Felhasznált és ajánlott irodalom

Felhasznált és ajánlott irodalom

Patobiokémia

Szarka András, Bánhegyi Gábor

Patobiokémia

Szarka András, Bánhegyi Gábor

Szerzői jog © 2014 Szarka András, Bánhegyi Gábor, Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem, Semmelweis Egyetem

Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Tartalom

Patobiokémia 0

0

1. Redox egyensúly: oxidatív stressz, antioxidánsok 0

1. 1.1. Oxidatív stressz 0

2. 1.2. Reaktív oxigénvegyületek 0

3. 1.3. Az oxigén tartalmú gyökök termelődésének legfontosabb helyszíne, a mitokondrium 0

4. 1.4. A lánc mely pontjain keletkezik a ROS? 0

5. 1.5. Más ROS termelő folyamatok a mitokondriumban 0

6. 1.6. A ROS alapszintű termelődése és eliminációja 0

2. Több mint antioxidáns – a C-vitamin patobiokémiája 0

1. 2.1. Fontos funkcióinak felismerése, hiánybetegsége a skorbut 0

2. 2.2. Mi áll a skorbut tüneteinek hátterében? A C-vitamin funkciói 0

3. 2.3. A C-vitamin felszívódása, sejtmembránon keresztüli transzportja 0

4. 2.4. C-vitamin az endoplazmatikus retikulumban 0

5. 2.5. C-vitamin a mitokondriumban 0

6. 2.6. Vajon milyen szerepet tölthet be a C-vitamin a mitokondriumban? 0

7. 2.7. Mennyi is az annyi? 0

3. A mitokondriális DNS és a mitokondriális betegségek 0

1. 3.1. A mtDNS eredete 0

2. 3.2. Bevezetés a mitokondriális betegségekbe 0

3. 3.3. Mitokondriális genetika: alapok 0

4. 3.4. Az emlős mtDNS replikációja és transzkripciója 0

5. 3.5. Homoplazmia és heteroplazmia 0

6. 3.6. A mutáns mtDNS szegregációja szomatikus szövetekben 0

7. 3.7. A mtDNS anyai öröklésmenetének princípiumai 0

8. 3.8. A mtDNS betegségek klinikai sajátságai 0

9. 3.9. Klasszikus mtDNS szindrómák 0

10. 3.10. Klinikai szindrómák, amelyek hátterében nagy valószínűséggel mtDNS eltérés áll 0

11. 3.11. A mtDNS rendellenességek szerepe gyakori betegségekben 0

4. Mitokondrium, oxidatív stressz és öregedés 0

1. 4.1. Oxidatív stressz és mitokondriális DNS 0

2. 4.2. ROS-mtDNS mutáció-ROS ördögi kör? 0

3. 4.3. Az mtDNS mutátor egér 0

4. 4.4. Egy váratlan fordulat: az mtDNS mutátor egér és a ROS kapcsolata 0

5. 4.5. Záró gondolatok, konklúzió 0

5. A fehérjék nem enzimes glikációja, késői glikációs végtermékek 0

1. 5.1. AGE képződés és szerkezet 0

2. 5.2. Külsődleges AGE források 0

3. 5.3. AGE keresztkötések kialakulása 0

4. 5.4. AGE és AGE receptor kapcsolat 0

5. 5.5. AGE metabolizmus 0

6. 5.6. Az AGE képződés következményei diabéteszben 0

7. 5.7. Az AGE képződés, mint terápiás célpont 0

6. A fehérjetekeredés (folding) patobiokémiája 0

1. 6.1. A fehérjeszerkezeti betegségek legnagyobb csoportja – az amiloidózisok 0

1.1. 6.1.1. Az amiloidózisok formái 0

1.2. 6.1.2. Szisztémás amiloidózisok 0

2. 6.2. Szövetspecifikus amiloidózisok 0

2.1. 6.2.1. Alzheimer betegség 0

2.2. 6.2.2. Parkinson kór 0

2.3. 6.2.3. Poliglutamin betegségek 0

3. 6.3. Prion betegségek 0

4. 6.4. Egyéb konformációs betegségek 0

7. A szekréciós pálya patobiokémiája és az UPR 0

1. 7.1. Fehérjeszintézis az endoplazmás retikulumon 0

1.1. 7.1.1. A szekréciós fehérjék minőségi ellenőrzése 0

2. 7.2. Az endoplazmás retikulum stressz 0

3. 7.3. Jelátvitel az endoplazmás retikulum és a sejtmag között 0

4. 7.4. Selejtfehérje válasz (unfolded protein response, UPR) 0

5. 7.5. A szekréciós pályával összefüggő betegségek 0

8. Fehérjelebontás – a lizoszóma 0

1. 8.1. A lizoszomális proteóma kialakulása 0

2. 8.2. A lebontandó szubsztrátok felvétele 0

2.1. 8.2.1. Extracelluláris szubsztrátok 0

2.2. 8.2.2. Intracelluláris szubsztrátok 0

2.3. 8.2.3. A végtermékek exportja 0

3. 8.3. Lizoszomális betegségek 0

3.1. 8.3.1. A lizoszóma biogenezis zavarai 0

3.2. 8.3.2. Lizoszomális tárolási betegségek 0

4. 8.4. A lizoszomális ion- és pH homeosztázis zavarai 0

9. Proteosztázis – az ubikvitináció/proteaszóma rendszer 0

10. Felhasznált és ajánlott irodalom 0

Patobiokémia

Patobiokémia

Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Az ábrák listája

1.1. A molekuláris oxigén lépésenkénti redukciója során kialakuló reaktív oxigénvegyületek 0

1.2. A Q ciklus 0

2.1. A kollagén hidroxilációja 0

2.2. Az aszkorbát szerepe a prolin hidroxilációjában 0

2.3. A C-vitamin (aszkorbát, DHA) plazmamembrán és intracelluláris transzport rendszerei, transzportja 0

2.4. A plazma C-vitamin koncentrációjának alakulása a C-vitamin bevitel függvényében 0

3.1. A mitokondriális DNS 0

5.1. A fehérjék nem enzimes glikációja 0

5.2. A késői glikációs termékek képződése 0

5.3. Néhány AGE vegyület szerkezete 0

Patobiokémia

Patobiokémia

Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Patobiokémia

Szarka András, Bánhegyi Gábor

Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem, Semmelweis Egyetem, 2014

© Szarka András, Bánhegyi Gábor

Typotex Kiadó, www.typotex.hu

ISBN: 978-963-279-178-4

Creative Commons NonCommercial-NoDerivs 3.0 (CC BY-NC-ND 3.0) A szerzők nevének feltüntetése mellett nem kereskedelmi céllal szabadon másolható, terjeszthető, megjelentethető és előadható, de nem módosítható.

Készült a TÁMOP-4.1.2/A/1-11/1-2011-0079 számú, „Konzorcium a biotechnológia aktív tanulásáért” című projekt keretében.

Patobiokémia

Patobiokémia

Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Kedves Olvasó!

A Patobiokémia tankönyv megírásakor két dologra törekedtünk, arra, hogy az olvasó érdeklődve lapozzon és várja a következő oldalt, élvezettel utazzon a gondolatok fonala mentén a sejtek világába. Emellett fontosnak tartottuk, hogy a tárgyalt probléma időszerű legyen és a legújabb ismereteket közvetítsük. Tekintve, hogy tankönyvünket elsősorban biomérnök M.Sc. hallgatóknak szánjuk feltételezzük, hogy az olvasó alapvető biokémiai, élettani, kórélettani és klinikai kémiai ismeretek birtokában van. Mindezen szempontokat figyelembe véve építettük fel a tankönyvet, amely így nem arra törekszik, hogy átfogó patobiokémiai ismereteket nyújtson, hanem arra, hogy néhány a szerkesztő és a szerzők által érdekesnek ítélt patobiokémiai problémával ismertesse meg az olvasót. Ennek megfelelően mondandónkat három fő, egymással összefüggésben levő problémakör köré szőttük. A tankönyv e három tartópillére az oxidatív stressz, amely területről szinte észrevétlenül váltunk a mitokondriális patobiokémiára, illetve a fehérjék megfelelő térszerkezetének kialakulása, ennek defektusai, illetve ezek megoldására irányuló (pato)biokémiai folyamatok. Ahogy említettük, a tankönyv elkészítésekor rendelkezésre álló legfrissebb irodalmi ismeretekre alapoztunk, ennek velejárója az átlagos tankönyvekhez képest jóval töményebb, szakkifejezésekkel sűrűbben átszőtt nyelvezet. Így reményeink szerint a tankönyv érdekessége mellett, segít be-, illetve átvezetni az olvasót a tudományos szakirodalom világába is, amely egy M.Sc. hallgató esetében kifejezetten kívánatos lehet.

A szerzők izgalmakkal teli, élvezetes utazásra invitálják az olvasót a patobiokémia világába.

Szarka András

Budapest, 2013. december 19.

Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Created by XMLmind XSL-FO Converter.

1. fejezet - Redox egyensúly: oxidatív stressz, antioxidánsok

1. 1.1. Oxidatív stressz

Mit is takar az oxidatív stressz kifejezés? Egy gyűjtőfogalom: az összes olyan biológiai folyamatot így nevezzük, amely során megbomlik az oxidáns és az antioxidáns rendszer közötti egyensúly. Az oxidatív stressz leggyakoribb kiváltói a nem kellő helyen és/vagy megnövekedett mennyiségben keletkezett szabad gyökök.

A szabad gyökök olyan molekulák vagy molekularészletek, amelyek párosítatlan elektront tartalmaznak a legkülső elektronhéjukon. Tekintettel arra, hogy az elektronok párképzésre hajlamosak, a magányos elektront tartalmazó molekulák nagy intenzitással keresnek más molekulákat, amelyektől elektronokat vonhatnak el. Így a szabad gyököknek nagy a reakciókészségük, könnyen és gyorsan kémiai reakcióba lépnek egymással vagy más vegyületekkel. A biológiai szempontból legfontosabb szabad gyökök az oxigén-, nitrogén- és kéncentrumú reaktív anyagok.

2. 1.2. Reaktív oxigénvegyületek

Az élet paradoxona, hogy az aerob léthez nélkülözhetetlen oxigénből a sejtek a biokémiai folyamatok melléktermékeként (a víz mellett) igen káros, redukált oxigénszármazékokat hoznak létre, amelyek nagy része szabadgyök. A molekuláris oxigén alapállapotban (ez a triplet oxigén) egyáltalán nem reaktív, azonban egyik elektron spinjének átfordításával (szinglet oxigén) vagy egy elektron felvételével aktiválódhat (szuperoxid anion, O2.-). Ezt követően további egyértékű redukciókon is keresztülmehet (a sor utolsó tagja természetesen a víz) (1.1. ábra). Ezen aktiválódott oxigénszármazékokat összefoglaló néven reaktív oxigénvegyületeknek hívjuk (reactive oxygen species, ROS).

1.1. ábra - A molekuláris oxigén lépésenkénti redukciója során kialakuló reaktív oxigénvegyületek

Fontos megemlíteni, hogy ide tartozik a hidrogén-peroxid is, ami nem szabad gyök, de fémionok hatására hidroxil gyököt képez (Fenton-reakció), amely a jelenleg ismert legerősebb oxidálószer. A hidrogén-peroxid azért is különösen fontos, mert töltéssel nem rendelkezik, így a membránokon könnyedén áthatolhat, ezáltal a sejt nem képes elkülöníteni, karanténba zárni.

A reaktív oxigénvegyületek képesek a legtöbb szerves vegyületet oxidálni, vagy gyököt képezni belőlük. Mindkét esetre nézzünk egy példát.

Az alábbi egyenletekben (1-4) egy szerves vegyületet hidroxil gyök oxidál, majd ezen alkil gyök redukálódik fémionok, triplet oxigén vagy éppen egy másik alkil gyök által.

(1)

(2)

(3)

(4)

Az alábbi egyenletekben (5-7) pedig szintén hidroxil gyök indít el egy láncreakciót, melynek során alkil-peroxidok és gyökök képződnek mindaddig, míg jelen van oxigén és oxidálható vegyület.

