sandra stanimirov antimikrobna aktivnost bakterija mlečne ... · laktobacila mlečna kiselina,...
TRANSCRIPT
UNIVERZITET U NIŠU
PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET
DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU
Sandra Stanimirov
Antimikrobna aktivnost bakterija mlečne kiseline izolovanih iz
peglane kobasice
Master rad
Niš, 2018
UNIVERZITET U NIŠU
PRIRODNO MATEMATIČKI FAKULTET
DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU
Antimikrobna aktivnost bakterija mlečne kiseline izolovanih iz
peglane kobasice
Master rad
Kandidat: Mentor:
Sandra Stanimirov 227 Dr Nataša Joković
Niš, 2018
UNIVERSITY OF NIŠ
FACULTY OF SCIENCE AND MATHEMATICS
DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY
Antimicrobial activity of lactic acid bacteria isolated from
“peglana kobasica”
Master thesis
Candidate: Mentor:
Sandra Stanimirov 227 Dr Nataša Joković
Niš, 2018
Zahvalnica
Mentorki, dr. Nataši Joković,
Na saradnji, ukazanom poverenju, idejama, usmeravanju, motivaciji i uloženom
trudu tokom izrade ovog master rada.
Saradniku, Nikoli Stankoviću,
Na satima dnevno izdvojenih tokom više meseci rada, posvećenosti, pomoći i
savetima u svrhu što bolje realizacije celog toka istraživanja.
Porodici,
Na neizmernoj podršci, ljubavi i razumevanju tokom svih godina studiranja.
Moj uspeh ne bi bio postignut bez vas.
Iskreno Vam hvala!
Biografija
Sandra Stanimirov rođena je 07. februara 1994. godine u Pirotu. Osnovnu školu završila
je u Dimitrovgradu 2009. godine, a potom i gimnaziju “Sveti Kirilo i Metodije” 2013. godine, kao
nosilac diplome “Vuk Karadžić”.
Nakon završetka srednje škole upisuje osnovne akademske studije na Prirodno-
matematičkom fakultetu u Nišu, na Departmanu za biologiju i ekologiju. Osnovne akademske
studije završava 2016. godine sa zvanjem “Biolog”. Iste godine upisuje master akademske
studije na Departmanu za biologiju i ekologiju Prirodno-matematičkog fakulteta u Nišu, smer
Biologija. Master akademske studije završava 2018. godine sa zvanjem “Master biolog”.
Sažetak
U ovom radu ispitivana je antimikrobna aktivnost jedanaest izolata BMK, izolovanih iz
peglane kobasice, na potencijalno patogene bakterije, agar difuzionom metodom,
mikrodilucionom metodom, kristal violet metodom, Bradfordovom metodom i Time-kill
analizom. Ispitivani izolati pripadaju vrstama Lactobacillus sakei (M16, PF3, PF6, PF18, PF19),
Lactobacillus curvatus PK4, Leuconostoc mesenteroides ssp. dextranicum (PK15, PK16A),
Carnobacterium divergens PK3, Carnobacterium maltaromaticum M2 i Weissella viridescens M1.
Kao indikator sojevi korišćene su vrste Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Staphylococcus
aureus, Salmonella typhimurium i Bacillus cereus.
Na osnovu dobijenih rezultata može se zaključiti da supernatanti testiranih izolata BMK
imaju inhibitorni efekat na sve indikator sojeve. Supernatanti BMK imaju veću efikasnost protiv
Gram-pozitivnih (L. monocytogenes, St. aureus i B. cereus) nego protiv Gram-negativnih
bakterija (E. coli i S. typhimurium) i veće zone inhibicije u odnosu na neutralisane supernatante.
Supernatanti BMK narušavaju strukturu membrane što dovodi do oslobađanja ćelijskih proteina
u supernatant. Permeabilnost membrane većine indikator sojeva raste tokom vremena. Najjači
baktericidni efekat zabeležen je na vrstu B. cereus, a najslabiji na vrstu E. coli.
