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Université Paris Descartes
5ème année de Pharmacie Filière Industrie
Spécialisation TOXICOLOGIE
Etude de la cytotoxicité des nanoparticules d’oxydes de fer
Mémoire présenté par Katia ALLOUN
Sous la direction du Dr L’Hocine Yahia
Laboratoire d’Innovation et d’Analyse de Bioperformance (LIAB)
Département de génie biomédical Ecole Polytechnique de Montréal
Année universitaire 2010/2011
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REMERCIEMENTS
Je remercie le Dr L’Hocine Yahia, directeur du laboratoire d’Innovation et d’Analyse de
Bioperformance, de m’avoir accueilli et permis de travailler au sein de son laboratoire.
Je tiens à remercier tout particulièrement Doris Antoinette Mbeh, de m’avoir encadrée,
formée, avec rigueur intellectuelle, gentillesse et dans la bonne humeur ; ainsi que pour
son aide, ses encouragements et sa générosité manifestés à mon égard.
Je remercie également tous les membres du LIAB pour leur accueil et leur sympathie.
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SOMMAIRE
I. Introduction p.5
1. Les nanoparticules d’oxydes de fer p.5
A. Généralités……………………………………………………………..p.5
B. Synthèse et caractérisation……………………………………..p.5
C. Utilisation et applications……………………………………….p.6
D. Contexte de l’étude…………………………………………………p.7
E. Potentiel zêta………………………………………………………….p.8
F. « Protein corona »…………………………………………………..p.8
2. Etude de la cytotoxicité ……………………………………………….p. 9
A. Objectif…………………………………………………………………..p.9
B. La culture cellulaire………………………………………………...p.9
C. Les différents tests de viabilité cellulaire………………….p.10
3. Objectif du travail de recherche p. 11
II. Matériel et méthodes p. 11
1. Nanoparticules d’oxyde de fer………………………………………...p.11
2. Culture cellulaire……………………………………………………………p.12
3. Préparation des échantillons de nanoparticules……………..p.12
4. Test MTT……………………………………………………………………….p.13
5. Mesure du potentiel zêta…………………………………………………p.14
III. Résultats p. 15
1. Mesure du potentiel zêta………………………………………p.16
2. Taille des nanoparticules………………………………………p.17
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3. Mesure du pH………………………………………………………p.18
4. Test MTT………………………………………………………………p.18
IV. Discussion……………………………………………………………………...p. 19
V. Conclusion et perspectives……………………………………………..p.20
VI. Références bibliographiques p. 21
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I. Introduction
Depuis plusieurs années, il y a eu un intérêt croissant dans la recherche en nanotechnologie, qui se concentre sur les particules qualifiées de particules ultrafines dont au moins une dimension est comprise entre 1 et 100 nanomètres encore appelé nanoparticules (NPs). Leurs propriétés physiques, chimiques, voire biologiques découlent spécifiquement de cette taille nanométrique. Nous nous intéresserons plus particulièrement aux nanoparticules d’oxydes de fer de forme magnétite (Fe3O4). Grâce à leur haute magnétisation, les nanoparticules d’oxydes de fer induisent une importante diminution au niveau de la relaxation transversale des protons d’eau et sont par conséquent, des agents de contraste d’imagerie IRM très efficaces. La connaissance et le contrôle des caractéristiques physico-‐chimiques des nanoparticules sont d’une grande importance. Le choix des méthodes de synthèse (microémulsions, synthèse sol-‐gel, synthèse par pyrolyse laser, synthèse sonochimique ou co-‐précipitation) détermine la taille et la forme des nanoparticules magnétiques, ainsi que la distribution de leur taille et de leur chimie de surface.