(5)

(6)

(7)

A fenti egyenletekből látszik a hidroxil gyök hihetetlen reaktivitása, így nem csoda, hogy a sejt számos védelmi mechanizmust fejlesztett ki, hogy elkerülje képződését. A legveszélyeztetettebb molekulák a telítetlen lipidek (ezáltal a sejtmembránok), a fehérjék és a DNS.

A lipidek esetében a hidroxil gyök indítja el a reakciót, mely a telítetlen kötésnél támadva (pl.: linolénsavnál a 11-es szénatomon), egy hidrogén elvonásával vízzé alakul és egy karbon gyököt hagy hátra, melynek párosítatlan elektronja megoszlik a 9-es és 13-as szénatomok között. Ez a gyök már könnyen reagál triplet oxigénnel, amely a sejtben bőségesen megtalálható. Ennek során peroxil gyök képződik, mely további zsírsavakat oxidálhat el. Látható, hogy a hidroxil gyöknek itt szikra-szerű szerepe van, a további reakciók során már csak az alapállapotú oxigén vesz részt.

Fehérjék esetén az oxidatív hatás specifikus aminosav módosulásokat, peptid fragmentációkat, keresztkötéseket, megváltozott töltéseloszlást, ezek által megváltozott funkciót eredményezhet. A legérzékenyebbek a kéntartalmú aminosavak: a hidroxil gyök a cisztein tiol csoportjáról egy hidrogén atomot elvonva tiil gyököt képez, amely ezt követően további tiil gyökökkel reagálva keresztkötéseket hozhat létre. Az oxigén a metioninra is addicionálódhat, metionin-szulfoxid származékokat eredményezve. Mindkét származék redukálható a tioredoxin és a tioredoxin oxidáz segítségével. Más oxidatív reakciók nem reverzibilisek, számos aminosav irreverzibilisen módosulhat a fehérje oxidációjakor pl. a fehérjék Fe-S centrumját a szuperoxid végérvényesen működésképtelenné teszi.

Az aktivált oxigén számos sérülést okozhat a DNS-ben, pl. deléciót, pont mutációt és más letális genetikai hatásokat válthat ki. Ismert, hogy a DNS cukor és bázis része is érzékeny az oxidációra, a bázis lebomlik, az adott szál elszakadhat, valamint fehérje keresztkötések képződhetnek. A lánc szakadásának oka a cukor hidroxil gyök kiváltotta oxidációja. In vitro sem a hidrogén-peroxid, sem a szuperoxid nem okoz láncszakadást fiziológiás körülmények között, így az in vivo toxicitásuk valószínűleg a fémionok által katalizált reakciók eredménye. A hidroxil gyök támadásának másik eredménye lehet a keresztkötések kialakulása a DNS és a fehérjék közt, melynek során a timin kovalens kötést alakít ki a ciszteinnel. Az ilyen nukleoproteineket nem lehet károsodás nélkül szétválasztani. Bár a keresztkötések kialakulásának esélye egy nagyságrenddel kisebb, mint a láncszakadásé, nehezen javítható, ezáltal az ilyen módosulás könnyen letálissá válhat. A DNS egyértelműen a sejt leggyengébb pontja a reaktív oxigénvegyületekkel szemben, mivel könnyen köti a fémionokat, lehetőséget ad a Fenton-reakció lejátszódására, valamint más makromolekulákhoz képest sokkal kevesebb károsodást visel el. Ez lehet az egyik oka annak, hogy az eukarióta sejtek a DNS tartalmukat, messze a légzési redox folyamatoktól, a sejtmagba helyezték.

3. 1.3. Az oxigén tartalmú gyökök termelődésének legfontosabb helyszíne, a mitokondrium

Reaktív oxigénvegyületek a sejt több pontján, organellumában és enzime által képződhetnek. Képződésükhöz jelentősebb mértékben hozzájárulnak a plazmamembrán egyes fehérjéi, mint például a NADPH oxidázok, a peroxiszóma lipid anyagcseréje, illetve változatos citoplazmatikus enzimek, mint például a ciklooxigenázok. Habár mindezek a folyamatok hozzájárulnak a teljes oxidatív terheléshez, a celluláris ROS legjelentősebb része (hozzávetőlegesen 90%-a) a mitokondriumból származik.

A mitokondriális ROS termelés az oxidatív foszforiláció következménye. A folyamaté, amely a NADH, illetve a FADH2 kontrollált oxidációja során a mitokondriális membrán két oldala között proton gradienst, potenciálkülönbséget (ΔΨ) hoz létre, majd ez a potenciálkülönbség hajtja meg az F1-F0 ATP-ázt, hogy az ADP-t ATP-vé foszforilálja. A NADH-ról, illetve FADH2-ről származó elektronok a citokróm lánc (vagy más néven a respirációs elektron transzfer lánc) során számos helyen direkt módon reagálhatnak az oxigénnel, vagy más elektron akceptorral szabad gyökök képződését eredményezve. Korábban a ROS és más szabad gyökök keletkezését egyszerűen csak az elektron transzfer lánc „megcsúszásának”, vagy egyféle nem produktív mellékreakciónak tekintették. A legújabb kísérleti eredmények azonban azt valószínűsítik, hogy a mitokondriális ROS termelés fontos redox jelátviteli szerepet tölt be, illetve felvetették szerepét az öregedéssel kapcsolatos folyamatokban is. Ez utóbbival külön fejezetben foglalkozunk.

Az elsősorban a TCA ciklusból érkező NADH a komplex I-nél oxidálódik. Miközben az elektronok a NADH-ról az első mobilis elektronszállítóra az ubikinonra kerülnek a felszabaduló energia a mitokondriális mátrixból történő protonpumpálásra fordítódik. Az ubikinon, az I-es komplex megkerülésével, a II-es komplex közvetítésével a FADH2-ről szintén kaphat elektronokat. Az ubikinol ezt követően a citokróm b-nek adja át az elektronokat a III-as komplexnél. Az elektronok a III-as komplexnél a citokróm c1-re kerülnek, miközben újfent protonok kerülnek a mátrixból a két membrán közti térbe. A citokróm c1-ről a második mobil elektronszállítóra a citokróm c-re kerülnek az elektronok. Az ily módon redukálódott citokróm c ezt követően redukálja a citokróm c oxidázban található citokróm a-t, a3-at a komplex IV-nél, amely aztán végső soron az oxigént vízzé redukálja. Ez utóbbi redox energia disszipáció szintén protonok mátrixból történő kipumpálásával jár együtt. Ily módon a respirációs elektron transzfer lánc a viszonylag stabil NADH és FADH2 redox energiáját a belső membrán két oldala között mérhető membránpotenciál különbséggé alakítja. Az elektrontranszferben történő „kisiklás” okozza a mitokondriális ROS termelést, amellyel kapcsolatban számos kérdés jogosan merülhet fel bennünk: A lánc mely pontjain keletkezik a ROS? Mi az alap ROS képződési ráta? Mi szabályozza a mitokondriális ROS termelést? Hogyan szabadul meg a mitokondrium a káros ROS-től?

4. 1.4. A lánc mely pontjain keletkezik a ROS?

A jelenleg elfogadott általános nézet szerint két helyen, az I-es és a III-as komplexnél keletkezik ROS nagyobb mennyiségben, azokon a pontokon, ahol az oxigén redukciójához képest nagy elektron potenciális energiaváltozás következik be. Azok a kísérletes manipulációk, amelyek az I-es, vagy III-as komplex redox potenciálját növelik, megnövelik a ROS termelődés mértékét is. Ez alátámasztani látszik azt a vélekedést, hogy ezen komplexek redox potenciálja fontos szerepet játszik a ROS termelődésben. A mitokondriális elektron transzfer lánc kevésbé ismert elemei közé tartozik az I-es komplex. Ez a több alegységből álló komplex mintegy 46 fehérjéből áll össze és molekulatömege meghaladja az 1000 kDa-t, legalább 1 flavin mononukleotidot és 8 vas-kén csoportot tartalmaz. Mind a vas-kén csoportok, mind a flavin mononukleotid részletek potenciális ROS termelő helynek számítanak. Harmadik potenciális szuperoxid produkciós helyként az ubikinon komplex I kötőhelyét (Qi) szokták emlegetni.

A komplex III esetében a Q ciklus jóval komplikáltabb történet. Ha a mitokondriális ROS termelés számszerű adatait tekintjük, akkor izolált mitokondriumokon nyert adatok alapján elmondhatjuk, hogy oxigénfogyasztásunk, mintegy 2-5%-a szuperoxid anion képződésre fordítódik és ennek a szuperoxid termelésnek mintegy 70-80%-áért a III-as komplex Q ciklusa felelős. Ezen becslések esetében azonban figyelembe kell vennünk néhány további tényt: a szuperoxid termelés sejttípus, illetve légzési állapot függő. Mindezen tényeket figyelembe véve egy jóval reálisabb jóslást kaphatunk, amely szerint fiziológiás körülmények között a szuperoxid termelés a respirációs ráta 0.1%-ának adódik. Ezek után vizsgáljuk meg alaposabban a Q-ciklust! A redukált ubikinol (miután az I-es és II-es komplexek felöl begyűjtötte az elektronokat) a Qo kötési helyére diffundál. Kötési helye a mitokondriális belső membrán citoszólhoz közeli felén található a vas-kén fehérje (Rieske fehérje) közelében. Elsőként egy elektron adódik át az ubikinolról (UQH2) a Rieske fehérjére két protont a citoplazmatikus oldalra átadva és UQ.- szemikinon gyök marad vissza a Qo helyhez kötve. A Rieske fehérje által átvett elektron továbbadódik a citokróm c1-re, majd a citokróm c-re, végül a citokróm c oxidázra. A második elektron a citoszólikus oldalhoz közel található bL hemre kerül, majd ezt követően ugyanazon fehérje bH hem csoportjára. Jelenleg azt gondoljuk, hogy az UQH2 és az UQ a hidrofób mag egyik helyéről a másikra szabadon vándorolhat, a proton motoros erőtől függetlenül, mivel ezek a hidrofób szállító molekulák nem rendelkeznek töltéssel. Egy másik a bH közelében található kinon kötőhely, a Qi lehetővé teszi a redukált bH-ról történő egy elektronos elektron transzfert, így a UQ.- képződését. A folyamat eredménye egy Qi kötőhelyhez erősen kötött szemikinon. A Q ciklus, következő szakaszában, egy második UQH2 molekula oxidálódik a már ismertetett módon a Qo helyen. Újfent egy elektron a citokróm c1-re kerül és egy másik pedig a bL-es keresztül a bH-ra. Ezen elektron révén bekövetkezik a UQ.- UQH2-vé történő redukciója, amelyhez a két proton a mátrix oldalról származik. Az UQH2 visszatér a fő ubikinon poolba és a Q ciklus bezárul. A Qo és a Qi ezen modell szerint nem ekvivalensek: kizárólag a Qi köti a szemikinont erősen. A Qo esetében termodinamikai és/vagy kinetikai kényszer hiányában a szemikinon mindössze csak átmenetileg létezik.

1.2. ábra - A Q ciklus

Forrás: Rigoulet M, Yoboue ED, Devin A: Mitochondrial ROS Generation and Its Regulation: Mechanisms Involved in H2O2Signaling ANTIOXIDANTS & REDOX SIGNALING 2011, 14, 459-468.

