capaci di legare e neutralizzare latossina.


MATERIALI BIOLOGICIO-streptolisina titolata, globuli rossi di coniglio al 5%

MATERIALI CHIMICISoluzione tampone a pH 6,5

VETRERIA, ...,Pipette in vetro o pipette automatiche, puntali, provette da sierologia, portaprovette

STRUMENTICentrifuga, bagnomaria

79

Diluire il siero 1/10 = 0,2 ml di siero + 1,8 ml di soluzione tampone

METODICA (1a FASE)

1/100 = 0,5 ml siero 1/10 + 4,5 ml “ “1/500 = 1 ml siero 1/100 + 4 ml “ “

11

Lavare la sospensione di globuli rossi almeno 3 volte con il tampone, centrifugando ogni volta a 1500-2000 rpm per 5’. Dopo il lavaggio finale preparare la sospensione al 5% in tampone.

22

1:10 1:100 1:500 Controlli

provetta 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

siero diluito 0,8 0,2 1 0,8 0,6 0,4 0,3 1 0,8 0,6 0,4 0,2 - -

Disporre 14 provette come da schema:33

tampone 0,2 0,8 - 0,2 0,4 0,6 0,7 - 0,2 0,4 0,6 0,8 1,5 1

reagente

o-streptolisina

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 - 0,5

Agitare ed incubare a 37° per 15’

emazie al 5% 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Agitare e incubare a 37° per 45’, ripetere l’agitazione dopo 15’. Centrifugare le provette per 1-2’ a 1000-1500rpm

Il titolo del siero in esame è espresso dalla più alta diluizione che è capace di inibire l’emolisi. L’emolisi nelle provette è caratterizzata dal colore rosso della soluzione in esame. Le unità anti-o-streptolisiniche sono espresse come il reciproco del titolo di anticorpi come nello schema:anticorpi come nello schema:

provetta diluizione provetta diluizione

1 1/12 8 1/500

2 1/50 9 1/625

3 1/100 10 1/833

4 1/125 11 1/1250

5 1/166 12 1/2500

6 1/250 13 non vi deve essere emolisi

7 1/333 14 vi deve essere emolisi completa

80

APPENDICE

TERRENI DI COLTURA

AGAR BIOS SPECIAL LL

Agar Bios Special LL è l'agente solidificante d'elezione per iterreni dl coltura per microbiologia.

Grazie al suo elevato grado di purezza fornisce soluzioniacquose limpide alle concentrazioni d'uso nei terreni dicoltura (1.5%).

AZIDE DEXTROSE BROTHF l ( i lit )

PreparazioneSciogliere 71.4 g di polvere in 1000 ml di acqua distillatafredda, portare all'ebollizione sotto agitazione bollire percinque minuti, raffreddare in bagnomaria a 50°C edaggiungere, con le cautele dell'asepsi, 10 ml di unasoluzione acquosa di 2,3,5 trifeniltetrazolio cloruro (TTC)all'1% sterilizzata per filtrazione; il terreno così preparatopuò essere conservato a 50°C per circa tre ore prima diessere versato nelle piastre. Le piastre preparate possono

i 5 i i i f i if l b iFormula (grammi per litro)

Peptocomplex 15.0

Beef Extract 4.5

Glucose 7.5

Sodium Chloride 7.5

Sodium Azide 0.2

Preparazione

essere conservate per circa 15 giorni in frigorifero al buio.

Il terreno non aggiunto di TTC può essere sterilizzato inautoclave a 121°C per 10 minuti e quindi conservato infrigorifero: una volta scelto un modo di preparazioneattenervisi sempre.

pH finale 7.2±0.2.

ImpiegoAzide Maltose Agar, preparato secondo la formula diPreparazione

Sciogliere 34.7 g di polvere in 100 ml di acqua distillatafredda. Scaldare fino a completa solubilizzazione, distribuirein tubi da 10 ml ed autoclavare a 121°C per 15 minuti.

Per inoculi superiori a 1 ml per 10 ml di terreno, preparare ilterreno a concentrazione doppia o multipla. pH finale7.2±0.2.

ImpiegoA id D t B th è t l tti l

Azide Maltose Agar, preparato secondo la formula diKenner, Clark e Kabler, è un terreno selettivo utilizzato perl'isolamento ed il conteggio degli streptococchi fecali.APHA e FDA raccomandano il terreno nell'isolamentoprimario degli enterococchi (nel senso lato del termine)nelle acque e negli alimenti con la tecnica della membranafiltrante o con il conteggio in piastra (agar-germi).

Su Azide Maltose Agar coltivano con colonie da rosse arosa per la riduzione del TTC tutti gli streptococchi fecaliconsiderati tali da Hartman: enterocchi di gruppo D (S.f li S f li b li f i S f li bAzide Dextrose Broth è un terreno selettivo per la

determinazione presuntiva degli streptococchi fecali nelleacque e negli alimenti: la composizione è conforme a quantostabilito da OMS e APHA.

Eseguire il conteggio in tubi, secondo il metodo del numeropiù probabile; variare l'entità dell'inoculum (multipli ofrazioni di 1 ml) in funzione del tipo di campione, allestendoalmeno cinque tubi per ogni diluizione.

Usare come liquido per diluizione tampone di fosfati oppurel i di ll 0 5% ( / ) I b

faecalis, S. faecalis subsp. liquefaciens, S. faecalis subsp.zymogenes, S. faecium), i non enterococchi di gruppo D (S.bovis, S. equinus) ed inoltre S. mitis e S. salivarius. Dopo48 ore a 35°C si registra sul terreno una crescita scarsa concolonie incolori, di Lactobacillus plantarum e diPediococcus cerevisiae; completamente inibiti sono glistreptococchi non di gruppo D (S. cremoris, S. lactis, S.pyogenes, S. termophilus) altri batteri acido lattici(Leuconostoc mesenteroides, L. lactis, L. acidophilus) ed icoliformi.

una soluzione acquosa di peptone allo 0.5% (p/v). Incubare a35°C per 24 ore, osservare se vi è sviluppo; in caso negativoprotrarre l'incubazione per altre 24 ore.

