riparazione del danno da radiazione al dna esame di radiobiologia scuola di specializzazione in...
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Riparazione del danno da radiazione al DNA
Esame di Radiobiologia
Scuola di Specializzazione in Fisica Sanitaria
A.A. 2003-2004Antonella Roggio
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Mutazione = Danno - Riparazione
Cause di mutazioni
• Errori naturali endogeni al DNA• Danni esogeni al DNA (agenti fisici o chimici)• Riparazione del DNA tendente all’errore
Le mutazioni del DNA possono essere il risultato di danno al DNA non riparato o
mal riparato
La riparazione del DNA danneggiato ha una funzione centrale non solo nella protezione del genoma ma anche nella generazione della
diversità genetica.*
* Nilsen- Krokan “Base excision repair in a network of defence and tolerance” Carcinogenesis, Vol. 22, No. 7, 987-998, July 2001
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Perché proprio il DNA?
È più radiosensibile il nucleo o il citoplasma?
È possibile provocare la morte cellulare irraggiando solo l’uno o l’altro?
Il nucleo è 100 volte più radiosensibile del citoplasma per quanto concerne l’effetto letale
Solo quando la dose al citoplasma è molto elevata si può verificare la morte della cellula
È possibile uccidere le cellule e provocare altri tipi di danno irradiando il citoplasma ma è più semplice ottenere lo stesso effetto con
l’irradiazione del nucleo
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Come è “fatto” il DNA
NUCLEOTIDE
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• Evento fisico: Radiazioni x, γ, UV o particelle cariche di alta energia ionizzano la materia biologica cedendo energia [Dose = ΔE/Δm].
• Evento radiochimico: Formazione di radicali liberi
• Evento biologico: Danno a carico di molecole biologicamente importanti come acidi nucleici, membrane, etc.
Danno al DNA
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Principali Tipi di Danno al DNA
• Danno alle basi• Danno ai nucleotidi• SSB• DSB • Ponti di collegamento
Ionizing Radiation
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Morte 2/3 di una popolazione cellulare (mammifero)Una dose di 1 ÷ 2 Gy
• Tutte le cellule hanno subito elevato numero di distruzione di basi
• 1000 SSB
• 50 DSB
Le rimanenti cellule hanno riparato un elevato numero di lesioni o sono in grado di sopravvivere con un genoma lesionato
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LET e Distribuzione del Danno nel DNA
Il tipo e la distribuzione spaziale delle lesioni dipende dalla qualità della radiazione.
Basso LET
•Le tracce della radiazione sono uniformemente distribuite entro il nucleo
•Distruzione di basi, nucleotidi, SSB
Alto LET
•Le tracce della radiazione sono “raggruppate” entro il nucleo
• DSB
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Cos è la riparazione ?
È presente in tutti gli organismi studiati: batteri, lieviti, drosophila, pesci, anfibi, roditori e uomini.
È un processo di difesa nei confronti di un danno
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Modi o tipi di riparazione
Riparazione esente da errore
Riparazione tendente all’errore
Mancata Riparazione
Non causa letalità o mutazioni
Può provocare mutazioni non letali o
letali
La mancata riparazione è letale
La cellula sopravvive Insorgenza di neoplasie Morte cellulare
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Lesioni a carico della Timina
Correlazione lineare con la dose
Insorge attraverso l’interazione con radicali liberi acquosi come l’OH•
Nelle cellule di mammifero è più frequente delle SSB (rotture di catena singola).
Incapacità nella riparazione alcuni tipi di danno alle basi
atassia-telangiectasia (AT)
Danno alle basi
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Short Patch Repair
Rimuove la singola base danneggiata
Damaged Base
Abasic Site
DNA Polymerase bXRCC1
DNA Ligase III
DNA Glycoslyase
AP endonuclease
DNA Pol /PCNA
FEN1DNA Ligase I
Short Patch Repair Long Patch Repair
Long Patch Repair
Rimuove 2 ÷ 10 nucleotidi
Base excision repair - BERRiparazione mediante asportazione
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Nucleotide Excision Repair (NER)nell’uomo
• Una nucleasi di escissione si lega al DNA nei pressi della lesione e taglia il filamento in entrambi i punti ai lati della lesione.
• Il frammento viene rimosso dalla DNA-elicasi
• Il segmento mancante viene colmato dalla DNA-polimerasi
• Infine viene unito al DNA dalla DNA-ligasi
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Single Strand Break — SSB
Nro SSBs Dose [0.2Gy – 60 MGy]Per quanto piccola la dose si
verificheranno sempre delle SSBs !
Radiazioni Ionizzanti di basso LET
10 ÷ 20 eV per 1 rottura
Riparazione mediante asportazione
• Tecnica rapida ed efficiente – esente da errori
• Nelle cellule di mammifero la velocità di riparazione mediante escissione è esponenziale
• Il processo è controllato enzimaticamente e dipende dalla temperatura: a 0° non avvengono riparazioni.
• Le SSBs non riparate possono prendere parte alla formazione di DBSs.
Nro SSBs indotte attraverso radicali liberiIn condizioni di ipossia il Nro SSBs
si riduce a 1/3
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Viene asportato il tratto di catena contenente il frammento deficitario di DNA e viene utilizzata il filamento non alterato complementare della catena per la
risintesi del nuovo tratto di DNA.
Riparazione mediante asportazione delle SSBs
• Riconoscimento della sede del danno e
incisione (endonucleasi)
• Risintesi (DNA-polimerasi)
• Asportazione della lesione (esonucleasi)
• Unione (ligasi)
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Rotture di catena doppia — DSBs
Il rapporto tra dose e numero di DSBs indotte lineare-quadratico
Possono prodursi per evento singolo ionizzante o per la coincidenza di casuali rotture della catena su catene complementari.
