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1. Introducción

LLa eliminación biológica defósforo en aguas residuales(EBPR) (Barnard 1974) ha

cobrado una creciente importanciaen los últimos años. El fósforo y elnitrógeno, nutrientes esenciales,pueden provocar importantes dese-quilibrios en sistemas acuáticos ta-les como ríos, embalses o aguas ma-rinas, favoreciendo el desarrollodesmesurado de fitoplancton, y pro-duciendo problemas de color y oloren las aguas (Meganck et al. 1988).La solución a este problema de eu-trofización pasa por la eliminaciónde estos nutrientes de las aguas resi-duales, de forma que el efluente delas depuradoras esté libre de nitró-geno y fósforo. En esta experiencianos hemos centrado en el caso delfósforo.

Las bacterias descritas como res-ponsables de la eliminación biológi-ca de fósforo son las PAO (Polyp-hosphate Accumulating Orga-nisms).

Estas bacterias, sometidas a al-ternancia de condiciones anaero-

bias aerobias, son capaces de elimi-nar el fósforo soluble de las aguas(fosfatos, PO4

3-), de modo que en laetapa anaerobia toman ácidos gra-sos de cadena corta presentes en elmedio como acetato y propionato,(Gerber et al. 1986), y transformanel polifosfato (poly-P) almacenadointeriormente en PO4

3-, producien-do un incremento de PO4

3- en elmedio.

En la etapa aerobia, las PAO to-man el PO4

3- del medio, y lo alma-cenan en forma de poly-P, resultan-do una eliminación neta del fósforocomo muestra la Figura 1. En la Fi-gura 2 se muestra un esquema sim-plificado del metabolismo de estasbacterias, (Seviour et al. 2003), aun-que existen diversas teorías sobreeste metabolismo (Hesselmann etal. 2000).

En esta experiencia se ha desa-rrollado una técnica que permitiráidentificar el poly-P acumulado enel interior de las PAO, y su posteriorrecuento mediante el uso de progra-mas informáticos de análisis deimagen.

Técnica de detección de polifosfatosintracelulares y cuantificaciónmediante análisis de imagenPor: Luis Borrás Falomir (*), José L. Alonso Molina (**), Pernilla Eggöy (***),

José Ferrer Polo (*)

(*) Universidad Politécnica de ValenciaDpto. Ingeniería Hidráulica y Medio AmbienteCamino de Vera, s/n46022, ValenciaE-mail: luiborfa@doctor.upv.es

(**) Universidad Politécnica de ValenciaInstituto de Hidrología y Medio NaturalCamino de Vera, 1446021 Valencia

(***) Halmstad UniversitySchool of Business and Engineering (Sweden)

La eliminación biológica de fósforo enaguas residuales está cobrando una cre-ciente importancia de un tiempo a estaparte. Se ha desarrollado un método dedetección que permite, mediante unatinción simple, confirmar la presenciade polifosfatos (poly-P) en un fango, locual evidencia la existencia de bacte-rias acumuladoras de polifosfatos(PAO). Mediante herramientas infor-máticas se ha llevado a cabo el análisisde imagen, que permite cuantificar lapoblación de PAO, y llevar un registrode la evolución del contenido en poly-Pen un fango.

Palabras clave: EBPR, poly-P, PAO, eutrofización,azul de metileno, Turrax, análisis deimagen, ImageJ.

Resumen

Polyphosphates detection method andimage analysis quantification The EBPR has become an importantprocess in wastewater treatment. Amethod has been developed to detect,by a simple stain, the presence ofpolyphosphates (poly-P) in a sludge,that is an evidence of the presence ofpolyphosphate accumulating orga-nisms (PAO). Using the appropiatesoftware is possible to do an imageanalysis to quantify this PAO, and mo-nitorize the evolution of the poly-Pcontent in a sludge.

Keywords:EBPR, poly-P, PAO, eutrophication,methylene blue, Turrax, image analy-sis, ImageJ.