Calcolare il risultato servendosi delle apposite tabelle edesprimerlo come numero più probabile presuntivo.Confermare il risultato presuntivo trapiantando in EthylViolet Azide Broth

AZIDE MALTOSE AGAR (KF)

Formula (grammi per litro)

APHA nell'esame degli alimenti suggerisce di inoculare 1ml delle diluizioni decimali del campione con la tecnicadell'agar germi e di incubare le piastre a 35°C per 48 ore.Per il test di conferma trapiantare 5-10 colonie tipiche inBrain Heart Infusion Broth e incubare a 35°C per 18-24ore; usare queste brodocolture per una colorazione Gram,un test della catalasi, un trapianto in Aesculin Bile Broth,una semina in Brain Heart Infusion Broth normale(incubazione a 45°C) e addizionato di NaCI 6.5%. Ladiagnosi presuntiva di streptococco fecale è data da:Formula (grammi per litro)

Peptocomplex 10

Yeast Extract 10

Sodium Chloride 5

Sodium Glycerophosphate 10

Maltose 20

Lactose 1

g p pcatalasi negativa, sviluppo in brodo bile dopo 72 ore a35°C, crescita a 45°C e in presenza a di NaCI. Tra glistreptococchi fecali considerati da APHA solo S. equinus,S. bovis non coltivano in presenza di NaCI 6.5%.

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Agar Bios LL 15

Sodium Azide 400 mg

Brom Cresol Purple 15

BRILLIANT GREEN BILE BROTH 2%Formula (grammi per litro)Ox Bile Bios 20.0000Lactose 10.0000

ENDO BROTH MEMBRAN FILTERFormula (grammi per litro)Peptone Bios D 5.000Peptomeat 5.000

Peptomeat 10.0000Brilliant Green 0.013

PreparazioneSciogliere 40 g di polvere in 1000 ml di acqua distillatafredda, riscaldare fino a soluzione, distribuire e autoclavare a121°C per 15 minuti. Si raccomanda di non eccedere neltempo e nella temperatura di sterilizzazione Per un terreno

Biotone 10.000Yeast Extract 1.500Lactose 12.500Sodium Chloride 5.000Dipotassium Phosphate 4.375Monopotassium Phosphate 1.375

di l hitempo e nella temperatura di sterilizzazione. Per un terreno2X sciogliere 80 g di terreno in 1000 ml di acqua.pH finale 7.2±0.2.

ImpiegoBrilliant Green Bile Broth 2% è un terreno selettivoraccomandato per la determinazione e la conferma deicoliformi nelle acque, nei liquami, nei prodotti lattiero-

Sodium Sulphite 2.100Sodium Desoxycholate 0.100Sodium Lauryl Sulphate 0.050Basic Fuchsin 1.050PreparazioneSciogliere 48 g di polvere in 1000 ml di acqua distillatafredda contenente 20 ml di etanolo, mescolare e portarell' b lli i N l Il d

q q pcaseari, negli alimenti. La presenza del verde brillantesopprime la crescita dei batteri anaerobi lattosio-fermentanti(C/ostridium perfringens) non ottenendosi falsi positivi conincubazione a 44°C; il verde brillante ed i sali biliariinibiscono la crescita dei microrganismi Gram positivi. Nellarassegna dei metodi per la determinazione dei coliformi neglialimenti ICMSF suggerisce l'uso del Brilliant Green BileBroth 2% per la determinazione, con il metodo del numeropiù probabile, dei coliformi totali con incubazione a 35-37°Cper 24 e 48 ore, seguito dal test di conferma su piastre diVi l R d Bil A di E d A i b 35 37°C

all'ebollizione. Non autoclavare. Il terreno deve essereusato il giorno stesso della sua preparazione; se necessarioconservare al buio a 4°C per non più di 96 ore.pH finale 7.2±0.2.ImpiegoEndo Broth Membran Filter è un terreno selettivo per ilconteggio dei coliformi nell'acqua e nel latte con la tecnicadella membrana filtrante.

Violet Red Bile Agar o di Endo Agar incubate a 35-37°C per48 ore; questo metodo è soprattutto utilizzato nei laboratorieuropei.ICMSF in conformità ad APHA ed a FDA consiglia l'uso delBrilliant Green Bile Broth 2% nel test di conferma deicoliformi: trasferire un'ansata di crescita microbica dai tubipositivi di Lauryl Pepto Bios Broth o di Lactose Broth in tubidi Brilliant Green Bile Broth 2% e incubare a 35°C per 24 e48 ore. La formazione di gas entro le 48 ore conferma lapresenza dei coliformi nei tubi del test presuntivo in Lauryl

Per l'esecuzione del metodo si consiglia di seguire leindicazioni dell'APHA. I coliformi coltivano con viraggiodel terreno verso il color porpora con o senza riflessimetallici in superficie. Il volume di campione da filtraredeve essere scelto in base al numero di cellule battericheche si attende di trovare.La quantità ideale è quella che fornisce una crescitamicrobica compresa tra 50 e 200 colonie.Ad eccezione delle acque potabili e delle acque dellepresenza dei coliformi nei tubi del test presuntivo in Lauryl

Pepto Bios Broth. Seguendo la procedura descritta daMackenzie, ICMSF descrive l'uso del terreno al verdebrillante nella determinazione dei coliformi fecali: trasferireun'ansata di crescita dai tubi positivi di Mac Conkey Broth inprovette di Brilliant Green Bile Broth 2% e di Peptone Watered incubare a 44±0.1°C; osservare lo sviluppo di gas nelleprovette di Brilliant Green Bile Broth 2% dopo 24 e 48 ore diincubazione ed eseguire il test dell'indolo sulla crescita di 24ore in Peptone Water; le colture che producono gas e sonoindolo positive sono da considerarsi coliformi di origine

Ad eccezione delle acque potabili e delle acque dellepiscine che devono essere filtrati in duplicato ad un unicovolume di 100 o 500 ml, tutti gli altri campioni di acquadevono essere filtrati a tre diversi livelli volumetrici, diluitio non diluiti, (Si veda la tabella sottostante).Volumi da filtrare per il conteggio dei coliformi nelleacque:

p gfecale.Anche OMS raccomanda per le acque potabili l'uso delBrilliant Green Bile Broth 2% per il test di conferma deicoliformi con incubazioni differenziate a 37°C ed a 44°C perrispettivamente 48 e 6-4 ore per la distinzione tra coliformi ecoliformi fecali; il test di conferma segue la seminapreliminarein Lactose Broth o in Mac Conkey Broth e precede il test diverifica finale in terreno solido (Endo Agar o Levine EMB

82

verifica finale in terreno solido (Endo Agar o Levine EMBBlue Agar o Mac Conkey Agar OMS). Per le acque potabili l'arricchimento preliminare del

campione dà risultati eccellenti, anche se esso non èindispensabile per l'esame di routine dei campioni.