1) Les nanoparticules d’oxydes de fer A. Généralités
Parmi les nanoparticules d’oxydes de fer, on distingue les nanoparticules d’oxyde
de fer superparamagnétiques (appelées SPION) qui possèdent un corps d’oxyde de fer, et enveloppées par des matériaux inorganiques (tels que la silice, l’or) ou des matériaux synthétiques/naturels (tels que les phospholipides, acides gras, polysaccharides, les polymères naturels). Ces SPIONs sont souvent classés en fonction de leur taille qui inclut le corps d’oxyde de fer et le rêvetement/fonctionnalisation, appelé le diamètre hydrodynamique. Les SPIONs de taille comprise entre 60 et 150 nm sont ceux utilisés en tant qu’agent d’IRM ou sont en phase de développement pour être employés en tant que système de délivrance de médicament. B. Synthèse et caractérisation
• Synthèse des nanoparticules d’oxydes de fer La voie classique de synthèse de ces NPs est la voie chimique. Des nombreuses méthodes chimiques peuvent être utilisées pour synthétiser des nanoparticules magnétiques : microémulsions, synthèses sol-‐gel, procédé hydrothermal, hydrolyse et thermolyse de précurseurs. Le contrôle de la taille, la forme et composition des NPs dépend du type de sels utilisés, du ratio Fe2+/Fe3+, le pH et la force ionique du milieu. [1] Cependant la méthode la plus commune est la coprécipitation de sels de fer. Elle est probablement la plus simple et la plus efficace pour obtenir ces nanoparticules d’oxyde
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de fer qui sont généralement préparées grâce à un mélange stoechiométrique de sels ferreux et ferrique en milieux aqueux. La réaction chimique de formation Fe3O4 peut être écrite comme suit : Fe2 + + 2 Fe3 ++ 8 OH-‐ Fe3O4+ 4 H2O Cependant, avec cette méthode, la distribution de taille des nanoparticules obtenues est trop grande i.e comprise entre 2 et 16 nm [2], donc notre produit n’est pas assez homogène. Il existe aussi une technique dite hydrothermal et à haute température qui se fait aussi en milieu aqueux dans des réacteurs ou autoclaves afin d’augmenter la pression au-‐delà de 1,4.106 Pa et d’atteindre une température supérieure a 200°C. Deux voies sont donc possibles, l’hydrolyse et l’oxydation ou la neutralisation d’un mélange d’hydroxydes métalliques. Ces deux possibilités sont très similaires mis a part que des sels ferreux sont utilises dans la première.
• Caractérisation La caractérisation des nanomatériaux et la compréhension de leur comportement est primordiale pour le développement de nouvelles applications et la production de nanomatériaux de façon reproductible et fiable Il est donc nécessaire de déterminer les caractéristiques des nanomatériaux de manière à pouvoir étudier leur toxicité. Autrement, les possibles effets toxiques ne peuvent pas être attribués à certaines propriétés du nanomatériau ou au nanomatériau même, à cause de la présence d’impuretés par exemple. Il est donc très important de connaître le matériau pur et ses propriétés. Sa taille, sa forme, sa force, ses propriétés électriques, physiques, optiques sont déterminées grâce à l’utilisation de plusieurs techniques tels la microscopie électronique à balayage (SEM) pour produire des images en haute résolution de la surface des échantillons de NPs, la microscopie électronique en transmission (TEM) pour identifier la taille, la composition chimique et la structure cristalline des NPs, la diffractométrie de rayons X(XRD) pour l'analyse physico-‐chimique, la spectrométrie photoélectronique X (XPS) qui permet de connaître la composition élémentaire, l’état électronique et chimique des éléments contenus dans les 1 à 10 premiers nm de la surface d’une NP. [3]
C. Utilisation et applications
Depuis plus de 30 ans, le secteur de recherche de nanotechnologie ne cesse de se
développer passant d’un intérêt physique et biologique initialement à des applications cliniques. Cependant, plusieurs de ces particules ayant une application biomédicale sont toujours en phase pré-‐clinique ou clinique. Combinés à des médicaments ou gènes, ces NPs peuvent changer la viabilité ou les processus de transcription des cellules, ce qui les rend fortement intéressante pour l’industrie pharmaceutique, la biologie cellulaire et les diagnostics. Elles permettent une nouvelle approche de la recherche et développement d’un médicament puisqu’elles sont capables d’interagir avec les cellules de manière spécifique. Elles sont utiles en tant qu’outils versatiles pour les diagnostics précoces (notamment utilisées en tant qu’agent de contraste en imagerie IRM), souvent combinés lors des