A III-as komplexnél található szuperoxid generátort kicsit jobban szemügyre véve két komponens kerülhet gyanúba, hogy elektronokat ad át az oxigénnek: a szemiubikion, illetve a citokróm b. Annak érdekében, hogy megállapítsák melyikük ad át közvetlenül elektronokat a dioxigénnek, specifikus III-as komplex (elektrontranszfer) gátlókat alkalmaztak. Elektrondonorként szukcinátot használva Antimycin A jelenlétében intakt patkány mitokondriumokat myxothiazollal kezelve, amely meggátolja a Rieske vas-kén fehérje redukcióját, a szuperoxid anionok képződése elkerülhető volt. Ehhez hasonlatosan a mitokondriális citokróm c depléciója gátolta, míg az antimycin A önmagában elősegítette a szuperoxidok keletkezését. Ezen eredmények alapján, úgy tűnik, hogy minden olyan tényező, amely a szemiubikinon képződését gátolja, az gátolja a szuperoxid keletkezését is. Mindezen megfigyelések összhangban vannak azzal a vélekedéssel, amely szerint a komplex III esetében a szemiubikinon az egyetlen redukált elektronszállító, amely képes a dioxigén szuperoxiddá történő redukciójára. A Q ciklus tehát képes a mitokondriális belső membrán belső és külső felszínén is szuperoxidot generálni. A szuperoxid nem képes átjutni a membránon, így igen fontos lenne az intermembrán tér és a mátrix relatív fluxusainak ismerete. Jelenleg azonban erre a kérdésre nem tudunk választ adni.

5. 1.5. Más ROS termelő folyamatok a mitokondriumban

Ahogy arról korábban említést tettünk, a respirációs elektrontranszfer lánc komplexeit tanulmányozták legrészletesebben a mitokondriális ROS termelés tekintetében. Mostanság azonban egyre gyakrabban keverednek gyanúba a mitokondriális dehidrogenázok is.

Az α-ketoglutarát dehidrogenáz enzimkomplex, amely az α-ketoglutarát szukcinil-KoA-vá történő oxidációját katalizálja NADH képződése mellett a citrát körben három enzimből épül fel: α-ketoglutarát dehidrogenáz (E1), dihidrolipoamid szukcinil-transzferáz (E2) és a dihidrolipoil dehidrogenáz (Dld, LADH, E3). Emlős agy mitokondriumok esetében a komplex ROS termeléséről számoltak be. A szuperoxid képződését a Dld flavin kofaktorához kötik. Ez a megfigyelés más mitokondriális flavoenzimek esetében is felveti a ROS képzés gyanúját, mint például a piruvát dehidrogenáz, amely szintén tartalmaz Dld részegységet. A glikolízis során a citoszólban keletkezett NADH mitokondriumba juttatását szolgáló glicerol-3-foszfát inga egy citoszólikus és egy mitokondriális glicerol-3-foszfát dehidrogenázból áll. A mitokondriális forma a belső membrán külső felszínén helyezkedik el és a glicerol-3-foszfátot dihidroxi-aceton-foszfáttá oxidálja, miközben elektronokat juttat az ubikinonra. Tekintve, hogy az enzim nem rendelkezik ubikinon kötőhellyel, ami növelhetné a szemiubikinon védelmét, az enzimet egy potenciális ROS forrásként tartják számon.

Jó néhány éve galamb és patkány mitokondrium esetében palmitoil-karnitint alkalmazva szubsztrátként H2O2 termelődést lehetett mérni. A hidrogén-peroxid termelődés a respirációs lánctól függetlennek bizonyult és egyértelműen a mátrix oldalon jelentkezett. A lipid anyagcsere és a ROS keletkezés között meglévő kapcsolat felderítése újabb lendületet kapott a felfedezéssel, amely szerint számos rendellenesség, mint például a diabétesz sajátja a megváltozott lipidanyagcsere, illetve oxidatív stressz. Vázizomban kimutatták, hogy az oxidatív stressz inzulinrezisztenciához vezet. A korábbi megfigyeléssel összhangban sikerült kimutatni, hogy alacsony, fiziológiás palmitoil-karnitin koncentráció mellett a vázizmokban szignifikáns mértékű ROS keletkezik, amelynek meglehetősen csekély hatása van a mitokondriális membránpotenciálra.

6. 1.6. A ROS alapszintű termelődése és eliminációja

Az irodalom nem egységes azzal a kérdéssel kapcsolatban, hogy milyen mértékben keletkezik az alap mitokondriális oxigénfogyasztás során ROS. Ez nem meglepő, hisz a tanulmányok meglehetősen nagy része izolált mitokondriumokon készül, amelyekben a redox alkotók közel sem fiziológiás állapotban találhatóak, így a redox potenciál értékük is módosult, valamint a reverz elektronáram sem zárható ki (ami tekintélyes mértékű ROS képződést generálhat). Mindezen megfigyelések alapján azt valószínűsítették, hogy a teljes oxigénfogyasztás, mintegy 2%-a fordítódik ROS termelődésére. A korábban említett mesterséges vizsgálati körülményekből fakadó limitáló tényezők ellenére ezt az értéket igen széles körben idézték és alapul vették. Később, a fiziológiás körülményeket sokkal inkább megközelítő körülmények között elvégzett vizsgálatok a korábbi értéket egy nagyságrenddel 0.2%-ra csökkentették. Ez az alacsonyabb érték természetesen nem azt jelenti, hogy az alap ROS szint jelentéktelen, mindössze csak annyit, hogy a mitokondriális ROS termelés a legtöbb szövet esetében nem annyira súlyos mértékű, mint azt korábban gondoltuk.

Ahogy arról még szót ejtünk, a szuperoxid diszmutáz (SOD) felfedezése kulcsszerepet játszott a mitokondriális ROS és H2O2 termelődés megértése szempontjából. A sejtben két intracelluláris SOD fordul elő: SOD2, egy mangán-függő enzim a mátrixban, illetve a SOD1, egy réztartalmú enzim elsősorban a citoszólban. Mindkét enzim a szuperoxidot (O2-) alakítja H2O2-dá, amelyet ezt követően a kataláz hatástalanít. Ez utóbbi folyamat során víz és oxigén keletkezik. A kataláz mellett fontos megemlítenünk a glutation peroxidázokat, amelyek szintén a H2O2 vízzé alakításában játszanak fontos szerepet. Sőt a mitokondriumban a kataláz hiányában a glutation peroxidázok játszanak igen fontos szerepet. A szuperoxid, amely nem kerül azon nyomban hatástalanításra közvetlenül reagálhat az oxidált citokróm c-vel vagy a citokróm c oxidázzal. A mátrix azon tulajdonságát, amely szerint képes egész nagymértékű ROS terheléssel is megbirkózni jól demonstrálta 1 mM mátrix NADH NAD+-dá és 2 ROS-sá történő rapid fotooxidációja. Ez a rendkívül hatékony ROS eltávolító rendszer azt valószínűsíti, hogy a mitokondriumból felszabaduló és így mérhető ROS mindössze csak igen csekély hányada lehet az ott keletkező teljes ROS mennyiségnek.

Redox egyensúly: oxidatív stressz, antioxidánsok

Redox egyensúly: oxidatív stressz, antioxidánsok

Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Created by XMLmind XSL-FO Converter.

2. fejezet - Több mint antioxidáns – a C-vitamin patobiokémiája

Az enzimes antioxidánsokon kívül számos kis molsúlyú molekuláról gondoljuk, hogy antioxidáns tulajdonsággal rendelkezik. Ezek között találunk olyanokat, amelyeket szervezetünk képes előállítani, mint például a bilirubint, a liponsavat, az ubikinont, vagy a húgysavat, másokat pedig a táplálékkal kell felvennünk, mint például az E-, vagy a C-vitamint. Természetesen ez a felsorolás sem lehet teljes, ennyi különböző molekulával pedig nem tudunk jelen tankönyv keretében foglalkozni, ezért kiválasztottunk egyet, a sok közül, amellyel egy kicsit bensőségesebb viszonyt teremtünk. Választásunk, talán nem is oly meglepő módon, a C-vitaminra esett. Valószínűleg nincs még egy ilyen molekula, amelyet ennyi legenda övezne és ennyire erős kötelékek kötnének a magyar (pato)biokémia múltjához és jelenéhez.

1. 2.1. Fontos funkcióinak felismerése, hiánybetegsége a skorbut

Hiánybetegségét, a skorbutot már az egyiptomiak is leírták, a figyelem középpontjába a XV-XVIII század között a nagy felfedezések idején került, amikor a tengerészek rettegett betegsége lett. A skorbut legjellemzőbb tünetei, melyek patobiokémiai hátterével a későbbiekben foglalkozni fogunk a fragilis erek, fogvesztés, lassú sebgyógyulás, már bezáródott sebek újra kinyílása, csontfájdalmak, csontleépülés, szívelégtelenség, enyhébb hiány esetében, gyengeség, légúti fertőző betegségek kialakulása. A skorbutról és lehetséges kezelési módjáról az első komoly tudományos munkát „A treatise of the scurvy” címmel James Lind közölte 1753-ban. Dr. Lind a Salisbury hajó orvosaként, a hasonló állapotú skorbutos betegeket csoportokra osztotta, majd mindegyik csoportnak különböző diétát írt elő (kontroll csoport, vitriol, ecet, tenger víz, narancs-citrom, szerecsendió). Az első ismert kontrollcsoportos kísérlet eredményeként megállapította, hogy a skorbut leghatásosabb ellenszere a citrusdiéta. Majd kétszáz év telt el mire kiderült, hogy a James Lind narancsaiban található „skorbut ellenes faktor” egy hat szénatomos cukorszármazék, az aszkorbinsav. Az aszkorbinsavat marha mellékveséből, narancsból és káposztából elsőként Szent-Györgyi Albert izolálta 1928-ban. Kezdetben egy mellékvesehormonnak vélte és rendkívül csodálkozott, hogy az növényekben is előfordul, ezért kezdetben az „ignose” (csuda tudja) és „godnose” (Isten tudja) elnevezéseket javasolta, majd a skorbut ellenes hatásra utalva, az újonnan felfedezett anyag szerkezetének felderítőjével, Walter N Haworth-tel együtt az aszkorbinsav elnevezés mellett döntöttek.

2. 2.2. Mi áll a skorbut tüneteinek hátterében? A C-vitamin funkciói

Az aszkorbinsav az emlős sejtekben legalább 8 enzim kofaktora. Ezek közül vitathatatlanul a legismertebb a proli- és lizil-hidroxiláz, amelyek fontos szerepet töltenek be a kollagén bioszintézisben. A prolil- és aszparaginil-hidroxiláz pedig az O2 érzékelésben. Az említett enzimek mindegyike aktív helyükön vasat tartalmaz. Az aszkorbinsav hiányában szintetizált kollagén nem kellő mértékben hidroxilált és így nem formál megfelelő szálakat, ennek következménye a kötőszöveti elégtelenség, a lassú sebgyógyulás, a fragilis erek. Állapotos nők esetében a nem megfelelő kollagén szintézis a magzatburok korai repedését is okozhatja. A réz tartalmú enzim, a dopamin-β-hidroxiláz szintén aszkorbátot igényel. A szóban forgó enzim, felelős a dopamin noradrenalin átalakulásért. Nem megfelelő működése okozhatja a skorbutban tapasztalható hangulatváltozást, letargiát. A zsírsav anyagcseréjében kulcsszerepet játszó karnitin bioszintézise során két enzim nélkülözhetetlen kofaktora az aszkorbát, így hiányában a karnitin bioszintézis is hiányt szenved, amely következménye az elégtelen zsírsavoxidáció, amely csökkent mértékű oxidatív foszforilációhoz, ATP hiányhoz vezet. Így ez utóbbi következménye lehet a skorbutban tapasztalható gyengeség, fáradtság. További aszkorbátot igénylő enzimek vesznek részt a tirozin anyagcserében, illetve a peptid hormonok stabilitásához szükséges amid csoportok hormonmolekulákra juttatásában.

Itt meg kell álljunk egy szóra! A bevezetőben említett legendák közül szeretnénk kettőt kiválasztani és egy kicsit részletesebben foglalkozni velük. Az első ilyen legenda az aszkorbinsav kollagén hidroxilációban betöltött szerepe. Ahogy láttuk a legtöbb skorbut tünet hátterében az elégtelen kollagén hidroxilációból fakadó kötőszöveti rendellenesség áll.

