qualify ubiquitin-proteasome - presentation before phd thesis
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17/06/2009 Presentation Qualis A - Qualificação para Doutorado Biofísica IBCCF. O objetivo do exame de qualificação é avaliar a capacidade do aluno de selecionar conteúdo com base na relevância, organizá-lo, sintetizá-lo e apresentá-lo com clareza nos conceitos, concisão, coerência, coesão e objetividade. O tema escolhidos deve ser, obrigatoriamente, fora do tema da tese do aluno. Qualify ubiquitin - Presentation before PhD thesys - AIM: endereçamento e exportação de proteinas para degradação, ubiquitin-proteasome pathways signaling, proteasome, ubiquitin, via ubiquitina-proteassomaTRANSCRIPT
Exame de Qualificação para o Título de DoutoradoQualis A – UFRJ – IBCCF
Apresentado em 17/06/2009
Via Ubiquitina-proteassoma: exportação, endereçamento e métodos de determinação da
estrutura proteica
Roberta Alvares CamposIBCCF – UFRJ
Proteólise intracelular
Sumário dos Sistemas Proteolíticos Intracelulares
Sistema Localização Especificidade/Substrato/Função
Lisossomo Citoplasma Degradação intracelular de proteínas por endocitose.
Ubiquitina-proteassoma (UPS)
Citoplasma, Núcleo, Compartimentos
Ação sobre muitas proteínas intracelulares, bem como degrada a maioria das proteínas danificadas/unfolding. Via dependente de ATP.
Via dependente Cálcio - Calpaínas
Citoplasma Degrada proteínas do citoesqueleto.
Cascata das Caspases
CitoplasmaRelacionadas a apoptose celular e com as vias de resposta do sistema imune/citocinas/TNFs. São reguladas pos-traducionalmente.
Proteinases Mitocondriais
MitocôndriasDegradam proteínas mitocondriais oxidadas. Degradação parcial de proteínas para importação do citoplasma para mitocôndria e vice-versa (dependente de UPS).
Proteinases de Membranas
Retículo Endoplasmático (ER), Membrana plasmática e Mitocôndria
Degradação parcial de proteínas secretadas, endocitadas e importadas. Degradação de proteínas defeituosas, recém sintetizadas.
Modificado de: Donohue, TM Jr & Osna NA. Alcohol Res. Health, 2004: 27(4).
• REGULADORES DO CICLO CELULAR: proteínas que são ubiquitinadas e endereçadas para
proteólise cumprem um papel essencial para as células que fazem parte de vias regulatórias. Ex.
ubiquitinação das ciclinas durante a fase G1 da mitose.
• PROMOVE FATORES PARA LINFÓCITOS: estimulando a diferenciação dos linfócitos B e T.
• EXPORTAÇÃO E IMPORTAÇÃO PROTEÍNAS: intracelularmente. Ex. Monoamina oxidase A e B,
dependentes de ATP e que são associadas com outras proteínas de membranas para entrar e sair de
mitocondrias.
• HEAT SCHOCK PROTEINS: como resposta rápida ao aumento de temperatura, observa-se um
aumentando da expressão gênica de ubiquitinas, promovendo um aumento na degradação de
proteínas que perderam a conformação e que não voltaram a sua conformação funcional, mesmo
com a assitencia ou não das chaperonas, evitando oxidação celular.
• FATORES PARA COMPONENTES NEURONAIS: a via tem funções importantes para degradação de
proteínas que perderam a sua conformação e/ou formação de agregados (fibras) no sistama nervoso
central. Principalmente de pessoas cometidas por doenças neurodegenarativas como Alzheimer,
Parkinson, Machado-Joseph, Síndrome de Rett, Doença de Huntington, entre outras.
Funções Biológicas específicas : Via Ubiquitina-proteassoma
Funções Biológicas específicas : Via Ubiquitina-proteassoma
• APARATO IMUNITÁRIO: ubiquitinação de proteínas como resposta imune-primária.
• REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA DE HISTONAS H2A: mono-ubiquitinação de regiões
transcritas sendo desviadas do endereçamento para proteólise, sugere que a ubiquitina pode
influenciar na expressão gênica.
• MANUTENÇÃO DA ESTRUTURA DA CROMATINA: histonas H2A que são mono-ubiquitiniladas, e
não proteolisadas, sugerindo que a ubiquitina pode ter influência na conformação da cromatina.