EOSINE METHYLENE BLUE AGARFormula (grammi per litro)Peptone Bios D 10.00Sodium Chloride 5.00

ETHYL VIOLET AZIDE BROTHFormula (grammi per litro)Biotone 20.0Sodium Chloride 5.0

Lactose 5.00 Sucrose 5.00Dipotassium Phosphate 20.0Methylene Blue 0.065Eosin Yellow 0.40Agar Bios LL 15.00

P i

Glucose 5.0Dipotassium Phosphate 2.7Monopotassiurn Phosphate 2.7Sodium Azide 0.4Ethyl Violet 0.83 mg

P iPreparazioneSciogliere 42.5 g di polvere in 1000 mi di acqua distillatafredda. Portare all'ebollizione sotto agitazione, distribuire esterilizzare a 121°C per 15 minuti.Raffreddare il terreno a circa 50°C e, prima di trasferirlo inpiastra, agitare delicatamente per disperdere il materialeflocculante che si forma durante la sterilizzazione.pH finale 7.2±0.2.

PreparazioneSciogliere 35.8 g di polvere in 1000 ml di acqua distillatafredda. Scaldare fino a completo scioglimento del terreno,distribuire in provette ed autoclavare , a 121°C per 15minuti. Si raccomanda di non eccedere nel tempo disterilizzazione.pH finale 7.0±0.2.

ImpiegoEosine Methylene Blue Agar è un terreno differenzialepreparato secondo una modificazione del terreno originale diHalt-Harris e Teague, da usarsi in piastra per l'isolamentodegli enterobatteri e per la differenziazione dei microrganismilattosio-Saccarosio fermentanti.I batteri Gram-positivi sono notevolmente inibiti. La

bi i d ll' i d l bl di il l

ImpiegoEthyl Violet Azide Broth è un terreno selettivo per ladeterminazione degli enterococchi nelle acque, come indicedi un inquinamento fecale delle stesse. Il terreno èpreparato secondo una modificazione della formulaoriginale proposta da Litsky ed è in accordo con lespecificazioni dell'APHA riguardo all'uso delle tecnicheper la determinazione degli streptococchi fecali nelleacque.

combinazione dell'eosina e del blu di metilene nel terreno,contenente lattosio e saccarosio, permette di distinguere imembri dei generi Escherichia e Enterobacter dagli altrienterobatteri.I batteri lattosio-saccarosio fermentanti sull'EMB Agarformano colonie mucoidali e convesse con una colorazioneda rosso a porpora con assenza o presenza di riflessi metallici.Salmonella, Shigella e gli altri batteri lattosio-saccarosio nonfermentanti formano colonie da incolori a rosa.

L'uso dell'azide sodica, associata al violetto di etile, rende ilterreno selettivo per gli enterococchi essendo inibiti tutti glialtri microrganismi Gram-positivi ed i microrganismiGram-negativi.Gli enterococchi che si devono considerare come indicatoridi inquinamento fecale sono: Streptococcus faecalis subsp.liquefaciens, Streptococcus faecalis subsp. zymogenes,Streptococcus faecium, Streptococcus bovis, Streptococcusequinus.

La presenza del tampone fosfato nel terreno permette didistinguere E. coli da E. aerogenes; E. coli anche in presenzadi un sistema tampone, produce una notevole acidificazionedel terreno, mentre E. aerogenes, avendo modeste proprietàfermentanti, provoca una minore acidificazione del terreno.L'abbassamento del p H durante la crescita di E. coli inducela formazione di legami amidici tra l'eosina e il blu dimetilene che si traduce in una colorazione porpora metallicadelle colonie.

Le caratteristiche di crescita di questi microrganismi,resistenza alle alte temperature, ai detergenti, aidisinfettanti, fanno si che l'indice di inquinamento da loroespresso debba essere integrato dalla ricerca di altriindicatori faecali (coliformi).APHA consiglia di utilizzare l'Ethyl Violet Azide Broth peril test di conferma degli enterococchi coltivati nei tubi diAzide Broth. Dopo 24-48 ore di incubazione delle provettedi Azide Broth si trasferiscono tre ansate di crescita

i bi i bi i 10 l di E h l Vi l A idPer l'isolamento degli enterobatteri patogeni si consiglia diutilizzare, parallelamente all'EMB Agar, terreni più selettiviquali l'XLD, il Brilliant Green Agar, ecc.Nella tabella sottostante sono riportate le caratteristichecolturali di alcuni microrganismi su EMB Agar:

microbica in tubi contenenti 10 ml di Ethyl Violet AzideBroth e si incuba per 24 ore a 35°C.La presenza di enterococchi è rivelata dall'intorbidimentodel brodo e dalla formazione di un anello porporino attornoal menisco del liquido.