Az emberi testhőmérsékleten végbementő termostabil tripla helikális kollagén szerkezethez elengedhetetlen a prolin és lizin oldalláncok hidroxilációja. A prolin hidroxilációja -X-Pro-Gly- tripleteknél következik be, a reakciót a kollagén prolil 4-hidroxiláz katalizálja. Az enzim az endoplazmás retikulum lumenében található, 2-oxoglutarátot (α-ketoglutarátot), oxigént, ferro vasat és aszkorbátot igényel működéséhez (2.1. ábra). A kollagénben található lizin hidroxilációja a X-Lys-Gly részleteknél következik be. A folyamatot a lizil 5-hidroxiláz katalizálja, amely a prolil 4-hidroxilázhoz hasonlóan kofaktorként 2-oxoglutarátot, ferro vasat és oxigént igényel. A lizil 5-hidroxiláz szintén az endolpazmás retikulum lumenében található homodimer formában.

2.1. ábra - A kollagén hidroxilációja

Ebből fakad az első legenda, amely szerint a hidroxilációhoz aszkorbát szükséges. A valóság azonban az, hogy a hidroxiláció maga nem igényli az aszkorbát jelenlétét. A hidroxilázok két folyamatban játszanak szerepet: az egyikben az oldalláncok hidroxilálódnak, míg a 2-oxoglutarát dekarboxilálódik és molekuláris oxigén fogy (2.2. ábra). A molekuláris oxigén atomjai a hidroxil csoportba, illetve a szukcinát újonnan képződő karboxil csoportjába épülnek be. Ez a reakció aszkorbát-független. A hidroxilázok által katalizált másik reakció a 2-oxoglutarát dekarboxilezése, amely a hidroxilációtól függetlenül zajlik, de szintén molekuláris oxigént igényel azonban aszkorbát-függő (2.2. ábra). Ez esetben, a ferro vas oxidálódik (ferri vassá) és a fehérje mindaddig inaktív marad, amíg a ferri vasat az aszkorbát vissza nem redukálja ferro vassá. Habár ez utóbbi reakcióarány meglehetősen alacsony (1-4%), de még a (hidroxilálandó) szubsztrátfehérjék telítési koncentrációja mellett is lejátszódik, így az aszkorbát elengedhetetlen az oxidált enzim újraaktiválásához. A lizil hidroxiláció esetében az aszkorbátot helyettesíteni tudták DTT-vel és ciszteinnel, igaz jóval kisebb reakció rátával. Az aszkorbinsav funkciónak tárgyalásakor a hidroxilációban betöltött szerepét követően egészen biztos antioxidáns szerepköre következik, ha nem ez kerül elsőként tárgyalásra.

2.2. ábra - Az aszkorbát szerepe a prolin hidroxilációjában

Antioxidáns sajátságok: Az aszkorbát talán legismertebb kémiai sajátsága, hogy redukálószerként képes viselkedni. Erre kiváló példát szolgáltat, hogy a duodénumban a ferri (III) vasat ferro (II) vassá redukálja, így elősegítve a vas felvételét, a korábban már említett módon a lizil-, aszparaginil- és prolil-hidroxázokat aktív formában tartja azáltal, hogy az aktív centrumban található vas iont ferro vassá redukálja. Ha megnézzük az aszkorbát redox potenciálját (DHA/AFR: -0,17 V, AFR/aszkorbát: 0,28 V), megállapíthatjuk, hogy képes az olyan reaktív vegyületek, mint a hidroxil gyök (OH., H+/ H2O: 2,31 V), és a szuperoxid anion (O2.-, 2H+/H2O2: 0,94), vagy az urát gyök (HU.-, H+/UH2-:0,59 V) redukciójára. Az aszkorbát egy elektron átadásával (donálásával) szemidehidroaszkorbáttá, vagy más néven aszkorbil gyökké (AFR), ami további oxidációval dehidroaszkorbáttá (DHA) alakul. Az aszkorbil gyök nem túlságosan reaktív, mivel sem igazán oxidáló, sem igazán redukáló sajátságokkal nem rendelkezik és a molekuláris oxigén szuperoxiddá történő redukciójára sem képes lényeges mértékben (ha egyáltalán reakcióba lép vele). Az aszkorbil gyök gyenge reaktivitása adja az aszkorbát antioxidáns sajátságának esszenciáját: a reaktív vegyületek reakcióba lépnek az aszkorbáttal és egy jóval kisebb mértékben reaktív vegyület az aszkorbil gyök képződik.

Az aszkorbil gyök lassú diszproporcionálódáson mehet keresztül, amely révén az aszkorbát egy része regenerálódhat.

A DHA vizes oldatban igen instabil és a lakton gyűrű felnyílásával diketo-gulonáttá alakul. Az aszkorbát vizes oldatban pH=7.4-en stabil, hacsak nincsenek átmeneti fém ionok az oldatban, amelyek az aszkorbát igen gyors oxidációját katalizálják. A réz sók igen kiváló katalizátorok, így ha C-vitaminban gazdag táplálékot szeretnénk enni, rézedényben ne tároljuk, vagy készítsük el a zöldségeket. A réz és a vas az aszkorbát igen gyors oxidációját váltják ki, amely során H2O2 és .OH keletkezik. Az irodalomban számos helyen előforduló beszámolókat, amelyek szerint az aszkorbát károsítja a DNS-t, illetve különféle állati, köztük tumor sejteket minden bizonnyal a médiumban található átmenetifémek kiváltotta ROS képződése okozza.

Itt az ideje, hogy a másik ködbe vesző aszkorbát legendával foglalkozzunk! A molekula megismerését követően viszonylag gyorsan fellángoltak a viták, hogy milyen mennyiségben érdemes fogyasztanunk. A skorbut kialakulása már 10 mg/nap bevitelével elkerülhető, a napi ajánlott bevitel Magyarországon jelenleg 60 mg/nap, terápiás céllal azonban akár néhány ezer mg/nap aszkorbátot is a szervezetbe szoktak juttatni. Tekintve, hogy a C-vitamin vízoldható molekula kizárólag különböző membránba ágyazott transzporterek segítségével juthat el a sejtekbe, sejtorganellumokba. A következőkben a különböző C-vitamin transzportereket kívánjuk áttekinteni, továbbá a transzporterek kinetikai tulajdonságai alapján gyakorlati érvényű becslést adni az ésszerű aszkorbát bevitelről.

3. 2.3. A C-vitamin felszívódása, sejtmembránon keresztüli transzportja

A C-vitamin szükségletünket természetes források és étrend kiegészítők fogyasztásából fedezzük. A C-vitamin, étrendben található leggyakoribb formája, az L-aszkorbinsav és annak oxidált formája, az L-dehidroaszkorbinsav (DHA). Luminális oldali (kefeszegélyű) membrán vezikulum transzportaktivitása alapján megállapíthatjuk, hogy az aszkorbát és a DHA egyaránt felszívódik az emberi bélrendszer teljes hosszában. Mind az aszkorbát, mind a DHA felvétel, növekvő szubsztrát koncentráció hatására telíthetőnek bizonyult. Mindezen megfigyelések nagy affinitású ligand-transzporter kölcsönhatásra utalnak.

A redukált forma, az L-aszkorbinsav felvétele aktív mechanizmus során valósul meg, két nátrium-függő C-vitamin transzporter (SVCT1 és SVCT2) segítségével (2.3. ábra), amelyek klónozása először 1999-ben valósult meg. Az SVCT1 egy nagy kapacitású, de kis affinitású (Km: 65-237 μM) aszkorbát transzporter. Előfordulása igen kifejezett az epitheliális szövetekben, ahol funkcióját, a szervezet C-vitamin homeosztázisának fenntartását, a táplálékkal bevitt aszkorbát felszívása, illetve a vesékben a visszaszívás révén fejti ki. Az SVCT1 transzporter gén kiütése 7-10-szeresére emelte a C-vitamin vizeletbe történő ürítésének mértékét. Ezzel párhuzamosan a C-vitamin vérszintje 50-70%-kal csökkent homozigóta mutánsok esetén a vadtípusú társakhoz képest.

Az SVCT2 egy kis kapacitású, nagy affinitású (Km: 8-62 μM) transzporter. Az intracelluláris redox státusz fenntartása érdekében széles körben fejeződik ki, az aktív anyagcserét folytató és specializált sejtekben, szövetekben. Az SVCT2 génkiütött mutánsokkal végzett kísérletek alapján az SVCT2 elengedhetetlen a prenatális aszkorbinsav transzportfolyamatokhoz. Fontos szerepet tölt be a C-vitamin placentán keresztül történő transzportjában. A homozigóta génkiütött mutánsokat légzési elégtelenség és intracerebralis haemorrhagia jellemezte.

A human jejunum luminális oldali membránjának DHA felvételi karakterisztikája egyértelműen különbözött az aszkorbát felvételétől. A DHA felvétele kis affinitású (Km ≈ 0,8 mM) nátrium-független facilitált diffúzióval valósul meg (2.3. ábra). A glukóz gátolta az aszkorbát felvételét, de a DHA felvételt nem. Ugyanakkor a transzport gátlási profil kizárta az SGLT1 (nátrium-függő glukóz transzporter) szerepét az aszkorbát transzportban. A bélcsatornából történő DHA felszívódásért felelős transzporter fehérjét a mai napig sem sikerült azonosítani.

2.3. ábra - A C-vitamin (aszkorbát, DHA) plazmamembrán és intracelluláris transzport rendszerei, transzportja

A C-vitamin plazma koncentrációja orális bevitel esetén igen feszes szabályozás alatt áll. Ennek következtében növekvő orális dózisok mellett a C-vitamin plazma koncentrációja egy telítési értékhez tart (2.4. ábra). Ennek két fő oka van: egyrészt, ahogyan arról már az előző bekezdésben szó volt, a transzporter fehérjék kapacitása korlátozott, másrészt pedig a két nátrium-függő transzporter aktivitását, a saját ligandja (az aszkorbát) finomra hangolja. A béllumen megemelkedett aszkorbát koncentrációja az SVCT1 mRNS szintjének csökkenését eredményezte enterocitákban. Az aszkorbát hasonló szabályozó szerepéről számoltak be SVCT2 esetén vérlemezkékben is. A közelmúltban derült ki, hogy a vázizom sejtek az SVCT2 transzporter expresszióját redox-állapotuk függvényében szabályozzák. Az SVCT2 mRNS és fehérje szintje egyaránt megemelkedett myotubulusok hidrogén-peroxiddal történt kezelését követően, ugyanakkor liponsavas antioxidáns kezelés hatására expressziója csökkent. Valószínűnek tűnik tehát, hogy a sejt redox állapota befolyásolja az SVCT2 expresszióját, ily módon az aszkorbát transzport és az intracelluláris koncentráció befolyásolásával reagálni képes a változó körülményekre.

A C-vitamin plazmakoncentrációját nemcsak a felszívódás, de a vesében, az SVCT1 által történő visszaszívás is befolyásolja. Ennek megfelelően a biológiai hasznosíthatósága alacsonyabb dózisoknál majdnem teljes és a dózis növekedtével csökken: 30 mg esetén 87%, 100 mg esetén 80%, 200 mg esetén 72%, 500 mg esetén 63% és 1250 mg esetén kevesebb, mint 50%. Ezt a megfigyelést alátámasztotta a C-vitamin 3-kompartimentum farmakokinetikai modellje is. A modell alapján egyszeri 3 g-os orális dózis – a maximális tolerálható egyszeri dózis – 206 µmol/l csúcs plazmakoncentrációt eredményez, ehhez képest az 1,25 g-os dózis ettől csekély mértékben különböző 187µmol/l-es plazmakoncentrációt eredményez. Végezetül 200 mg esetén – amely mennyiség egy C-vitaminban gazdag táplálék elfogyasztásából származik – a koncentrációcsúcs 90 μmol/l körül várható.

