Univerza v Ljubljani Fakulteta za farmacijo

Katedra za farmacevtsko kemijo

SEMINARSKA NALOGA

H1 ANTAGONISTI

Mentor:

prof.dr.Danijel Kikelj, mag.farm.

Pripravili: ŠINKOVEC UROŠ ŠKOF KATARINA

ŠOŠTARIĆ SABINA ŠPANIĆ VESNA TAVČAR NENA

TEMOVA BILJANA TERBUC VESNA TERČELJ MATIC TOMAŽIČ PETRA TOMSIČ JASNA

ELIF ҪINAR EZGI EVRIM ӦZKOL

Kazalo 1. HISTAMIN .................................................................................................................................. 1 

1.2. Kemijske značilnosti histamina ............................................................................................. 1 

1.2.Biosinteza in metabolizem histamina ..................................................................................... 2 

1.3.Receptorji za histamin ............................................................................................................ 3 

2. UČINKOVINE Z DELOVANJEM NA HISTAMINERGIČNI SISTEM .................................. 4 

2.1. INHIBITORJI SPROŠČANJA HISTAMINA ...................................................................... 4 

2.2. ANTAGONISTI HISTAMINSKIH RECEPTORJEV (ANTIHISTAMINIKI) .................... 4 

a) 1.generacija H1-antihistaminikov ......................................................................................... 4 

b) 2. generacija H1-antihistaminikov ........................................................................................ 7 

2.3. TOPIKALNI H1- ANTIHISTAMINIKI ................................................................................ 8 

3. SINTEZE H1 ANTAGONISTOV ............................................................................................... 9 

1.ASTEMIZOL ............................................................................................................................ 9 

2.CETIRIZIN ............................................................................................................................. 10 

2.1.LEVOCETIRIZIN ............................................................................................................ 11 

3.LORATADIN, DESLORATADIN ......................................................................................... 12 

4.DIMETINDEN ........................................................................................................................ 14 

5.DIMETOTIAZIN .................................................................................................................... 15 

6.DIFENHIDRAMIN ................................................................................................................. 15 

7.DIMENHIDRINAT ................................................................................................................. 16 

8.FEKSOFENADIN ................................................................................................................... 16 

9.FENINDAMIN ........................................................................................................................ 18 

10.FENIRAMIN ......................................................................................................................... 19 

11.KLEMASTIN ........................................................................................................................ 20 

12.KETOTIFEN ......................................................................................................................... 21 

13.TIETILPIRAZIN ................................................................................................................... 22 

4. HOMOLOGNO MODELIRANJE ............................................................................................. 23 

4.1. Osnovni princip ................................................................................................................... 23 

4.2. Homology modelling and binding site mapping of the human histamine H1 receptor ....... 25 

4.2.1. Experimental Protocols ................................................................................................ 26 

4.2.2. Results .......................................................................................................................... 27 

1. HISTAMIN

Histamin je biogeni amin, ki nastane v telesu iz aminokisline histidina. Sintetizira se v mnogih tkivih, v bazofilcih, v parietalnih celicah želodčne mukoze, v nevronih CŽS in tudi na periferiji. Histamin je eden izmed mnogih mediatorjev vpletenih v alergični vnetni odziv in ima tudi pomembno vlogo v uravnavanju sekrecije želodčne kisline. Poleg tega pa ima vlogo v več delih CŽS kot regulator spanja in budnosti, kognitivnih funkcijah in v spominu. 1.2. Kemijske značilnosti histamina

Histamin ima pKa 5,80 (imidazol) in 9,40 (primarni alifatski amin). Pri fiziološkem pHju obstaja kot mešanica tavtomernih monokationov (97%) in v manjši meri kot dikation (3%). Oba, mono in dikation sta fiziološko aktivna. V vodnih raztopinah je histamin v dveh tavtomernih oblikah π in τ.

V ravnotežju prevladuje τ oblika histamina in sicer je razmerje med τ in π obliko 4:1. Raziskave kažejo da je tavtomerna sestava pomembna za interakcijo agonist-receptor. Po raziskavah sodeč obstaja histamin v raztopini tudi v dveh konformernih oblikah: trans (antiperiplanarna) in gauche (sinklinalna).

Trans konformacija je pomembna za delovanje na H1 in H2 receptorjih, gauche konformacija pa je pomembna na H3 receptorjih.

1 

Dodajanje alkilnih skupin na histamin rezultira v spojinah z zmanjšanim delovanjem na H1 in H2 receptorjih. 2-metilhistamin je selektivni H1 agonist (4-metil histamin je pa selektivni H2 agonist), ampak substitucija na imidazolnem dušiku z metilnimi skupinami daje skoraj neaktivne spojine. Podobno substitucija na alifatskem aminu daje manj aktivne spojine ( NH2>NHMe>NMe2>N+Me3) na H1 in H2 receptorjih.

1.2.Biosinteza in metabolizem histamina

Histamin se sintetizira v Golgijevem aparatu mastocitov in bazofilcev z encimsko dekarboksilacijo histidina. Konverzija poteka z encimom L-histidin dekarboksilaza in kot kofaktor pri tej reakciji sodeluje piridoksal fosfat.