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FAECAL COLIFORM BROTHFormula (grammi per litro)Biotone 10.0Peptocomplex 5.0

PreparazioneSciogliere 13 g di polvere in 1000 ml di acqua distillatafredda. Scaldare fino a completa solubilizzazione,distribuire in tubi Durham ed autoclavare a 121°C per 15minuti. Se necessario, usare il terreno a doppia o triplaconcentrazione

Yeast Extract 3.0Sodium Chloride 5.0Lactose 12.5Bile Salts Bios 1.5Aniline Blue 0.1PreparazioneS i li 37 di l i 1000 l di di ill

concentrazione.pH finale 6.8±0.2.ImpiegoLactose Broth è consigliato da APHA per ladeterminazione presuntiva dei coliformi con il metodo delnumero più probabile, nelle acque e nei liquami, pereseguire il test finale di conferma dei coliformi nei prodottilattiero caseari dopo la semina in Endo Agar o in LevineEMB Blue Agar ed è consigliato da FDA e ICMSF per

Sciogliere 37 g di polvere in 1000 ml di acqua distillatafredda; addizionare 10 ml di una soluzione al1'1 %, inNaOH 0.2 N, di acido rosolico. Portare all'ebollizione sottoagitazione, raffreddare e saturare dei tamponi assorbentisterili con 2 ml di terreno in piastre Petri.p H finale 7.4±0.1.ImpiegoFaecal Coliform Broth, preparato in in accordo alla formula

g g pl'arricchimento non selettivo di SaJmonella.Il terreno contiene lattosio, estratto di carne e peptone inquantità tali da permettere una crescita ottimale deimicrorganismi non particolarmente esigenti quali sono icoliformi.Per la determinazione presuntiva dei coliformi nelle acqueAPHA suggerisce la seguente tecnica:inoculare una serie di tubi da fermentazione con volumi

i ti di i i d d lt il t, p pproposta da APHA, è utilizzato per il conteggio dei coliformifecali nell'acqua con il metodo delle membrane filtranti. Perl'esecuzione del test filtrare un volume opportuno dicampione d'acqua (si veda la tabella sottostante) e depositare ifiltri sui tamponi impregnati di Faecal Coliform Broth inpiastre Petri. Entro 30 minuti deporre in bagnomariatermostatato a 44-45°C e incubare in contenitori a tenuta per24 ore. I coliformi fecali coltivano con colonie blu, le rarecolonie date dai coliformi non fecali appaiono di coloregrigio-crema. Per il conteggio delle colonie si consiglia di

appropriati di campione in modo da non alterare il rapportotra volume finale di terreno inoculato e ingredienti per litro;ogni variazione rispetto allo schema di lavoro consigliato eriportato nella tabella sottostante, può alterare lecaratteristiche biologiche del terreno

g g gg gutilizzare un microscopio a basso potere d'ingrandimento (10-15 ingrandimenti).Volumi da filtrare per il conteggio del coliformi fecali nelleacque:

Incubare i tubi da fermentazione a 35°C ed eseguire unaprima lettura agitando leggermente le provette dopo 24 ore;

GELATIN BIOS

p g gg p p ;se non si osserva produzione di gas incubare per ulteriori24 ore.La formazione di gas entro le 48 ore è indice di positivitàper i coliformi. Il limite arbitrario di 48 ore può escluderela possibilità di coltivare occasionali coliformi chefermentano lentamente il lattosio, i quali comunque hannoscarso interesse sanitario e non inficiano la validità delmetodo.Confermare il test presuntivo con semine dai tubi positiviGELATIN BIOS

Gelatin Bios, costituita da materiale proteico, è utilizzatacome agente solidificante nei terreni di coltura per lamicrobiologia e per saggiare l'attività gelatinolitica dei batteri.Gelatin Bios, priva di carboidrati a fermentabili e diconservanti, è realmente solubile in acqua e fornisce soluzionilimpide e prive di colore.

LACTOSE BROTH

Co e a e test p esu t vo co se e da tub pos t vdi Lactose Broth in tubi di Brilliant Green Bile Broth 2% ericercare, se necessario, i coliformi fecali con semine in ECMedium.La presenza di coliformi nelle acque è considerata indice diinquinamento fecale; il loro ritrovamento in prodottilattiero caseari è indice di cicli produttivi nonrigorosamente controllati da un punto di vista sanitario e/odi modalità di conservazione non idonee.

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LACTOSE BROTHFormula (grammi per litro)Beef Extract 3Peptocomplex 5Lactose 5

M17 AGARFormula (grammi per litro)Tryptone 2.50Meat Peptone 2.50

PreparazioneSciogliere 69.2 g di agar e 54.2 g di brodo in 1000 ml diacqua distillata fredda. Portare all'ebollizione sottoagitazione, aggiungere 1 ml di polisorbato 80 (Tween),distribuire ed autoclavare a 121°C per 15 minuti.

Soya Peptone 5.00Yeast Extract 2.50Meat Extract 5.00Sodium Glycerophosphate 19.00Magnesium Sulphate 0.25Ascorbic Acid 0.50

00

pH finale 6.4±O.2.ImpiegoMRS Agar e Broth, preparati secondo la formula di DeMan, Rogosa e Sharpe, sono terreni selettivi indicati perl'isolamento dei lattobacilli.Sui due terreni coltivano lattobacilli provenienti daqualsiasi materiale: latte, prodotti lattiero caseari, cavoorale, feci, ed inoltre i lattobacilli normalmente difficili da

lti lt i t i (L t b ill b iLactose 5.00Agar Bios LL 15.00

PreparazioneSciogliere 57 g di polvere in 1000 ml di acqua distillatafredda. Scaldare fino a completa solubilizzazione, distribuirebeuta ed autoclavare a 121°C per 15 minuti. Non eccederenella temperatura di ebollizione. L’acidità del terreno può

coltivare su altri terreni (Lactobacillus brevis,Lactobacillus fermentum).De Man e coll. riportano una migliore rispondenzadell'MRS Agar rispetto ai terreni contenenti estratto dipomodoro di Briggs e di Cox Briggs e al terreno all'estrattodi carne di De Man, nell'isolamento dei lattobacilli.Il Tween 80, il sodio acetato e il triammonio citratointensificano la crescita dei lattobacilli; il magnesio solfatoè inserito per motivi precauzionali poiché lo Yeast Extractd bb f i i à di i ffi i llnella temperatura di ebollizione. L acidità del terreno può

idrolizzare parzialmente l’agar.pH finale 6.8±0.2.ImpiegoIl terreno M17 è selettivo per l’identificazione diSterptococcus thermophilus.