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screening de nouvelles molécules. Elles peuvent également être utilisées en tant que système de délivrance de médicaments qui peut être modifié ou dirigé vers des cellules, tissus, organes spécifiques. Ainsi, les effets secondaires systémiques peuvent être évités (exemple : dans le traitements des tumeurs cancéreuses, les cellules saines seront épargnées). Ces NPs d’oxydes de fer superparamagnétiques sont capables de se lier aux médicaments, protéines, enzymes, anticorps ou nucléotides et peuvent être dirigés vers un organe, tissu, ou tumeur en utilisant un champ magnétique externe. Grâce à leur taille, leurs propriétés dépendant de cette taille et cette capacité à être dirigé spécifiquement vers une cible privilégiée, ces matériaux sont des candidats prometteurs pour la recherche, les diagnostics et les applications thérapeutiques dans plusieurs domaines, tels que le cancer, les maladies neurodégénératives (sclérose en plaque, accident vasculaire cérébral) et les maladies inflammatoires (arthrite rhumatoïde). Les patients sont donc amenés à être exposés à des produits pharmaceutiques contenant ces NPs. Il est alors important de connaître leur biocompatibilité et d’étudier leur toxicité, notamment cellulaire. [6]
D. Contexte de l’étude Le département de génie biomédical de l’Ecole Polytechnique de Montréal et plus particulièrement le Laboratoire d’Innovation et d’Analyse de Bioperformance (LIAB), dirigé par Dr L’Hocine Yahia, s’est engagé dans un projet en collaboration avec un partenaire industriel (Medical Nitrox Device) qui consiste à exploiter les propriétés de ces nanoparticules d’oxydes de fer (Fe3O4). Ceci afin de mettre en place un nanovecteur qui pourra délivrer une molécule médicamenteuse dans les poumons et plus précisément dans la région alvéolaire. Pour cela, il est nécessaire de fonctionnaliser la surface des nanoparticules superparamagnétiques (magnétite -‐Fe3O4,) avant de les incorporer dans des microsphères de chitosane. Cet ensemble sera déposé sur la paroi alvéolaire par inhalation, et grâce au pH local et à la température interne du corps humain, la biodégradation du chitosane permettra la libération de la molécule en quantités nécessaires et contrôlées. Ce projet compte donc de nombreuses étapes : la première est la synthèse et la fonctionnalisation des nanoparticules d’oxyde de fer, elle est réalisée à l’Institut des Matériaux Industriel du Canada (IMI). La seconde consiste à caractériser ces nanoparticules, la troisième est l’étude de la biocompatibilité de ces NPs à chaque étape de la fonctionnalisation dans un milieu physiologique. Et enfin, la dernière étape, qui constitue l’objectif principal du projet du laboratoire, est l’évaluation de la faisabilité de l’incorporation des nanoparticules d’oxyde de fer dans les microsphères de chitosane. L’étude de la biocompatibilité implique non seulement l’étude de l’effet toxique des NPs particules sur les cellules mais aussi l’effet des milieux physiologiques sur les NPs. Pour comprendre ce dernier volet, il faut comprendre l’influence des paramètres comme la variation du potentiel zêta, la formation du « corona », La modification du pH, l’effet de l’agglomération etc.
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E. Potentiel zêta
• Définition : Il s’agit de la charge qu’une particule acquiert grâce aux ions qui l’entourent quand
elle est en solution. On l’appelle charge de surface. C’est un potentiel électrique mesuré au niveau du diamètre hydrodynamique d’une particule en suspension au sein d’un milieu liquide. Il permet de caractériser la charge électrique au voisinage de la surface de la particule, en fonction de son environnement. C’est aussi un bon indicateur des interactions entre les particules et avec les espèces chargées présentes en solution. Le changement dans les valeurs de potentiels zêta est relatif à la charge de surface de la cellule, la charge de surface de la NP et de l’interaction entre les cellules et les NPs. [4]
Figure 1 : Représentation schématique du potentiel zêta
http://www.malvern.com/LabEng/technology/zeta_potential/zeta_potential_LDE.htm
F. Le « protein-‐corona »
Le rôle-‐clé des intéractions protéine-‐nanoparticule dans le domaine de la nanomédecine et nanotoxicité est apparu récemment avec le développement de l’idée du « corona » nanoparticule-‐protéine. Le « corona » est une couche dynamique de protéines (et autres biomolécules) absorbe immédiatement à la surface des NPs en contact avec les liquides biologiques. La composition du « corona » à un temps donné est déterminée par les concentrations des plus de 3700 protéines dans le plasma et la cinétique des constantes d’association et dissociation pour chaque protéine à une nanoparticule donnée. Le « corona » peut ne pas atteindre immédiatement l’état d’équilibre. [5]
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Figure 2 : Représentation schématique du « protein-‐corona » sur une nanoparticule illustrant les processus d’échange et constantes d’équilibre
Protein-nanoparticle interactions REVIEW
FEB-APR 2008 | VOLUME 3 | NUMBER 1-2 41
quite different biological consequences. Indeed, there is the potential
that highly curved surfaces (very small nanoparticles) can suppress
protein adsorption to the point where it no longer occurs, an effect
likely to be selective to larger proteins, offering a route to differential
control of protein adsoption17. In addition, flat surfaces can only affect
biological process via cell surface receptors such as integrins, whereas
nanoparticles can enter cells and thereby access a vast range of extra
biological processes.
