quelques conseils pratiques: préparation des biopsies conditionnement pour l’envoi des...
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Quelques conseils pratiques:Préparation des biopsies
Conditionnement pour l’envoi des échantillons
Nathalie Quellard, Sihem Kaaki, Corinne Lacombe, Julie Godet
Service d’Anatomie et Cytologie PathologiquesUnité de Pathologie Ultrastructurale,CHU Poitiers
Paris, 16 janvier 2015
Centre de référence Amylose AL et autres maladies par dépôts d’Ig monoclonales
Interprétation fiable et rigoureuse
Diagnostic assuré
Mise en place d’un traitement
Techniques coûteuses
Intérêt d’une bonne préparation
Réalisation des biopsies
• Prélèvement au lit du patient
- Microscopie optique: Duboscq Brazil
- Immunofluorescence: Azote liquide
- Microscopie électronique
Glutaraldéhyde
Plonger le plus rapidement possible les fragments biopsiques dans les liquides de conservation
Microscopie photoniqueService AnaPath
Rouge congo5µm
Lumière polarisée
HES3µm
• Fixation
- Duboscq Brazil (éthanol, ac.acétique, formol, ac.picrique)
- 6-8H à 20°C ou 24H à 4°C
- Conservation formol tamponné 10%
Topographie générale des dépôts Détection des dépôts amyloïdes
• Coloration
• Mauvais rendement sur bloc paraffinéPrélèvement congelé
Typage des dépôts: Immunofluorescence
Système révélateur
Anticorps primaire
Antigène
Echantillon
Epitope
Vaste gamme d’anticorps:IgG, IgA, IgM, kappa, lambda, ss-classes IgG,TTR, SAA…
Plonger rapidement dans l’azote liquide
Cryotube + support carton Support de congélation + cryocolle
Biopsie de graisse sous cutanée
• Rappels:
- Possibilité de transport en sérum physiologique à 4 °C
- Si rouge Congo réalisé au labo:
Coupes de 7 µm d’épaisseur ( Rouge Congo et IF)
Ne jamais fixer les prélèvements en acétone
Microscopie électronique(Unité de Pathologie Ultrastructurale et Expérimentale
Service Anatomie et Cytologie pathologiques )
• Localisation précise
• Organisation
• Diamètre et structure des fibrilles (amyloïdes ou microtubulaires)
• 2 possibilités:
Prélèvement Fixation
InclusionPrélèvement Fixation
Bonne qualité de l’échantillon Fiabilité de l’interprétation
Vide pousséImpact électronique Nécessité d’une bonne fixation
• Morphologie et structure préservées
• Pas de destruction irréversible
• Processus enzymatiques immobilisés
Autolyse dès 1ères sec après exérèse
La fixation doit être réalisée rapidement après exérèse
Fixation
• Fixation physique: Cryofixation
- Congélation rapide dans l’azote liquide
Comment fixer?
Conservation à -80°C jusqu’à l’envoi en carboglace
• Fixation chimique : glutaraldéhyde 2-4%
- Réticulation du gel protéique
- Inhibition de l’autolyse
Immersion rapide dans le fixateur
Découpe dans le fixateur
Fragment < 2 mm3
Conservation dans le fixateur à 4°C et min 1H
Comment fixer?
Fixateur utilisé en ME
Il est très important d'utiliser un glutaraldéhyde "EM grade"Composé uniquement de monomères, les seuls de taille suffisamment réduite pour pénétrer rapidement le tissu (les autres formules sont destinées à tanner le cuir !)
• Glutaraldéhyde: COH(CH2)3COH
- 2 aldéhydes libres autour d'une chaîne carbonée aliphatique
- Ponts méthylène entre fonction amine des protéines et aldéhyde
- Fixation rapide mais pénétration lente (1mm/h)
- Fixation +++protéines, chromatine, acides nucléiques
Préparation du fixateur
• Protocole de préparation sur le site du CR: www.cr.amylose-al.fr
- Respect du milieu intérieur cellulaire:
Composition de la solution contenant le fixateur:
-Osmolarité (saccharose, NaCl)
-pH ( tamp. phosphate, tamp.cacodylate)
- Concentration : entre 2 et 4%
- Quantité: 10 fois le volume des pièces à traiter
- Volume des pièces à fixer : 1 à 2 mm3
- Température de fixation : 4°C 1H minimum
- Qualité du fixateur : date de péremptionRapidité de la fixation
Délai entre l’exérèse et la fixation < 30 secondes
La solution fixatrice doit être osmotiquement équilibrée par rapport au milieu cellulaire du tissu étudié
Effet de la pression osmotique dans le tampon de préparation des fixateurs
Solution hypertonique
Solution hypotonique
Bonne fixation Fixation tardive
Mauvaise congélation
MO
Pb osmolarité
Séjour prolongé dans le tampon
mitochondrie
noyau
Fixation tardive
8nm
• Conservation une quinzaine de jours à 4°C dans le glutaraldéhyde
Sans altérations ultrastructurales (pas de surfixation)
Envoi du fixateur possible par courrier avant biopsie
Disposition de la biopsie dans le moule
Biopsie perpendiculaire à l’axe de coupe
Axe de coupe
Inclusion
• Permet la confection de coupes ultrafines (50-80nm)
Faible pouvoir de pénétration des électrons dans la matière
• Evite toute évolution du tissu sous l’action des électrons
• Biopsie fixée au glutaraldéhyde:
-Envoi dans cryotube rempli de fixateur envoi à 4°C
• Biopsie congelée:
- Envoi en carboglace
Conditionnement des biopsies pour l’envoi
Mettre suffisamment de carboglace
Eviter le week-end
Eviter le colissimo
www.cr.amylose-al.fr