Histamin se takoj po sprostitvi hitro metabolizira v skoraj neaktivne metabolite po dveh glavnih poteh: N-metilacija in oksidacija. Metilacijo katalizira encim N-metiltransferaza. Metiliran metabolit je neaktiven in del tega metabolita oksidirata encima monoaminska oksidaza in potem še aldehid oksidaza do N-metilimidazol ocetne kisline. Histamin je prav tako oksidiran do imidazol ocetne kisline z diamin oksidazo.

2 

1.3.Receptorji za histamin

H1 – receptorji se nahajajo v gladkem mišičju bronhijev, črevesja in maternice. Posledica delovanja histamina na te receptorje je kontrakcija bronhijev, kar povzroči zožitev ali celo zaprtje zračnih poti v pljučih. Histamin tudi poveča prepustnost kapilarnih sten in snovi iz plazme tečejo v ekstracelularni prostor zaradi kontrakcije endotelijskih celic, kar privede do nastanka edemov. Na ravni osrednjega živčnega sistema se zdi, da ima histamin vpliv na budnost, medtem ko blokada H1 – receptorjev povzroči utrujenost. H1 – receptor ima lastnosti z G – proteinom sklopljenega receptorja. Prenos signala se začne s hidrolizo fosfatidil-4,5-bisfosfonata v IP3 in DAG, ki poteče preko aktivacije fosfolipaze C. Poveča se intracelularna koncentracija Ca2+, ki izhaja iz intracelularnih skladišč Ca2+. Napetostno odvisni kalcijevi kanalčki se lahko odprejo zaradi aktivacije ionskih kanalov permeabilnih za Na+ in K+ ione. Zato antagonisti kalcijevih kanalčkov delno blokirajo nekatere učinke histamina na intestinalne gladke mišice.

H2 – receptorji so v želodcu in sprožijo stimulacijo parietalnih celic, ki povečajo nastajanje in izločanje želodčne kisline. Prav tako pa ima H2 receptor manjšo vlogo pri alergičnem vnetnem odzivu. H2 – receptor je 7 – TM receptor. Je pozitivno sklopljen s cAMP kot sekundarnim prenašalcem in splošno je sprejeto, da so H2 – receptorji sklopljeni z adenilat ciklazo.

3 

H3 – receptorji so v osnovi avtoreceptorji (zmanjšujejo izločanje nevrotransmitorjev: histamina, noradrenalina, serotonina in acetilholina), o njih pa je znanega mnogo manj o molekularnih karakteristikah in njihovih funkcijah kot o ostalih dveh razredih.

H4 – receptorji so izraženi predvsem na eozinofilcih in na mastocitih, kjer so povezani z kemotaktičnimi odzivi.

2. UČINKOVINE Z DELOVANJEM NA HISTAMINERGIČNI SISTEM

2.1. INHIBITORJI SPROŠČANJA HISTAMINA

To so učinkovine, ki onemogočajo sproščanje histamina, vendar ne delujejo antagonistično (se ne vežejo na histaminske receptorje). Predstavniki: kromolin, nedokromil, lodoksamid, pemirolast.

2.2. ANTAGONISTI HISTAMINSKIH RECEPTORJEV (ANTIHISTAMINIKI)

a) 1.generacija H1-antihistaminikov

Generacijo razdelimo na podskupine glede na strukturne značilnosti: - etilendiamini - etanolaminski etri - alkilamini - piperazini - triciklični H1- antihistaminiki Stranski učinek: depresija centralnega živčevja (zmedenost, tremor)

4 

ETILENDIAMINI So prvi antihistaminiki, med katerimi je najstarejši predstavnik je fenbenzamin. Spojine imajo različne, vendar sorodne aromatske obroče: fenil, 2-piridil, halogeniran fenil, fenil s metoksi skupino, pirimidil. Majhni substituenti so ponavadi metilne skupine. Veliko teh učinkovin se še danes uporablja. Med učinki v centralnem živčnem sistemu je najpogostejša sedacija. ETANOLAMINSKI ETRI Spojina vodnica etanolaminskih etrov je difenhidramin, benzhidrilni eter, ki je tudi danes pogosto uporabljen. Iz njega so speljane različne spojine z različnimi substituenti (Cl, Br, Me, OMe) na enem od obročev in z različnimi obroči (npr. 1 fenilni obroč zamenjan za 2-piridilni obroč). Kot najpogostejši stranski učinki so omenjeni antiholinergiči učinki (suha usta, zamegljen vid, tahikardija …) s sedacijo. Učinkovina klemastin, ki ima manjši sedacijski učinek, je novejši strukturni analog z dodanim ogljikovim atomom med dušikom in kisikom.

5 

ALIKILAMINI To so spojine, ki imajo heteroatom v distančniku zamenjan z ogljikom. V primeru, da sta v spojini 2 obroča različna, imamo tako uveden kiralni C-atom. Predstavniki spadajo med dolgodelujoče antihistaminike z zmanjšanim delovanjem na CŽS: feniramin, klorfeniramin, bromfeniramin in E-izomeri olefinskih homologov. Ta skupina antihistaminikov je bila najpogosteje uporabljena, dokler ni prišlo do razvoja naslednje, 2. generacije. PIPERAZINI Zgodnji predstavniki: ciklizin, klorciklizin, buklizin, hidroksizin, so uporabljeni kot antihistamini, antiemetiki za preprečevanje morske bolezni in močni antiholinergiki. Primarno jih uporabljamo za zdravljenje morske bolezni, vrtoglavice in preprečevanje slabosti in bruhanja. Študije, ki so bile izvedene na glodalcih, so pokazale teratogeno delovanje, torej mora biti uporaba na nosečnicah izredno previdna. Cetirizin je amfoterne narave, saj ima terciarno alifatsko amino skupino in karboksilno skupino in s tem najmanj izražene sedativne učinke.