Abstract

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2. Materiales y métodos

2.1. Preparación de lamuestra

Uno de los principales problemasque encontramos a la hora de exa-minar un fango con elevado conte-nido en bacterias acumuladoras depolifosfatos es que el fango se en-cuentra muy floculado, haciendoimposible su observación mediantemicroscopía óptica convencional.Por ello, en ocasiones se hace nece-sario realizar un pretratamiento dela muestra que consiste en homoge-nizar, diluir, y disgregar la muestra.Para ello se ha utilizado el homoge-neizador Ultra-Turrax T25 (Wallneret al. 1995), y el disgregador Ultra-Turrex T8 (Ziglio et al. 2002), am-bos de IKA Labortechnik, Staufen,

Germany. El proceso consiste en to-mar una muestra de 150-250 ml ysometerla a la acción de del Ultra-Turrax T25 durante 5 min. en la po-sición de velocidad 1 (11.000 rpm).Seguidamente, se toman una alícuo-ta del fango homogeneizado, y sediluye con el propio filtrado de lamuestra. La filtración se realiza me-diante filtro de 0,2 mm. De esta for-ma se evita la adición de fosfatospresentes en tampones de uso co-mún, que podrían provocar un alma-cenamiento de poly-P extra por par-te de las PAO, dando lugar a resulta-dos erróneos. Seguidamente se so-meten 5 ml de la muestra diluida alUltra-Turrax T8 durante 10 min., enla posición de velocidad 5 (21.000rpm), y con refrigeración. Esta téc-nica permite disgregar el flóculo de

forma que se pueden realizar re-cuentos de poblaciones en muestrascon un flóculo originalmente muyagregado.

2.2. Tinción de la muestraExisten varias tinciones conven-

cionales que permiten diferenciarlos gránulos de poly-P del resto delflóculo, como la tinción de Neisser,la tinción con o-toluidina, o la tin-ción con azul de metileno de Loef-fler (Serafim et al. 2002). Esta últi-ma es la que se ha seleccionado paraesta experiencia, por su sencillez, surapidez, y el contraste obtenido (Fi-gura 3). Este reactivo se puede ad-quirir ya preparado, o prepararlo enel laboratorio como se describe acontinuación. Disolver 0,3 g de azulde metileno en 100 ml de etanol60% (solución de Loeffler), y disol-ver 10 mg hidróxido potásico en100 ml de agua destilada (solución2). Mezclar las soluciones 1 y 2 enpartes iguales (Seviour et al. 1999).

Para realizar la tinción se dispo-nen 10 ml de muestra disgregada so-bre un portaobjetos, ocupando unasuperficie de 18 x 18 mm2, corres-pondiente a las dimensiones de uncubreobjetos. Se deja la muestra se-car al aire durante aproximadamen-te 30 min, o en una estufa a 37 ºC du-rante 5-10 min. Cabe destacar quelas PAO trabajan con alternancia deciclos anaerobio aerobio, y que elhecho de extender la muestra sobreel portaobjetos aumenta su superfi-cie de muestra en contacto con el ai-re, de forma que las bacterias pue-den disponer de oxígeno que no seencontraba originalmente en lamuestra, provocando así cambios enla localización del fósforo en lamuestra, es decir, los fosfatos di-sueltos podrían pasar a poly-P alma-cenado intracelularmente.

Una vez se encuentre la muestracompletamente seca, se cubre con lasolución de azul de metileno de Lo-effler durante 20 segundos. Segui-damente se lava con cuidado lamuestra con agua destilada, de for-ma que no sean arrastradas las bac-terias fijadas en el portaobjetos. Por

Figura 2. Metabolismo de las bacterias PAO (Seviour et al. 2003).

Figura 1. Evolución del fósforo soluble (PO43-) y el poly-P en alternancia de fases aerobia y anaerobia.