MRS AGAR

dovrebbe fornire una quantità di magnesio sufficiente allacrescita dei lattobacilli. Per l'isolamento dei lattobacillioperare come segue: inserire 1 mi delle diluizioni decimalidel campione in piastre Petri e addizionare 10-15 ml diterreno, lasciar solidificare e addizionare un secondo stratodi MRS Agar non inoculato e incubare a 37°C per 3 giornio a 30°C per 5 giorni. Le colonie coltivate su MRS Agar ola crescita in MRS Broth devono essere sottoposte ai testsbiochimici per l'identificazione dei lattobacilli in MRSAesculin Broth, MRS Arginine Broth ed in MRSF t ti B thMRS AGAR

Formula (grammi per litro)Peptomeat 10.00Beef Extract 10.00Yeast Extract 5.00Glucose 20.00Dipotassium Phosphate 2.00

Fermentation Broth.

MUELLER HINTON MEDIUMFormula (grammi per litro)Beef, Infusion from 300.0Hydrolyzed Casein Bios A 17.5Starch 1 5

6odium Acetate 5.00Triammonium Citrate 2.00Magnesium Sulphate 0.20Manganous Sulphate 0.05Agar Bios LL 15.00

Starch 1.5Agar Bios LL 14.0

MUELLER HINTON BROTHFormula (grammi per litro)Biomeat 2.0Hy Casein Bios A 17.5

MRS BROTHFormula (grammi per litro)Peptomeat 10.00Beef Extract 10.00Yeast Extract 5.00Glucose 20.00Dipotassium Phosphate 2 00

Starch 1.5PreparazioneSciogliere 36 g di agar e 21 g di brodo in 1000 ml di acquadistillata fredda. Portare all'ebollizione sotto agitazionel'agar e scaldare fino a completa soluzione il brodo,distribuire ed autoclavare a 115°C per 10 minuti.Non superare il tempo e la temperatura di sterilizzazioneindicati.

85

Dipotassium Phosphate 2.006odium Acetate 5.00Triammonium Citrate 2.00Magnesium Sulphate 0.20Manganous Sulphate 0.05

indicati.pH finale 7.4±0.2.

ImpiegoMueller Hinton Medium e Broth sono terreni originariamentepreparati per l'isolamento dei meningococchi e deigonococchi e trovati indicati, dato i bassi livelli di acido p-aminobenzoico per il test di sensibilità ai sulfamidici.

NUTRIENT BROTHFormula (grammi per litro)Beef Extract 3Peptomeat 5

Mueller Hinton Medium è raccomandato da FDA per il test disensibilità agli antibiotici chemioterapici con il metododell'agar diffusione utilizzando dischi di carta da 6 mm adalta concentrazione.Mueller Hinton Medium è preparato con peptonirigorosamente selezionati, contenenti bassi livelli di agentiinibitori dei sulfamidici e del co-trimossazolo, tanto che èpossibile effettuare l'antibiogramma senza ricorrereall'utilizzo del sangue lisato di cavallo per neutralizzarel'azione della timidina antagonista del trimetoprim

PreparazioneSciogliere 23 g di agar e 8 g di brodo in 1000 ml di acquadistillata fredda. Portare ad ebollizione sotto agitazione,distribuire ed autoclavare a 121°C per 15 minuti.pH finale 6.8±0.2.ImpiegoNutrient Agar e Nutrient Broth sono terreni a base dipeptoni di carne utilizzati per la coltivazione deil azione della timidina antagonista del trimetoprim

nell'associazione trimetoprim-sulfametossazolo. Il contenutodi cationi bivalenti (Ca++, Mg++) del terreno è entrol'intervallo di valori suggerito da Reller e coll. (Ca++: 50-100mg/l; Mg++: 20-35 mg/l), cosicché gli aloni di inibizione daaminoglucosidi su Pseudomonas aeruginosa risultano entro ilrange raccomandato da ASM e riportati in tabella.Nell'esecuzione dell'antibiogramma secondo il metodo diBauer e coll. e raccomandato da FDA utilizzare il MuellerHinton Medium in piastre da 14 cm o da 10 cm, in strato di 4

peptoni di carne utilizzati per la coltivazione deimicrorganismi non particolarmente esigenti sotto il profilodelle richieste nutritive.Il Beef Extract e il Peptomeat forniscono una quantità dicarbonio, azoto e vitamine sufficienti per la crescita dellamaggior parte dei microrganismi non esigenti(enterobatteri, stafilococchi).L'APHA raccomanda l'uso di Nutrient Agar nell'esamemicrobiologico delle acque e dei prodotti lattiero caseari. It i i i ti b i

pmm (60 ml di terreno per piastre Ø 140 mm 25 ml per piastreØ 100 mm); addizionare sangue defibrinato di montone o dicavallo al 4-5% per eseguire l'antibiogramma su speciebatteriche particolarmente esigenti (streptococchi,pneumococchi) e utilizzare l'agar cioccolato con gli emofili.Per preparare l'inoculo sospendere 4-5 colonie coltivate suterreno primario d'isolamento in 4-5 ml di Tryptic Soy Brothe incubare per 2-6 ore fino a che la brodocoltura raggiunga lastessa densità dello standard opacimetrico preparatoaggiungendo a 99 5 ml di acido solforico 0 36 N 0 5 ml di

terreni possono essere impiegati come base a cuiaggiungere vari materiali quali carboidrati, sali, colorantiecc., per ottenere terreni selettivi, differenziali,d'arricchimento. Il Nutrient Agar e il Nutrient Broth, sonostati tra i primi terreni utilizzati in microbiologia e tuttorapossono essere usati di routine per l'esame a delle acque,degli alimenti, per preparare colture stock, per lacoltivazione preliminare di un campione da sottoporre asuccessivi esami batteriologici, per l'isolamento deimicrorganismi in coltura pura.

