肝癌作为世界上的一种恶性肿瘤，其发病率和死亡率高，严重危害了人类健康［1］。 据统计，在恶性肿瘤中， 我国肝癌患者每年的病死率居第二位 ［2］。临床上， 肝癌的主要治疗方法是手术以及放化疗，但是在接受了手术治疗后，还有 50%以上的患者会发生肿瘤的复发及转移，同时，虽然化疗对肿瘤的发展能够有效的控制，但化疗明显降低了患者的生存质量及其产生的如胃肠道不适、骨髓抑制、脱发等毒副作用不可小觑 ［3］。 因此，现代医学治疗肝癌的局限性使得开发疗效确切、毒副作用小的抗肿瘤药物成为了当今国内外研究的重点。 本研究通过体外培养肝癌细胞观察复方白花蛇舌草（hedyotis dif-fusa willd formula，HDWF）对肝癌细胞增殖的抑制作用及对肝癌细胞凋亡的诱导作用，为其临床治疗肿瘤提供理论根据。1 材料与仪器1.1 药物与细胞株 复方白花蛇舌草生药材购自福建中医药大学附属第三人民医院；肝癌细胞株（Bel-7402、SK-Hep-1）购自南京凯基生物科技发展有限公司。1.2 试剂与材料 DMEM、RPMI 1640 培养基、双抗（青霉素、链霉素）、胎牛血清 （FBS）、0.25%胰蛋白酶 （trypsin）、二甲亚砜 （DMSO）购自美国 Gibco公司；四甲基偶氮唑蓝（MTT）干粉（北京索莱宝科技有限公司）；磷酸盐缓冲液（PBS，美国 Hyclone 公司）；Annexin V ／ PI 染色试剂盒（南京凯基生物技术

发展有限公司）。1.3 实验仪器 超净工作台（苏州净化设备公司）；CO2培养箱、－80 ℃超低温冰箱（美国 Thermo 公司）；倒置显微镜系统（德国 Leica 仪器有限公司）；形态学显微图像分析系统 LAS V4.1 Countes誖全自动细胞计数仪（美国 Life 公司）。2 实验方法2.1 复方白花蛇舌草乙醇提取物的制备 取 HD-WF（白花蛇舌草、半枝莲、炙黄芪、炒麦芽各 125 g）加入 70%乙醇 5 kg，浸泡 30 min，加热回流提取 1h，滤过；药渣加入 70%乙醇 5 kg，再加热回流提取1 h，滤过 ；合并滤液 ，减压 （-0.09 MPa、50 ℃）浓缩至稠膏 15 g，减压 （-0.09 MPa、50 ℃）干燥 ，粉碎，得干粉约 90 g。 先用 PBS 配成 200 mg ／ mL，放入-20 ℃ 贮存备用；超声 30 min 助融，用 0.45 μm过滤器过滤，再用培养基配成所需要的浓度。2.2 细胞培养 将肝癌细胞株 Bel -7402、SK -Hep-1 分别置于含 10％灭活 FBS、100 U ／mL 青霉素和 100 μg ／mL 链霉素的 DMEM 和 RPMI 1 640 完全培养基中，置于 37 ℃、5％ CO2 和饱和湿度的细胞培养箱中培养。 细胞单层贴壁生长，当汇合度至80％～90％时 ，加入 1 mL 的胰蛋白酶 （含 0.25％EDTA）消化后，加入 2 mL 完全培养基中和以终止消化，1 000 转 ／min 离心 3 min，弃上清，收集沉淀细胞，用完全培养基重悬制成新细胞悬液后传代。2.3 MTT 法检测细胞增殖 取对数生长期的Bel-7402 和 SK-Hep-1 肝癌细胞，接种于 96 孔培养板中，调整细胞密度为 1×105 个 ／mL，每孔 100 μL，置37℃、5% CO2培养箱中培养。 当细胞汇合度达到50%～60%时，弃掉原培养基，分别加入含有不同浓度 HDWF（终浓度分别为 0.0、0.5、1.0、1.5 mg ／mL）