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último, se deja secar la muestra has-ta que no quede nada de agua sobreella. Se observa la muestra en el mi-croscopio óptico con aceite de in-mersión (aumentos x1.000). Las in-clusiones de poly-P se observan co-mo puntos de color rosa brillante-violeta, mientras que el resto delfloculo adquiere un tono ligeramen-te azulado (Seviour et al. 1999) (Fi-gura 3).

Existen otras tinciones como ladoble tinción que permiten diferen-ciar entre el poly-P y el PHB presen-tes en una muestra (Rees et al.1992), pero es necesario el uso demicroscopios de epifluorescencia,de uso poco común en plantas depu-radoras de reales.

2.3. Análisis de imagenEl análisis de imagen permite

cuantificar las áreas correspondien-tes a poly-P, y el resto del flóculo.Para ello se ha utilizado la cámaraDP12 montada sobre un microsco-pio BX50, ambos de Olympus.

Con el fin de obtener unas imáge-nes que representen fielmente a lamuestra teñida, se realizan 20 foto-grafías de 20 campos distintos se-leccionados al azar en la muestraextendida teñida sobre el portaobje-tos. Si se desea comparar resultadosentre muestras de distintos días, esimportante que las fotografías seantomadas todas en las mismas condi-ciones, es decir, se deben mantenerla apertura del diafragma, el tiempode exposición de la cámara, y la luzdel microscopio siempre en las mis-mas condiciones.

Una vez realizadas las fotografí-as se debe hacer uso de un programa

de análisis de imagen para obtenerel porcentaje, en área, de poly-P enla muestra. El programa que se hautilizado es el ImageJ 1.31v (WayneRasband, Nacional Institutes of He-alth, USA. http://rsb.info.nih.gov/ij), de libre distribución. Esconveniente que el tamaño de las fo-tografías no sea excesivo, de formaque podamos trabajar con variasimágenes simultáneamente. Nor-malmente se está trabajando conimágenes de 512 x 640.

En primer lugar se cargan lasimágenes, y se analizan en busca departes de la muestra teñidas que nosean poly-P. Si existen, se seleccio-nan, y se determina el área en píxe-les mediante la aplicación informá-tica. Figura 4a. A continuación seconvierten las imágenes a escala degrises y 8 bit, para que el programapueda trabajar con ellas, Figura 4b.Una vez se tiene la imagen cargaday convertida a escala de grises se

ajusta el brillo y el contraste, Figu-ra 4c, de forma que todas las imáge-nes de distintos días tengan el mis-mo ajuste. La selección del umbral(threshold) es la más importante. Sedeben seleccionar las partículas quese identifiquen como poly-P en unade las fotografías. El programa mar-ca en rojo la selección, Figura 4d, yal aplicar los cambios, convierte laimagen a blanco y negro, Figura4e, de forma que podrá contar lospíxeles negros, Figura 4f. Todoslos cambios se realizan automática-mente sobre las 20 imágenes. El re-sultado dado por el programa es unporcentaje sobre el área total de lasimágenes. Es posible que se deseereferenciar ese porcentaje al áreatotal de muestra. Para ello se puedetrabajar con las mismas imágenes,pero ajustando el umbral (thres-hold), (Figura 4d) al total del flócu-lo, de forma que el resultado sea elporcentaje total de muestra en las 20imágenes. Ahora se puede referen-ciar el porcentaje de poly-P obteni-do anteriormente, al porcentaje to-tal de muestra que se acaba de obte-ner. En ocasiones, mediante la tin-ción de azul de metileno no se con-sigue teñir el total de la muestra. Enestos casos se puede realizar, sobreun duplicado de la muestra, una se-gunda tinción con safranina (Kojec-ká et al. 2001), que teñirá el total delflóculo.

Figura 3. 1000x Tinción de poly-P mediante azul de metileno de Loeffler.

Figura 4. Programa ImageJ de análisis de imagen.