• ATUAÇÃO EM IMUNOFILINAS: ubiquitina atua em ligações com FK506 e rapamicinas
promovendo uma ação inibitória da fosfatase calcineurina (proteína que se liga ao cálcio e a
calmodulina do SNC). Recentemente, mostrou-se que a calcineurina desfosforila várias
fosfoproteínas, incluindo histonas, cadeia leve da miosina e a subunidade reguladora da proteína
quinase dependente de cAMP.
•IMUNOMODULADORA – alguns estudos noticiaram que fragmentos de ubiquitina podem trabalhar do lado
de fora das célula, especialmente os resíduos 51-59, como biopolímeros, podem diminuir uma resposta
imune humoral e celular. Alguns análogos da ubiquitina podem ser comparáveis a ciclosporina A ou
FK506, usados como drogas imunosuppressoras para pessoas transplantadas.
•BIOGÊNESE DE RIBOSSOMOS – ubiquitina é expressada frequentemente em células como copia única
fusionadas a algumas proteínas rbossomais, como L40 ou S27A. Após a tradução as proteínas fusionadas
são clivadas da ubiquitina.
• REPARO DE DNA – genes implicados nas respostas ao estresse genotóxico relacionado ao sistema do
retículo endoplasmático (ERAD) têm funções ligadas a via ubiquitina-proteassoma e com UPR (unfolded
protein response). Vlachostergios PJ, Patrikidou A, Daliani DD, Papandreou CN. 2009. The Ubiquitin-Proteasome
System in cancer, a major player in DNA Repair. Part 1: Post-translational regulation. J Cell Mol Med.
Funções Biológicas específicas : Via Ubiquitina-proteassoma
Via Ubiquitina-proteassomaFunção Biológica GERAL
• Ubiquitinação de proteínas e endereçamento para degradação no
proteassoma.
30% das proteínas recém-sintetizadas de uma
célula sofrem regulação proteolítica pela via da
ubiquitina-proteassoma, por serem reprovadas
pelo rigoroso controle de qualidade intracelular.
Essa via é “balanceada” pela presença de
chaperonas do citoplasma e do núcleo, pois
muitas proteínas precisam do unfolding/folding
protéico para exercer as suas funções dentro da
célula, antes que sejam marcadas e
endereçadas a degradação.
Cam Patterson (2006). Search and destroy:
the role of protein quality control in maintaining
cardiac function. Editorial. JMCC (40).
A molécula da Ubiquitina
76 aminoácidos de 85 kDa
Conservada nos eucariotos (difere no máximo em 4 aa).
Presente no citosol, núcleo e demais compartimentos.
Grande tolerância a mudanças de pH e temperatura.
Podem se ligar formando cadeias
poliubiquitinas (ligação ocorre entre os
resíduos Gly76 + Lys48, podendo ocorrer mais
de uma vez formando di-tri-tetraubiquitinas.
(Kim JH et al, 2003).
É sintetizada diretamente pelos ribossomos.
Enzimas – Ubiquitinação Quatro enzimas são necessárias para a ubiquitinação:
E1 - enzima ativadora da ubiquitina
E2 - enzima conjugadora da ubiquitina
E3 - ubiquitina ligase (mais específica/substrato)
E4/E3 - coopera com a E3 para extender a cadeia de poliubiquitina (mais rara).
Enzimas - Ubiquitinação
E1 – enzima ATIVADORA da ubiquitina
• O enzima E1 é codificada por um único Gene.
Sua deleção provoca inviabilidade celular, embora em mamíferos sejam conhecidas duas
isoformas, E1a e E1b, que resultam da iniciação da tradução em dois locais diferentes.
• O primeiro passo de ubiquitinação envolve a formação de um adenilato de ubiquitina
intermediário (concomitante hidrólise de ATP) e a transferência da ubiquitina ativada para o
grupo tiol da cisteína do centro ativo do enzima E1 (com a libertação de AMP).
• Cada enzima E1 pode no máximo transportar duas moléculas de ubiquitina, uma como tiol-
éster e outra como adenilato.
• A ubiquitina ativada é transferida para a cisteína do centro ativo de E2.
Enzimas - Ubiquitinação E2 – enzima CONJUGADORA da ubiquitina
• Ao contrário de E1, cada célula contém muitas enzimas E2. Em Saccharomyces são 11 capazes
de transportar ubiquitina, enquanto que em mamífero são conhecidas mais de 30.
• Possuem um domínio muito conservado (UBC – ubiquitin conjugation) com cerca de 150
resíduos de aminoácidos contendo uma cisteína que é o centro aceptor da ubiquitina
ativada por E1.
• As diferenças situam-se nas regiões dos terminais N e C, podendo alguns casos existirem
inserções no domínio UBC.
• Estas sequências estão envolvidas na interação com os enzimas E3.