A DHA és a glukóz között fennálló szerkezeti hasonlóság miatt, már korán felmerült a glukóz transzporterek lehetséges szerepe a DHA sejtbe történő felvételében. S valóban Xenopus oocita expressziós modellrendszerben igazolták a GLUT1, GLUT3 és esetlegesen a GLUT4 részvételét a plazmamembránon keresztüli DHA felvételben (2.3. ábra). A DHA felvételét a szerkezeti analóg 2-deoxi-glukózzal, illetve a facilitált hexóz transzport gátló cytochalasin B gátolta. A látszólagos Km értékek (GLUT1: 1.1 mM, GLUT3: 1.7 mM, for GLUT4: 0.98 mM) az SVCT transzporterekénél kisebb affinitású transzportfolyamatokról tanúskodnak. A gyors intracelluláris DHA redukció egyfelől tekintélyes DHA gradiens fenntartását eredményezi, másfelől egy olyan vegyületet, amely nem szubsztrátja a GLUT transzportereknek. A DHA formában, GLUT transzportereken keresztül, sejtekbe jutó C-vitamin mennyiségét mindazonáltal rendkívül nehéz megítélni, nehéz, mert normális fiziológiás körülmények között a glukóz jelentős kompetáló partnerként szerepel, ez a kompetíció a magasabb vércukorszinttel járó diabéteszben természetesen még fokozottabb mértékben jelentkezhet. Érdemes megemlíteni, hogy a vitamin a plazmában elsősorban redukált formában található, ami szintén az SVCT transzporterek hangsúlyosabb transzport szerepét húzza alá. Ugyanakkor fontos megjegyeznünk, hogy a humán diéta a redukált aszkorbát mellett, jelentős mennyiségben DHA-t is tartalmaz, illetve jelentős mennyiségben keletkezik a gasztrointesztinális traktus lumenében az aszkorbát oxidánsokkal történő reakciójában. Ezen kívül a DHA extracelluláris koncentrációja jelentős mértékű növekedést mutat olyan patológiás állapotokban, mint például a gyulladás. Igen valószínű, hogy ilyen és hasonló állapotokban a lokális prooxidáns produkció fokozza az aszkorbát, DHA átalakulást, mely révén előtérbe kerül a glukóz transzportereken keresztül történő C-vitamin transzport is.

2.4. ábra - A plazma C-vitamin koncentrációjának alakulása a C-vitamin bevitel függvényében

Forrás: Levine M, Conry-Cantilena C, Wang Y, Welch RW, Washko PW, Dhariwal KR, Park JB, Lazarev A, Graumlich JF, King J, Cantilena LR.: Vitamin C pharmacokinetics in healthy volunteers: evidence for a recommended dietary allowance. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996, 93, 3704-3709.

A transzporterek telíthetősége, illetve a redox státusz redukált irányba történő eltolódása (amely szükségszerűen bekövetkezik magas C-vitamin dózisok esetén) következtében fellépő SVCT transzportfehérje szupresszió miatt az orális adagolás révén elérhető plazmakoncentráció erősen korlátos. Gyakorlatilag 200-400 mg/nap orális dózis esetén (itt érdemes megjegyezni, hogy a jelenlegi napi ajánlott bevitel mindössze 60 mg/nap) elérjük a telítési (80 μM körüli) plazmakoncentrációt (2.4. ábra). Ennél magasabb plazmakoncentrációt intravénás aszkorbát adagolással lehetséges elérni, ahol az intesztinális korlátok megszűnnek, kizárólag a vesén keresztüli ürüléssel kell komolyan számolnunk. Ezt a módszert alkalmazzák terápiás aszkorbát plazmakoncentráció elérésére.

4. 2.4. C-vitamin az endoplazmatikus retikulumban

Az aszkorbát intracelluláris importját követően további kompartmentalizáción megy keresztül. Az endomembrán-rendszerhez kötött aszkorbát termelő és felhasználó útvonalak, valamint a fehérje hidroxilációban és luminális reaktív oxigénvegyület képződés eliminálásban betöltött szerepe miatt, korán az érdeklődés homlokterébe került az endoplazmatikus retikulumba (ER) történő aszkorbát és DHA transzport. Patkánymáj endoplazmatikus retikulum eredetű mikroszómán végzett kísérletek alapján az aszkorbát vezikuláris felvétele preferáltan DHA formájában történik GLUT-típusú transzportfehérjéken keresztül, majd a lumenben visszaredukálódik aszkorbáttá (2.3. ábra).

Az ER lumenben az aszkorbát több hidroxiláz kofaktora (prolin- és lizin-hidroxiláz), valamint itt történik az ER-asszociált L-gulonolakton-oxidáz által katalizált aszkorbát bioszintézis utolsó lépése is az arra képes állati fajokban. Mindemellett az aszkorbát jelenlétét antioxidáns sajátsága nélkülözhetetlenné teszik az itt lejátszódó reaktív oxigénvegyület termeléssel járó folyamatok, mint például a fehérjefolding.

Ahogy már említettük a lumenben lejátszódó hidroxiláció nagy szerepet kap a szekrécióra kerülő kollagén termostabil triplahelikális szerkezetének kialakításában. A prolin hidroxilációja a kollagén-prolin-4-hidroxiláz (C-P4H) által katalizált reakcióban X-Pro-Gly tripletmotívumokon történik. A folyamat zavartalan lejátszódásához az enzim 2-oxoglutarát, oxigén, Fe2+ és aszkorbát kofaktorokat igényel.

A C-P4H szerkezete α2β2 heterotetramer, amelynek β-alegysége a fehérjefolding folyamatában kiemelt szereppel bíró PDI (Protein Diszulfid Izomeráz).

A lizin hidroxilációja a homodimer lizin-5-hidroxiláz (L5H) katalizálta reakció során X-Lys-Gly motívumokon történik. A folyamat zavartalan lejátszódásához az enzim kofaktorigénye megegyezik a C-P4H-val. Számos patológiás, a kötőszövetet érintő betegség köthető a L5H-t kódoló génekhez. Az L5H-1 izoformát kódoló PLOD1 gén mutációja kyphoscoliosis (Ehlers-Danlos Szindróma VI-os típus, EDS VI) kialakulásával jár, míg az L5H-2 izoforma PLOD2 mutációja a Bruck 2-es szindrómával hozható összefüggésbe, amelyben a lizin oldalláncok csökkent mértékű hidroxilációja figyelhető meg.

A fent említett hidroxilációs reakciók csökkent aszkorbát mennyiség mellett alulműködnek, és patológiás esetekhez vezetnek. A skorbut kialakulása az aszkorbinsav hiánybetegsége, amely egy részről a kollagén struktúrfehérje csökkent mértékű hidroxiláltságából fakadó stabilitási problémáknak tudható be, másrészről pedig a fáradékonyság és a depresszió az aszkorbinsav-függő metabolitok (mint pl. a karnitin, dopamin) bioszintézisének hiányából fakad.

5. 2.5. C-vitamin a mitokondriumban

Habár a mitokondriális aszkorbát/dehidroaszkorbát transzport megléte több mint 30 éve ismert, mégis számos részlet csak a közelmúltban vált ismertté. Szarka András és Bánhegyi Gábor 2004-ben tett megfigyelését, mely szerint a C-vitamin dehidroaszkorbát formában kerül a mitokondriumba egy évvel később Golde és munkatársai humán vese sejtkultúra eredetű mitokondriumok esetén is megerősítették. Sztereoszelektív, a dehidroaszkorbát transzporttal kompetáló mitokondriális D-glukóz felvételt tudtunk megfigyelni. Az in silico tanulmányokkal összhangban, a GLUT1 transzporter mitokondriális jelenlétét (2.3. ábra) alátámasztották a GFP és az immunoblot vizsgálatok is.

A GLUT1 kizárólagos mitokondriális C-vitamin transzporter hegemóniáját Lee és munkatársainak 2010-es megfigyelése törte meg, mely szerint az aorta simaizom sejtek, illetve inzulin-stimulálta adipociták mitokondriumaiban jelentős mértékű GLUT10 kifejeződés figyelhető meg. A külsődlegesen kifejezett GLUT10 fokozni tudta a mitokondriumba belépő jelölt dehidroaszkorbát mennyiségét, ezzel párhuzamosan csökkent a hidrogén-peroxid kezelt simaizom sejtekben mérhető reaktív oxigénvegyületek mennyisége is. Ez a védőhatás adipociták esetében fokozható volt inzulinkezeléssel, illetve felfüggeszthető volt glukóz előkezeléssel, vagy GLUT10 mRNS interferenciával simaizom sejtekben.

Egészen az idei évig úgy gondoltuk, hogy a C-vitamin kizárólagosan dehidroaszkorbát formájában képes a mitokondriális belső membránon átjutni. A redukált forma, az aszkorbát akkumulációja nem volt igazolható sem humán vese, sem patkány májszövet eredetű mitokondriumok esetében. Egy, a közelmúltban megjelent tanulmány azonban nátriumfüggő SVCT2 transzporter expresszióról számolt be U937 humán mieloid leukémia sejtek mitokondriumaiban (2.3. ábra). Ez a megfigyelés arra utalhat, hogy a redukált forma, az aszkorbinsav is képes a mitokondriális belső membránon történő átjutásra. Természetesen ezen transzportmechanizmus általános meglétének és relevanciájának bizonyításához további független kísérletes eredmények szükségesek.

A különböző GLUT izoformák által a mitokondriumba transzportált dehidroaszkorbát meglehetősen instabil molekula, továbbá antioxidáns tulajdonságokkal kizárólag az aszkorbát rendelkezik, így a mátrixba jutott, vagy ott keletkezett, dehidroaszkorbátnak vissza kell redukálódnia aszkorbáttá, különben fiziológiás körülmények között perceken belül elveszik az instabil lakton gyűrű felnyílása miatt. A patkány májszövet eredetű mitokondrium preparátumhoz adott dehidroaszkorbát a mitokondriumba transzportálódva, ott aszkorbáttá alakulva millimolos nagyságrendű koncentrációt ért el. Az intramitokondriális aszkorbát reciklálással kapcsolatban több mechanizmus is elképzelhetőnek látszik. A mitokondrium képes alfa-lipoinsav függő módon aszkorbáttá redukálni a dehidroaszkorbátot. Szelénium deficiens patkányokból származó mitokondriumokon végzett kísérletek alapján a tioredoxin reduktáz, ha kis mértékben is, de szerepet vállal az aszkorbát mitokondriumon belüli reciklálásában. A dehidroaszkorbát adagolásra megfigyelhető nagyfokú glutation szint csökkenés, illetve a glutation depléció hatására jelentős mértékben visszaeső dehidroaszkorbát redukció alapján valószínűsíthető, hogy a glutation függő aszkorbát redukció emlős mitokondriumban a fő dehidroaszkorbát redukciós útvonalak egyike lehet.

A mitokondriális elektrontranszport lánc szubsztrátjait, illetve inhibitorait használva sikerült bebizonyítani az elektrontranszfer lánc szerepét a mitokondriális dehidroaszkorbát redukcióban. A redukció legvalószínűbb helye a mitokondriális komplex III.

6. 2.6. Vajon milyen szerepet tölthet be a C-vitamin a mitokondriumban?

A kérdés megválaszolása során figyelembe kell vennünk, hogy az itt működő légzési elektrontranszport lánc miatt a mitokondrium a sejt legjelentősebb reaktív oxigénvegyület termelő organelluma.

A megemelkedett reaktív oxigénvegyület szint a mitokondriális membránpotenciál összeomlását idézheti elő, amely aztán apoptózishoz vezethet. Hidrogén-peroxiddal kezelt HL-60-as sejtek esetében a mitokondriális membránpotenciál részleges megőrzését, a mitokondriális citokróm c felszabadulását el lehetett kerülni a sejtek dehidroaszkorbáttal történő előkezelésével. Az előző esethez hasonlóan dehidroaszkorbát előkezeléssel elkerülhető volt a mitokondriális membránpotenciál zsugorodása és a következményes programozott sejthalál FAS kiváltotta apoptózisban monociták esetében, illetve humán endothel sejtekben hipoxia-reperfúzió hatására. Mindezen megfigyelések azt valószínűsítik, hogy a mitokondriális C-vitamin jelentős mértékben hozzájárul a mitokondriális membrán potenciál megőrzéséhez. A C-vitamin anti-apoptotikus hatását minden bizonnyal reaktív oxigén vegyület fogó sajátságán keresztül fejti ki.