aggiungendo a 99.5 ml di acido solforico 0.36 N, 0.5 ml dibario cloruro 1 %. Entro 15 minuti dalla preparazionedell'inoculo immergere un tampone sterile nella brodocoltura,spremerlo contro le pareti della provetta per eliminarel'eccesso di liquido quindi strisciare sulla superficie dell'agarin piastra in modo da ottenere una dispersione uniformedell'inoculo.Lasciare asciugare le piastre quindi depositare i dischi di cartapremendoli sulla superficie dell'agar con la punta dell'ago;depositare un massimo di 5 dischi nelle piastre Ø 100 mm e

O/F HUGH LEIFSON BASEFormula (grammi per litro)Peptone Bios D 2.00Sodium Chloride 5.00Dipotassium Phosphate 0.30B th l Bl 0 03un massimo di 9 dischi nelle piastre Ø 140 mm in modo tale

che tra i dischi e il bordo della piastra vi siano non meno di 2cm. Incubare 18 ore a 35°C quindi leggere gli aloni diinibizione tenendo conto della zona completamente priva dicrescita microbica e con bordi netti. Essendo numerose levariabili del metodo dell'agar diffusione che giocano un ruolofondamentale per l'ottenimento di risultati precisi ed accurati(inoculo, strato dell'agar, temperatura di incubazione,contenuto dei dischi, etc.), è indispensabile stabilire unprogramma per il controllo di qualità del metodo. Per tale

i tili d i St h l

Bromthymol Blue 0.03Agar Bios LL 2.50PreparazioneSciogliere 9.8 g di polvere in 1000 ml di acqua distillatafredda. Portare ad ebollizione sotto agitazione, distribuireed autoclavare a 121°C per 15 minuti. Raffreddare a 50°Ced aggiungere sterilmente una soluzione del carboidratodesiderato (concentrazione finale 1-2% p/v) ovvero, perevitare la lunga preparazione delle soluzioni steriliscopo si utilizzano due ceppi: Staphylococcus aureus,

Escherichia coli; questi ceppi devono essere inseriti di routinenella procedura operativa, ogni volta che si eseguel'antibiogramma.

NUTRIENT AGARFormula (grammi per litro)Beef Extract 3

evitare la lunga preparazione delle soluzioni sterili,addizionare dischi di carta contenenti carboidrati.Inoculare due tubi e ricoprire uno di essi con olio divasellina sterile.pH finale 7.1±0.2.ImpiegoO/F Hugh Leifson Base preparato in accordo alla formulaproposta da Hugh e Leifson è un terreno a cui possono

i i i b id i l di d ll

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Peptomeat 5Agar Bios LL 15

essere aggiunti vari carboidrati per lo studio delleossidazioni e/o fermentazioni dei microrganismi.

Il terreno è usato per la differenziazione della flora intestinalenon enterica, Gram negativa dagli enterobatteri, per ladifferenziazione dei micrococchi e per la determinazione delmodello metabolico con cui vengono degradati gli zuccheridai microrganismi.L'utilizzo dei carboidrati da parte dei batteri può avvenire

Nelle tabelle sottostanti sono indicati i modelli di reazionesu O/F Hugh Leifson Base, e le caratteristiche colturali dialcuni microrganismi su detto terreno.

L utilizzo dei carboidrati da parte dei batteri può avveniresecondo due processi: fermentativo o ossidativo.Alcuni microrganismi sono capaci di utilizzare i carboidraticon produzione di acido solamente in condizioni aerobie, altriin condizioni sia aerobie che anaerobie (anaerobi facoltativi).La degradazione anaerobia dei carboidrati avviene attraversola via metabolica di Embden Meyerhof o attraverso unacombinazione di questa con lo « shunt » dei pentosi con lavia di Entner Doudoroff; tutte e tre le vie metabolicherichiedono la fosforilazione iniziale del glucosio, hanno come

d i di l' id i i i hi dprodotto intermedio l'acido piruvico, richiedono un compostoorganico come acettore ultimo di elettroni e conducono ametaboliti finali diversi essendo diverso il patrimonioenzimatico delle varie specie batteriche.La degradazione ossidativa del glucosio non richiede la suafosforilazione iniziale, ha come prodotto intermedio l'acidopiruvico e richiede l'ossigeno o un composto inorganico,come acettore finale di elettroni.L'O/F Medium Base, addizionato del carboidrato adatto,

di di i i d i b li i d i i

+ reazione positiva, acidificazione con viraggio al giallodell’indicatore- reazione negativa, nessun cambiamento di colore del

permette di distinguere tra i due processi metabolici descritti.Il terreno contiene il blu di bromotimolo come indicatore dipH; una variazione del pH del mezzo verso l'acidità, indottadalla degradazione del carboidrato aggiunto, fa virarel'indicatore da verde a giallo. Il permanere, dopol'incubazione, di una colorazione verde del terreno ol'apparizione di una colorazione blu, dovuta ad unatrasformazione alcalina del mezzo, indicano che il test ènegativo e che non vi è stata nessuna degradazione deicarboidrati

g ,mezzo

PEPTONE WATERFormula (grammi per litro)Peptone Bios D 10Sodium Chloride 5P icarboidrati.

Il terreno ha un basso contenuto di peptoni per evitare unaloro degradazione da parte dei microrganismi conmetabolismo ossidativo, che porterebbe alla formazione diprodotti finali di natura alcalina che potrebbero mascherarel'acidità del mezzo.O/F Hugh Leifson Base è un terreno semisolido; la presenzadell'agar a una concentrazione del 0.25% impedisce aiprodotti acidi formatisi di disperdersi verso la superficie conuna conseguente loro diluizione

PreparazioneSciogliere 15 g di polvere in 1000 ml di acqua distillatafredda. Riscaldare agitando, distribuire ed autoclavare a121°C per 15 minuti.Per studi sull'utilizzazione degli zuccheri aggiungere, primadella sterilizzazione, a 900 ml di terreno, 100 ml di unasoluzione acquosa allo 0.2% di un indicatore (porporabromocresolo, blu bromotimolo o rosso fenolo).Aggiungere alla base sterilizzata una soluzione sterile dellouna conseguente loro diluizione.

