Rev. Inst, Med. trop. São paulo27(3) :ll5-122, maio-iunho, l9B5

FRACIONAMENTO DO VENENO CROTALUS DURISSUS TERRIFICUS PORCROMATOGRAFIA DE EXCLUSÃO MOLECULAR (-)

'{ugusta Klyomi TAKEDA (1), Sôn¡a França Correta BARBosa (z), Luctnda Marta da cosTA (B)e Marla das Graças Fernandes ADELINO (4)

RESUMO

Através da técnica de croma.tografia de exclusão molecular utilizando Se-phadex G-75 foram estudadas as diferentes frações d.o veneno de crotalus du_rissus terrificus, uma das serpentes peçonhentas mais comuns no Brasil. Foramobtidos 4 picos (correspondentes às frações 32, 60, 86 e 108) com peso molecularvariando de 4.000 a 150.000. As frações d.e tod.o o diagrama de gel filtraçáo foramtriadas através de reação de imunoeletroforese a fim d.e se verificar suas cargase velocidade de migraçáo. As linhas de precipitação encontradas foram compa_radas às 11 linhas apresentadas pela reação de imunoeletroforese do veneno totalcontra o soro anti-crotálico. constatou-se que as frações de um mesmo picoapresentavam caracteristicas próprias com exceçáo da fração 54 (subid.a do picoII) que mostrou diferenças significativas em relação à fração 60. Após a tria_gem foram escolhidas as frações de cada pico onde as linhas d.e precipitaçáo fo.ram mais nítidas e intensas, para estudo de identidade através da reação dedifusão radial dupla e letalidade comparada a concentraçáo de 0,0625 mg/ml doveneno total que corresponde a DLsü em camund.ongo pelq método d.e SpEARM& KARBEI¿. As frações 82, BÉt e l0B correspondentes respectivamente aos picosI, rII e IV apresentaram letalidade nula ou negligenciada e a fraçáo II foi arnais tóxica.

CDU 615,9

Entre muitas espécies d.e serpentes peço.nhentas encontradas no Brasil, Crotalus duris.sus terrificus l0 é uma das mais comuns. Dadosda Organização Mundial da Saúde mostram que74dto das vitimas sucumbem na ausência d.e tra_tamento enquanto que nos pacientes que rece-bem soro anti-veneno a mortalidade tend.e acair para L27o s. A soroterapia é portanto o úni-co meio elicaz de tratamento s,s,11 srnþs¡¿ ¡fleseja possÍvel assegurar que os diversos constituintes do veneno sejam neutralizados, devidoà dose do soro anti-veneno administrada ser fi.xada de maneira arbitrária.

INTRODUçÄO

(")(1)(2)(3)

G)

R€alizado na Seção de Imunologia do hstituto Adolfo Lutz, Säo paulo, BrasilPesquisador CientÍfico NÍvel VPesqu¡sador Cientffico Nfvel IBiologistaPiologista

Não existem, ainda, provas de laboratórioque permitam medir com segurança a concen-tração do veneno, tanto circulante como no te.cido após o tratamento com soro anti.veneno,podendo assim assegurar a neutralizaçáo domesmo.

De outra feita, é preocupação da Organiza-ção Mundial da Saúde o problema de reaçõesprecoces tipo anafiláticos que se observam empessoas tratadas com soro anti-veneno, devidoâ fatores tais como: natureza do soro, dose, via

115

TAI(EDÁ, A. K.; BARBOSÁ, S. F. C.; COSTA, L. M. da &durissus úerr¡ficus por cromatografia de exclusão molecular.

e modo de administraçã,o e exposição a estassubstâncias sensibilizantes.

E de grande interesse o estudo das fra-ções ou características do soro, responsáveispor estas desvantagens e, especialmente se osfatores sensibilizantes estão ou não ligados aosanticorpos protetores.

Portanto, para que se corìheça melhor osaspectos acima referidos é necessário que seestude as caracterÍsticas quÍmicas e biológicasdo veneno Crotalus durissus tcrrificus e quese obtenha um veneno padrão, que além dissopossibilitará a obtenção de soros monoespecificos eliminando acidentes indesejáveis com aadministração de soros polivalentes.

Neste trabalho, propomo-nos a estud.ar asdiferentes frações do veneno Crotalus durissusúerrificus obtidas por gel filtração em Sepha-dex G ?5 super fino através de imunoeletrofo-rese, imunodifusão dupla rad.ial e letalid.ad.ecomparada com DLro do veneno total em ca.mundongos NHI-N de 15 g d.e acord.o com ornétodo SPERMAN & KARGER da OrganizaçãoMundial da Saude +.