OGGI: È possibile una riparazione “tendente all’errore”
Si può solo stabilire se le estremità libere di una molecola di DNA frammentata si sono riunite; non si può stabilire se l’accoppiamento originario di basi è ripristinato.
La sequenza di basi nucleotidiche può non essere disponibile sull’una o sull’altra catena e può non esservi continuità tra le due “estremità libere”
!
IERI: Le DSBs non possono essere riparate e sono necessariamente letali !!!
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Sistemi di riparazione delle DSBnelle cellule di mammifero
NHEJ HR SSA
• fase G0 e G1 del ciclo cellulare
• ci può essere una perdita dell’ informazione genetica — error prone
• cellule meiotiche
• cellule mitotiche in fase di Replicazione del ciclo cellulare
• riparazione esente da errore — error free
Può essere vista come una variante dell’ HR
In un genoma complesso, dove non tutti i nucleotidi sono codificanti, il rischio
associato alla perdita di informazioni per una
riparazione non esente da errore è inferiore a quello che si corre se la cellula
entrasse nella fase S o M col DNA non riparato
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NHEJ
DNA-PK = DNA-PKcs Ku+
XRCC4
DNA-Ligasi IV
!Cellule che mancano di
DNA-PKcs o Ku o XRCC4 sono più radiosensibili e
difettose nella riparazione delle DSBs
XRCC4 esiste in un complesso con la DNA-ligasi IV
L’interazione di quest’ultima con XRCC4 stimola l’azione di “ligasi”
e forse anche di annealing
Cellule che mancano di XRCC4 hanno un basso
livello di DNA-ligasi IV morte per apoptosi
!
Pro
tein
e co
invo
lte
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HR
•Rad52 riconosce la sede del danno e si lega alle estremità danneggiate dei filamenti del DNA
•Il complesso endonucleasico taglia dei segmenti di DNA
Si ottengono due singole code
•Una coda invade il filamento fratello del DNA non danneggiato generando una struttura D-loop
•L’altra può anch’essa invadere il filamento fratello o legarsi semplicemente all’altro capo del filamento del DNA danneggiato
•Si formano dei legami (giunzioni di Holliday) tra i filamenti appartenenti alla sequenza danneggiata e a quella sana.
•Le informazioni mancanti nel sito della DSB vengono recuperate da una nuova sintesi del DNA.
Proteine coinvolte
• Rad 52
• Complesso endonucleasico Nbs1-Mre11-Rad50
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SSA
Proteine coinvolte
• Rad 52
• Complesso endonucleasico Nbs1-Mre11-Rad50
La riparazione avviene attraverso l’annealing delle sequenze complementari su entrambi i siti di rottura.
! Nella ricerca delle sequenze omologhe da appaiare produce la perdita di larghi frammenti !
Riparazione non esente da errore
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Sindromi associate alla mancanza o alterazione di geni coinvolti nel processo di riparazione delle DSB
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Nilsen- Krokan Base excision repair in a network of defence and tolerance Carcinogenesis, Vol. 22, No. 7, 987-998, July 2001
S.P. Lees-Miller, K. Meek Repair of DNA double strand breaks by non-homologous end joining, Biochimie 85 (2003) 1161–1173
Andrej Dudáš, Miroslav Chovanec, Review DNA double-strand break repair by homologous recombination, Mutation Research 566 (2004) 131–167
Peter Karran, DNA double strand break repair in mammalian cells
• Belli, Sapora, Tabocchini Molecular targets in cellular response to ionizing radiation andimplications in space radiation protection
Coggle, Effetti Biologici delle radiazioni, Ed. Minerva Medica, Torino 1998
Stephen P. Jackson Sensing and repairing DNA double-strand breaks, Carcinogenesis, Vol. 23, No. 5, 687-696, May 2002
www.users.rcn/jkinball.ma.ultranet/BiologyPages
Gary Roberts , DNA repair mechanisms, Cap.III: DNA repair mechanisms. Edited by Timothy Paustian, University of Wisconins-Madison ©2003
• Boreham, Cellular Defense Mechanisms Against the Biological Effects of Ionizing Radiation , IRPA-10, May 2000 Hiroshima, Japan
Bibliografia
BER
Strand Break
5’ Exonuclease Activity
Recombination with intact strand
New DNA Synthesis
DNA strand unwound annealed and ligated
HR
SSA
1. l’eterodimero Ku70/80 si lega alle estremità del DNA in corrispondenza della rottura, interagisce con la subunità catalittica PKcs attivandola e legandosi ad essa per formare il complesso DNA-PK
2. Si forma una Sinapsi quando le due molecole di PKcs, ciascuna a una estremità della DSB, mantengono unite le due parti terminali libere del DNA, funzionando come una "struttura di supporto" per l'assemblaggio di altre componenti del complesso sistema di riparo
3. Per il processamento delle parti finali libere del DNA e l'allineamento omologo sono necessari altri enzimi: esonucleasi ed elicasi.
4. avviene il legame tra le estremità del DNA mediante il complesso XRCC4/DNAligasiIV (processo non ancora del tutto chiaro)
5. il complesso XRCC4/DNA ligasi IV è interagisce con il complesso DNA-PK e opera la giunzione
6. avviene il rilascio di tutto la “macchina” proteica
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Danno alle membrane
Danno al reticolo endoplasmatico
Danno ai lisosomi
Danno ai mitocondri??