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ROSアッセイ技術講習会

ー JaCVAM多施設バリデーションの結果－

2014年10月15日（水）松本康浩（あすか製薬株式会社）

ROSアッセイバリデーションの大まかな流れ

Phase 1（技術移転）

Phase 2

＜アトラス社製光源＞＜セリック社製光源＞

Phase 1‐1（技術移転）

Phase 1‐2（異なる光源を用いた場合の条件検討）

Phase 2

バリデーション報告書作成

ピアレビュー

バリデーション報告書作成

アトラス社製の光源を用いたROSアッセイバリデーションチームの構成

小島肇 JaCVAM, VMT chairperson細井一弘 Santen Pharmaceutical Co., Ltd., VMT co‐chair尾上誠良 University of Shizuoka, Lead laboratory中村和市 Shionogi & Co., Ltd.戸田嗣人 Shionogi & Co., Ltd.松本康浩 ASKA Pharmaceutical Co., Ltd.Manfred Liebsch ZEBET高木広憲 Taisho Pharmaceutical Co., Ltd.大崎尚人 Taisho Pharmaceutical Co., Ltd.川上哲 Asahi Kasei Pharma Co.Valerie Zang ECVAMWarren Casey ICCVAM

VMT

Lab#1 世戸孝樹 University of Shizuoka

Lab#2 若栗忍Food and Drug Safety Center, Hatano Research Institute

Lab#3 山本敏誠 Mitsubishi Tanabe Pharma Co.

試験施設

セリック社製の光源を用いたROSアッセイバリデーションチームの構成

小島肇 JaCVAM, VMT chairperson細井一弘 Santen Pharmaceutical Co., Ltd., VMT co‐chair尾上誠良 University of Shizuoka, Lead laboratory戸田嗣人 Shionogi & Co., Ltd.松本康浩 ASKA Pharmaceutical Co., Ltd.Manfred Liebsch ZEBET岩瀬裕美子 Mitsubishi Tanabe Pharma Co.山本敏誠 Mitsubishi Tanabe Pharma Co.Valerie Zang ECVAMWarren Casey ICCVAM

Lab#4 川上哲 Asahi Kasei Pharma Co.

Lab#5 松本康浩 ASKA Pharmaceutical Co., Ltd.

Lab#6 戸田嗣人 Shionogi & Co., Ltd.

Lab#7 大崎尚人 Taisho Pharmaceutical Co., Ltd.

VMT試験施設

アトラス社製光源

Suntest CPS series

セリック社製光源

SXL‐2500V2

今回のバリデーションで使用した光源

標準太陽光とバリデーションで使用した機器の波長スペクトルの比較

ROSアッセイの測定原理

1. Singlet oxygen (SO)by bleaching of p‐nitrosodimethylaniline (RNO)

1O2 + A→ [AO2] → AO2[AO2] + RNO → ‐RNO (bleaching) + productsA : ImidazoleRNO : p‐nitrosodimethylaniline

2. Superoxide anion (SA)by reduction of nitroblue tetrazolium (NBT)

O2‐ + NBT → O2 + Nitroblue diformazan

クオーツ製容器 96ウエルのプラスチック蓋による照射量の減衰と反

応液の蒸発を避けるために使用特注品（オザワ科学）を使用

96-well plate (n=3)

BlankPC

NC Sample #1‐7

SO

SA

SO : Singlet OxygenSA : Superoxide Anion PC : Positive controlNC : Negative control

Mix (Vortex and Sonication for 5 ‐ 10 min)

Add 200 μL of mixture to each well (n=3)

Check solubility using a microscope (x100) and coloration

Pre‐read A440 and A560 after shaking for 5 sec

Light exposure for 1 hr

Read A440 and A560 after shaking for 1 min and coloration

NaPB 855 LNBT 125 LChemical 20 L

NaPB 480 LImidazole 250 LRNO 250 LChemical 20 L

操作手順

＜計算式＞

SO value =

[サンプルOD440（照射前－照射後）－ブランクOD440（照射前－照射後）]×1000

SA value =

[サンプルOD560（照射後－照射前）－ブランクOD560（照射後－照射前）]×1000

アトラス社製光源を用いたROSアッセイ

Phase 1試験

試験概略

●被験物質（非コード化）： ROSアッセイで実績のある化合物（11種類）

●陽性対照物質：Quinine

●陰性対照物質：Sulisobenzone

●溶媒：DMSO

●評価濃度：200及び20 M

●試験回数：1被験物質あたり独立した試験を3回実施

●光照射条件：250 W/m2, 25℃, 1時間（照度は機器の設定値）

結果の判定基準

• Positive（＋）：200及び20 Mの両方またはいずれかの濃度で “SO≥25” and/or “SA≥20”