MATERIAL E MÉTODOS

Empregou-se 250 mg do veneno de Crotalusdurissus terrificus obtido em 1982 (InstitutoButantan - São paulo - Brasil) secos a vá_cuo e conservados a b"C, que foram dissolvidosem 5 ml de acetato de amônia 0,2M pH ?,0. Es[aamostra foi fracionada em coluna de 2,5 cm dediâmetro por 72 cm de altura com SephadexG-75 super fino (Pharmacia Fine Chemicals AB,Uppsala, Sweden). O eluente usado foi acetatode amônio 0,2M pH ?,0 e as frações de 4 mleram coletadas em intervalos de B0 minutospor meio de um coletor automático (Toyo_SF160K) à temperatura de 4.C. Os eluatos forarnlÍclos a 280 nm em espectofotômetro (Variam-- Série 634 UV-VIS), tendo sido calculado opeso molecular das frações colhidas e analisa-das segundo seu perfil imunoeletroforético e le-talidade em camundongos. Os pesos molecula_res foram estimados por gel filtração I usandopadrões do Kit de calibraçáo de peso molecu_lar (Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala,Sweden).

116

ADELINO, M. das G. F. - Fracionamento do veneno CrotatusRev, Insú. Med, trop. São Paulo 27:115.122, 1995.

Imunoeletrof orese

A reação de imunoeletroforesee foi feitacom agarose a lVo em Tampáo Tris HCI pH8,6 p 0,6 em fonte estabilizada de eletroforese(Fanem 1050) contra tampáo Tris HCI pH8,6 p 0,113. Foi utilizado suporte contendo 6 Iâ-minas de 26 x 76 cm espessura 0,8 - 1,0 mmsobre o qual foram depositados 30 ml de aga-rose acima citada e analisando-se seis fraçõesem cada plarea. Cada fração foi testada frenteao veneno total na concentração de 10 mg/mt.O tempo de corrida foi de 50 minutos com cor-rente de 10 mA colocando-se em seguida o soroanti-veneno crotálico do Instituto Butantan, lo-te 8210003, deixando-se por 20 horas em difusãoem câmara úmida.

A análise de identidade das linhas de pre-cipitação das frações foi feita utilizando-se pla-ca de imunoeletroforese de 18 x 11 cm em 40ml de agarose corridas durante 1:10 hs com20 mA e difusão de 48 hs e reação de imunodifu-são.

Todas as reações foram coradas com negrode amido.

Reação de difusão radial dupla2

Realizada em placa de Petri, nas quais fo-ram colocadas 10 ml de agarose LVo em soluçãofisiológica 0,B5Vo. Os orifÍcios mediam B mmde diârnetro, contendo ?0 pl das frações a se-rem analisadas e do veneno crotálico total nasconcentrações de lmglml. No orifÍcio centralfoi colocado soro anti-crotálico do Instituto Bu-tantan sem diluir. As placas foram deixadas por48 horas em câmara úmida e soradas com ne-gro de amido LVo.

Letalidade

A DLs' do veneno crotálico total foi calcu.lada em camundongos NHI-N (Instituto AdolfcLutz - São Paulo - Brasil) de lb g pelo mé-todo de SPEARM & KÄRBER,4.

As frações analisadas foram inoculad.as emconcentrações próximas à concentraçáo obtidana D\o enr camundongos da mesma cepa, pe-lo método acima.

TAÌiEDA, A' K'; BAR'BOSA, S' F' C.; COSTA, L. M. da & ADELINO, M. das G. F. -Fracionamento do veneno crotalûsdurissus terrificus por cromatografia d.e exclusão molecular. Rev. rnst. Med. trop. são paulo 27tLL5-122, tg85.

RESULTADOS

Através da técnica de fracionamento em Se-phâdex G-75 super fino foram obtidos 4 picos(frações n.' 32, 60, 86 e 103) cujos pesos rno-leculares foram de 150.000, 89.000, 10.000 e 4.000Ïespectivamente (Fig. 1). Estas mesmas fraçõesforam analisadas através da técnica d.e imu-noeletroforese, com a Îinalidade de se estudar

=,tsE

o.EP3oaoEro^

Êo

quanto à sua pureza, carga e velocidade de mi_gração, tomando como parâmetro o veneno bru_to ou total (Figs. 2 e 3). Constatou-se que asfrações de um mesmo pico possuiam caracte-rísticas próprias com exceçáo da fração 54 quemostrou diferenças significativas quando com_parada a da fraçáo 60, do mesmo pico. Ðeacordo com esta técnica foi verifÍcada a exis_tência no veneno bruto, de 11 linhas de ,oreci_pitação.