Enzimas - Ubiquitinação
E3 – ligases de ubiquitina
• Enquanto que os enzimas E2 têm grande semelhança nas suas sequências e estruturas, os enzimas E3
são pouco semelhantes entre si, em parte porque estes são responsáveis pelo reconhecimento de sinais
de destruição nas proteínas/substrato.
• Existem duas classes distintas de E3.
• A primeira classe é caracterizada por ter um domínio designado HECT (homologous to the E6-AP
protein C-terminus). A proteína E6-AP foi a primeira ligase identificada desta classe e foi descoberta por
participar na degradação da proteína supressora de tumores P53 ao interagir com a proteína E6 do
papilomavírus humano. O domínio HECT é constituído por 80 resíduos de aminoácidos e inclui a
cisteína do centro ativo que forma uma ligação tiol com a ubiquitina.
• A segunda classe de E3 é definida pela existência de um domínio RING finger, assim designado porque
o gene que codifica a primeira proteína descrita contendo este domínio tem o nome de "really
interesting gene 1". O domínio RING finger possui a capacidade de quelar dois Íons de zinco, através
dos seus 8 locais de coordenação constituídos por histidinas e cisteínas, e medeia interações com as
proteínas E2.
E3 – ligases de ubiquitina
• As proteínas E3 pertencentes a última classe facilitam a transferência direta de ubiquitina de enzimas E2
para os substratos sem o envolvimento de um intermediário tiol-éster E3-Ub, como acontece com as E3
do tipo HECT. Encontram-se nesta situação UBL ligases envolvidas no ciclo celular como os complexos
APC (anaphase promoting complex), uma E3 constituída por várias subunidades que permite a
progressão do ciclo de divisão celular em vários pontos) e SCF-RING (E3 constituída por Skp1/Skp2,
Culina, uma subunidade variável com um domínio designado por proteínas F-box ou SOCS). Acumulando
evidencias que indicam a adicional modulação de fatores da proteólise sobre os substratos poli ou
monoubiquiotinados. Pines J & Lindon C. 2005. Proteolysis: anytime, any place anywhere? (Perspective).
Nature Cell Biol.: 8(7).
Enzimas - Ubiquitinação
Diferentes vias /funções UPS
a) Proteassoma dependente da
degradação de proteínas para
síntese de “novo”;
b) Mono ou oligoubiquitinação
(dependente de enzimas
regulatórias da via) para
endereçamento ao endossomo ou
lisossomo.
c) Monoubiquitinação endereçando a
proteína do citosol para o interior
do núcleo. Essa via é dependente
de chaperonas nucleares HSP60
que mantém o folding protéico
após a sua entrada.
d) Modificação simples feita pela
enzima UBL (E3) na proteína,
como a SUMO, pode endereçar
tanto para proteínas do poro de
membrana (NPC) como para o
interior do núcleo.
e) Poliubiqutinação de proteínas,
endereçando proteínas para o
núcleo, como a Proteína Y, que
pode regular fatores
transcricionais, direta ou
indiretamente.
Proteassoma: o coadjuvante da via UPS
A degradação de proteínas
• As proteínas multi-ubiquitiniladas são degradadas pelo proteassoma 26S.
• É uma protease multimérica dependente de ATP com 2000 kDa, constituída por dois
complexos regulatórios 19S (α) e por um complexos catalítico de 700 kDa, designado
por proteassoma 20S (β). Este ultimo pode apresentar diferentes composições e
rearranjos proteolíticas, conforme a espécie. Está presente desde arqueobactérias
até os mamíferos.
Função de ligação e reconhecimento da Ubiquitina = 19S• O proteassoma 19S faz a parte de reconhecimento de proteínas somente
ubiquitinadas.
• Desenrrolameno protéico.
• Translocação para o interior da câmara catalítica 20S.
Função catalíticas do proteassoma = 20S• O proteassoma 20S faz a parte de reconhecimento de proteínas somente
ubiquitinadas.
• Está disposto em forma de cilindro complexo, com 2 tipos de subunidades α e
β formando um heptâmero com centro catalítico internalizado com 3 funções
catalíticas diferentes:
1. ATIVIDADE PÓS-ACÍDICA (clivagem de ligação peptídica após resíduo
ácido);
2. ATIVIDADE TRÍPTICA (clivagem após um resíduo básico);
3. ATIVIDADE QUIMOTRÍPTICA (clivagem após resíduo hidrofóbico).
Especificidade do Proteassoma
Especificidade do Proteassoma
Alfred L. Goldberg. On Prions, Proteasomes, and Mad Cows.N Engl J Med. 2007 Sep 13; 357(11).