Interestingly, rather than complicating the story, recent studies
suggest that nanomaterial surfaces, which have much larger surface
area than flat ones, are more amenable to studies to determine the
identity and residence times of adsorbed proteins2,18. Indeed, direct
determination of curvature effects on protein adsorption can be made,
as with some material types the size of the particle can be increased
until the curvature effects vanish, leaving an effectively flat surface.
This offers several possibilities in terms of high-throughput or mass
screening of nanoparticle-protein interactions, a concept that may have
applicability as a new classification of nanoparticles based on their
associated protein molecules, or ‘protein corona’. We have recently
introduced the concept of the ‘nanoparticle-protein corona’ as the
evolving collection of proteins that associate with nanoparticles in
biological fluids, which is, in fact, the ‘biologically relevant entity’ that
interacts with cells19.
Here we review some of the recent literature on nanoparticle-
protein interactions in light of the fact that the biological impacts
of nanoparticles are affected by the nature of the adsorbed protein
layer, or the protein (biomolecule) corona. With the potential uses of
nanoparticles in biological applications such as nanomedicine being
well known, and the increasing importance of the emerging field
of nanotoxicology, which aims to address the safety of engineered
nanoparticles, the relevancy of protein-nanoparticle interactions
cannot be overstated. While most of the knowledge regarding protein-
nanoparticle interactions is from solution and in vitro studies, it is clear
that future directions will require studies under competitive binding
conditions such as occur in vivo.
The nanoparticle-protein coronaIt is a (near) universal rule of materials in biology that a material
is always covered by proteins immediately upon contact with a
physiological environment, and we believe that this phenomenon will
also be key to understanding much of the bionanoscience world19.
We have recently argued that the effective unit of interest in the cell-
nanomaterial interaction is not the nanoparticle per se, but the particle
and its ‘corona’ of more or less strongly associated proteins from
serum or other body fluids1,2. It is important to understand, though,
that it is not just the composition and organization of this protein
layer, but the exchange times of the proteins on the nanoparticles that
is ‘read’ by living cells.
We conceive of the proteins associated with a particle as possessing
a very wide range of affinities for the particle surface, resulting in a
range of different residence times for proteins at a nanoparticle surface.
In essence, we expect a huge range of equilibrium constants (one
for each protein) representing the quite different (and competitive)
binding mechanisms present. This means that we see the proteins
associated with a particle as a ‘corona’, rather than a solid fixed layer
(Fig. 1). The composition of the protein corona at any given time
will be determined by the concentrations of the over 3700 proteins
in plasma20, and the kinetic on and off rates (or equilibrium binding
constants) of each protein for the particular nanoparticle. This corona
may not immediately reach equilibrium when exposed to a biological
fluid. Proteins with high concentrations and high association rate
constants will initially occupy the nanoparticle surface, but may also
Fig. 1 Schematic representation of the protein corona on a nanoparticle illustrating the exchange processes and equilibrium constants. The exchange rates are a complex function of the affinity for the surface, curvature effects from the surface, and changes in the surrounding milieu, and much work is needed to evaluate the equilibrium constants under different conditions.
Lynch et al., 2008
2) Etude de la cytotoxicité
A. Objectif Bien que plusieurs modifications de surface aient été effectuées jusqu’à présent pour rendre ces NPs plus biocompatibles, leur potentiel toxique constitue toujours un souci majeur. Il a été montré que les causes de la toxicité des NPs peuvent être liées à leurs tailles, formes, propriétés électroniques, optiques et magnétiques (par exemple, étude du potentiel zêta), ainsi que leurs implications dans des réactions catalytiques et oxydatives. [3] Une étude montre que la cytotoxicité des NPs d’oxyde de fer est due à une induction de stress oxydant et par conséquent à une apoptose. [7] L’étude de la cytotoxicité consiste principalement en l’évaluation de la viabilité cellulaire par l’intermédiaire de différents tests in vitro sur des cellules préalablement cultivées.
B. Culture cellulaire Il s’agit du maintien en dehors de l’organisme des cellules non organisées en tissu mais capable de se diviser in vitro et d’exprimer des métabolismes et des fonctions spécifiques. Il existe deux types de cellules utilisées en laboratoire :
• Une lignée cellulaire qui est une population homogène de cellules, stables après des mitoses successives, et ayant en théorie une capacité illimitée de division. Il
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s'agit en général de cellules cancéreuses prélevées chez un patient et transformées artificiellement un gène immortalisant ou encore.