Egy ma általánosan elfogadott elképzelés szerint az örökítő anyag (membránnal elhatárolt, védett) sejtmagba telepítése, a DNS állomány védelme miatt történt. A humán sejtek (ahogyan minden eukarióta sejt) a sejtmagon kívül is rendelkeznek DNS-sel. Az extranukleáris örökítő anyag, a mitokondriumban található (utalva, annak egykori önálló prokarióta létformájára). A mitokondriális DNS (mtDNS) így ugyancsak kitett az ott képződött, erősen mutagén reaktív oxigénvegyületeknek. Így nem meglepő, hogy az aszkorbát egyértelműen védelmet nyújtott a mtDNS-ben a 8-oxo-dG (egy DNS oxidációs származék) és az apurinidációs/apiriminidációs helyek mennyiségének felszaporodása ellen. Ezen megfigyelésekhez hasonlatosan jelentős mértékben csökkenteni lehetett retina pigment epithelium sejtek esetében a hidrogén-peroxid kiváltotta mtDNS léziókat.

7. 2.7. Mennyi is az annyi?

Mind a mai napig nehéz tisztán látni, egyik legfontosabb vitaminunk, a C-vitamin optimális adagolásával kapcsolatban. A plazmamembrán és az intracelluláris membránokban található C-vitamin (aszkorbát és DHA) transzporterek és transzportfolyamatok középpontba állításával szerettünk volna tisztább képet festeni. A transzporterek telíthetősége, illetve redox regulációja miatt, a manapság oly sokszor és a mindennapi élet számos területén hallott, C-vitamin megadózisban történő orális adagolása erősen megkérdőjelezhető. Ugyanakkor, azt is tisztán kell látnunk, hogy a napi ajánlott bevitel (60 mg/nap) a transzporterek telíthetőségétől igencsak messze eső, alacsony érték. Amennyiben kizárólag a transzporterek karakterisztikáját vesszük alapul, ettől jelentősen magasabb napi bevitel (200-400 mg/nap) lenne indokolt.

Természetesen ez csak egyféle megközelítés, nem foglalkoztunk a C-vitamin anyagcserével fiziológiás, illetve patológiás körülmények között, és a megadózisban történő adagolás esetleges vesekárosító hatásaival. Az optimális vitaminmennyiség meghatározásához ezen igen fontos tényezők semmiképpen sem elhanyagolhatóak. Végezetül, de semmiképpen sem utolsó sorban, meg kell említenünk az egyes emberek között fennálló genetikai, illetve életmódbeli, élethelybeli különbségeket, amelyek jelentős mértékben módosíthatják napi C-vitamin igényüket.

Több mint antioxidáns – a C-vitamin patobiokémiája

Több mint antioxidáns – a C-vitamin patobiokémiája

Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Created by XMLmind XSL-FO Converter.

3. fejezet - A mitokondriális DNS és a mitokondriális betegségek

Mindkét korábbi fejezetben láttuk, hogy a mitokondrium központi szerepet játszik az energia előállítás, a redox háztartás, illetve a sejthalál folyamatában. Pontosan ezen fontos szerepe miatt egyre nagyobb figyelem irányul erre a sejtszervecskére, azonban a mitokondriális DNS, illetve az annak eltéréseiből fakadó patobiokémiai folyamatok ez idáig méltatlanul kevés figyelmet kaptak, a következő két fejezetben ezt a hiányt szeretnénk bepótolni.

1. 3.1. A mtDNS eredete

A mitokondriális oxidatív foszforilációs rendszer és a teljes mitokondriális proteom egyik különleges sajátsága, hogy egyes elemeit a nukleáris genom (nDNS), míg másokat a mitokondriális genom (mtDNS) kódolja. A mitokondrium az α-protobaktériummal ápol rokonságot. Az eukarióta sejtek úgy 2 milliárd évvel ezelőtt jelentek meg feltehetően az α-protobaktériumok és archaebaktériumok fúziójával. Feltehetően mind a mai napig zajlik a mtDNS fragmentumainak nukleuszba történő áthelyeződése és az evolúció során ily módon került át számos respirációs lánc elem génje a sejtmagba. Az eddig vizsgálat alá vont különböző eredetű mtDNS-ek közös sajátsága volt, hogy a citokróm b és a citokróm c oxidáz I-es alegységének génje minden esetben a mtDNS-ben maradt. Vajon mi lehet ennek az oka? Egyes vélekedések szerint ezen gének terméke túlságosan is hidrofób ahhoz, hogy gond nélkül a mitokondriumba szállítódjék abban az esetben, ha a nukleuszba helyeződne a génje. A hozzávetőlegesen 750-1000 fehérjéből álló élesztő mitokondriális proteom mintegy 25%-a felelős a mtDNS fenntartásáért, illetve kifejeződéséért. Ez azt jelenti, hogy nagyjából 200-250 magban kódolt fehérje szükségeltetik egy maréknyi mtDNS által kódolt fehérje kifejezéséhez. Egyelőre nem teljesen világos, hogy miért is maradhatott fenn az evolúció során egy ilyen rendkívül „gazdaságtalan” felállás, ha mindössze csak annyi áll a háttérben, hogy néhány géntermék a kelleténél nagyobb fokú hidrofóbicitást mutat. Egy érdekes alternatív hipotézis szerint a mtDNS fennmaradásának hátterében regulációs okok állhatnak, mely szerint az oxidációs foszforilációs rendszer biogenezise igényli a respirációs elektrontranszfer lánc alegységeinek és a mtDNS direkt kapcsolatát.

2. 3.2. Bevezetés a mitokondriális betegségekbe

Ahogy láttuk a mitokondriumot érintő rendellenességek fakadhatnak a magban kódolt, de mitokondriumba irányított fehérjék, illetve a mitokondriumban kódolt, mitokondriumban lokalizálódott fehérjék eltéréséből. Jelen fejezetben kizárólag a mtDNS defektusaival és azok következményeként kialakult betegségekkel foglalkozunk.

A mitokondriális genom vizsgálhatóságának egyre könnyebbé válása, valamint a humán konszenzus szekvencia elérhetővé válása hozzájárultak ahhoz, hogy kiderüljön egyre több genetikai betegség hátterében valamilyen mtDNS rendellenesség áll. Meglehetősen nehéz megjósolni a mtDNS betegségek tényleges prevalenciáját, mivel igen változatos klinikai kép formájában jelennek meg és rendkívül sokféle kiváltó mutáció állhat a hátterükben. Az egyik gyakori pont mutáció (3243A>G) finn populáció körében való előfordulásáról vannak adatok, amelyek azt mutatják, hogy hozzávetőlegesen minden 6000 emberből 1 érintett, ugyanakkor a brit populációra vonatkozó becslések azt mutatják, hogy minden 3500 emberből 1 szenved mtDNS betegségben, vagy esélyes, hogy kifejlődjön benne. Igen fontos megemlítenünk, hogy egyre nagyobb annak a valószínűsége, hogy az életünk során szerzett mtDNS mutációknak és mitokondriális diszfunkciónak szerepe lehet az öregedésben (lásd ezen jegyzet erről szóló fejezetét) és az öregedéssel kapcsolatos megbetegedésekben, mint például a diabéteszben.

3. 3.3. Mitokondriális genetika: alapok

Minden sejtmaggal rendelkező sejtben megtaláljuk a mitokondriumokat, ahol az oxidatív foszforiláció révén a celluláris ATP fő előállítói. Az oxidatív foszforilációs apparátus magában foglalja a respirációs elektrontranszfer láncot (I-IV komplex) és az ATP-szintázt (V komplex). A sejten belül egyedül a mitokondrium tartalmaz extrakromoszómális DNS-t (természetesen növényekben a mitokondriumon kívül a kloroplaszt is, most ezzel nem foglalkozunk részletesebben). A mitokondriumok tehát duális nDNS és mtDNS kontroll alatt állnak. A mitokondriális genom egy több kópiában jelen lévő cirkuláris kettősszálú DNS molekula, amely az emberekben 16569 bp hosszú. A mtDNS az oxidatív foszforilációs apparátus 13 nélkülözhetetlen polipeptid láncát és a kifejezésükhöz szükséges 2 rRNS-t, illetve 22 tRNS-t kódolja (3.1. ábra). A többi respirációs lánc fehérjealegység a mtDNS fenntartásáért felelős fehérjékkel egyetemben a sejtmagban kódoltak és citoplazmatikus riboszómákon transzlálódnak, majd szignálszekvenciájuk alapján kerülnek szortírozásra és transzportra az organellum megfelelő helyére. A mitokondriális genetika szinte minden aspektusában eltér a mendeli genetikától. Gondoljunk csak az uniparentális (egyszülős) öröklésre, vagy arra, hogy egy sejten belül számtalan kópiában fordul elő a mitokondriális genom. Ezen főbb jellegzetességekre és patobiokémiai jelentőségükre mind szeretnénk kitérni a következőkben.

3.1. ábra - A mitokondriális DNS

Forrás: Larsson NG: Somatic Mitochondrial DNA Mutations in Mammalian Aging Annu. Rev. Biochem. 2010, 79, 683–706

4. 3.4. Az emlős mtDNS replikációja és transzkripciója

A kétszálú cirkuláris mtDNS asszimetrikusan tartalmazza a guanin és citozin nukleotidokat, így egy nehéz (H) és egy könnyű (L) lánc jön létre (3.1. ábra). Az mtDNS transzkripciója policisztronos és egy-egy fő promóteren indul meg mindkét láncon: a könnyű lánc promóteren (light strand promóter, LSP) és a nehéz lánc promóteren (heavy strand promoter, HSP) (3.1. ábra).

Az alapvető transzkripciós gépezet három fehérje együtteséből áll és teljes mértékben sikerült in vitro rekonstruálni: a mitokondriális RNS polimerázból (POLRMT), a mitokondriális transzkripciós faktor B2-ből (TFB2M) és a mitokondriális transzkripciós faktor A-ból (TFAM). Érdekes módon a POLRMT legközelebbi rokona a bakteriofág RNS polimerázok és egy meglehetősen nagyméretű N-terminális toldalékot visel, amelynek valószínűleg a transzkripció transzlációhoz kapcsolásában van szerepe.

A TFB2M nélkülözhetetlen a transzkripció során, mivel a POLRMT iniciációhoz szükséges katalitikus helyének egyik alkotója. A TFAM pedig azon túl, hogy az egyik transzkripciós faktor, az mtDNS egyik csomagoló fehérjéje, beburkolja és nukleotidszerű kompakt formába hozza a mitokondriális DNS-t. Jelenleg emlős sejtkultúrán és szöveteken nyert adatok alapján úgy gondoljuk, hogy 15-20 bp-onként található egy TFAM kópia és szinte biztosra vehető, hogy a teljes mtDNS molekulát beburkolja. Egy ilyen mtDNS nukleoid 100 nm átmérőjű és egyetlen mtDNS kópiát tartalmaz. Az ily módon csomagolt mtDNS jelentős része a mátrixban található, vagy lazán kötődik a belső membrán mátrix felőli oldalához.

A mtDNS replikációja szintén nem nélkülözheti a POLRMT-t, amely a rövid RNS primer megszintetizálásáért felelős, mind a könnyű, mind a nehéz lánc replikációs origójánál (OL, OH). A mtDNS replikációjához szükséges repliszómának minimálisan tartalmaznia kell a mtDNS polimerázt (POLG), a csillogó helikázt (nevét az érdekes elszórt lokalizációja után kapta, a mikroszkópos képen megjelölve úgy ragyog, mint megannyi ragyogó csillag az égbolton), és a mitokondriális egyszálú-DNS kötő fehérjét. A PLOG atomi szerkezetét felderítették és kiderült, hogy egy alegység POLG A alegységet és két POLG B alegységet tartalmaz.