• Negative（－）：200 Mで “SO<25” and “SA<20”

データ採用基準

1. データ（Blank、陽性・陰性対照物質、被験物質）の欠損がない

2. Blankを除く吸光度＝0.02～1.1

3. 陽性対照値（200 M, 3ウェルの平均値）＝“SO: 150~500” and “SA: 200~400”

4. 陰性対照値（200 M, 3ウェルの平均値）＝“SO: -20~24” and “SA: -20~19”

アトラス社製光源によるPhase 1試験施設内、施設間変動

Chemicals

Lab#1 Lab#2 Lab#3

N Mean SD CV(%) N Mean SD CV(%) N Mean SD CV(%)

Intra‐day

Positive Control Quinine

SO 6 462 14.4 3.1 4 402 14.8 3.7 4 359 6.9 1.9

SA 6 372 11.1 3.0 4 343 28.7 8.4 4 217 14.2 6.5

Negative Control Sulisobenzone

SO 6 2 12.2 ‐ 4 1 2.4 ‐ 4 ‐7 1.0 ‐

SA 6 ‐12 2.3 ‐ 4 ‐7 2.4 ‐ 4 ‐2 0.5 ‐

Inter‐day


SO 3 455 4.5 1.0 3 401 18.6 4.6 3 359 7.6 2.1

SA 3 349 16.2 4.6 3 335 17.8 5.3 3 223 10.0 4.5


SO 3 3 8.7 ‐ 3 ‐1 1.0 ‐ 3 ‐5 3.0 ‐

SA 3 ‐14 6.4 ‐ 3 ‐7 4.6 ‐ 3 ‐2 1.0 ‐

Chemicals N Mean SD CV(%)Inter‐Laboratory

Positive Control QuinineSO 3 410 50.0 12.2SA 3 312 82.9 26.6

Negative Control SulisobenzoneSO 3 ‐2 2.0 ‐SA 3 ‐7 5.0 ‐

アトラス社製光源によるPhase 1試験 13化合物を用いた結果

Chemicals Lab#1 Lab#2 Lab#35‐Fluorouracil (5‐FU) N N N8‐Methoxy psoralen (8‐MOP) P P PAmiodarone P P PChlorpromazine P P PDiclofenac P P PDoxycycline P P PFurosemide P P PKetoprofen P P PLevofloxacin P P PNorfloxacin P P POmeprazole P P PQuinine P P PSulisobenzone N N N

アトラス社製光源を用いたPhase 1試験まとめ

陽性および陰性対照物質の各施設内における日内・日間変動は小さく、施設間変動も良好であった。

ROSアッセイで使用実績のある化合物を用いた試験でも各施設とも全て同じ判定結果が得られた。

以上のことから、各施設とも試験方法の技術移転（Transferability）はできたと判断した。

セリック社製光源を用いたROSアッセイプレバリデーション

Phase 1‐1 試験

試験概略




●溶媒：DMSO



●光照射条件：2.3 mW/cm2, 20～29℃, 1時間（照度は各施設の照度計の値）







3. 陽性対照値（200 M, 3ウェルの平均値）＝“SO: 150以上” and “SA: 200以上”

4. 陰性対照値（200 M, 3ウェルの平均値）＝“SO: 25未満” and “SA: 20未満”

セリック社製光源によるPhase 1‐1試験施設内、施設間変動

Chemicals

Lab#4 Lab#5 Lab#6 Lab#7

N Mean SD CV(%) N Mean SD CV(%) N Mean SD CV(%) N Mean SD CV(%)

