74 (1955) RECUEIL 579

612.398.12 : 541.18 : 537.36

RECHERCHES ELECTROPHORETIQUES DU SERUM SANGUIN HUMAIN DANS DIPPERENTES

SOLUTIONS TAMPONS

PAR

G. V. HEYNDRICKX et A. DE VLEESCHAUWER*) (Institut Superieur Agronomique de l'Etat, Chaire de Technologie Agricole

Gand (Belgique) . Des diagrammes obtenus lors des recherches electrophoretiques de s&um

sanguin d'apres Tisklius avec differentes solutions tampons, il apparait qu'une bonne dparation entre l'albumine et la globuline a, est determinee par le pH, qui doit =%re de 8,6 tt 8,9. I1 apparait egalement qu'une bonne &para- tion entre la globuline y2 et le delta, depend de la concentration en ions B mobilite reduite. Dans la pratique on donnera la preference soit au tampon modifie de Michaelis, soit au tampon de Longsworth, d'apres notre modifi- cation (Tableau I - Solutions 3 et 5). Lors de l'emploi du tampon original de Longsworth (Tableau I - Solution 4) on obtient Pgalement une bonne separation de la globuline a, et du delta, mais les electrodes doivent ktre couvertes d'une solution de chlorure de sodium, ce qui occasionne certaim desavan tages.

Introduction. Lorsqu'on effectue des recherches electrophoretiques d 'aprb la

methode classique de TisCZius, on emploie une solution tampon, dans laquelle on a dialyse la solution protkinique 5 examiner. Le choix de la solution tampon dependra du pH, de la force ionique ,u et des ions composants. La valeur du pH doit &re telle que les differentes fractions proteiniques puissent se mouvoir dans la mCme direction et que leurs mobilites aient entre-elles la plus grande difference possible. O n pro- pose en general dans la litterature un trajet de pH de 8 a 9. Pour diminuer l'effet delta et epsilon, on conseille en general une valeur pour la force ionique entre 0.1 ii 0.2. L'influence de la force ionique et de la concentration proteinique sur les diagrammes electro- phoretiques du serum ou plasma sanguin fut etudiee entre autres par

*) Nous remerdons vivement Monsieur le Professeur Dr. G. Vmlonck qui now a fourni le serum sanguin.

580

Perlmann et Kaufman 1) et Koenig, Perrings et Hogness 2 ) . En ce qui concerne les ions composants de la solution tampon, on prCfCre les anions a mobilite reduite, comme le veronal. I1 semble d‘aprks des re- cherches e,a. de Suensson 3) que les anions h mobilite reduite, ont une influence favorable sur la nettete des diagrammes.

Entre les dif ferentes solutions tampons, proposees dans la littera- ture, les solutions de Longsworth4) et de Michaelis5) ont la prefe- rence. De nos experiences electrophorktiques sur le serum sanguin humain avec la solution tampon de Michaelis h pH = 8 et ,u = 0.1 qui fut employee lors de nos recherches sur le lait et le sang bovin e), il ressort que les diagrammes obtenus sont caracterises par une mau- vaise separation entre l’albumine et la globuline ai et la globuline yr et le delta.

Dans le but d’amCliurer ces resultats, nous fimes des recherches concernant l’influence de la solution tampon sup le diagramme electroc phoretique du serum sanguin humain.

G. V. Heyndrickx et A. de Vleeschauwer,

MCfhodes. Plusieurs echantillons de Serum sanguin humain ont ete analyses dans differentes

solutions tampons, mentionnees dans le tableau I.

T a b l e a u I. Composition et proprietes des solutions tampons employ&.

PH

- -

8.0 8.9 8.9 8.6 8.6 -

P

- -

0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 -

x B 2%

0.00436 0.00463 0.00392 0.00321 0.00404

. .

Concentrations en grammes par litre

3.886 5.886 3.886 5.886

- 20.620 - 10.310

3.886 5.886

1.919 2.387

3.684

*) Modification propos6e par Wiedemann, Schweiz. Med. Woch. 76, 241 (1946). **) Nous proposons cette modification afin de ne pas &re oblige denvelopper

les electrodes par m e solution normale de chlorure de sodium, dans le but d’empecher la formation de gaz sur le p6le positif.