• Les cellules primaires qui sont des cellules cultivées in vitro à partir d'un organe qu'il faudra donc séparer les unes des autres différentes par des techniques de culture cellulaire ou des cellules isolées dans les liquides biologiques comme le sang,
C. Les différents tests de viabilité cellulaire
L’objectif de ces tests est d’évaluer la viabilité des cellules face à l’exposition aux NPs. Il s’agit du paramètre le plus communément évalué dans les études de cytotoxicité. Il existe différents tests de viabilité cellulaire :
- Test MTT (cf Matériel et Méthodes § II.4)
- Test LDH : C’est un test de détection colorimétrique de la sécrétion de LDH (lactate déshydrogénase). La lactate déshydrogénase est une enzyme exclusivement cytoplasmique et relativement stable. L'augmentation de l'activité de cette enzyme dans le surnageant des cellules permet de détecter une altération de la perméabilité membranaire et par conséquent une mesure de la cytotoxicité.
Dans une première étape, LDH catalyse la réduction du NAD+ en NADH et H+ par l’oxydation du lactate en pyruvate. Dans une seconde étape de la réaction, LDH utilise le NADH et H+ formés pour catalyser la réduction du sel de tetrazolium (INT) en un précipité hautement coloré qui absorbe à 490-‐520 nm. La quantité de précipité « formazan » produite est proportionnelle à la quantité de LDH libéré dans le milieu de culture.
- Test au rouge neutre
La cytotoxicité est exprimée comme étant la diminution, en fonction de la concentration, de la fixation du colorant vital rouge neutre après traitement par le produit chimique mis à l’essai. Le rouge neutre est un colorant cationique faible qui pénètre facilement dans les membranes cellulaires par diffusion, et s’accumule au niveau intracellulaire dans les lysosomes. Le colorant est exclu des cellules mortes. Après le temps de contact avec les nanoparticules, la quantité de rouge neutre incorporée dans les cellules est mesurée par spectrophotométrie à 540 nm.
- Test Annexine V/propidium iodide
L’annexine V est utilisée pour déterminer quantitativement le pourcentage de
cellules dans une population, qui entre activement en apoptose.
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Ce test est basé sur la propriété des cellules de perdre l’asymétrie de leurs membranes lors des premières phases de l’apoptose. Dans les cellules apoptotiques, la phosphatidylsérine située sur la membrane est transloquée et se retrouve sur le feuillet externe de la membrane et donc exposée à l’environnement extérieur. L’annexine V se lie à la phosphatidylsérine de « manière calcium-‐dépendante » 7-‐Amino-‐Actinomycine (7-‐AAD) est un marqueur utilisé pour distinguer les cellules viables des cellules non viables, et ce par une technique de cytométrie de flux. Les membranes des cellules mortes ou endommagées laissent passer le 7-‐AAD. Les cellules qui sont « Annexine V positive » et « 7-‐AAD négative » sont en début d’apoptose.
- Test ELISA Le test ELISA (Enzyme-‐linked immunosorbent assay) est un dosage immuno-‐enzymatique sur support solide. Il peut également être utilisé pour examiner la régulation de médiateurs pro-‐inflammatoires tels que les cytokines IL-‐1,6, TNF alpha, PGE2)
3) Objectif du travail de recherche Les mécanismes à la nano-‐bio interface peuvent être soit chimiques soit physiques. Les mécanismes chimiques incluent la production d’espèces réactives de l’oxygène (ERO), la dissolution et la libération d’ions toxiques, la perturbation de l’activité de transport des électrons/ions au niveau de la membrane cellulaire, le stress oxydant, et la peroxydation lipidique. Les mécanismes physiques eux sont principalement la résultante de la taille des NPs et leurs propriétés de surface ; notamment les ruptures de membranes, l’activité membranaire, les processus de transport, l’agrégation, les conformations et repliements des protéines. [3] L’objet de notre étude est alors de déterminer s’il existe un lien entre la cytotoxicité des NPs d’oxyde de fer, le potentiel zêta et l’absorption des protéines. Nous allons pour cela procéder à différentes mesures du potentiel zêta des NPs et effectuer un test de cytotoxicité.
II. MATERIEL ET METHODES
1) Nanoparticules d’oxyde de fer Nous avons utilisé des nanoparticules d’oxyde de fer sous forme magnétite Fe3O4, acheté dans le commerce .Ces NPs ont par la suite été caractérisés dans le laboratoire ; leur taille a été mesurée et est de 86 nm.