Intra‐day

Positive Control

QuinineSO 6 242 5.5 2.5 4 288 24.7 8.6 4 200 13.2 6.6 6 335 28.1 8.4

SA 6 110 7.0 6.4 4 153 19.6 12.8 4 209 16.1 7.7 6 189 9.0 4.8

Negative Control

SulisobenzoneSO 6 ‐3 3.5 ‐ 4 1 1.3 ‐ 4 1 4.7 ‐ 6 3 3.7 ‐

SA 6 ‐22 0.9 ‐ 4 ‐7 6.7 ‐ 4 ‐8 1.5 ‐ 6 ‐2 1.3 ‐

Inter‐day

Positive Control

QuinineSO 3 251 6.5 2.6 3 240 12.8 5.3 3 214 22.5 10.5 4 277 51.9 18.7

SA 3 123 3.5 2.8 3 132 14.8 11.2 3 222 28.5 12.8 4 171 28.1 16.4

Negative Control

SulisobenzoneSO 3 ‐1 2.6 ‐ 3 ‐2 2.0 ‐ 3 2 5.5 ‐ 4 1 2.6 ‐

SA 3 ‐22 0.6 ‐ 3 ‐4 10.5 ‐ 3 ‐8 4.6 ‐ 4 ‐1 1.3 ‐


Positive Control Quinine SO 4 251 36.4 14.5SA 4 162 43.2 26.7

Negative Control Sulisobenzone SO 4 0 1.7 ‐SA 4 ‐9 9.7 ‐

セリック社製光源によるPhase 1‐1試験 13化合物を用いた結果

Compound Lab#4 Lab#5 Lab#6 Lab#7

5‐Fluorouracil (5‐FU) N N N N8‐Methoxy psoralen (8‐MOP) P P P PAmiodarone P P P PChlorpromazine P P P PDiclofenac P P P PDoxycycline P P P PFurosemide P P P PKetoprofen P P P PLevofloxacin P P P PNorfloxacin P P P POmeprazole P P P PQuinine P P P PSulisobenzone N N N N

セリック社製光源を用いたPhase 1‐1試験まとめ

陽性および陰性対照物質の各施設内における日内・日間変動は小さく、施設間変動も良好であった。


以上のことから、各施設とも試験方法の技術移転（Transferability）はできたと判断した。

しかしながら、1施設を除いて、陽性対照物質のSAの値が暫定の下限基準である200を超えなかった。

陽性対照のSAで200を超えなかったことから、セリック社製光源を用いたバリデーションを進めるに当たり、試験条件をどうするか？

1. 照射強度をアトラスと同等にし、陽性対照のSAの下限基準を下げる。

2. 陽性対照のSAの下限基準を変えずに陽性対照物質の反応性をアトラスと同等（200以上）になるまで照射強度を上げる。

VMTで協議した結果、ガイドライン化のためには、アトラス社やセリック社以外

の機器も利用できるようにする必要があるが、照射強度を規定するとその対応が困難となるため、対照物質の反応性を同等にした試験法の方が望ましいと考え、２を選択することにした。

各施設で検討した結果、陽性対照のSAの下限基準である200を超えるためには、照度*が3.0 mW/cm2以上であれば、満たせることが明らかとなったため、Phase 1‐2試験を実施した。

*：照度は基準とした照度計（Dr Hönle 0037）の相当値

セリック社製光源を用いたROSアッセイプレバリデーション

Phase 1‐2 試験

試験概略




●溶媒：DMSO



●光照射条件：3.0 mW/cm2以上, 20～29℃, 1時間（照度は基準照度計（Dr Hönle 0037）の相当値）









セリック社製光源によるPhase 1‐‐2試験施設内、施設間変動

ChemicalsLab#5 Lab#6 Lab#7

N Mean SD CV(%) N Mean SD CV(%) N Mean SD CV(%)