A mtDNS replikáció mechanizmusa a közelmúltban fellángolt intenzív viták tárgya. Szerkezeti és biokémiai vizsgálatok alapján úgy gondoltuk, hogy a mtDNS replikációja a szál-kiszorításos modell alapján zajlik. A modell értelmében a vezető (nehéz) szál replikációja történik meg elsőként, amely a rövid nem kódoló, regulációs szakasz (D-loop) OH pontjánál indul meg. Amikor a vezető szál replikációja a genom 2/3 részén már lezajlott, akkor indul meg a késlekedő (könnyű) lánc replikációja az OL pontnál. Így a könnyű lánc szintézise gond nélkül végbemehet az ellenkező irányba. A közelmúltban kétdimenziós gélelektroforézissel nyert eredmények alapján azonban elkezdték ezt a modellt vitatni és a jóval konvencionálisabb vezető-szál, követő-szál koordinált modellt preferálják. A vitát tovább fokozta egy harmadik D-loop origójú modell felvetése.

A 13 mtDNS által kódolt oxidatív foszforilációban szerepet játszó fehérje mitokondriális riboszómákon íródik át. A mitokondriális tRNS-ben és rRNS-ben bekövetkező mutációk patológiás következményekkel járnak, hiszen a mitokondriális transzláció megszakadásához vezethetnek.

5. 3.5. Homoplazmia és heteroplazmia

Patogén mtDNS mutációt első ízben 1988-ban írtak le. A patogén mtDNS mutációt hordozó betegek igen gyakran a vad típusú és a mutáns mtDNS molekulák keverékével rendelkeznek, ezt az állapotot heteroplazmiának nevezzük (ezzel analóg módon a megegyező mtDNS-t hordozó sejtek, szövetek esetében homoplazmiáról beszélünk). A mutációs terhelés ugyanazon család tagjai között igen jelentős eltérést mutathat, ahogyan ugyanazon szövet különböző sejtjei is igen eltérő mutációs érintettséget mutathatnak. Ezen egyenlőtlen mtDNS mutációs eloszlás az érintett szöveteken belül mozaikos respirációs lánc deficienciához vezet. Heteroplazmia esetén egy bizonyos mutációs arány, küszöb mutációs arány felett jelentkeznek a betegségre jellemző klinikai tünetek, illetve a jellegzetes biokémiai eltérések.

6. 3.6. A mutáns mtDNS szegregációja szomatikus szövetekben

A heteroplazmikus mtDNS mutációk szomatikus szövetekben megfigyelhető mitotikus szegregációja, illetve a mtDNS anyai ágon történő öröklése az emlős mitokondriális genetika sarokkövei. Sajnos fontosságuk ellenére még jelenleg is kevéssé ismertek sejtbiológiai szinten. Természetesen az alapvető összefüggések már feltárásra kerültek.

A mtDNS replikációja nem kötött a sejtciklushoz, egy sejtosztódás során egy adott mtDNS molekula akár többször is replikálódhat, de az is előfordulhat, hogy egyszer sem. Ez a replikációs módozat lehetővé teszi, hogy a sejtosztódások során egy adott mutáció klonálisan expandáljon, vagy teljesen eltűnjön. A mtDNS turnovere az egyes szövetekben nem ismert pontosan, patkány agyszövetben 14 napos fél-életidőről számoltak be. Tehát a mtDNS, igen valószínűleg, minden egyes szövetben folyamatosan replikálódik, amely poszt-mitotikus sejtek esetében is lehetővé teszi az mtDNS mutációk szegregálódását. Ahogy azt már korábban megjegyeztük a heteroplazmikus mtDNS mutációk csak akkor váltanak ki respirációs lánc diszfunkciót, ha az egy adott küszöbértéket meghalad. A küszöbérték pedig a mutáció és az érintett szövet típusától függ. Jelenleg teljesen elfogadott az a vélekedés, hogy a patogén mtDNS mutációk szegregációja nagymértékben random folyamat.

A mitokondriumok egy dinamikus hálózatot alkotnak, amely folyamatos fúzión és hasadáson megy keresztül. Ez a folyamat biztosítja, hogy az adott sejt mitokondriális hálózatának géntermék tartalma folyamatosan keveredjék. A folyamat a fennmaradás feltétele, mivel a fúzió blokkolása a mtDNS elvesztését okozta. A respirációs lánc deficiencia a mitokondriális hálózat fragmentációjához vezetet sejtvonalak illetve egér szövetek esetében. A mitokondriumok minőségi kontrolljában felvetődött az autofagocitózis szerepe, amely például az eritrocita differenciáció során végzi a mitokondriumok eltávolítását. Emlős sejtvonalakon nyert információk azt mutatták, hogy a Parkin, ami egy E3-ubikvitin ligáz mutálódott fiatal kórban megjelenő Parkinson kórban. A Parkin áthelyeződik a sérült funkciójú mitokondriumokba, hogy elősegítse azok autofagocitózissal történő degradációját. Természetesen itt meg kell jegyeznünk, hogy ezen mitokondriális minőségi kontroll létezéséről szóló bizonyítékokat fokozott Parkin expresszióra bírt transzformáns sejtekből nyerték, amelyek ráadásul igen drasztikus mitokondriális toxinkezelést kaptak. Így ezek a valóságos körülményektől merőben eltérő kondíciókkal rendelkeztek. Ezt figyelembe véve különösen érdekes, hogy mitokondriális betegséggel rendelkező pácienseknek gyakran rendelkeznek romló respirációs lánc funkcióval és az idő előrehaladtával akkumulálódó mtDNS mutációkkal, amely megkérdőjelezi a felvetett mitokondriális minőségi kontroll hatásosságát. A közeljövőben különösen fontos lenne a sejtvonalak esetében megfigyelt minőségi kontroll gyakorlati megerősítése.

7. 3.7. A mtDNS anyai öröklésmenetének princípiumai

Az emlős mtDNS anyai öröklésmenetét közel 40 éve fedezték fel. Igen nagy meglepetést okozott, amikor 30 évvel ezelőtt kiderült, hogy az mtDNS genotípusa néhány generáció alatt szinte teljes mértékű változáson mehet át. A kísérleti állatokon leírt rapid szegregációs jelenséget számos patogén heteroplazmikus mtDNS mutációt hordozó humán család esetében is megerősítették. Ezt a szegregációs jelenséget a női ivarsejtek esetében tapasztalható üvegnyak (bottleneck) mechanizmusnak tulajdonítják, amely során az ivari őssejtek mtDNS kópiáinak mindössze igen kis része kerül át a petesejtekbe.

Az egér csíra(ivar)sejtvonalon keresztüli mtDNS mutáció átadás nem neutrális, hanem egy meglehetősen jelentős mértékű tisztító szelekciót mutat a káros mtDNS mutációk kiszűrése érdekében. Az öregedéssel foglalkozó fejezetben is említésre kerülő mtDNS mutátor egér a POLG egy hibajavító enzimaktivitásban sérült változatát fejezi ki, amely a szerzett mtDNS mutációk számának jelentős mértékű felhalmozódásához vezet. Ezen mtDNS mutátor egerekben keletkezett, láthatóan random pont mutációk anyai átadása erős szelekciót mutat, mely során az aminosav cserével járó mutációk nagyrészt kiszelektálódnak, míg a tRNS, vagy rRNS géneket érintő mutációk nagyobb toleranciában részesülnek. Érdekes módon a mtDNS mutátor egér leszármazottjaiban megjelenő mutációs spektrum nagyfokú hasonlóságot mutat a humán populációban természetesen előforduló mutációs spektrumhoz. Mindez azt sugallja, hogy az emberekben természetes módon megjelenő mtDNS mutációs spektrum hátterében mtDNS replikációs hibák állhatnak, amelyek az anyai csíravonal tisztító szelekcióján átestek. Ezen tisztító szelekciós folyamat molekuláris hátteréről jelenleg semmiféle információval sem rendelkezünk. Elméletileg egy ilyen szelekciós folyamat több különböző szinten jelenhet meg. A mtDNS szintjén meglehetősen nehéz elképzelni, mivel ez a replikáció blokkolásával, vagy mtDNS megsemmisítésével járna, anélkül, hogy a mutáns géntermék bármiféle funkcionális teszt alá esne. Sokkal inkább elképzelhető egy organellum szintjén zajló funkcionális mtDNS teszt. Egy ilyen jellegű vizsgálat magába foglalhatja a petesejt fejlődésének bizonyos szakaszai alatt bekövetkező mitokondriális hálózat fragmentációt, így lehetővé téve, egyes (individuális) mtDNS molekulák kifejeződését és az ezt követőegyetlen mitokondriumot érintő funkcionális respirációs lánc funkció kiolvasást. Az is elképzelhető, hogy a csírasejtek (ivarsejtek) érése során versengés alakul ki az egyes sejtek között és az mtDNS mutációval rendelkezők hátrányba kerülnek, vagy apoptotizálnak. A tRNS-t, illetve az rRNS-t kódoló gének mutációi jóval nagyobb eséllyel túlélik a tisztogatási folyamatot, mint az aminosav cserét előidéző mutációk, ami összhangban van azzal a megfigyeléssel, mely szerint a humán mtDNS-t érintő patogén mutációk legnagyobb részt a tRNS géneket érintik, annak ellenére, hogy mindösszesen a mitokondriális genom ~9%-át foglalják el. Az üvegnyak mechanizmus elképzelhető, hogy a tisztogató szelekciós folyamathoz kapcsolódik, de az sem kizárt, hogy egy független védő folyamat. Természetesen az sem zárható ki, hogy a mtDNS kópiaszámának leszabályozása és a mitokondriális hálózat fragmentációja elősegíti a női ivarsejtekben zajló tisztogató szelekciós folyamatot. Az üvegnyak mechanizmus azonban szintén megakadályozhatja a kisszámú, de veszélyes mtDNS mutáció anyaágon történő elterjedését.

8. 3.8. A mtDNS betegségek klinikai sajátságai

Mitokondrium minden sejtmaggal rendelkező sejtben megtalálható, így nem meglepő, hogy az mtDNS betegségek számos szövettípust érintenek és a klinikai megjelenési formái is igen változatosak. A klasszikus mtDNS szindrómák valamelyikében szenvedő betegek esetében a klinikai sajátságok jellegzetesek és a klinikai diagnózis is meglehetősen egyértelmű. Számos esetben azonban a klinikai tünetek nem igazán specifikusak és a mtDNS betegség csak egy a számtalan lehetséges diagnózis közül. Ezekben az esetekben a mitokondriumra mutató fontos diagnosztikai vezérfonal lehet az anyai ágú családi érintettség, illetve többféle szövettípus érintettsége. A betegek egy jelentős részének esetében a diagnózist többféle vizsgálat alapján lehet felállítani, ilyenek lehetnek a hisztokémiai, biokémiai vizsgálatok, melyek során meghatározzák a respirációs lánc defektus pontos természetét. A mitokondriális genom vizsgálata, amely során első körben a gyakori mutációkra keresnek, majd a teljes mitokondriális genom szekvenálását is elvégezhetik ritka, vagy új mutációk fellelése végett. Itt azonban meg kell jegyeznünk, hogy ez diagnosztikai szempontból nem mindig célravezető, mivel a mitokondriális genom igen variábilis és az új szekvencia változatok interpretálása a patogenicitás szempontjából igen nehézkes lehet. Az mtDNS betegség akkurátus diagnosztizálása azonban a beteget és a családtagjait érintő súlyos következmények miatt szükségszerű.