6 

TRICIKLIČNI H1-ANTIHISTAMINIKI Fenotiazini so najstarejši delujoči triciklični antihistaminiki z 2 ali 3 ogljikove atome dolgo, razvejano alikilno verigo med nebazičnim dušikom fenotiazinskega obroča in alifatskim aminom. So dolgodelujoče spojine z antihistaminičnim, sedativnim, antiemetičnim delovanjem, zato jih uporabljamo med drugim tudi za terapijo morske bolezni. Struktura: 2 aromatska obroča, povezana s dodatnim heteroatomom (žveplo ali kisik) ali z enočlensko ali dvočlensko ogljikovo verigo.

b) 2. generacija H1-antihistaminikov

To so učinkovine s selektivnim delovanjem na H1-receptorje in posledično z manjšim sedativnim in antiholinergičnim delovanjem in potencialnim antialergijskim delovanjem. Delujejo predvsem periferno in imajo manjšo afiniteto za adrenergične in serotoninergične receptorje. So amfoterni (v fizioloških raztopinah so v obliki zwitterionov) in so substrati P-glikoproteinskega transporterja, t.j. transportnega proteina za organske ione. Te lastnosti spojinam onemogočajo prehajanje krvno-možganske pregrade. Nekatere učinkovine lahko apliciramo samo enkrat dnevno, ker jim to omogočata dolga biološka razpolovna doba in počasna disociacija s H1-receptorjev. Spojine si strukturno niso sorodne, zato jih ne moremo uvrščati v eno skupino.

7 

2.3. TOPIKALNI H1- ANTIHISTAMINIKI

Uporabljalo se za sistemsko in predvsem pa za lokalno antihistaminsko delovanje v obliki nazalnih sprejev in okularnih antihistaminikov (zmanjšajo srbež in zamašitev konjuktive).

8 

3. SINTEZE H1 ANTAGONISTOV

1.ASTEMIZOL (1-[(4-fluorofenil)metil]- N-[1-[2-(4-metoksifenil)etil]- 4-piperidil]benzoimidazol-2-amin)

Astemizol spada v 2.generacijo antihistaminikov, za katere je značilna izboljšana selektivnost za H1 receptorje in zelo malo ali nič sedativnih učinkov.

NH2 skupina 2-nitro anilina napade tiokarbonilni ogljik N,N-dietiltiokarbamoil klorida, pri čemer nastane derivat izotiocianata, ki reagira z NH2 skupino do derivata tiosečnine. Sledi redukcija nitro skupine do amino skupine s katalitskim hidrogeniranjem. Nastala amino skupina napade elektrofilni C-atom tiokarbonilne skupine. Pri tem dobimo benzimidazolski obroč. Dušik iz tega obroča reagira z elektrofilnim C-atomom 4-fluorofenilmetilklorida, pri tem izstopi HCl. Le-to

9 

nevtraliziramo z Na2CO3. Z uporabo HBr odstranimo karbamatno zaščito s piperidinskega dušika. V zadnji stopnji nanj uvedemo 4-metoksifenil etilno skupino. Pri tem izstopi metilsulfonska skupina in nastane produkt astemizol.

Umik iz tržišča: Zaradi redke, a potencialno smrtne interakcije z inhibitorji encima CYP3A4 je bil astemizol umaknjen s tržišča. Metabolizira se namreč z encimom CYP3A4. Interakcije opazimo: s sokom grenivke, klaritromicinom, inhibitorji HIV proteaze, kinidinom, s selektivnimi zaviralci privzema serotonina. Odkrili so tudi interakcije pri jemanju fluoksetina/terfenadina z astemizolom. Pri tem lahko pride do življenjsko nevarne srčne aritmije.

2.CETIRIZIN ((±)-[2-[4-[(4-klorofenil)fenilmetil]-1- piperazinil]etoksi]ocetna kislina)

Cetirizin je derivat piperazina in se uporablja kot antihistaminik 2. generacije za sistemsko delovanje. Najprej poteče nukleofilna substitucija. Prosti dušik N-etoksikarbonilpiperazina napade elektrofilni C-atom, pri čemer izstopi HCl. Za nevtralizacijo nastale kisline dodamo Na2CO3. Sledi hidroliza s HCl, pri kateri se odstrani zaščitna skupina. Poteče še nukleofilna substitucija med produktom prejšnje stopnje in metil 2-(2-kloroetoksi)-acetatom ob dodatku natrijevega karbonata. Po hidrolizi estra v vodni raztopini KOH dobimo končni produkt.