Intra‐day


SO 4 360 21.0 5.8 4 377 12.4 3.3 4 401 15.0 3.7

SA 4 235 23.6 10.0 4 271 21.0 7.7 4 268 14.0 5.2


SO 4 0 2.3 ‐ 4 2 2.2 ‐ 4 ‐1 1.0 ‐

SA 4 ‐15 13.5 ‐ 4 ‐3 0.5 ‐ 4 ‐11 4.0 ‐

Inter‐day


SO 2 370 8.5 2.2 2 359 0.7 0.2 3 410 17.7 4.3

SA 2 235 13.4 5.7 2 246 2.1 0.9 3 290 37.3 12.9


SO 2 3 0.7 ‐ 2 ‐4 5.7 ‐ 3 ‐5 4.0 ‐

SA 2 ‐6 2.8 ‐ 2 ‐1 2.8 ‐ 3 ‐10 6.5 ‐


Positive Control QuinineSO 3 382 22.7 5.9SA 3 262 27.2 10.4

Negative Control SulisobenzoneSO 3 ‐1 1.7 ‐SA 3 ‐7 4.7 ‐

セリック社製光源によるPhase 1‐2試験 13化合物を用いた結果

Chemicals Lab#5 Lab#6 Lab#75‐Fluorouracil (5‐FU) N N N8‐Methoxy psoralen (8‐MOP) P P PAmiodarone P P PChlorpromazine P P PDiclofenac P P PDoxycycline P P PFurosemide P P PKetoprofen P P PLevofloxacin P P PNorfloxacin P P POmeprazole P P PQuinine P P PSulisobenzone N N N

セリック社製光源を用いたPhase 1‐2試験まとめ

照度を3.0 mW/cm2以上にすることで、陽性対照のSA値が暫定の下限基準である200以上を満たすことができた。

照射条件を変更した場合においても、陽性および陰性対照物質の各施設内における日内・日間変動は小さく、施設間変動も良好であった。


以上のことから、照度を3.0 mW/cm2以上にすることで、Phase2試験の実施が可能と判断した。

Phase 2試験

化合物選定

化合物選定は光毒性陽性物質、陰性物質をおおよそ半々になるように選択した。

Phase2試験の化合物はコード化して試験を実施した。

＜光毒性物質＞

・最初にヒトで光毒性陽性の情報があるものから選択し、ヒトでの情報がないものについては、動物又は3T3NRU‐PTで陽性の情報があるものから選択した。

＜非光毒性物質＞

・非光毒性物質については、多くの化合物でヒトのデータが見つけられなかったため、多くは3T3NRU‐PTで陰性と判定されているものから選択した。

Classification Phototoxic Non‐phototoxic

Drug

Acridine 8‐Methoxy psoralen AspirinAcridine HCl Nalidixic acid BenzocaineAmiodarone HCl Nalidixic acid (Na salt) ErythromycinChlorpromazine HCl Norfloxacin PhenytoinDoxycycline HCl Ofloxacin Penicillin GFenofibrate PiroxicamFurosemide Promethazine HClKetoprofen Rosiglitazone6‐Methylcoumarine Tetracycline

Chemical

Anthracene Camphor sulfonic acidBithionol ChlorhexidineHexachlorophene Cinnamic acidRose Bengal L‐histidine

Octyl methacrylatePABASDS

UV absorber

Avobenzone BumetrizoleDrometrizoleMethylbenzylidene camphorOctrizoleOctyl methoxycinnamateOctyl salicylateUV‐571

Phase2試験で使用した被験物質

23 18 5

11 4 7

9 1 7

23 19

試験概略

●被験物質（コード化）： 23種類の光毒性物質、19種類の非光毒性物質（合計42種類）



●溶媒：DMSOまたは2% DMSOを含むNaPB

●評価濃度：

アトラス（Lab 1～3）：200、20 or 2 M

セリック（Lab 4～7）： 200、100、50 or 20 M

析出が見られない最高濃度で実施。最低濃度でも析出が見られた被験物質は評価不能。


●光照射条件：後述


1. 光照射前の反応液中に析出が認められない






• Positive（＋）：試験を実施した濃度で “SO≥25” and/or “SA≥20”


• Inconclusive（I）：上記以外

試験概略（続き）

Light source Suntest CPS/ CPS+ (Atlas)

LampXenon lamp

(Atlas, No. 56-0017-94)Facility Lab# 1 Lab# 2 Lab# 3

UVA intensities*(mW/cm2)

2.07 1.95 1.93

Light source SXL-2500V2 (Seric)

LampXenon lamp(SX25001)

Facility Lab# 4 Lab# 5 Lab# 6 Lab# 7

UVA intensities*, **(mW/cm2)

4.0 5.0 3.5 3.0

*: UVA intensities were measured with a same calibrated UV meter (Dr.Honle).**: UVA intensities of Lab#4‐7 were set at an appropriate value to satisfy the criteria for data acceptance (Positive control value at 200 µM : SO ≧150 and SA≧200).

