razvoj in validacija pol-avtomatske metode za vrednotenje...

Razvoj in validacija pol-avtomatske metode za vrednotenje farmacevtskih onesnažil v

odpadnih vodah z metodo LC-MS/MS

Robert Roškar, Anita Klančar, Albin Kristl, Jurij Trontelj

Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Slovenija

LIFE13 ENV/SI/000466

http://lifepharmdegrade.arhel.si

Zaključna konferenca projekta LIFE PharmDegradeFarmakološko aktivne snovi v odpadnih vodah:

optimizacija analitskih metod in procesov odstranjevanja

24. -25. november 2016Ljubljana, Slovenija

LIFE PharmDegradeRazgradnja farmacevtikov iz odpadnih vod domov za ostarele in bolnišnic

Osnovni cilj projekta: Optimizacija, demonstracija in validacija tehnologije terciarne stopnje čiščenja

odpadne vode: od laboratorijskega nivoja do postavitve naprave v dejanskem okolju.

Prispevek FFA: Izbor reprezentativnih učinkovin

Razvoj analiznih metod za ugotavljanje prisotnosti učinkovin v odpadnih vodah

Monitoring učinkovitosti razgradnje učinkovin v čistilni napravi



Izbor reprezentativnih učinkovin



Kriteriji: pojavljanje učinkovin v okolju potencialni vpliv učinkovin na okolje raba zdravil v Sloveniji

Izbrane učinkovine

Vir: Journal of Hazardous Materials 175 (2010) 45–95

Osnovni izbor

učinkovin

Farmakološka

skupina

Prilagojen izbor

učinkovin

Ciprofloksacin antibiotik √

Karbamazepin antiepileptik √

Klofibrična kislina metabolit učinkovin

za zniževanje lipidov

Atorvastatin

(ustrezna zamenjava)

Fluoksetin antidepresiv Sertralin

(ustrezna zamenjava)

Diklofenak nesteroidni

antirevmatik

√

Bisoprolol beta-blokator √

Metoprolol beta-blokator √

Imatinib citostatik √

Problematika analitike vodnih okoljskih vzorcev

odpadne vode so kompleksen

in zahteven medij

nizke koncentracije učinkovin:

območje nizko ng/L do µg/L



Vir: WHO, Pharmaceuticals in waters



Redčenje vzorca

metanol

voda

PREKONDICIONIRANJE

EKVILIBRACIJA

SPE DISK

nanos vzorca

sušenje diska

Elucija vzorca

Sušenje in

rekonstitucija vzorca

Analiza na LC-MS/MS

Razvoj pol-avtomatske analizne metode

Redčenje vzorca

metanol

voda

PREKONDICIONIRANJE

EKVILIBRACIJA

SPE DISK

nanos vzorca

sušenje diska

Elucija vzorca

Sušenje in

rekonstitucija vzorca

Analiza LC-MS/MS

Razvoj pol-avtomatske analizne metode -optimizacija

Optimizacija SPE metode – nanos vzorca

Optimizacija SPE metode – izbira diska

Optimizacija SPE metode – elucija

Metoda ELUCIJSKO TOPILO SOAK TIME

M1 ACN:MeOH= 1:1 45 sek

M2 2% HCOOH v ACN:MeOH=1:1 45 sek

M3 ACETON 45 sek

M4 100 % MeOH 45 sek

M5 100 % ACN 45 sek

M6 ACN:MeOH= 3:1 45 sek

M7 MeOH:iPrOH=1:1 45 sek

M8 ACN:iPrOH=1:1 45 sek

M9 ACN:MeOH:iPrOH=2:1:1 45 sek

M10 ACN:MeOH:iPrOH=2:1:1 1 min 30sek

M11 ACN:MeOH:iPrOH=2:1:1 3 min

metoda metoprolol [%]bisoprolol [%] fluoksetin [%] karbamazepin [%]klofibrična kislina [%] diklofenak [%]M1 91,1 93,9 95,3 83,7 34,3 53,9