10 

2.1.LEVOCETIRIZIN (2-[2-[4-[(R)-(4-klorofenil)-phenil-metil]piperazin-1-il]etoksi]ocetna kislina)

Levocetirizin je antihistaminik 2. generacije in farmakološko aktiven enantiomer cetirizina. Razlikujeta se v farmakološki aktivnosti, afiniteti do receptorjev in disociacijski konstanti. Levocetirizin je bolj specifičen za H1 receptorje in se ireverzibilno veže, zato ga histamin težko izpodrine. Iz cetirizina s tionilkloridom v toluenu (SOCl2) tvorimo kislinski klorid. Sledi nukleofilna substitucija klora z amoniakom, pri kateri nastane racemna zmes amidov, ki ju ločimo s kiralno kromatografijo na Chiralpak AD koloni. Izoliramo (R)-izomer, ki ga izpostavimo kislemu mediju (HCl) pod refluksom v metanolu. Pri tem dobimo kiralni metilni ester, ki ga hidroliziramo v vodni raztopini HCl.

11 

3.LORATADIN, DESLORATADIN (Etil-4-(8-kloro-5,6-dihidro-11H-benzo[5,6]ciklohepta[1,2-b]piridin-11-ilidin)-1-piperidinkarboksilat) (8-kloro-6,11-dihidro-11-(4-piperdiniliden)- 5H-benzo[5,6]ciklohepta[1,2-b]piridin)

12 

Sinteza se začne z Ritter-jevo reakcijo 2-ciano-3-metilpiridina s terc-butanolom ob prisotnosti koncentrirane žveplove kisline in ob ustrezni temperaturi. Gre za nukleofilni napad dušikovega atoma nitrilne skupine na terc-butilni kation, ki nastane ob prisotnosti kisline in vode iz terc-butanola.

Naslednja stopnja je nukleofilna substitucija. Ob prisotnosti močne baze Bu-Li heksana pride do deprotonacije metilne skupine na piridinu. NaBr deluje kot katalizator in po Finkelstein-ovi reakciji z m-klorobenzil kloridom tvori m-klorobenzil bromid, ki je boljši elektrofil za SN2 reakcijo. Sledi napad metilnega aniona na ogljikov atom ob bromu in nastanek ustreznega produkta za nadaljnjo reakcijo.

V naslednji stopnji s POCl3 terc-butilni karboksamid pretvorimo nazaj v nitrilno skupino. Sledi adicija Grignard-ovega reagenta na nitrilno skupino in nastane keton. S HF in BF3 izvedemo ciklizacijo. Cikloheptenu dodamo etil kloroformiat pri 80 °C. Pri tem pride do hkratne demetilacije in tvorbe karbamata.

13 

Desloratadin dobimo s hidrolizo loratadina z NaOH in EtOH ali z von Braun-ovo reakcijo, pri kateri najprej z bromcianom tvorimo N-ciano piperidin, nato pa s kislo hidrolizo odstranimo –CN skupino.

R2NCN + H2O/HCl R2NCOOH R2NH -NH3 -CO2

Loratadin in desloratadin spadata v 2. generacijo antihistaminikov in se uporabljata za sistemsko zdravljenje.

4.DIMETINDEN ((RS)-dimetil(2-{3-[1-(piridin-2-il)etil]-1H-inden-2-il}etil)amin)

Z močno bazo (NaH) odcepimo kisel proton med dvema elektron privlačnima skupinama dietil benzilmalonata. Pri tem nastane ogljikov nukleofil, ki se v reakciji nukleofilne substitucije izmenja s klorom dimetilaminoetilklorida. S polifosforno kislino ob segrevanju poteče hidroliza, odcep etanola in dekarboksilacija. Poteče še reakcija aciliranja ob zaprtju obroča, saj je nastanek petčlenskega obroča energetsko ugoden. Z močno bazo (fenil litij) odcepimo proton z alfa ogljikovega atoma etilne substituente. Nastane ogljikov nukleofil, ki reagira z elektrofilnim atomom karbonilne skupine. Z dodatkom kisline se iz molekule eliminira voda in nastane konjugiran sistem. Dobimo alkilaminski antihistaminik 1. generacije dimetinden.

14 

5.DIMETOTIAZIN (10-[2-(dimetilamino)propil]-N,N-dimetil-10H-fenotiazin-2-sulfonamid)

Dimetotiazin je antihistaminik 1. generacije in spada med triciklične antihistaminike. Sinteza poteče v eni stopnji. Z bazo (NaNH2) odcepimo proton z dušika na fenotiazinskem obroču. Nanj se veže reagent (2-dimetilaminopropil klorid), izstopi pa HCl.

6.DIFENHIDRAMIN (2-(difenilmetoksi)-N,N-dimetiletanamin)

Difenhidramin je aminoalkilni eter in antihistaminik 1.generacije. Sinteza poteče v eni stopnji po mehanizmu nukleofilne substitucije. Izhajamo iz difenilbromometana, ki ima v svoji strukturi elektrofilno in dobro izstopajočo skupino, t.j. brom. Dodamo 2-dimetilaminoetanol, ki ima nukleofilno hidroksilno skupino. Hidroksilna skupina kot nukleofil izpodrine brom. Pri reakciji nastaja HBr, ki jo nevtraliziramo z dodatkom kalijevega karbonata.