Número de froções

A fração número 82 apresenta 2 linhas deprecipitaçáo sendo que uma delas migra para aregião do cátodo e a outra permanece no pon_to de aplicação. Na fração número 54 foramdetectadas 4 linhas de precipitação correspon_C,entes às linhas 2, 8, g e 11 do veneno þruto. fraçáo 60 apresenta B linhas, sendo que a 11e 9 foram comuns à fração 54; porém, apre-sentou a linha n: 5 náo encontrada nâs d.emais.A fração 86 apresentou, atém da linha n." 11comum às frações 54 e 60, as linhas específicasn." 3 e 4. Finalmente, a fraçâo l0B apresentouuma única linha, a número 1.

A Fig. 3 mostra as linhas de precipitaçãode cada fração correlacionando-as com as obti-d-as do veneno total frente ao soro anti-crotáli-co.

A reação de imunodifusão radial dupla dasfrações contra o soro anti-crotálico, confÍrmaos dados obtidos na reaÇão de imunoeletrofo-

II

i

Fig. I - Diagrama de gel filitaçãoem Sephadex G-?5 superfino do ve-neno total do Crotalus durissus ær.

rificus

I'ese, quanto a características próprias das mes-mas (Fig. 4).

As linhas de precipitaçáo da fração 82 náomostram identidade com nenhuma outra fração(Fig. 4A). Já a fuaçáo 54 apresenta duas li-nlras de precipitação com identidade total cornas linhas da fração 60, sendo que uma delastambém apresenta esta identidade corn a linhaapresentada pela fração 86, possivelmente sen-do a linha n.' 11 observada na reaçáo de imu-noeletroforese.

Á,s frações que apresentaram na reação deimunoeletroforese linhas de precipitaçáo nasmesmas regiões não apresentaram nenhum ti_po de identidade fora as acima mencionadas(Figs. 48 e C).

Quanto à letalidade das frações (Tabela II),comparada com a DLs' do veneno bruto (0,062bmglml) em camundongo de 15 g foi observado

717

TAKEDA, A' K'; BARBOSA, S. F. C.; COSTA, L. M. da & ¡,DELINO, M. das c. F. - Fracionamento do veneno Croúalusdulissus tefrificus por cÌomatografia do exclusão moleculat. Rev. rnst. Med. trop. são paulo 2?:115-122. 1985.

(+)

Veneno lotol- lOmg/ml

"J.

tl8 \. ) sz---:-=/ "- soroAnficrotórico,-r -l

Froçöo 32-O,495mg /ml

(+)

I

Froçao 54-O,729mg/ml

Soro Anticrotólico

(+)

¡l

Froçöo 60-5,Omg/ml

Õ

Soro Anlicrotólico

(+) -)Fig. 3 - Esquema das linhas de precipitaçáo das imunoeletroforeses do veneno crotálico ,orut frOmg/ml) e das frações 32, 54, 60, 86 e 103 nas respectivas concentrações do eluato cortespondente,

ftente ao soro anti-ctotálico do Instituto Butantan

outros componentes que são bastante hábeisem soluçáo; iogo, as técnicas de separaçáo quemelhor se adaptam a estas características sãoas de exclusáo molecular em Sephadex 2.

GRILLO & SCANONES utilizando o Sepha-

TAI(EÐA, A. K.; BAÌ,BOSA, S. F. C.; COSTA, L. M. da & ADELINO, M. das G. F. -Fracionâmento d.o veneno Crotalusdurissus terrificus por cromatografia do exclusão molecular. Rev. Inst. Med. úrop. São paulo Z?:LLS-122, l9BS.

tt\-+\ e/t\ .//,/

@ Y"@

I VENENO CROTÀLICO TOTAL ( IMg,/MI)Z rnnçaO 52 (tm9/ñt)s rnnçÁo s4 ( tmqlmt )+ rnnçÃo 60 (tmq/mt)s rnaçÁo 86 (tmqlmt)e ¡n¡çÃo to3 (tmq/mt)7 SORO ANTICROTÂLICOFig. 4 - Esquema das reações de imunodifusão radial duplaA) comparação das frações 32, 54, 60, 86 e 103 e do veneno total nas concentrações de 1 mg/ml frente ao soroanti-crotálico do Instituto Butantan;B) Comparação das frações 54, 86 e 103 nas concentrações de 1 mg/ml frento ao veneno anti-crotálico do InstitutoButantan;c) comparação das frações 32, 54 e 86 nas concentrações de I mg/ml frente ao soro anti-crotálico do Instituto Bu-Iantan.