M2 37,3 24,6 10,9 46,0 75,2 37,7

M3 94,8 93,9 100,0 88,6 75,2 63,0

M4 77,0 75,4 65,6 72,8 83,2 73,8

M5 83,3 86,2 87,1 82,1 51,7 70,0

M6 88,1 89,5 91,1 78,6 90,2 81,1

M7 84,4 85,2 68,8 85,0 42,0 79,2

M8 61,3 62,9 58,2 68,9 65,4 77,1

M9 100,0 100,0 84,6 100,0 62,2 90,2

M10 96,4 97,0 88,9 94,7 74,5 100,0

M11 95,5 98,2 83,4 92,5 100,0 95,5

Relativni izkoristki

Optimizacija SPE metode – rekonstitucija

Analit / topilo ACN ACN:MeOH (3:1)ACN:MeOH

(1:1)ACN:MeOH (1:1)+H2O

ACN:MeOH (1:1)+ HCOOH

2,5 mM NH4COO ACN:H20 (1:1)

atorvastatin 41 64 100 52 33 35 57

bisoprolol 89 99 100 92 4 79 81

ciprofloksacin 48 69 100 59 41 40 62

diklofenak 84 95 100 87 84 68 81

fluoksetin 36 56 100 50 30 33 59

imatinib 34 49 100 37 23 25 46

karbamazepin 86 97 100 83 85 69 79

klofibrična kislina 33 45 100 34 23 23 43

metoprolol 42 79 100 74 77 64 62

sertralin 86 98 99 86 100 73 77

Uporaba izotopsko označenih internih standardov

• Zniževanje učinka matrice!

cipro cipro-d8 cipro/IS karba karba-d6 karba/IS setralin sertralin-

c6

sertralin/

IS

po ČN 1 70990 107587 0,66 48140 31396 1,53 30859 60118 0,51

2 72627 112093 0,65 54160 34960 1,55 38359 71566 0,54

3 65801 104023 0,63 47941 31714 1,51 32339 61749 0,52

4 65657 101113 0,65 46777 31531 1,48 33184 66084 0,50

5 69020 105999 0,65 41335 28045 1,47 36640 66560 0,55

6 64036 98090 0,65 44880 31455 1,43 34242 66456 0,52

povprečje 68022 104818 0,65 47205 31517 1,50 34271 65422 0,52

RSD(%) 4,98 4,70 1,39 8,98 6,95 2,97 8,14 6,20 3,32

pred ČN 1 260081 58650 4,43 272254 33456 8,14 42484 63514 0,67

2 242831 54146 4,48 283861 34788 8,16 44216 64832 0,68

3 256102 59319 4,32 266925 33716 7,92 45399 66079 0,69

4 230338 51294 4,49 300954 36039 8,35 43007 63015 0,68

5 250211 55228 4,53 302362 36533 8,28 39913 61771 0,65

6 239767 54891 4,37 293015 34780 8,42 45692 67086 0,68

povprečje 246555 55588 4,44 286562 34885 8,21 43452 64383 0,67

RSD(%) 4,48 5,36 1,83 5,17 3,50 2,21 4,94 3,09 2,25

LC-MS/MS metoda

analit MRM (m/z) kolizijska energija [eV]

fragmentor [V]

ionizacija

atorvastatin 559,3 440,2 17 180 +atorvastatin-D5

564,3 440,2 17 180 +

bisoprolol 326,2 116,1 13 150 +ciprofloksacin 332,1 314,1 16 134 +ciprofloksacin-D8

340,1 322,1 16 134 +

diklofenak 296,0 214,0 15 55 +diklofenak-13C6

302,1 220,0 15 55 +

fluoksetin 310,1 148,1 1 100 +fluoksetin-D5 315,1 309,1 1 100 +imatinib 494,0 394,0 25 200 +imatinib-D8 502,3 394,0 25 200 +karbamazepin 237,1 194,1 12 103 +karbamazepin-D6