复方白花蛇舌草对肝癌细胞增殖和凋亡的影响杨 弘 1，靳祎祎 1，林露敏 2，林 珊 1，3，魏丽慧 1，3，林久茂 1，3

（1.福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州 350122；2.福建中医药大学中医学院，福建 福州 350122；3.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建 福州 350122）

摘 要： 目的 探讨复方白花蛇舌草（HDWF）抑制肝癌细胞增殖及诱导细胞凋亡的作用。 方法 体外培养人肝癌细胞 Bel-7402 和 SK-Hep-1，用不同浓度的 HDWF 干预，采用 MTT 法检测肝癌细胞的活力，计算 HD-WF 对细胞增殖的抑制率。 采用倒置显微镜观察肝癌细胞形态，细胞计数仪计算肝癌细胞数，集落形成实验观察肝癌细胞的集落形成能力，Annexin-V ／ PI 染色实验检测肝癌细胞凋亡情况。 结果 MTT 法检测结果显示 HDWF对抑制肝癌细胞增殖有显著抑制作用（P＜0.01），形态观察和细胞计数显示 HDWF 可减少肝癌细胞的密度及细胞数量，HDWF 可显著抑制肝癌细胞的集落形成及促进肝癌细胞凋亡（P＜0.05）。 结论 HDWF 具有抑制肝癌细胞增殖和诱导肝癌细胞凋亡的作用。

关键词：肝癌；细胞增殖；细胞凋亡；复方白花蛇舌草中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1000-338X（2018）04-0064-04

收稿日期：2018-05-05基金项目：福建省中医药科研课题 （2017FJZYZY203）；福建省卫生

计生委中青年骨干人才培养项目（2016-ZQN-67）作者简介：杨弘（1993—），女，硕士研究生，主要从事中西医结合抗

肿瘤的机制研究。通讯作者：林久茂（1975—），男，医学博士，副研究员，硕士生导师。

E-mail：jiumaolin@hotmail.com

·博硕园地·

福建中医药 2018年 7月 第 49卷 第 4期Fujian Journal of TCM July 2018，49 （4）64

DOI:10.13260/j.cnki.jfjtcm.011674

注：与对照组比较，1） P＜0.01。

表 2 HDWF 对 Bel-7402、SK-Hep-1细胞数的影响（x±s）

浓度 ／ （mg ／mL）0.0

0.51.01.5

Bel-74021.36±0.39

1.19±0.451）

0.75±0.321）

0.59±0.141）

SK-Hep-11.12±0.36

0.96±0.431）

0.73±0.111）

0.42±0.241）

×106个

组 别对照组

实验组

n3

3

注：与对照组比较，1） P＜0.01。

48 h0.00±2.67

11.50±3.211）

76.50±2.301）

81.00±1.161）

表 1 HDWF 对 Bel-7402、SK-Hep-1 抑制率比较（x±s）

浓度 ／ （mg ／mL）

0.0

0.51.01.5

24 h0.00±1.16

19.19±6.101）

28.40±3.391）

60.14±2.081）

48 h0.00±3.21

12.38±4.621）

46.08±5.801）

82.26±2.511）

24 h0.00±3.07

4.60±2.901）

62.20±3.311）

74.10±1.051）

％

组 别

对照组

实验组

n

8

8

Bel-7402 抑制率 SK-Hep-1 抑制率

的培养基，每孔 100 μL，分别干预 24 h 和 48 h 后吸弃各孔溶液，每孔加入 0.5 mg ／mL 的 MTT 溶液100 μL，37 ℃孵育 4 h 后吸弃各孔中的液体， 加入DMSO 100 μL ／孔，室温静置 10 min，充分振荡混匀，使结晶柴充分溶解并混匀。 采用全自动酶标仪于570 nm 波长处测定各组吸光度值（A 值），并计算细胞生长抑制率。