1) G. E. Perlmann et D. Kaufman, J. Am. Chem. Soc. 67, 638 (1945). 2) V. L. Koenig, J. D. Perrings et K. R. Hogness. Archiv. Biochem. 11,345 (1946). *) H. Suensson, Ark. Kemi, Min. Geol. 22 A, No. 10 (1946). 4) L. G. Longsworth, Chem. Rev. 30, 323 (1942). 5) MicMlis, B i d . 2. 234, 139 (1931). 0) G. v. Heydrickx et A. de Vleeschauwer, Biochim. Biophys. Acta 6, 487 (1951):

Experientia 8, 317 (1952); Bull. SOC. chim. biol. 34, 1016 (1952).

-

HQ __ -

0.365 0.073 0.073 - -. -

Recherches klectrophoretiques, etc. 73 (1954) RECUEIL 581

Ces recherches, exigeant m e assez grande quantite de serum. ont ete effectuees sur du sang de patients ayant une hypertension et une defaillance cardiaque. Ce sont des serums pathologiques, ce qui n'a pas une grande importance, puis ce qu'il s'agit de recherches comparatives du meme serum dans differentes solutions tampons.

Les dialyses ont 6t6 faites a 5" C. pendant quelques jours en employant les VisWng saucage Casings. Les experiences 6lectrophoretiques ont ete executes B 2°C. avec un courant de 25 mA. en employant l'appareil de Strubin B optique de Philpot- Svensson. Lanalyse des diagrammes obtenus fut effect* daprks la methode semi-automatique de Wiedemann 7). Les concentrations relatives furent calcul&i dapres I'analyse des diagrammes des frontikrcs ascendantes (p6le+), B cause de lh ,,,9 globulin disturbance" des diagrammes des frontikres descendantes, en tenant compte des corrections pour l'effet delta et epsilon dapres les formules de Long#- worth et Mac Innes8) et Wiedemanne).

Rtsultats et discussion. Dans les tableaux I1 et I11 sont mentionnes les resultats obtenus

avec cinq dchantillons de serum, examines dans les differentes solutions tampons et dans la fig. 1 sont reproduits les diagrammes des Cchantillons D et E.

En examinant les diagrammes, il apparait tout d'abord que ceux obtenus avec tous les serums dans la solution tampon no. 1 (Michaelis pH = 8 ) . montrent une separation peu caracterisge entre I'albumine et la globuline a,, tandis que dans les diagrammes obtenus avec les autres solutions tampons, cette separation est tres nette. La difference entre les mobilites de l'albumine et de la globuline a1 n'atteint que 0.9.10-5 dans la solution tampon no. 1, tandis que cette valeur atteint 1.1 a 1.3- 10-5 dans les autres solutions, ce qui d'ailleurs occasionne cette nette separation. En augmentant le pH de la solution tampon de 8.0 h 8.6 ou 8.9, la mobilite de l'albumine augmente plus que celle de la globuline xl, d'oo derive une plus grande difference entre les mobilites de ces deux fractions. Cette constatation est en pleine concordance avec celle que nous avons faite lors de recherches analo- gues sur des melanges de lait et d'albumine de serum sanguin 10). Pour l'examen de tels melanges, qui d'ailleurs existent in vivo dans certains cas pathologiques, il est intkressant d'obtenir une bonne separation entre la caseine a et l'albumine du serum qui la succede de tres p rh . Nous avons constate que pour obtenir une bonne separation. il est necessaire de diminuer le pH de la solution tampon jusqu'h 7.2 5 7.4 En diminuant le pH on obtient une diminution de la mobilite de l'albumine qui est beaucoup plus prononcee que celle de la caseine 9.

Outre une bonne separation de l'albumine et de la globuline nl, il

7) E. Wiedemann, Helv. Chim. Acta 30, 892 (1947). 8 ) L. G. Longsworth et D. A. Mc Innes, J. Am. Chem. SOC. 62, 705 (1940). 0 ) E. Wiedemann, Helv. Chirn. Acta 30, 168 (1947). 10) G. V. Heyndrickx et A. de Vleeschauwer, Meded. V1. Chem. Ver. 17, 167

(1955).