Ključne reči: bakterije mlečne kiseline, antimikrobna aktivnost, mehanizam delovanja
Abstract
In this paper work, the antimicrobial activity of eleven isolates of LAB isolated from
“peglana kobasica”, against potentially pathogenic bacteria, was investigated by agar diffusion
method, microdilution method, crystal violet assay, Bradford method and Time-Kill analysis.
Isolates belong to the species Lactobacillus sakei (M16, PF3, PF6, PF18, PF19), Lactobacillus
curvatus PK4, Leuconostoc mesenteroides ssp. dextranicum (PK15, PK16A), Carnobacterium
divergens PK3, Carnobacterium maltaromaticum M2 and Weissella viridescens M1. Escherichia
coli, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium and Bacillus
cereus were used as indicator strains.
According to the results, the cell free supernatants (CFS) from the tested LAB isolates
have an inhibitory effect on all indicator strains. CFS from the LAB isolates had higher efficacy
against Gram-positive (L. monocytogenes, St. aureus and B. cereus) than against Gram-negative
bacteria (E. coli and S. typhimurium) and higher inhibition zones compared to neutralized
supernatants. CFS disrupted the structure of the membrane which led to the release of cellular
proteins into the supernatant. Membrane permeability of the most indicator strains increased
over time. The strongest bactericidal effect was observed for B. cereus, and the weakest for E.
coli.
Key words: lactic acid bacteria, antimicrobial activity, mechanisms of action
Sadržaj 1. Uvod .......................................................................................................................................... 2
1.1. Bakterije mlečne kiseline ................................................................................................... 3
1.1.1. Rod Lactobacillus ........................................................................................................ 5
1.1.2. Rod Leuconostoc ........................................................................................................ 7
1.1.3. Rod Carnobacterium .................................................................................................. 8
1.1.4. Rod Weisella ............................................................................................................... 9
1.2. Antimikrobne supstance .................................................................................................... 9
1.2.1. Antimikrobne supstance BMK .................................................................................. 10
2. Ciljevi rada ............................................................................................................................. 14
3. Materijal i metode .................................................................................................................. 15
3.1. Materijal .............................................................................................................................. 15
3.1.1. Bakterijski sojevi............................................................................................................ 15
3.2. Metode ................................................................................................................................ 15
3.2.1. Agar difuziona metoda .................................................................................................. 15
3.2.2. Mikrodiluciona metoda ................................................................................................. 16
3.2.3. Kvantitativno određivanje vodonik peroksida .............................................................. 17
3.2.4. Kristal violet metoda ..................................................................................................... 17
3.2.5. Bradfordova metoda ..................................................................................................... 18
3.2.6. Time-kill analiza ............................................................................................................. 19
4. Rezultati i diskusija .................................................................................................................. 20
4.1. Antimikrobna aktivnost BMK ............................................................................................... 20
4.2. Određivanje minimalne inhibitorne koncentracije (MIK) ................................................... 26
4.3. Ispitivanje mehanizama antimikrobne aktivnosti BMK ....................................................... 27
5. Zaključci ................................................................................................................................... 36
6. Literatura ................................................................................................................................. 37
2
1. Uvod
Bakterije mlečne kiseline (BMK) predstavljaju veoma heterogenu grupu bakterija, a
objedinjene su zajedničkom osobinom da proizvode mlečnu kiselinu kao krajnji produkt
fermentacije laktoze. BMK su među prvim mikroorganizmima upotrebljenim u industriji hrane, a
posebno važnu ulogu imaju u proizvodnji fermentisanih mlečnih proizvoda i proizvoda od mesa.
Svojom metaboličkom aktivnošću doprinose poboljšanju ukusa, arome i teksture krajnjeg
proizvoda.
Snižavanjem pH vrednosti usled sinteze mlečne kiseline, produkcijom vodonik-peroksida
ugljen-dioksida i diacetila, kao i produkcijom bakteriocina koje sintetišu neke BMK, sprečava se
razvoj patogenih mikroorganizama u fermentisanoj hrani. Ova osobina bakterija mlečne kiseline
omogućava njihovu implementaciji u proizvodnji hrane kao dodatnih zaštitnih faktora protiv
nepoželjnih mikroorganizama. Druga mogućnost primene BMK je u ishrani i terapeutici kao
probiotika, zbog njihovih različitih mehanizama delovanja prema patogenim mikroorganizmima
u intestinalnom traktu.