细胞生长抑制率 ／%＝（1－实验组 A 值 ／对照组 A 值）×100%。2.4 细胞形态观察与计数 将对数生长期的 Bel-7402 和 SK-Hep-1 肝癌细胞按 2.5×105个 ／孔的密度接种于 6 孔板中，于细胞培养箱中培养过夜，待细胞汇合度达到 60%时， 用不同浓度 HDWF（0.0、0.5、1.0、1.5 mg ／mL）干预 24 h，在倒置显微镜下观察细胞形态变化并拍照记录。 拍照后细胞予消化、中和、离心、重悬处理，台盼蓝染色，于 Countes誖全自动细胞计数仪对两株细胞进行计数分析。2.5 细胞集落形成能力分析 Bel-7402 和 SK-Hep-1 肝癌细胞以 2.5×105 个 ／孔接种于 6 孔板，置于 37 ℃细胞培养箱中培养过夜，待细胞汇合度达到50%～60%时 ，加入不同浓度 HDWF（0.0、0.5、1.0、1.5 mg ／mL）干预 24 h。 吸弃培养液，用 1 mLPBS 清洗，经过消化、中和、离心、重悬操作，将细胞按 500 个细胞 ／孔接种于 12 孔板中，2～3 d 换液，且换液前于倒置显微镜下观察细胞状态，连续培养7～10 d 后，当培养板孔中出现肉眼可见克隆时，停

止培养。吸弃上清，用 PBS 清洗 2～3 次，加入 4%多聚甲醛固定 15 min，用 PBS 清洗 3 遍，最后加入结晶紫染色液染色 20 min 后用超纯水清洗 4～5 遍，相机拍照观察细胞集落形成情况。2.6 Annexin-V ／ PI 染色检测细胞凋亡 Bel-7402和 SK-Hep-1 肝癌细胞以 2.5×105 个 ／孔接种于 6孔板，置于 37 ℃细胞培养箱中培养过夜，待细胞汇合度达到 50%～60%时，加入不同浓度 HDWF（0.0、0.5、1.0、1.5 mg ／mL）干预 24 h 后，收集细胞；然后加入 Annexin V ／ FITC 和 PI 各 5 μL，避光染色 15min 后，流式细胞仪检测细胞早期凋亡、晚期凋亡及总凋亡情况。2.7 统计学处理 采用 SPSS 22.0 统计软件进行数据处理。 计量资料符合正态分布以（x±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，组间比较采用 t检验。3 结 果3.1 HDWF 对 Bel-7402、SK-Hep-1 肝癌细胞生长抑制的影响 MTT 检测结果显示： 随着 HDWF 浓度的升高，Bel-7402 和 SK-Hep-1 肝癌细胞的生长明显被抑制，具有明显的剂量依赖和时间依赖作用，与对照组（0 mg ／mL）比较差异均有非常显著性（P＜0.01）。 台盼蓝染色计数结果显示：肝癌细胞Bel-7402和 SK-Hep-1经 HDWF干预 24 h后，细胞数量显著减少，与对照组比较具有非常显著性（P＜0.01）。 见表 1、表 2。

3.2 HDWF 对 Bel-7402、SK-Hep-1 肝癌细胞形态的影响 倒置显微镜观察结果显示：肝癌细胞 Bel-7402 和 SK-Hep-1 经不同浓度的 HDWF 干预 24 h后， 随着药物浓度的增加，Bel-7402 和 SK-Hep-1细胞密度逐渐减少，悬浮细胞增多，部分细胞皱缩

变圆。 该结果进一步证实 HDWF对 Bel-7402和SK-Hep-1 细胞生长具有显著的抑制作用，并呈明显的剂量效应，见图 1。3.3 HDWF 对 Bel-7402、SK-Hep-1 肝癌细胞集落形成能力的影响 集落形成实验结果显示：HDWF对肝癌细胞 Bel-7402 和 SK-Hep-1 的集落形成能力有明显的抑制作用，具有一定的剂量依赖性。 该结果也进一步证实了 HDWF 具有显著抑制肝癌细胞 Bel-7402 和 SK-Hep-1 生长的作用，见图 2。3.4 HDWF 对 Bel-7402、SK-Hep-1 肝癌细胞凋亡的影响 与对照组比较，HDWF 各剂量组的早期凋亡率均有明显增加（P＜0.01），而 HDWF 各剂量组的晚期凋亡率及总凋亡率均高于空白组（P＜0.05）。