582 G. V. Heyndrickx et A. de Vleeschauwer,

Fig. 1. Diagrammes electrophol.etiques du serum sanguin humain. obtenus dans differentes solutions tampons.

Echantillon D Echantillon E

Solution no. 1 Solution no. 3

Solution no. 2

Solution no. 4

Solution no. 3

Solution no. 5

Solution no. 5

Recherches dectrophoretiques, etc. 7i (1955) RECUEIL 583

est egalement d'une importance essentielle d'obtenir une bonne separa- tion de la globuline y2 et du delta. I1 apparait que dans les diagrammes obtenus avec les solutions tampons no. 1 et 2 (Michaelis pH = 8 et pH = 8.9 - NaCl) cette separation est floue, tandis que dans ceux

-__--

_____

51.8 49.6 46.8

47.3 45.1 43.3 44.1

46.4 44.7 43.1 41.8

51.1 49.2 47.1 46.1

39.4 39.7 40.6

T a b l e a u 11. Concentrations relatives des differentes fractions.

4.8 6.0 5.4

6.2 7.9 7.7 6.8

6.0 5.2 6.1 5.6

5.5 5.1 4.9 5.8

6.6 5.6 5.8

A

B

C

D

E

* I I

544 545 547

548 549 550 552

564 560 566 562

569 570 57 1 572

597 60 1 599

-- --

1 2 5

1 2 3 5

1 2 3 5

1 2 3 5

3 4 5

- rJ" 0 0 3 0

8

3.7 6.0 5.2

9.6 7.9 7.0 8.6

7.5 8.4 8.2 7.2

5.8 7.1 5.6 5.4

7.2 6.8 6.9

~ .~

sc-

9 % 8

al

~ __

4.1 3.6 4.6

4.3 3.7 3.7 3.5

6.7 5.1 4.9 6.6

5.9 5.5 5.0 4.6

4.9 5.2 5.2

a"

3 -2 8

al U

__ ~

15.6 16.1 14.2

15.2 13.3 15.0 12.9

15.3 13.8 13.2 13.5

13.6 14.3 12.7 14.3

15.7 16.6 16.3

x' Q) e 3 0

8 ~ ~

8.1 7.2 8.5

5.9 7.9 6.3 6.6

7.5 8.1 7.8 8.5

7.4 6.1 7.0 6.8

11.5 11.9 10.2

x" al e 3 0

8 __ ~

11.9 11.5 14.9

11.5 14.2 17.0 17.5

10.6 14.7 16.7 16.8

10.7 12.7 17.7 17.0

14.7 14.2 15.0

') La composition de ces solutions est donnee dam le tableau I.

obtenus avec les solutions tampons no. 3 et 5 (Michaelis pH = 8.9 avec l'oxalate de potassium et la recette modifike de Longsworfh), la separation est trts nette. Lorsque la separation entre la globuline y2 et le delta est peu caracterisee, on attribue une trop grande surface au delta dans le comble mixte globuline-delta. La concentration qu'on trouve de ce fait pour la globuline y2 est trop petite, ce qui augmente indument la concentration des autres fractions, surtout de l'albumine. La concentration en globuline y2 n'atteint que 11.5 "/o dans I'Cchantillon

584 G. V. Heyndrickx et A. de Vleeschauwer, ~~~

B, analyse dans la solution tampon no. 1. tandis que cette valeur augmente respectivement jusqu'h 17.0 et 17.5 % dans les solutions tampons no. 3 et 5.

T a b l e a u 111. Mobilitks (X l0-a an' Volt-I s e c l ) -

Y U

*QI a f d 544 545 547

548 549 550 552

564 560 566 562

569 570 57 1 572

597 601 599

d R G 4 u' 7 -

___ __

1 2 5

1 2 3 5

1 2 3 5

1 2 3 5

3 4 5

-

i $ - ~

7.8 8.0 8.5

7.8 8.4 8.5 7.9

7.9 8.6 8.5 8.4

8.2 8.7 8.5 8.5

9.0 8.4 8.6

rT

ZJ 3 % 8

~ ~

6.9 6.9 7.4

6.9 7.2 7.4 6.8

7.0 7.4 7.3 7.3

7.3 7.5 7.4 7.3

7.8 7.1 7.5

F!