9. 3.9. Klasszikus mtDNS szindrómák

Ahogy azt korábban már megjegyeztük, az első humán mitokondriális defektust 1988-ban írták le és két szindróma a Kearns–Sayre szindróma (KSS) és a Léber-féle öröklött optikus neuropátia (Leber Hereditary Optic Neuropathy; LHON) tanulmányozása vezetett el hozzá. A KSS-ban egyedülálló nagy-méretű (általában sporadikus) mtDNS mutációkat, valamint egyértelmű mitokondriális szerkezeti és citokémiai abnormalitásokat találtak a betegekből származó izom biopsziákban. A LHON esetében a szigorú anyai öröklésmenet egyértelmű volt és az ND (NADH dehidrogenáz) géncsaládot (az I-es komplex alegységeit kódoló) érintő pont mutációkat írtak le. 1988 óta számos mitokondriális genomot érintő mutációt írtak le és társítottak különböző megbetegedésekhez. A mitokondriális betegségek az ATP szintézis csökkenésével járnak együtt, így elsősorban a nagy energiaigényű szöveteket érinti, mint például az agy-, szívizom-, vázizomszövetek.

10. 3.10. Klinikai szindrómák, amelyek hátterében nagy valószínűséggel mtDNS eltérés áll

Az elmúlt 1-2 évtizedben számos olyan klinikai szindrómát ismertünk meg, amelyek mtDNS mutációkkal hozhatók összefüggésbe. A mtDNS és különböző betegségek közötti összefüggések megerősödésében és egyre gyakoribb felismerésében részben szerepet játszhat viszonylag könnyű szekvenálhatósága, habár az egyes báziscserék patogenicitásának azonosítása nehézségekbe ütközhet. Ezen betegségekre jó példa a progresszív külsődleges szemizombénulás, a Pearson és a Leigh szindróma, a mozgás kiváltotta izomfájdalom, a fáradtság és rabdomiolízis, illetve az amino-glikozid kiváltotta halláskárosodás. Ezek közül néhány esetben, mint például a progresszív külsődleges oftalmoplégia esetében a mtDNS betegség a legvalószínűbb ok, azonban más esetekben, mint például a Leigh szindróma esetében is igen hosszú a lehetséges genetikai okok listája.

11. 3.11. A mtDNS rendellenességek szerepe gyakori betegségekben

A klinikusok számára a legnagyobb nehézséget az jelenti, hogy a mtDNS betegséggel rendelkezők ritkán mutatnak klasszikus fenotípust, tüneteket és a mtDNS-sel kapcsolatos problémák számos gyakori klinikai szindróma differenciáldiagnosztikájában megjelenik. Erre igen jó példát szolgáltat a leggyakoribb anyagcsere betegség, a diabétesz, amelynek hátterében mtDNS defektus is állhat. A mtDNS-t érintő betegségek tehát diabéteszt okozhatnak, de ezek a betegek a teljes diabéteszes populáció csak igen csekély (hozzávetőlegesen 1-2%-át) hányadát teszik ki. Tekintve, hogy számos mtDNS mutáció okozhat diabéteszt, egyszerűen gyakorlattól elrugaszkodott, indokolatlan és rendkívül költséges lenne minden diabéteszes embert ezen, betegséget kiváltó mutációkra szűrni. A mtDNS betegségben szenvedő betegek gyakori klinikai tüneteit felsoroló táblázaton (táblázat) végigtekintve nyílvánvalóvá válik, hogy nehéz eldönteni, hogy melyik (klinikai tünetekkel rendelkező) beteg esetében keressünk lehetséges mtDNS betegséget. A további diagnosztikai nehézségekre jól rávilágít egy közelmúltban megjelent tanulmány, amely egyértelmű összefüggést mutatott egy nagy család tagjaiban előforduló homoplazmikus mitokondriális tRNS mutáció és a hipertenzióval, hipomagnéziával, valamint hiperkoleszterinémiával jellemezhető metabolikus szindróma között. Ha figyelembe vesszük, hogy az olyan állapotok, mint a hipertenzió és a hiperkoleszterinémia rengeteg embert érintenek, akkor beláthatjuk, hogy a potenciális mtDNS rendellenességgel rendelkező emberek száma is igen magas. Azt azonban mindenképpen észben kell tartanunk, hogy minden egyes ilyen beszámoló izolált családokról szól. Az epidemiológiai felmérések szerint a mtDNS mutációk incidenciája a specifikus betegségek (fenotípusa) között alacsony. További nehézséggel, mint például a klinikai tünetek specifikus kombinációjával is számolnunk kell az mtDNS rendellenességek diagnosztizálása esetén. Erre jó példa a mitokondriális diabétesszel gyakran társuló süketség, vagy a stroke-szerű epizódok gyakran járnak migrén-szerű tünetekkel. Vitathatatlan, hogy számos, mtDNS mutációval rendelkező beteg évekig, vagy akár sohasem kerül diagnosztizálásra. Ezen sokat segíthetnek a direkt mitokondriális betegségekre berendezkedett centrumok felállítása.

A mitokondriális DNS és a mitokondriális betegségek

A mitokondriális DNS és a mitokondriális betegségek

Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Created by XMLmind XSL-FO Converter.

4. fejezet - Mitokondrium, oxidatív stressz és öregedés

Valószínűleg nincs még egy olyan orvostudományi kutatási terület, amely annyira régen és oly intenzíven foglalkoztatná az emberiséget, mint az öregedés és az örök fiatalság titka. A szabad gyökök öregedésben betöltött szerepével komolyabban a XX. század közepén kezdtek el foglalkozni, amikor felfedezték, hogy a (röntgen) sugárzás és az oxigénmérgezés következtében in situ képződő reaktív oxigénvegyületek (ROS) felelősek a következményes toxicitásért. Denham Harman, azon megfigyelésekre alapozva, hogy a sugárzás mutációt, rákot és öregedést okoz, azzal a hipotézissel állt elő, hogy a normális oxigén felhasználó metabolikus útvonalak által termelt ROS (ezek közül is elsősorban a hidroxil- és hidroperoxil gyökök) lényeges szerepet kapnak az öregedés folyamatában. A teória újabb lendületet kapott és elfogadottsága jelentősen megnövekedett a szuperoxid-diszmutáz felfedezésével, illetve a H2O2in vivo létezésének leírásával. Harman 1972-ben módosította korábbi teóriáját, arra a megfigyelésre hivatkozva, amely szerint emlős sejtekben a mitokondrium felelős a ROS döntő részének képződéséért. Az ezt követő évek során számos tanulmány igazolta, hogy az oxidatív sérülések mértéke fokozódik az életkor előrehaladtával. Harman módosított teóriájával összhangban kiderült, hogy a mitokondriális DNS-t (mtDNS) érintő mutációk (deléciók, pontmutációk) mértéke fokozódik oxidatív stressz hatására és igen jelentős mértékben megnő az életkor növekedtével.

Mind a mai napig felmerül a kérdés, hogy vajon az oxidatív károsodásoknak kóroki szerepe van-e az öregedés folyamatában, az élethossz meghatározásában, vagy „csak” szimplán velejárói a kórral együtt járó betegségeknek. A mitokondriumot központba helyezve úgy is feltehetjük a kérdést, hogy a mitokondriális defektusok (az mtDNS mutációk) az öregedés kiváltó okainak egyike, vagy csak velejárói, következményei annak?

1. 4.1. Oxidatív stressz és mitokondriális DNS

Tekintve, hogy a mtDNS, a mitokondriális ROS termelő folyamatok közelében található, tekintélyes mértékű oxidatív stressz hatásnak van kitéve, ennek eredménye a nukleáris DNS-től háromszor magasabb oxidatív DNS károsodási szint is. A mtDNS-t érintő deléciók és pontmutációk száma a kor előrehaladtával drámai mértékben megnő. Míg a deléciók gyakorlatilag kimutathatatlanok fiatal korban, addig idős korban a mtDNS akár 2%-a is érintett lehet. Ez alól természetesen az idegrendszer sem képez kivételt. Számos esetben számoltak be rágcsáló és humán agysejtek esetében egyértelműen korfüggő módon emelkedő mtDNS deléciós rátáról. In situ citokróm c oxidáz (COX) aktivitásfestés során heterogén festődés figyelhető meg idős substantia nigra neuronok esetén. Ezzel egyidejűleg megfigyelték, hogy a COX-negatív neuronok magasabb arányban tartalmaznak mtDNS deléciókat, mint a COX-pozitívak. A mutációk kétségtelenül szomatikus (és nem örökletes) mutációk voltak, mivel az egyes neuronok egyedi mintázatú (deléciós) mtDNS-t tartalmaztak. Az egyre szaporodó megfigyelések afelől sem nagyon hagynak kétséget, hogy az öregedés során, az oxidatív károsodások száma megnő az emlős agyban. Heves viták arról sem dúlnak, hogy a mitokondriumban képződött ROS hozzájárul az mtDNS mutációk létrejöttéhez. A közelmúlt eredményei alapján jelenleg úgy gondoljuk, hogy a kettősszálú törések lehetnek az mtDNS deléciók mediátorai. Ugyanis a kettősszálú törések nagyméretű deléciókhoz vezettek egér izom és agysejtek esetében, tovább erősítve a feltételezést, mely szerint ez a mechanizmus lehet döntő részben felelős az öregedéssel együtt járó mtDNS deléciókért. Ezeket a kettősszálú töréseket okozhatják a ROS vegyületek, azonban a hátterében a replikációs villa leállása is lehet.

Ezeket, a potenciálisan ROS kiváltotta mtDNS mutációkat (deléciókat és pontmutációkat) olyan öregedéssel kapcsolatos rendellenességekkel hozták összefüggésbe, mint a sporadikus neurodegeneratív rendellenességek, a II-es típusú diabétesz és a szívbetegségek.

Ha mindezek a megfigyelések nem is adnak választ a kérdésünkre, hogy a mutáns mtDNS akkumulációjának, illetve az oxidatív stressznek van-e okozati szerepe az öregedésben, azért azt valószínűsítik, hogy a mutáns mtDNS (és az oxidatív károsodások) az adott élőlény élettartamától függetlenül hasznos öregedési biomarkerként viselkedhetnek.

2. 4.2. ROS-mtDNS mutáció-ROS ördögi kör?

Térjünk vissza Harman elméletéhez, amely szerint az öregedés, illetve az azzal összefüggésbe hozható degeneratív megbetegedések (többek között) a ROS káros hatásainak tudhatók be. A sejten belül az elsődleges ROS forrás a mitokondriális elektrontranszfer lánc, így a mitokondrium tekinthető az oxidatív károsodás elsődleges célpontjának is. Ezen teóriára, megfigyelésekre építve az öregedés szabadgyökös, illetve mitokondriális teóriája egy ördögi kör meglétét vetíti elénk, amely jelentős mértékben hozzájárul az öregedés folyamatához. Az „ördögi kör” szerint a normális metabolizmus során az elektrontranszfer lánc ROS-et termel. Ez a ROS termelés a mitokondriális lipidek, fehérjék és nukleinsavak károsodását idézi elő. A ROS kiváltotta mtDNS mutációk csökkent funkciójú respirációs lánc alegységek szintéziséhez vezetnek, amelyek a respirációs lánc diszfunkcióját okozzák és így felerősítik a ROS termelődését. Ez az ördögi kör jó eséllyel, az mtDNS mutációk idővel történő exponenciális felszaporodását váltja ki, amely öregedéshez és az azzal együtt járó degeneratív megbetegedésekhez vezet. Tekintélyes számú morfológiai, bioenergetikai, biokémiai és genetikai adat támogatta a kör meglétét. Az idősebb emberekben nagyobb méretű és kevesebb mitokondriumot találunk és a mitokondriális abnormalitások, mint vakuolák, abnormális kriszták és parakristályos zárványok is gyakrabban előfordulnak. Ne felejtsük el, hogy az emlősök öregedése az mtDNS mutációk akkumulációjával, illetve a fehérjék oxidatív károsodásával járt együtt és egyre nagyobb a konszenzus afelől is, hogy létezik, egy korral együtt járó, a kor előrehaladtával folyamatosan romló respirációs lánc funkció csökkenés is. Végezetül, számos tanulmány számolt be különböző állatfajok esetében a ROS képződés és a maximális élettartam között fennálló korrelációról.

Ugyanakkor azt sem szabad elfelejtenünk, hogy az összes rendelkezésünkre álló adat nem más, mint puszta korreláci