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Elles se présentent sous forme de poudre noire toxique par inhalation et au toucher. Leur manipulation nécessite l’utilisation d’un masque et de gants.
2) Culture cellulaire
Nous avons choisi le type cellulaire A549 : ce sont des cellules épithéliales alvéolaires humaines.
Figure 3 : Confluence des cellules A-‐549 sous conditions normales de culture (A gauche : Basse densité ; A droite haute densité). Le milieu de culture que nous avons utilisé est le Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), avec 10% de sérum de bovin fœtal (FBS) , à 37°C dans un incubateur saturé à 5% de CO2 et 1% streptomycine/pénicilline. Deux repiquages ont été réalisés à l’aide d’une solution de trypsine. Puis les cellules ont été comptées à l’aide d’un hémacytomètre.
3) Préparation des échantillons de NPs Ces échantillons nous serviront pour la mesure du potentiel zêta, de la taille des NPs, du pH ainsi que pour le test de cytotoxicité. Nous avons choisi 5 concentrations de nos NPs : 10, 25, 50, 100 et 150 µg/ml. Considérant la dose d’oxyde de fer recommandé pour la lymphographie qui est de 45 µmol/kg, nous avons limité les concentrations à analyser entre 0-‐150 µg/ml. Nos NPs sont mises en suspension dans 3 milieux différents :
• DMEM/F12 • DMEM/F12 + FBS • DMEM/F12 + sérum de remplacement
Le sérum de remplacement est un sérum dépourvu de protéines et de substances d’origine animale. Nous procédons ensuite à la sonication de nos échantillons à l’aide d’un sonicateur.
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La sonication consiste en l’application d’ultra-‐sons à un échantillon pour faciliter l’agitation et la séparation des particules en suspension.
4) Test MTT
C’est un test de détection colorimétrique de l’activité mitochondriale. Il est basé sur la réduction du « yellow tetrazolium dye 3-‐(4,5-‐dimethylthiazol-‐2-‐yl)-‐2,5-‐diphenyltetrazolium bromide » (MTT) en un précipité « formazan » violet insoluble dans l’eau.
Figure 4 : Principe du test MTT
Chapitre 2. Matériels et méthodes
spectrophotométrique de l’absorbance est réalisée à 565 nm. Le clivage se pro-duisant uniquement dans les cellules vivantes, l’intensité de coloration est direc-tement proportionnelle aux nombres de cellules vivantes.
FIGURE 2.17 – Principe du test MTT.
Protocole opératoireLe test MTT est réalisé selon la méthode décrite par Mosmann (1983). Au
terme de l’exposition, 10 µL d’une solution de PBS à 5 g.L−1 de MTT sont dépo-sés dans chaque puit. Les microplaques sont ensuite incubées 1 h à 37°C à l’abride la lumière. Au terme de la période d’incubation, les surnageants sont élimi-nés, et les cristaux de formazan formés dans cellules sont solubilisés dans 100µL de DMSO. Les solutions colorées sont ensuite homogénéisées par agitation etlaissées reposer pendant un heure afin de permettre une sédimentation des na-noparticules au fond des puits. Enfin, 50 µL de chaque puit sont transférés dansune nouvelle plaque en prenant soin de ne pas prélever le fond du puit contenantles nanoparticules, puis complétés avec 50 µL de DMSO. Leur absorbance est lueà 565 nm.
2.3.2.2 Le test XTT
PrincipeLe principe du test XTT consiste lui aussi à mesurer l’activité de la succinate
déshydrogénase mitochondriale des cellules vivantes. Cette enzyme coupe le cycletetrazolium du XTT (2,3-bis[2-Methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl]-2Htetrazolium-5-carboxyanilide) de couleur jaune, et libère des cristaux de formazan orangesqui sont directement solubles dans l’eau (Scudiero et al., 1988). La lecture spec-trophotométrique à 450 nm se fait donc directement et l’intensité de colorationorange dépend du nombre de cellules vivantes.