3
1.1. Bakterije mlečne kiseline
Bakterije mlečne kiseline pripadaju grupi Gram-pozitivnih bakterija koje u morfološkom
smislu ne predstavljaju jedinstvenu grupu. To su asporogeni štapići raznih dužina i kokoidni
oblici. Tipične BMK koje rastu pod standardnim uslovima su fakultativno anaerobne, mezofilne,
acidotolerantne, hemoorganotrofne. Ćelije su obično nepokretne. Nemaju mogućnost sinteze
katalaze, citohroma i porfirina. Nedostatak citohroma onemogućava elektron-transportni lanac
te je nakon glikolize favorizovana mlečna fermentacija. Grupa BMK pripada razdelu Firmicutes
sa niskim procentom GC parova (≤55 mol%) i redu Lactobacillales (Holzapfel i Wood, 2014). U
okviru šest familija, kao najvažniji rodovi izdvajaju se: Lactobacillus, Leuconostoc, Lactococcus,
Carnobacterium, Aerococcus, Oenococcus, Enterococcus, Pediococcus, Streptococcus,
Tetragenococcus, Vagococcus i Weissella.
Kao izvor energije BMK koriste ugljene hidrate i alkohole. Imaju specifičan odnos prema
ugljenim hidratima- jedne koriste laktozu, druge maltozu. Laktozu koriste bakterije koje rastu u
mleku i mlečnim produktima, maltozu-one koje fermentišu biljni materijal (Petrović i sar., 2007).
Na osnovu krajnjih produkata metabolizma glukoze dele se na homofermentativne i
heterofermentativne BMK. Homofermentativne bakterije putem glikolize i mlečne fermentacije
produkuju mlečnu kiselinu-laktat (oko 90%) i vrlo malu količinu ostalih međuprodukata.
Heterofermentativne glukozu razgrađuju 6-fosfoglukonat/fosfoketolaznim (6-PG/PK) putem i
proizvode manje ili veće količine mlečne kiseline (oko 50%), a znatniji je udeo ostalih proizvoda:
ugljen dioksid, sirćetna kiselina i etanol (Slika 1). U homofermentativne BMK spadaju rodovi
Streptococcus, Lactococcus, Pediococcus i neki rodovi Lactobacillus, a u heterofermentativne rod
Leuconostoc i podgrupa roda Lactobacillus, Betabacteria.
4
Slika 1. Putevi fermentacije glukoze kod: A – Homofermentativnih BMK i B: Heterofermentativnih BMK. a-
glikoliza, b- mlečna fermentacija.
BMK su široko rasprostranjeni organizmi, ali su izbirljive prema hranljivoj sredini i
zahtevaju sredine bogate ugljenim hidratima. Osim ugljenih hidrata, BMK imaju složene
nutritivne zahteve za aminokiselinama, peptidima, estrima masnih kiselina, solima, derivatima
nukleinskih kiselina i vitaminima (Tannock, 2004). S druge strane, zahvaljujući dobroj
sposobnosti prilagođavanja, BMK podnose širok spektar životnih uslova i prisutne su u brojnim
staništima. Mogu se naći na raspadnutom biljnom materijalu i voću, u mlečnim proizvodima,
fermentisanom mesu i ribi, na repi, krompiru, kiselom kupusu, kiselom testu, ukiseljenom
povrću, silaži, biljkama, u vodi i drugim napicima, kanalizaciji i šupljinama (usta, genitalije, creva i
respiratorni trakt). One su deo zdrave mikrobne flore u ljudskim crevima. Osim onih koji
izazivaju karijes, BMK su generalno nepatogene (Konig i sar., 2017). Mnoge BMK su stekle GRAS-
status (Generally Recognized As Safe), a neke od njih spadaju i u grupu probiotika, zbog
pozitivnog delovanja na zdravlje ljudi i životinja.