15 

7.DIMENHIDRINAT (2-benzhidriloksietil-dimetilazid; 8-kloro-1,3-dimetil-2-oksopurin-6-olat)

Reakcija poteče v eni stopnji. Difenhidraminu dodamo 8-kloroteofilin. Pri tem nastane sol – dimenhidrinat, ki je tako kot difenhidramin aminoalkilni eter in antihistaminik 1.generacije.

8.FEKSOFENADIN ((RS)-2-[4-[1-Hidroksi-4-[4-(hidroksi-difenil-metil)-1-piperidil]butil]fenil]-2-metil-propanojska kislina)

16 

Feksofenadin je učinkovina, ki glede ne Register zdravil Republike Slovenije spada v drugo generacijo antihistaminikov. Pri sintezi izhajamo iz 2-metilfenil propanojske kisline, ki jo reduciramo do alkohola (potrebno, da kasneje dobimo ustrezno usmerjanje) in nato acetiliramo z acetanhidridom. Iz (I) pridemo do (III) s Friedel – Craftsovo reakcijo, nato pa s substitucijo po mehanizmu SN2 na (III) pripnemo (IV). Izloči se HCl in spojina (IV) se preko dušika v piperidinskem obroču veže na spojino (III). Z bazično hidrolizo nato odstranimo acetatno zaščito, dobimo hidroksilno skupino, ki jo pod pogoji Swernove oksidacije nato pretvorimo do aldehidne skupine.

S to reakcijo lahko iz primarnih in sekundarnih alkoholov pripravimo aldehide in ketone. Iz DMSO in oksalnega klorida se in situ tvori dimetilklorosulfonijev ion, ki reagira z alkoholom. Sledi oksidacija do -COOH. Na koncu le še reduciramo ketonsko skupino, s HCl pa tvorimo sol na dušiku piperidina.

17 

9.FENINDAMIN (2-metil-9-fenil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-indeno[2,1-c]piridin)

V prvi stopnji dvakrat poteče Mannich-ova reakcija. Nastane simetrični produkt (bis keton Mannichova baza). Nato z NaOH odcepimo vodik z enega od ogljikov pri karbonilni skupini. Ta ogljik deluje kot nukleofil, ki napade elektrofilni karbonilni ogljikov atom. Pri tem poteče ciklizacija in tvorba 4-fenil piperidina. Po dodatku koncentrirane raztopine HBr se odcepi voda in tvori intramolekularna vez. Nastane dodaten petčlenski obroč. V zadnji stopnji izvedemo še katalitsko hidrogeniranje. MANNICHOVA REAKCIJA

Je reakcija kondenzacije ali nukleofilne adicije. Poteče v kislih pogojih v dveh stopnjah: V prvi stopnji nastane elektrofil z nukleofilno adicijo amina na karbonilno skupino, ki ji sledi odcep vode. Nastane resonančno stabiliziran imin. V drugi stopnji pa poteče adicija karbaniona iz spojine s kislo -CH skupino.

18 

10.FENIRAMIN (N,N-dimetil-3-fenil-3-piridin-2-il-propan-1-amin)

Z močno bazo natrijevim amidom odcepimo kisel vodikov proton na alfa mestu glede na ciano skupino. Nastali ogljikov nukleofil reagira z 2-kloropiridinom, pri tem pa izstopi klor, ki je dobro izstopajoča skupina. V naslednji stopnji ponovno uporabimo natrijev amid, ki odcepi vodik in omogoči nastanek ogljikovega nukleofila. Slednji reagira z 2-(dimetilamino)-etil kloridom (nukleofilna substitucija), pri čemer ponovno izstopi klor. Na koncu sledi še kislinsko katalizirana hidroliza ciano skupine: R – CN → R – CONH2 → R – COOH → R – H + CO2 (dekarboksilacija) Produkt : propilaminski antihistaminik 1. generacije feniramin.

19 

11.KLEMASTIN ((2R)-2-{2-[(1R)-1-(4-klorofenil)-1-feniletoksi]ethyl}-1-methylpyrrolidine)

Klemastin je homolog etanolaminskih etrov. Izhajamo iz 4-klorobenzofenona ali 4-kloroacotofenona, na katerega adiramo Grignardov reagent in dobimo spojino (I). Z NaH (baza) odcepimo proton z nastale hidroksilne skupine, nato poteče Williamsonova sinteza etra. Dobimo zmes 4 izomerov in s pomočjo vinske kisline in tvorbe diastereoizomerov izoliramo želeni izomer (R,R) .

20 

12.KETOTIFEN (4-(1-metilpiperidin-4-iliden)-4,9-dihidro-10H-benzo[4,5]ciklohepta[1,2-b]tiofen-10-on)

Ketotifen spada med topikalne H1-antihistaminike, ki se uporabljajo pri eritmu in za aplikacijo v oko, pri čemer olajšajo srbenje in zamašitev konjuktive. Prva stopnja sinteze je Wohl-Zieglerjeva reakcija, kjer gre za radikalski mehanizem. Najprej poteče bromiranje z N-bromosukcinimidom na alilnem mestu, dehalogeniranje in nastanek dveh različnih produktov(I). Sledi adicija Grignardovega reagenta na karbonilno skupino, odcepitev vode in tvorba dvojne vezi. V naslednji stopnji poteče nukleofilna substitucija, kjer se brom substituira s piperidinom(III). Spojina (III) reagira z 2N HCl in dobimo 4-(1-metilpiperidin-4-iliden)-4H-benzo(4,5)ciklohepta(1,2-b)tiofen-10(9H) in 9(10H)-on. S ločbo na silikagelu očistimo produkt in dobimo samo ketotifen.