Il dipotassio fosfato è incorporato per promuovere lafermentazione dei carboidrati e per stabilizzare il pH delterreno, mentre il sodio cloruro stimola la crescita diBrucella.II glucosio è il carboidrato che più frequentemente vieneusato per il test O/F; Cowan e Steel comunque raccomandanodi usare, per la differenziazione dei microrganismi che nondegradano il glucosio, una batteria di zuccheri costituita daglucosio lattosio saccarosio maltosio

Aggiungere alla base sterilizzata una soluzione sterile dellozucchero desiderato e distribuire in tubi con campanellaoppure addizionare alle provette dischi di carta contenenticarboidrati.L'aggiunta di alcuni zuccheri può produrre unabbassamento del pH del terreno: in questo casoricorreggere il pH con NaOH 0.1 N sterile.pH finale 7.2±0.2.Impiegoglucosio, lattosio, saccarosio, maltosio.

Per l'esecuzione del test si inoculano due provette, contenentiil carboidrato alla concentrazione dell'1 %, per infissione diun ago caricato di una sospensione batterica. Dopo averricoperto una delle provette con olio di vasellina si incuba per48 ore o più a 37°C.I microrganismi con metabolismo ossidativo produrrannoun'acidificazione del mezzo, con viraggio dell'indicatore daverde a giallo, nella provetta aperta; i batteri con metabolismofermentati o prod rranno n'acidifica ione del terreno in

p egoPeptone Water, dato l'elevato contenuto in triptofano delPeptone Bios D, è particolarmente adatto come substratoper .la determinazione della produzione di indolo.La capacità di metabolizzare il triptofano con formazionedi indolo è caratteristica distintiva di alcune speciebatteriche; il test è perciò utile ai fini dell'identificazione eclassificazione dei microrganismi.Il tempo e la temperatura di incubazione variano a secondad ll i b i i l di i d l

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fermentativo produrranno un'acidificazione del terreno inentrambe le provette.Con il test O/F si può determinare anche la produzione di gasda parte dei microrganismi e la loro mobilità (crescita diffusaa partire dalla linea dell'inoculo).

della specie batterica in esame; la presenza di indolo puòessere rivelata con il reattivo di Kovacs o di Erlich.

Il metodo prescelto deve essere controllato con ceppi dicollezione: Escherichia coli indolo +, Enterobacteraerogenes indolo -.Seguendo la procedura descritta da Mackenzie, ICMSFsuggerisce l'uso di Peptone Water nel test di conferma deicoliformi fecali negli alimenti: trasferire un'ansata di crescita

Tali prove, che vanno sotto il nome generico di “prove difermentazione degli zuccheri“, anche se a volte vengonoeseguite su microrganismi a metabolismo prevalentementeossidativo e se fanno uso di carboidrati che non sono solozuccheri ma anche alcoli e glucosidi, consistono nelseminare il germe in esame, in coltura pura, in terreni

t ti i b id ticoliformi fecali negli alimenti: trasferire un ansata di crescitamicrobica dai tubi positivi di Mac Conkey Broth in provettedi Peptone Water e di Brilliant Green Bile Broth 2% eincubare a 44°C; eseguire il test dell'indolo sulla crescita di24 ore in Peptone Water e osservare lo sviluppo di gas inBrilliant Green Bile Broth 2% dopo 24 ore e 48 ore. Lecolture che a 44°C sono indolo positive e producono gas sonoda considerarsi coliformi di origine fecale. Peptone Water èanche utilizzato come base per lo studio della utilizzazionedegli zuccheri. Dopo l'aggiunta degli zuccheri incubare allatemperatura desiderata e osservare tutti i giorni per 7 giorni se

contenenti vari carboidrati.Phenol Red Agar Base e Broth, contengono il rosso fenolocome indicatore di pH che, da rosso, in terreno alcalino,diventa arancio in terreno neutro e giallo in terreno resoacido dall’attacco dei carboidrati da parte deimicrorganismi.Metodo in terreno solido con dischi di carta (Bios Discs)Dividere il terreno autoclavato in piastre sterili (Ø 14 mm),lasciar solidificare indi seminare in superficie il germe intemperatura desiderata e osservare tutti i giorni per 7 giorni se

vi è stata produzione di gas e/o di acido.

PHENOL RED AGAR BASEFormula (grammi per litro)Peptocomplex 11.000Sodium Chloride 5.000Ph l R d 0 025

lasciar solidificare indi seminare in superficie il germe inesame. Per ottenere risultati più rapidi e più netti ricorrerealla tecnica dell'agar-germi. Deporre i Bios Discs sullasuperficie dell'agar inoculato, facendo attenzione che sianoopportunamente distanziati e ben aderenti al terreno(seminare anche una piastra di controllo senza carboidrati)incubare a 37°C. La produzione di acido è segnalata da unalone di viraggio giallo attorno ai dischi.Metodo in terreno liquido con dischi di carta (Bios Discs)Nelle provette di Phenol Red Broth Base autoclavatePhenol Red 0.025

Agar Bios LL 15.000

PHENOL RED BROTH BASEFormula (grammi per litro)Peptomeat 10.000Beef Extract 3 000

Nelle provette di Phenol Red Broth Base autoclavate,introdurre sterilmente i Bios Discs e inoculare conun'ansata di crescita microbica. Seminare anche unaprovetta di controllo senza carboidrati e incubare a 37°C.La produzione di acido è segnalata dal viraggio al giallo delbrodo di coltura. Con entrambi i terreni la produzione diacido è rapida, è bene quindi eseguire letture frequenti, laprima dopo circa 4 ore. Dopo che si è osservata unareazione positiva scartare il tubo; prolungando infatti ilperiodo di incubazione si può assistere ad un'inversioneBeef Extract 3.000

Sodium Chloride 5:000Phenol Red 0.018

PreparazioneSciogliere 31 g di agar e 18 g di brodo in 1000 ml di acquadistillata fredda. Portare all'ebollizione sotto agitazione,distribuire in tubi da fermentazione il brodo in ragione di 3-4

p pdella reazione con viraggio dell'indicatore verso l'alcalinità.