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La identificación de los gránulosde poly-P es la parte más importan-te del método. Para ello, es conve-niente fijarse, no sólo en las diferen-cias de color obtenidas, sino tam-bién en la morfología de las zonasteñidas. Normalmente, las PAO for-man agregados de un número im-portante de bacterias. Aunque lasustancia teñida es el poly-P, en elcaso de las PAO es tan abundante lacantidad de poly-P almacenada ensu interior, que la aplicación delazul de metileno da como resultadola tinción de prácticamente toda labacteria, observándose una formabastante circular. Existen algunostipos de bacterias filamentosas, Mi-crothrix parvicella y Nostocoida li-micola (Seviour et al. 1990), queson capaces de almacenar poly-P,aunque en menor cantidad que lasPAO. De hecho, no son de utilidadpara la EBPR. Su identificación enuna muestra teñida con azul de me-tileno es sencilla, ya que los gránu-los se agrupan en forma de cordón,lo que las hace claramente diferen-ciables.

3. Resultados y discusiónMediante este método se ha podi-

do obtener resultados que muestranclaramente una tendencia en el por-centaje de poly-P en un fango con eltiempo (Figura 5). Sin embargo, elmétodo presenta limitaciones a la

hora de comparar muestras aerobiasy anaerobias de un mismo sistema.Cuando las bacterias PAO se en-cuentran en fase anaerobia, deberí-an tener menos poly-P almacenadointracelularmente que en la fase ae-robia (Figura 1).

Los resultados obtenidos me-diante este método no siempremuestran este comportamiento. Es-ta anomalía se debe, probablemen-te, al tratamiento previo al que se so-mete a las muestras. Una vez lasmuestras llegan al laboratorio, sonhomogeneizadas por medio del Ul-tra-Turrax T25. Se ha comprobadoque el uso del homogeneizador pro-voca un incremento notable en lacantidad de oxígeno disuelto en la

muestra, cambiando así su estado.Este efecto es más importante en elcaso de muestras anaerobias, ya quese transforman en aerobias, y portanto, aumenta su contenido enpoly-P intracelular, lo que se apre-ciará en la tinción con azul de meti-leno.

En este tipo de muestras se podríarealizar la homogeneización en unaatmósfera de nitrógeno, evitandoasí la reaireación superficial.

Para poder disgregar la muestra ytener un número de células apropia-do para su recuento se realiza unadilución. El problema es que si seutiliza un tampón con fosfato, sepuede potenciar que las muestrasaerobias aumenten su contenido enpoly-P, dando como resultado unatinción con más poly-P del espera-do. Para ello se ha utilizado el filtra-do de la muestra homogeneizada, deforma que los fosfatos disueltos se-rán los mismos que tenía la muestraoriginalmente.

4. ConclusionesMediante el método desarrollado

se puede determinar la presencia depoly-P en un fango, y por tanto, laposible presencia de bacterias acu-muladoras de poly-P (PAO). Ade-más, una sencilla aplicación infor-mática, permite llevar un registro dela evolución de estas bacterias enuna planta depuradora con EBPR.

Las principales característicasdel método son su rapidez y su sen-cillez. Mediante este método no esposible conocer el tipo de bacteriasacumuladoras de poly-P presente enun fango, pero se puede conocer consuficiente exactitud su proporción yevolución. Por otra parte, los mate-riales e instrumentos necesarios pa-ra su aplicación son de uso habitualen las plantas depuradoras de aguasresiduales, de modo que la inversiónen equipo es baja, y tan solo necesi-taremos algunos reactivos como elazul de metileno.

5. AgradecimientosSe agradece la colaboración de

los miembros del grupo Calagua deFigura 5. Representación típica de la evolución de la proporción de poly-P de un fango.

La principal

característica

de este método es

su rapidez y sencillez

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la Universidad de Valencia, y la Universidad Politécnicade Valencia, y la financiación del MCYT (ProyectoPPQ2002-04043-C02).

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