21 

13.TIETILPIRAZIN (2-(etiltio)-10-[3-(4-metilpiperazin-1-il)propil]-10H-fenotiazin)

Tietilperazin je antihistaminik 1. generacije (triciklični H1 antagonisti), spada pod fenotiazine. Uporablja se kot antiemetik in za preprečevanje vrtoglavic. V prvi stopnji sinteze poteče Ullmannova reakcija. Gre za nukleofilno aromatsko substitucijo. Kot nukleofil nastopa 3-etiltioanilin, ki napade kalijevo sol 2-klorobenzojske kisline. Vlogo katalizatorja imata baker in baza (K2CO3).

V naslednji stopnji odstranimo karboksilno skupino. Dekarboksilacija poteče ob segrevanju. Sledi zaprtje obroča, v katerega se vključi še žveplo (segrevamo 3-etiltiodifenilamin v prisotnosti žvepla in joda). Tako dobimo fenotiazinski skelet. V zadnji stopnji ponovno izvedemo nukleofilno aromatsko substitucijo ob prisotnosti močne baze. Natrijev amid odcepi proton na dušiku fenotiazinskega obroča, prosti elektronski par napade 1-(3-kloropropil)-4-metilpiperazin.

22 

4. HOMOLOGNO MODELIRANJE

4.1. Osnovni princip Osnovni princip homolognega modeliranja temelji na mapiraju proteina z znanim aminokislinskim zaporedjem in neznano strukturo proti drugemu ali več drugim (homolognim) proteinom s poznano strukturo. Ker pričakujemo, da si bosta dva proteina podobnega izvora in s podobno funkcijo v veliki meri tudi strukturno podobna, je smiselno uporabiti znane strukture kot matrico za modeliranje neznane strukture.

Homologno modeliranje je torej tehnika, s katero aminokislinsko zaporedje makromolekule z neznano strukturo primerjamo z zaporedjem homolognega proteina, katerega strukturo poznamo, s ciljem, da ugotovimo strukturo naše makromolekule.

Odločitvena predpostavka o uporabi načrtovanja učinkovin na podlagi strukture je znanje o strukturi ciljnega proteina. Zaradi napredka na področju raziskovanja proteinskih struktur je bilo razjasnjenih že veliko število 3D struktur terapevtsko pomembnih proteinov, vendar ne smemo spregledati, da je hkrati nepoznanih še precej zanimivih ciljnih terapevtskih proteinov.

Prvi korak pri načrtovanju liganda za protein z znano 3D strukturo je natančna analiza le-te. Predvsem nas zanima, kakšno je vezavno mesto ter katere funkcionalne skupine liganda bi se še posebej dobro vezale na preučevani protein. Danes so za to na razpolago računalniški programi, ki preiskujejo površino in iščejo primerna vezavna mesta za različne funkcionalne skupine. Eksperimentalne metode, ki so predvsem primerne za tovrstno iskanje »hot spots-ov« (t. j. mesto, kjer se funkcionalne skupine liganda še posebej močno vežejo na protein) pa so rentgenska kristalografija in NMR spektroskopija.

Pogosto s pojasnitvijo strukture proteina odkrijejo tudi prve zadetke ligandov ter grobe povezave med strukturo in učinkom. Z množičnim presejanjem podatkov lahko odkrijemo nove substance, ki ustrezajo vezavnemu mestu, le-te pa lahko nadalje modificiramo, da bi dosegli močnejšo vezavo in selektivnejše delovanje. Hkrati pa lahko ligand tudi poenostavimo ter izpustimo mesta, kjer do interakcij s proteinom ne pride ali pa jih modificiramo tako, da izboljšamo njegove ADME lastnosti. Pri razvoju nove učinkovine imamo torej 2 možnosti: ali poiščemo popolnoma novo spojino ali pa že znano spojino vodnico modificiramo. Slednja metoda ima prednost, saj na tak način hitro pridemo do selektivne in delujoče učinkovine.

Predpostavka za uspešno načrtovanje učinkovin na podlagi strukture je iterativno postopanje, in sicer si faze ciklusa sledijo v zaporedju, kot ga kaže naslednja skica:

Biološko aktiven ligand

Sintetizirana spojina

Predlagani ligand

Oblikovanje liganda 3D struktura proteina Določanje 3D strukture

Sinteza Testiranje

23 

Proteine lahko med seboj primerjamo na osnovi vezavnega mesta, vendar je aminokislinsko zaporedje le-tega veliko manj pomembno, kot pa so pomembne fizikalno-kemijske lastnosti samega vezavnega mesta. Program, ki omogoča to primerjavo, opiše obliko in površino vezavnega mesta in njegove lastnosti. Ugotovitve skupnih značilnosti proteinov v vezavnem mestu nam omogočajo, da odkrijemo njihova funkcionalna sorodstva, hkrati pa lahko odkrijemo tudi njihovo navzkrižno delovanje, ki je povzročitelj neželenih stranskih učinkov. Pri analizi podobnosti oz. razlik tako tudi ugotovimo, kako spremeniti naš ligand, da bomo dobili željeno selektivnost.