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extrait de : http://www.mclab.com/product.php?productid=19249&cat=91
C’est une méthode rapide et simple de numération de cellules vivantes, très utilisée dans les études de cytotoxicité. Nous utilisons le kit « Trevigen’s TACS MTT Cell Proliferation Assay ». Il nous permet de mesurer le taux de prolifération cellulaire et réciproquement la diminution de la viabilité cellulaire. Pour chaque type cellulaire, la relation linéaire entre le nombre de cellules et le signal produit est établie nous permettant ainsi une quantification précise des changements de taux de modification de la prolifération des cellules. Nous avons utilisé 3 plaques :
• Plaque 1 : cellules + NPs mises en suspension pendant 2h • Plaque 2 : cellules + NPs mises en suspension pendant 24h • Plaque 2 : NPs mises en suspension pendant 2h et 24h
Nos cellules (en quantité égale à 1x106 cellules/ml) sont incubées pendant 24h puis à l’ajout de 10 µl de MTT dans chaque puits. Notre plaque est alors laissée à l’incubateur pendant 4h. Le milieu est ensuite retiré et les précipités de formazan sont solubilisés lors d’une nouvelle incubation de 3h dans 100 µl de détergent. Enfin, l’absorbance de chaque puits est lue à 570 nm, ce qui nous donne ensuite la quantité de cellules vivantes, grâce au calcul suivant :
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% de viabilité cellulaire = 100 x (moyenne absorbance des cellules + NPs – moyenne absorbance des NPs)/ moyenne absorbance du témoin
5) Mesure du potentiel zêta
La mesure de potentiel zêta de particules colloïdales (comme les NPs) peut s’effectuer par la technique de micro-‐électrophorèse. [3] Le principe de cette technique consiste en l’application d’une tension à travers une paire d’électrodes à la cellule contenant les particules en suspension. Les particules chargées sont attirées par l’électrode ayant une charge opposée. Leur vitesse est alors mesurée et convertie en potentiel zêta par l’intermédiaire de l’équation d’Henry. Cette vitesse est proportionnelle au potentiel zêta et est mesurée par la technique du Laser Doppler Anemometer., aussi appelée « diffusion dynamique de la lumière ». (dynamic light scattering) Le Laser Doppler mesure des petits décalages de fréquence dans la lumière diffuse qui surviennent à cause du mouvement des particules dans un champ électrique appliqué. Cette différence de fréquence Δf est égale à:
Δf = 2υ sin (θ/2)/λ avec : υ : Vitesse de la particule λ : Longueur d’onde du laser θ : Angle de diffusion UE, la mobilité électrophorétique mesurée est convertie en potentiel zêta (ζ) par l’équation d’Henry :
UE = 2εςF(Kα)/3η avec : F(Kα) = fonction d’Henry, aussi = 1,5 par l’équation de Smoluchowski ε : Constante diélectrique de l’agent dispersant η : Viscosité Remarque : cette équation s’applique seulement pour les particules isolées dont le potentiel zêta est inférieur à 25 mV. Figure 5 : Schéma de la configuration optique d’un instrument d’électrophorèse de
type Laser Doppler
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Kaszuba et al., 2010 L’appareil utilisé est le Zeta Potential Analyzer® (Brookhaven Instruments Corp.) Nous avons procédé à plusieurs mesures du potentiel zêta dans différentes conditions : une mesure de nos échantillons après une suspension de 2h et une autre mesure après une suspension de 24h. La taille de nos NPs a également été mesurée à l’aide de cet appareil.
III. RESULTATS
1) Mesure du potentiel zêta
Lors de la première mesure, nos échantillons ont été soniqués 2h avant la mesure exacte du potentiel zêta. En revanche, lors de la deuxième mesure, nos échantillons ont été soniqués juste avant cette mesure.
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2) Taille des NPs Lors de la 1ère mesure, la sonication des échantillons a été réalisée 2h avant la mesure.
3) Mesure du pH
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à t = 2h et température = 22°C Concentration 10 25 50 100 150 Milieu
seul Fe3O4+
DMEM/F12 8,05 8,07 8,08 8,10 8,14 8,10
Fe3O4 + DMEM/F12+
FBS
8,26 8,25 8,25 8,26 8,27 8,22
Fe3O4 + DMEM/F12+
serum
7,95 7,96 7,98 7,98 8,04 8,51
A t = 24h et température = 22°C
4) Test MTT
Concentration 10 25 50 100 150 Milieu seul
Fe3O4+ DMEM/F12
8,31 8,30 8,31 8,32 8,35 8,59
Fe3O4 + DMEM/F12+
FBS
8,59 8,55 8,48 8,38 8,29 8,77
Fe3O4 + DMEM/F12+
serum
8,51 8,52 8,43 8,43 8,56 8,56
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IV. DISCUSSION
Nos résultats des deux mesures du potentiel zêta des NPs d’oxyde de fer ne sont pas
convergents. En effet, lors de la première mesure on observe une nette différence de potentiel zêta des NPs en fonction des milieux ; les potentiels zêta des NPs mises en suspension dans le milieu DMEM/F12 et FBS sont positifs quelque soit la concentration, alors que ceux des NPs mises en suspension dans les autres milieux sont négatifs. On observe également que le potentiel zêta des NPs du milieu contenant le FBS a tendance à augmenter avec la concentration.