光照射条件

Lab #

Solar simulator Sensitivity Specificity Positive

predictivityNegative

predictivity Accuracy

1 Atlas 100%(21/21)

41.7%(5/12)

75.0%(21/28)

100%(5/5)

78.8%(26/33)

2 Atlas 100%(20/20)

60.0%(6/10)

83.3%(20/24)

100%(6/6)

86.7%(26/30)

3 Atlas 100%(21/21)

81.8%(9/11)

91.3%(21/23)

100%(9/9)

93.8%(30/32)

4 Seric 100%(20/20)

53.8%(7/13)

76.9%(20/26)

100%(7/7)

81.8%(27/33)

5 Seric 100%(20/20)

46.2%(6/13)

74.1%(20/27)

100%(6/6)

78.8%(26/33)

6 Seric 100%(19/19)

60.0%(6/10)

82.6%(19/23)

100%(6/6)

86.2%(25/29)

7 Seric 100%(20/20)

63.6%(7/11)

83.3%(20/24)

100%(7/7)

87.1%(27/31)

Phase 2試験結果

【結果及び考察】

1. 難溶性のため評価不可能であった被験物質を除くと、光毒性に対する陽性検出率は全施設ともに100%、陰性検出率は41.7～81.8%であった。

2. 擬似太陽光照射装置によらない機器汎用性をみとめた。

3. いずれの施設においても偽陰性が認められなかったことから、本アッセイは、光毒性試験の必要性を判断する光化学的特性試験の一つとして利用可能と考えられた。

4. 反応液中で化合物の析出や着色が認められる化合物は評価不可である。

5. ROSアッセイは、化合物の光反応性を評価する系であるため、生体における光毒性に対して偽陽性を生じる場合がある。従って、ROSアッセイで陽性の場合、さらなる光毒性評価が必要である。

ピアレビュー

Peer review Panel

William S. Stokes, Consultant to the NTP/NIEHS (Contractor)

Horst Spielmann, Freie Universität Berlin

Ikuo Horii, DSRD Global consultant to Pfizer

Kim Bae Hwan, College of Natural Sciences, Keimyung University

ピアレビュアーからの提言

1. これまでの結果から20μMで実施した陰性結果を含めても問題ないのではないか？

2. SAのクライテリアを現行の20よりも上げれば、偽陽性判定の化合物が減るのではないか？

判定基準の変更

Judgment1, 2 Concentration3 SO(mean of 3 wells)

SA(mean of 3 wells)

Photoreactive 200 μM

≥25 and ≥70

<25 and/or I4 and ≥70

≥25 and <70 and/or I4

Weakly photoreactive 200 μM <25 and ≥20, <70

Non‐photoreactive 200 μM <25 and <20

Inconclusive The results do not meet the above‐mentioned criterion.

1. 1回の実験で判定可能

2. 20 M及び200 Mの両方で析出や着色等の影響が認められた場合は判定不能。Weakly photoreactive判定の場合は、その後、フォローアップが必要。

3. 200 Mで析出や着色がみられた場合、20 Mの結果

が利用可能。ただし、申請目的の場合、陰性と判定するためには反応液中の光安定性確認が必要

4. 析出や着色等

ピアレビュー後まとめ

1. ROSアッセイは200 μMで試験を実施し、200 μMで析出等のため評価できない場合のみ20 μMで評価する。最初から20 μMのみでの評価は不可である。

2. 20 μMの陰性結果をその後の光安全性試験を実施しない根拠として用いる場合には、光照射中の被験物質が安定であったことを確認する必要がある。

3. ただし医薬品開発で使用する場合は、ICH‐S10ガイドラインに従い、 200 μMの結果のみが受け入れられる。

参考文献

≪バリデーション報告書、推奨プロトコール、ピアレビュー報告書≫1. http://www.jacvam.jp/news/news131017.html

≪発表論文≫2. Onoue S et al. Establishment and intra‐/inter‐laboratory validation

of a standard protocol of reactive oxygen species assay forchemical photosafety evaluation. J Appl Toxicol, 33, 1241‐1250,2013.

3. Onoue S et al. Intra‐/inter‐laboratory validation study on reactiveoxygen species assay for chemical photosafety evaluation usingtwo different solar simulators. Toxicol in Vitro, 28, 515–523, 2014.

ご静聴ありがとうございました。

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