Pri visoki homologiji DNA zaporedja in malo mutacijah je izgradnja modela proteina dokaj preprosta; pri indentičnosti nad 90% je mogoče izdelati modele, s katerimi se približamo določeni strukturi, upoštevati pa je potrebno napake eksperimentalnih metod.

Največji del razlik v aminokislinskem zaporedju najdemo pri homolognih proteinih v regijah, ki niso kritične pri oblikovanju v 3D strukturo. Če pa pride do zamenjav aminokislin v notranjosti proteina, ima to velik vpliv na izgradnjo le-tega. Tako smo omejeni na menjavo z aminokislinami s podobnimi fizikalno-kemijskimi lastnostmi (npr. levcin in izolevcin). Kadar pa pri menjavi aminokislinski preostanki tvorijo nove interakcije s sosednjimi skupinami, se mutirani protein zvije v novo najstabilnejšo strukturo, ki pa je lahko tako spremenjena, da prejšnje interakcije niso več možne.

Pri visoki identičnosti moramo zamenjati le nekaj stranskih verig, katerih konformacijo pridobimo s primerjavo strukturno okarakteriziranih proteinov, kjer se aminokisline nahajajo v podobnem okolju. Pri zmanjšanem ujemanju moramo upoštevati tudi podaljšanje ali skrajšanje polipeptidne verige. Za modeliranje zanke je bila za napoved konformacije proteina sestavljena knjižnica iz že znanih proteinskih struktur. S pomočjo računalniške programske opreme lahko knjižnico preiščemo in nam je tako v pomoč pri konstrukciji modificirane zanke. Nato sledi še preizkus, ki mora potrditi ali se nova geometrija sklada z eksperimentalnimi rezultati (npr. ali so hidrofobni ostanki orientirani navznoter in hidrofilni navzven, interakcije med aminokislinami, primerjava torzijskih kotov).

Ob zmanjšanju enakosti aminokislinskega zaporedja med znanim in modeliranim proteinom pod 30% je strukturno homologijo težko ugotoviti. Za sekvenco modeliranega proteina predvidimo, na katerem odseku polimerne verige lahko pričakujemo določene sekundarne strukture (vijačnice, ravnine ali zanke); npr. prolin velja za »lomljivca vijačnice«, pojavlja se namreč največ v 1. zavoju heliksa, na drugih pozicijah pa moti geometrijo in inducira pregib. Ob ugotovitvi, ali se določeno zaporedje raje zvije v eno od zgoraj naštetih sekundarnih struktur, se bodo te informacije prekrivale za vsakič več sosednjih aminokislin, ki jih bomo analizirali. Tako analizirane primarne strukture so potem primerjane z znano geometrijo referenčnega proteina. Ker poznamo njegovo 3D strukturo, je znano tudi zaporedje aminokislin, ki pripada elementom sekundarnuh struktur. Iz več znanih 3D struktur homologne družine proteinov in s primerjavo njihovega aminokislinskega zaporedja sestavimo reprezentativen profil pričakovanih sekundarnih struktur. Ta profil se nato uporablja kot referenca za medsebojno prilagajanje zaporedja strukturno znanih oz. neznanih proteinov.

24 

Modeliranje proteinov dobro uspe predvsem tam, kjer proteini med seboj izkazujejo visoko homologijo. Vezavna mesta ležijo na področju zank in ravno tam se homologni proteini najbolj razlikujejo in tako struktura modela ne dosega željenih natančnosti. Izboljšanje je mogoče doseči, če že med samim modeliranjem vstavljamo ligande. Model in umestitev v domnevno vezavno regijo moramo takoj zatem tudi optimirati s stališča energijsko najugodnejše vezave.

Po analizi vezavnega mesta, ki je bodisi del eksperimentalno določenega proteina ali modeliranega proteina, je naslednji korak oblikovanje liganda. Tu obstajajo različni pristopi k tvorbi računalniškega osnutka proteinskega liganda. Lahko uporabimo program sidranja ligandov iz banke podatkov, kjer so ponavadi glede na red velikosti tiste molekule, ki ležijo v istem velikostnem razdredu, kot molekule učinkovin. Drug pristop se začne z majhnim »semenom« v vezavnem mestu, iz katerega potem raste ligand. Kritična je določitev mesta prvega »semena«. Pristop je uspešen predvsem takrat, kadar začnemo rast liganda tam, kjer se funkcionalne skupine liganda še posebej močno vežejo na protein (to je t.i. »hot spot«) in se tam začne nadaljnja optimizacija strukture. Ta princip uporabljajo predvsem de-novo programi, primeren je pri ligandih, ki imajo za koencime kovinske ione ali pa tvorijo interakcije z nabitimi aminokislinami. Pri drugih pristopih začnemo z več malimi fragmenti ter izvedemo vmeščanje v vezavno mesto ter nato skušamo preko mostov povezati gradnike enega z drugim.