第 4期 杨 弘等：复方白花蛇舌草对肝癌细胞增殖和凋亡的影响 65

注：与对照组比较，1） P＜0.01，2） P＜0.05。

表 3 HDWF 对 Bel-7402 细胞凋亡率的影响（x±s）

浓度 ／（mg ／mL）

0.0

0.51.01.5

早期凋亡率

4.55±0.32

10.16±0.481）

23.42±2.111）

25.14±2.321）

晚期凋亡率

0.40±0.19

0.55±0.212）

0.81±0.312）

2.77±0.901）

％

组 别

对照组

实验组

n

3

3

总凋亡率

4.95±0.50

10.61±0.901）

24.22±2.321）

27.91±2.831）

注：与对照组比较，1） P＜0.01。

表 4 HDWF 对 SK-Hep-1 细胞凋亡的影响（x±s）

浓度 ／（mg ／mL）

0.0

0.51.01.5

早期凋亡率

0.87±0.19

2.52±0.211）

12.24±1.231）

11.84±1.041）

晚期凋亡率

0.35±0.21

2.42±0.271）

14.48±2.311）

32.36±3.741）

％

组 别

对照组

实验组

n

3

3

总凋亡率

1.22±0.25

4.94±0.51）

26.72±2.241）

44.22±3.801）

Annexin-V ／ PI 染色结果显示 HDWF 具有诱导肝癌细胞 Bel-7402 和 SK-Hep-1 凋亡的作用，凋亡细胞数随着 HDWF 浓度增加而逐渐增多，呈现明显的剂量依赖作用，见表 3、表 4。

4 讨 论近年来，随着环境、生活方式 、饮食习惯等改

变，每年我国的肝癌发病率不断增长。 临床上常规的手术和放、化疗都有其局限性，且治疗后易复发，对机体的继发性损伤也很大 ［4］。 目前研究发现：临床上中医治疗肝癌有一定的优势，日益受到广泛关注，已成为医学研究热点 ［5］。 肝癌在中医学中归属于“癥瘕、臌胀、痃癖”等病范畴，认为是由于阴阳失调、七情郁结、脏腑受损等因素导致脏腑功能失调，气血津液运行失常，从而产生气滞、痰凝、湿浊、热毒蕴结于脏腑，相互搏结，日久积渐而成的恶性疾病 ［6］，应治以清热解毒、扶正祛邪等法 ［7］。 HDWF 具有清热解毒、益气健脾消食等功效，方中白花蛇舌草味苦甘，性温，无毒，归胃、大肠、小肠经，具有清热解毒、消痈散结、活血止痛的功效；半枝莲性味辛、苦、寒，归肺、肝、肾、大肠经，具有清热解毒、活血祛瘀、消肿止痛等功能；两者以药对方式治疗肿瘤，可通过诱导细胞凋亡 、抑制细胞增殖、增强免疫、降低端粒酶等方式达到抗肿瘤目的 ［8］。 炙黄芪健脾补中、升阳举陷、益卫固表；炒麦芽行气消积、调节脾胃气机升降失调；两药同用，具有补气健脾、