TRIPTIC GLUCOSE EXTRACT AGARFormula (grammi per litro)Peptone Bios D 5Beef Extract 3Glucose 1distribuire in tubi da fermentazione il brodo in ragione di 3 4

ml per tubo, e in beuta l'agar, autoclavare a 121°C per 15minuti.Raffreddare a circa 50°C ed aggiungere con le precauzionidell'asepsi una soluzione sterilizzata per filtrazionedell'appropriato carboidrato, in modo che si ottenga unaconcentrazione finale dell'1-2% (p/v).Per evitare la lunga preparazione delle soluzioni sterili si puòaddizionare in provetta (brodo) o deporre sulla superficiedell'agar in piastra dischi di carta contenenti carboidrati

Glucose 1Agar Bios LL 15

TRIPTIC GLUCOSE YEAST AGAR (Plate countagar)Formula (grammi per litro)Peptone Bios D 5.0

dell agar in piastra, dischi di carta contenenti carboidratipH finale 7.4±0.1ImpiegoPhenol Red Agar Base e Broth Base sono terreni contenentiun indicatore di pH utilizzati per lo studio delle fermentazionidei carboidrati rispettivamente con il metodo in terreno solidoe con il metodo in terreno liquido. Phenol Red Broth Base èpreparato in accordo alla formula raccomandata da AOAC eda ICMSF per lo studio della fermentazione dei carboidrati

Yeast Extract 2.5Glucose 1.0Agar Bios LL 15.0PreparazioneSciogliere 24 g di Tryptic Glucose Extract Agar e 23.5 g diTryptic Glucose Yeast Agar in 1000 ml di acqua distillatafredda. Portare all'ebollizione sotto agitazione, distribuireed autoclavare a 121°C per 15 minuti

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pcon il metodo preparato da “International Committe onEnterobacteriaceae"; Phenol Red Agar Base è preparato inaccordo alla formula raccomandata da APHA.Per l'identificazione e la classificazione delle speciebatteriche si fa spesso ricorso a prove biochimiche che nestudiano il metabolismo glucidico.

ed autoclavare a 121 C per 15 minuti.pH finale 7.0±0,2.

ImpiegoTryptic Glucose Extract Agar e Tryptic Glucose Yeast Agarsono terreni d'uso generale raccomandati da APHA, ICMSF,AOAC per il conteggio dei microrganismi con la tecnicadell'agar germi, utilizzato in passato per la conta microbicatotale nel latte e prodotti lattiero caseari Tryptic Glucose

Per le loro caratteristiche nutrizionali; per l'assenza diinibitori, per la possibilità di essere supplementati con icomposti più svariati, i due terreni si prestano bene perl'isolamento dei patogeni, per lo studio dei microrganismi acrescita fastidiosa, per il mantenimento dei ceppi dicollezione, per la preparazione di autovaccini, perl' i d ll' tibitotale nel latte e prodotti lattiero caseari, Tryptic Glucose

Extract Agar è ora raccomandato da APHA insieme alTryptic Glucose Yeast Agar, solo per il conteggio deimicrorganismi nelle acque e negli alimenti, Tryptic GlucoseYeast Agar, corrispondente al Plate Count Agar (StandardMethods Agar) di APHA, AOAC, ICMSF, è il terrenod'elezione per il conteggio dei microrganismi aerobi e diquelli anaerobi facoltativi eterotrofi, nell'acqua, latte, prodottilattiero caseari, alimenti.Lo schema di lavoro da seguire per effettuare la conta

i bi i i di i l d il iù

l'esecuzione dell'antibiogramma.Il sangue è l'additivo più comune per il Tryptic Soy Agar eviene aggiunto a concentrazioni variabili tra il 5 e i115%come sangue defibrinato (di coniglio, cavallo, montone,uomo).In alcuni casi (isolamento di Neisseria e di Haemophilus) ilsangue viene aggiunto come tale al terreno e poi riscaldatoa 80°C per 10 minuti ottenendo così l'agar cioccolato.Tryptic Soy Agar è comunemente usato per il conteggio deimicrobica su ciascun tipo di materiale deve essere il più

possibile conforme a quanto raccomandato dagli organismiufficiali citati. Il metodo dell'APHA consiste nel prepararediverse diluizioni del campione in esame; a 1 ml di ciascunadiluizione in piastre Petri viene aggiunto in duplicato uno deidue terreni al 44-46°C. Dopo aver mescolato l'inoculo conagar si incuba per 48 ore a 32-35°C e quindi si contano lecolonie coltivate, in quelle piastre in cui siano presenti da 30a 300 colonie. Per il conteggio di microrganismi cherichiedono altre temperature di crescita si incuba a 5-7°C per10 giorni a 20°C per 3 5 giorni e a 45°C per 2 3 giorni

Tryptic Soy Agar è comunemente usato per il conteggio deigermi presenti nelle urine e negli espettorati ed inmicrobiologia alimentare per la conta dei microrganismipresenti nel latte, carni, alimenti conservati, ecc.Tryptic Soy Broth è utilizzato per la coltivazione dimicrorganismi aerobi, aerobi facoltativi, inclusi alcunifunghi e, aggiunto d'agar a concentrazioni 0.1-0.2% per lacoltivazione degli anerobi obbligati.

10 giorni a 20°C per 3-5 giorni e a 45°C per 2-3 giorni.

TRYPTIC SOY AGARFormula (grammi per litro)Tryptic Casein Bios D 15Soy Peptone 5SQdium Chlbride 5SQdium Chlbride 5Agar'Bios LL 15

TRYPTIC SOY BROTHFormula (grammi per litro)Tryptic C~sein Bios D 17.0Soy PeptoÌle 3.0Sodium Ch.foride 5.0Dipotassium Phosphate 2.5Glucose 2.5

PreparazioneSciogliere 40 g di agar e 30 g di brodo in 1000 ml di acquadistillata fredda Portare all'ebollizione sotto agitazionedistillata fredda. Portare all ebollizione sotto agitazione,distribuire e autoclavare a 121°C per 15 minuti.pH finale 7.3±0.2.ImpiegoTryptic Soy Agar e Tryptic Soy Broth sono terreni d'usogenerale che supportano la crescita di una larga varietà dimicrorganismi.

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quaderno di laboratorio

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