0)

3 0 8

~ __

5.6 5.5 5.9

5.7 5.6 5.7 5.4

5.5 5.7 5.7 5.7

6.0 6.0 5.7 5.8

6.2 5.7 6.0

,s B 4 3 ij - __

4.8 4.5 4.8

4.5 4.5 4.6 4.3

4.4 4.9 4.7 5.1

5.0 5.1 4.9 5.0

5.5 5.0 5.3

- < 8

B 2 0

~ ~

3.9 3.9 4.2

4.0 3.9 4.1 3.9

3.7 4.2 4.2 4.3

4.3 4.4 4.2 4.2

4.4 4.2 4.5

- >:

B

5 2 0

___ __

2.5 2.6 3.1

2.4 2.5 2.8 3.0

2.3 2.8 3.2 3.0

2.6 2.7 3.0 2.8

3.0 2.9 2.8

- z QI E

2 0

B - __

1.1 1.2 1.5

1.2 1.3 1.6 1.6

1 .o 1.3 1.5 1.4

1.1 1.1 1.3 1.3

1.5 1.8 1.3

1;

2% 25 2E '.

- ~

0.9 1.1 1.1

0.9 1.2 1.1 1.1

0.9 1.2 1.2 1.1

0.9 1.2 1.1 1.2

1.2 1.3 1.1

Les mobilites furent calculees par rapport 5 la position du comble epsilon. Quand la concentration en ions 2 mobilitt reduite dans la solution tampon est tres elevee, comme dans les solutions no. 3, 4 et 5, les combles delta et epsilon ne se deplacent pas et la separation avec la globuline y2 est t r b nette. Par contre, si la concentration en ions h mobilite rkduite n'atteint pas au mobs celle des solutions no. 3 ou 5, le gradient de sel migre ItgQement ( f 0.3.lO-5) ce qui occasionne la formation d'un comble mixte avec la globuline y2. Dans ce cas, la mobilite de la globuline y2 est inkrieure 2 celle obtenue lors d'une separation nette.

Recherches &ctropho&iques, etc. 73 (1954) RECUEIL 585

I1 est aussi a remarquer que les mobilites pour les mCmes fractions, obtenues dans les mCmes solutions tampons varient un peu B cause d'influences individuelles.

Dans le but de verifier les bons resultats obtenus avec les tampons no. 3 et 5, nous avons analyse un cinquikme tchantillon (E) qui fut de mCme examine dans le tampon original de Longsworth. Des resul- tats, il apparait que les diagrammes obtenus avec les solutions tampons no. 3 et 5 montrent a nouveau une separation nette de la globuline u1 et du delta. En ce qui concerne le diagramme obtenu avec la solution originale de Longsworth, il est caracterise. outre la bonne separation de la globuline ai, par un comble delta et mCme un comble epsilon qui sont tout a fait separes de la globuline y2. Ces resultats confirment que la separation entre le delta et la globuline yp est determinee par la concentration en veronal, qui est double dans la solution originale de Longsworth par rapport a la solution modifiee. Toutefois, il est a remarquer que la forme du comble delta et parfois d'autres combles dans le diagramme obtenu dans le tampon original est trts irrkgulitre, probablement ti cause d'une perturbation de l'kquilibre de dialyse, laquelle d'apres nous serait 2 attribuer au fait que les electrodes sont enveloppees par une solution de chlorure de sodium. Ces mCmes constatations furent faites lors de nos recherches sur des echantillons de serum de sang bovin. Vu ces desavantages, nous preferons les solutions tampons no. 3 et 5, qui donnent d'ailleurs une separation suffisante du delta, quoique moins complete qu'avec la solution originale de Longsworth.

Conclusions. Pour l'analyse klectrophoretique d'aprts la methode clascique ile

Tisdius du serum sanguin humain, nous preferons les solutions tampons no. 3 ou 5, mentionnees dans le tableau I, parcequ'iis donnent une separation nette des diffkrentes fractions protkiniques, surtout des globulines a1 et y2 et qu'on n'est pas oblige de couvrir les Clec- trodes lors des expkriences d'une solution saline.