Prekrivanje 3 zvitih oblik citokroma C (moder: Paracoccus denitrificans – Gram negativna bakterija, rdeč: Rhodospirillium rubrum – Gram negativna bakterija, rumen: tuna)

4.2. Homology modelling and binding site mapping of the human histamine H1 receptor HHR1 is a typical 7TM GPCR consisting of two soluble domains and seven transmembrane helices. Availability of the high resolution structure of bovine rhodopsin as well as the large number of mutational data prompted us to build a homology model of HHR1. Several useful information have already been published by means of GPCR homology models, and eligibility of these models for docking procedures has also been proven. For example; four known H1 antagonists were selected for docking into our receptor model. Mepyramine was

25 

chosen from the first-generation diaryl-antihistamines, desloratadine and loratadine were chosen from the second-generation tricyclic antihistamines, and the second generation acrivastine was chosen because of containing a carboxylate residue. These molecules embrace almost every binding possibilities of the H1 antagonists, apart from a few special structure. Published mutation data were used to identify the antagonist binding site and validating the homology model.

4.2.1. Experimental Protocols

Sequence alignment Comparative sequence analysis between HHR1 and bovine rhodopsin was performed by Clustal W. GPCRs’ TM domain show higher homology, than the extracellular (EC) or intracellular (IC) domains. The long IC3 loop of HHR1 was excluded from modelling, since it has no equivalent in the bovine rhodopsin sequence. Here, we have to mention that the bovine rhodopsin crystal structure is in its inactive conformation, therefore we assumed that homology modelling of the antagonist binding site is reasonable. The bovine rhodopsin structure contains a disulfide-bond between residues Cys 110 and Cys 187. In the sequence alignment two cysteins of HHR1 got into the same positions, therefore we assumed that Cys 100 and Cys 180 form a disulfide-bond in the HHR1. The automatic sequence alignment was followed by manual adjustment, paying attention to the position of the conserved GPCR residues.

Homology modelling and validation Six HHR1 initial models were built by MODELLER version 4, using the above described sequence alignment and the bovine rhodopsin crystal structure (PDB ID: 1F88). Modeller was run with default parameters, with the option of disulfide bridge assignment. The main geometric parameters of the models were determined by PROCHECK. The first model was chosen for further investigations, which possesses on average the most favourable features. In the last step of homology modelling the selected model was subjected to a series of tests for its internal consistency and reliability.Backbone conformation was evaluated by the inspection of the Psi/Phi Ramachandran plot obtained from PROCHECK analysis. The PROSA test was applied to check for energy criteria in comparison with the potential of mean force derived from a large set of known protein structures. Packing quality of the homology model was investigated by the calculation of WHATIF Quality Control value.

* WHAT IF Quality Control Value prompt you for a range of residues. The deviation from the average quality value for all residues in this range will be shown. Depending on the parameter setting, you will or will not see which atoms contributed in which way to the values for each residue. This option needs the surface contact area to be known, so you will be taken to the accessibility module if this has not been done already.

Binding mode analysis The homology model of HHR1 was used for docking antagonists into the binding site suggested by site-directed mutagenesis studies. All of the antagonists were first subjected to pKa evaluation to consider their protonation state at physiological pH. pKa values of histamine, mepyramine, desloratadine and loratadine were retrieved from references (10.13; 6.43; 8.92; 8.65; 4.58, respectively). pKa values of acrivastine (2.82, 7.59) were calculated by CompuDrug’s Pallas software.

26 

27 

4.2.2. Results

Homology modelling Validation of the homology model involved three independent tests. The first test was to compare the residue backbone conformations in our model with the preferred values obtained from the Protein Data Bank of known structures. The second test of the HHR1 model was to apply energy criteria using PROSA. We investigated whether the interaction energy of each residue with the remainder of the protein is negative .The third test used to evaluate our HHR1 model was to compare the packing environment for residues of the same type in high quality experimental structures deposited in the Protein Data Bank using theWHATIF program. Passing all tests by our structure suggests that we obtained an adequate model for HHR1 to characterize its binding site and to explore interactions formed with different antagonists.

Binding mode analysis for H1 antagonists Docking simulations of the four H1 antagonist molecules were performed by FlexiDock docking software as implemented in Sybyl 6.9. The homology model’s backbone structure has not been modified, because it is conserved in all probability in every GPCR and there is no information about the side chain conformations, so this situation allow modify the important ones to form the antagonist binding cavity. Mepyramine was chosen from the first-generation antihistamines for the first ligand to be docked. The docked mepyramine has created a strong ionic interaction with Asp 107, and its two aryl groups were found in the lipophilic cavity, formed by Tyr 108, Trp 158, Phe 184, Phe 190, Phe 199, Phe 424, Trp 428, Tyr 431, Phe 432 and Phe 435 . For the second ligand, desloratadine was chosen. The docked desloratadine’s protonated amine group is in an ionic interaction with the carboxylate group of Asp 107, and the condensed ring system was fitted well into the lipophilic binding cavity. Some H1 antagonists (acrivastine, cetirizine, olopatadine, fexofenadine) contain a carboxylate group, which reduces side effects considerably, because these compounds are unable to cross the BBB. A specific interaction point was supposed to be in HHR1, which can interact with the deprotonated carboxylate group of zwitterionic molecules.