En revanche, lors de notre deuxième mesure, tous les potentiels sont négatifs quelque soit le milieu (excepté lorsque les NPs ont été mises en suspension dans l’eau). D’après nos résultats, nous ne pouvons affirmer que le temps de suspension des NPs (2h et 24h) joue un rôle sur le potentiel zêta. La différence de période de sonication des échantillons lors de nos deux mesures pourrait influencer les résultats de potentiel zêta. Il est à noter que la préparation des échantillons de NPs s’est effectuée dans un laboratoire de l’Institut de Cardiologie de Montréal et que la mesure de potentiel zêta s’est effectuée dans un laboratoire de l’université du Québec à Montréal. Nos échantillons ont dus être transportés et leurs conditions de conservation (température
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etc) ont pu en être affectées. De ce fait, on peut également souligner que le pH aurait pu être modifié et donc possiblement affecter la mesure du potentiel zêta. De même, les tailles mesurées des NPs en suspension différent par rapport à la période de sonication des échantillons. Une étude sur l’internalisation cellulaire des NPs de silice a montré une baisse du potentiel zêta due à l’absorption des protéines. [8] Une autre étude basée sur la mesure de l’absorption des protéines (issues d’un milieu contenant du FBS) à la surface de nanoparticules de Al2O3 a montré une baisse du potentiel zêta après plusieurs heures de suspension. [9] D’après nos résultats, il nous est difficile d’établir un tel lien entre le potentiel zêta des NPs et les différents milieux (contenant des protéines ou non).
Les résultats du test MTT nous révèlent des taux de viabilité cellulaire élevés. On ne peut pas réellement parler de cytotoxicité des NPs. Une confirmation par un test LDH est nécessaire. On constate que les taux de viabilité cellulaire à t=2h correspondant aux milieux de culture enrichis (ajout de FBS ou de sérum) sont plus élevés que ceux correspondant au milieu DMEM/F12 seul. On peut en déduire un possible biais de ces milieux de culture enrichis favorisant la prolifération cellulaire. De même, on a constaté que les taux d’absorbance des NPs seules étaient déjà élevés. De ce fait, les taux d’absorbance de la plaque 1 (correspondant aux cellules avec NPs) ne reflètent pas réellement l’absorbance de nos cellules. Selon ce protocole choisi, on peut parler de limites à ce test MTT. Une récente étude montre l’effet du milieu de culture (DMEM ou RMPI (Roswell Park Memorial Institute) sur la formation du « nanoparticle-‐protein corona » et son impact sur la réponse cellulaire. En conséquence, lors de l’évaluation de la toxicité dose-‐dépendante à l’aide de test in vitro, tous les paramètres expérimentaux comprenant le choix du milieu cellulaire, l’origine et la préparation du sérum, doivent être soigneusement pris en considération pour établir un protocole. [10]
V. CONCLUSION ET PERSPECTIVES En conclusion, les résultats de notre travail ne nous permettent pas d’établir de lien entre le potentiel zêta, l’absorption des protéines et la cytotoxicité des nanoparticules d’oxydes de fer. En revanche, des liens de corrélation entre la taille, la sonication, le pH et le potentiel zêta ont pu être établis. Pour pouvoir approfondir nos recherches, un nouveau protocole est nécessaire. La même procédure peut être envisagée mais en incluant un ou deux lavages des NPs après suspension dans les différents milieux. Ceci nous permettrait de pouvoir étudier les protéines qui auront eu le temps de s’agglomérer et nous affranchir de tout biais induit par les milieux de culture plus nutritifs que d’autres.
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Nous pouvons aussi procéder à une analyse des surnageants, avec ou sans lavage. Nos NPs seront enlevés du milieu et cela nous permettrait de déterminer les protéines absorbées à la surface des NPs. Ces dernières années, la majorité des études de nanotoxicité s’est concentré sur les systèmes de culture cellulaire. Cependant, une compréhension du lien entre les propriétés physico-‐chimiques des nanostructures et leur comportement in vivo pourrait nous fournir un modèle standard prédictif d’étude de toxicité. VI. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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