图 1 HDWF 干预 Bel-7402、SK-Hep-1 细胞 24 h 形态图（×200）

0.0 mg ／mL 0.5 mg ／mL 1.0 mg ／mL 1.5 mg ／mL

SK-H

ep-1

Bel-7402

图 2 HDWF 干预 Bel-7402、SK-Hep-1 细胞集落形成染色图的影响

0.0 mg ／mL 0.5 mg ／mL 1.0 mg ／mL 1.5 mg ／mL

SK-H

ep-1

Bel-7402

福建中医药 第 49卷66

托毒生肌之功效［9］。有关研究发现：肝癌之所以难以控制，肝癌细

胞的无限增殖是其中的主要原因之一 ［10］，所以，抑制肝癌细胞的增殖是抑制肝癌发生发展的主要途径之一。 本研究 MTT 检测结果显示：HDWF 对肝癌细胞的增殖有明显的抑制作用，且呈一定的时间和浓度依赖性；同时，细胞计数和细胞形态学观察也直接、直观地验证了这一结论。 肝癌细胞的集落形成实验显示：HDWF 能抑制肝癌细胞集落形成的能力，则进一步验证了 HDWF 抑制肝癌细胞的增殖能力。 此外，肝癌细胞数的增加也与细胞凋亡密切相关，凋亡的过程是多基因、多途径参与的复杂过程，某些体内外因素能够导致细胞中的癌基因以及原癌基因被激活并过度表达，这一过程能够直接促进肝癌细胞的生长，并且阻断肝癌细胞凋亡，从而使肝癌细胞大量增加 ［11］，因此，抑制肝癌发生发展的另一关键是诱导肝癌细胞凋亡 。 本实验运用的Annexin-V ／ PI 结果显示：HDWF 能够诱导肝癌细胞的凋亡，且呈剂量依赖性。

综上所述，HDWF 具有抑制肝癌细胞增殖、诱导肝癌细胞凋亡的作用。 但肝癌等恶性肿瘤是一种系统性疾病，受到增殖、凋亡相关因子的调控，并与多条相关信号通路的异常活化密切相关，因此 HD-

WF 治疗肝癌等消化道肿瘤的分子作用机制及其作用靶点研究尚待进一步探讨。参考文献：［1］ 蒋智，张建淮，屠道远 . 肝癌肿瘤标志物的研究进展［J］. 中国

临床研究，2018，31（2）：270-273.［2］ 苗颖 . 原发性肝癌并门静脉癌栓的治疗进展（综述）［J］. 影像

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［5］ 程玉佩，张明香 . 中医药治疗原发性肝癌研究进展［J］. 辽宁中医药大学学报，2018，20（1）：167-169.

［6］ 戚益铭，吴霜霜，沈敏鹤，等 . 中医药治疗原发性肝癌研究述评［J］. 中医学报，2015，30（1）：14-16.

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inhibit cell proliferation and induce apoptosis in hepatocellularcarcinoma ［J］. BMC Complement Altern Med，2018，18（1）：147.

Hedyotis Diffusa Willd Formula Inhibited Hepatocellular Carcinoma Cell's Proliferationand Induced Apoptosis

YANG Hong1, JIN Yiyi1, LIN Lumin2, LIN Shan1,3, WEI Lihui1,3, LIN Jiumao1,31 Academy of Integrative Medicine, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou, Fujian 350122, China;

2 College of Traditional Chinese Medicine, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou, Fujian 350122, China;3 Fujian Key Laboratory of Integrative Medicine on Geriatrics, Fuzhou, Fujian 350122, China

ABSTRACT Objective: To investigate the effect of Hedyotis Diffusa Willd Formula (HDWF) on cell proliferation and apoptosis inHepatocellular Carcinoma (HCC) Cells. Methods: HCC cell lines (SK-Hep-1 and Bel-7402) was cultured and treated with differentconcentrations of HDWF in vitro. MTT assays was used to evaluate cell viability and measure the inhibition rate of HDWF on HCCcell proliferation. Cell density was measured by cell count and morphology was observed and by phase contrast microscope. Colonyformation assays was used to evaluate the effect of HDWF on cell colony forming ability. Annexin-V/PI staining assays was used todetect the effect of HDWF on cell apoptosis. Results: The results showed that HDWF inhibited the proliferation of HCC cells signifi-cantly (P＜0.01). HDWF can reduce the number and density of HCC cells. HDWF inhibited cell colony formation and promoted cellapoptosis of HCC cells significantly (P＜0.05). Conclusion: HDWF can inhibit cell proliferation and induce apoptosis of HCC cells.KEY WORDS hepatocellular carcinoma; proliferation; apoptosis; Hedyotis Diffusa Willd Formula

第 4期 杨 弘等：复方白花蛇舌草对肝癌细胞增殖和凋亡的影响 67