243,1 199,9 12 103 +

klofibričnakislina

213,0 127,0 10 80 -

metoprolol 268,2 116,0 12 100 +metoprolol-D7 275,2 123,0 12 100 +sertralin 306,1158,9 24 60 +sertralin-13C6 312,1159,0 25 100 +

Agilent 6460 QQQ + 1290 Infinity UHPLC(Agilent Techologies)

1. Optimizacija MS dela:- MRM prehodi- nastavitve ionskega izvora in plinov - (ESI v + in -)

LC-MS/MS metoda

2. Optimizacija LC dela:

- izbira kolone

- mobilna faza

- kromatografski pogoji

Preverjanje analizne metode

* Na običajen način pri analitiki vodnih vzorcev

območje linearnosti [µg/L] linearnost (R2) ponovljivost [%, n=3] izkoristek [%] LOQ [µg/L] točnost na LOQ [%] LOQ [µg/L]*

ciprofloksacin 500 - 12500 0,995 8,3 105,9 50 82,6 2,50

metoprolol 25 - 1250 1,000 3,7 80,5 25 96,3 0,90

imatinib 25 - 1250 0,996 9,2 89,7 25 93,7 0,79

bisoprolol 25 - 1250 1,000 7,1 87,2 25 101,4 0,22

karbamazepin 25 - 1250 0,998 3,9 105,9 25 110,8 0,60

fluoksetin 50 - 1250 1,000 3,4 86,6 50 93,2 6,20

setralin 20 - 1000 0,999 3,6 87,5 20 85,1 0,54

atorvastatin 25 - 1250 0,999 5,7 84,1 25 101,7 0,09

diklofenak 50 - 12500 1,000 4,3 105,3 50 114,6 5,72

klofibrična kislina 50 - 5000 0,997 15,5 89,4 50 85,6 5,44

Analiza vzorcev odpadnih vod

Primerjava klasični SPE in pol-avtomatski SPE

* pri 1 µg/L; § pri 100 ng/L

Favoriziran pol-avtomatski SPE:+ enostavnejša in avtomatizirana uporaba+ ni potrebe po predpripravi vzorca – filtriranje (časovno zelo zamudno!)+ ni težav z mašenjem diskov- višje LOQ - ni omejitev za odpadne vode, ker so koncentracije učinkovin višje

Vir: Sample preparation fundamentals for chromatography, Agilent Technologies

Nadaljnji koraki pri nadgradnji analitske metodologije

10 učinkovin 100+ učinkovin (vključevanje novih)

Optimizacija analizne metode še bolj kompleksna Verodostojnost meritev in kritičen pogled na rezultate

Optimizacija metode (n=111) Metoda standardnega dodatka

Hvala za pozornost!To raziskovalno delo je bilo podprto s strani LIFE+ projekta:

LIFE13 ENV/SI/000466 PharmDegrade

Hvala Evropski komisiji in Ministrstvu za okolje in prostor (prvotno Ministrstvu za kmetijstvo in okolje)!



Uspešno smo vpeljali analizno metodo za vrednotenje izbranih učinkovin v odpadnih vodah.Razvita analitska podpora je predstavljala osnovo za spremljanje učinkovitosti odstranjevanja teh mikroonesnažil v okviru projekta PharmDegrade.

Zaključek

Aktivnosti na analitski metodologiji okoljskih vzorcev

1. Razširitev na druge vzorce: 4. Pridobitev novega Q-HRMS

• površinske vode odpira nove možnosti!

• pitne vode

• ribja tkiva

2. Razširitev nabora analitov:

• metaboliti

• pesticidi

• hormonski motilci

3. Novejši pristopi priprave vzorca:

• eks. na osnovi sorptivnega mehanizma

Vir: Environmental Protection Agency, ZDA

[email protected]@[email protected]

razvoj in validacija pol-avtomatske metode za vrednotenje...

Documents