TABELA ILinhas de precipitação observadas na teação de imunoeletroforese

@7=:\

\@/o / @

o\-\

/:\

^7\?\fo/-\4/ ÃY/ \:/@-/

Ptco I

Ptco ll

O veneno total apresentou, frente ao soroanti-crotálico, 11 linhas de precipitaçáo comcargas e velocidades de migração diferentes.

Às frações não tóxicas corresponderam âslinhas 3, 4, 6, t0 e 11 e, às tóxicas provavel-mente as linhas 2, 5, I e 9.

Possivelmente as frações responsáveis porformação de anticorpos protetores seriam asdos determinantes antigênicos que reagiramcom o soro anti-crotálico dado as linhas de pre-cipitação 2, B e 9, pois a fração que as contém,a de n.' 54, é mais tóxica que a 60, uma vezque a linha 2 é mais imunogênica e a linha gestá presente nas duas frações tóxicas.

120

Prco il tPrco tv

N9 de linhos de precipitoçõo do veneno bruto

Os dados de imunoeletroforese ioram con-firmados pela imunodifusão radial dupla, sen-do verificado que as duas frações com ativi-dade letal (54 e 60) apresentaram identidade ro-tal em 2 linhas, umâ das quais corresponden-do a linha de número 11, pois apresentara icen-tidade total com uma das linhas da fração 86.

Diante destes dados obtid.os estamos nopresente momento inoculando coelhos para ob-tenção de anti-soro específico para as frações54 e 60, a fim de estudar melhor a atividadeimunogênica e protetora,

Isto será de grande ajuda para obtençáo desoros hiperimunes específicos, além de poder

TAKEDA, A. K.; BARBOSA, S. F. C.i COSTA, L. M. da & AÐELINO,M. dasc.F.-trtacionamentodovenenoorotalusdurlssus terrlficus por cromatografia de exclusã,o moleculat. Rev. fnst. Med. úrop. São paulo 2?:115-122, l9g5.

TABELA IILetâlidsde das frações 32, 54, 60,86 e 103 em camundongos NHI-N de 15 g comparada a DLõo de 0,0625 mg/ml, pelo

método de SPEASM & KÄR,Bffi,

Número das fragóes

PI

U

oI

Concentraçã,oprotelca oE

mg/ml

PIcoII

0,082

0,0675

N.o decamundongos

ir¡oculados

0,0512

PIco

III

0,0728

0,0505

0,0421

6

6

o

PI

oIV

0,0?83

0,065

0,054

Tempo de sobrevivência, observaçÉo om:

2h

6

6

o

* 2 anlmais apresentaram sintomas

padronizar melhor o veneno para ser utlliza-do náo só no controle dos soros hiperimunescomo tamþém medir a concentraçã,o de venenono sar¡gue circulante e poder orientar melhor aclfnica terapêutica.

SUMMAR,Y

Í'ractionation of Crotalus durissus terrificus ofchromaúography technique by molecular

exclusion

By means of chromatography technique bymolecular exclusion using Sephadex G-?5 werestudied different fractions of venom Crotalusdurissus terrificus, one the most cotnmon pol-sonous snakes in Brazil.

It were obtained four peaks related to frac-tions 32, 60, 86 and 103, which molecular weightvaried frorn 4.000 to 150.000.

103

0,0î2

0,060

0,050

3h

o

o

o

0,0906

0,0629

0,0524

42

15

15

4h

o

o

6

5h

6-

6-

6-

6b

o

o

o

Tt¡e fractions of all gel filtration diagram\d¡ere screened through immunoelectrophoresis,in order to verify its charges and migrationspeed. The precipitation lines were comparedwith 11 lines obtained through immunoelectro-phoresis of total venûm against anti-Crotalusdurlssus úerriflcus serum. It was observed thatfractions of same peak presented peculiar cha-racteristics except fraction 54 (correspondingto the ascendÍng of peak II), which showed sig-nificant differences when compared with frac-tion 60.

After screening, fractions of each peak v/erechosen in order to identify means of double ra-dial diffusion test and the letality \¡¡as compar-ed with 0,0625 mglrnl concentratlon of totalvenom, which corresponds to DLs. in mice bySPEARM & KÄRBER, method.

Fractions 32, 86 and 103 corresponding topeaks I, III and IV respectively, presented null

121

TAKEDA, A. K.; BARBOSA, S. F. C.; COSTA, L. M. da & ôDELINO,M.dasc.F.-FracionamentodovenenoCrotalusdüissus terrificus por cromatografia de exclusão molecular. Rev. fnst. Med. trop, São Paulo Z7ILL5-722, 7985.

or negligibe lethality, and fraction II was themost toxic.

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t0.

Recebido para publicação em 5/6/7984.

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