Mnogi sojevi BMK su među najvažnijim grupama mikroorganizama koji se koriste u
prehrambenoj industriji, iako neke vrste iz roda Pediococcus uzrokuju kvarenje hrane (Johnson-
Green, 2002). Tokom procesa fermentacije, BMK utiču na organoleptička svojstva proizvoda.
Zbog posedovanja antimikrobne aktivnosti BMK su prepoznate i kao komponente koje imaju
5
ulogu u očuvanju i mikrobiološkoj sigurnosti fermentisanih namirnica. Iz ovih razloga se mnoge
BMK koriste kao starter-kulture u industriji, ali su se vekovima unazad koristile i u proizvodnji
tradicionalnih proizvoda zahvaljujući spontanoj fermentaciji prirodno prisutnih BMK. Različiti
sojevi BMK se mogu naći u mlečnim proizvodima (jogurt, sirevi), fermentisanom mesu (salame,
kobasice), povrću (masline, kiseo kupus), hlebu od kiselog testa i vinu.
1.1.1. Rod Lactobacillus
Rod Lactobacillus predstavlja veoma raznovrsnu grupu bakterija koja obuhvata 236
opisanih vrsta i 29 podvrsta (http://www.bacterio.net/lactobacillus.html, 2018). Članovi roda
Lactobacillus su nesporulišući, uglavnom nepokretni Gram-pozitivni štapici, ređe bacili sa
sadržajem GC parova koji varira od 32 do 53 mol% (Slika 2). Obično formiraju lance raznih
dužina. Mogu da podnose kiseonik, ali obično rastu pod anaerobnim uslovima. Laktobacili su
acidofilni i acidotolerantni. Maksimalna vrednost pH koju mogu da podnesu je 7,2. Neke vrste
poseduju pseudokatalazu i neki sojevi mogu usvajati porfirine, a zatim pokazati katalaznu, nitrit
reduktaznu i citohromnu aktivnost. Laktobacili su striktno fermentativne bakterije. Imaju
kompleksne nutritivne zahteve za ugljenim hidratima, aminokiselinama, peptidima, masnim
kiselinama, derivatima nukleinskih kiselina, vitaminima i mineralima (Konig i sar., 2017). Mogu
se naći u najrazličitijim staništima, od usne duplje, gastrointestinalnog i urogenitalnog trakta
čoveka i životinja, preko biljnog materijala, žitarica i voća, sve do đubriva i kanalizacije.
Slika 2. Lactobacillus. delbrueckii ssp. bulgaricus
6
Laktobacili se koriste kao starter kulture u prehrambenoj industriji, npr. u fermentaciji i
zrenju mlečnih proizvoda, povrća, voća, vina i piva, mesa, ribe, čaja itd. (Holzapfel i Wood,
2014). Pokazuju veliku raznovrsnost kataboličke aktivnosti, a dokazano je i da su bezbedni za
primenu u prehrambenoj industriji. Iako je tehnološki najvažniji krajnji proizvod fermentacije
laktobacila mlečna kiselina, druge metaboličke osobine, kao što su njihova proteolitička i
lipolitička aktivnost i sinteza aromatičnih jedinjenja poput diacetila i acetaldehida rezultuju u
velikoj raznovrsnosti krajnjih proizvoda. Neki sojevi produkuju bakteriocine, netoksične proteine
koji sprečavaju rast drugih bakterija. Osim toga, tokom fermentacije snižava se pH hrane te se
ona konzerviše na prirodan način. Određeni selektovani sojevi laktobacila iz mlečnih proizvoda
pokazuju probiotska svojstva poput kontrole intestinalnih infekcija, alergijskih oboljenja i
dijareja izazvanih antibioticima, tretmana infekcija tokom trudnoće, prevencije infekcija
urinarnog trakta i dr. čime se utiče na poboljšanje zdravlja ljudi. Neki laktobacili, međutim, mogu
imati negativni efekat na kvalitet hrane izazivajući kvarenje vina, piva, kobasica, sira i dr.
Povećano znanje o metabolizmu laktobacila omogućava korišćenje bionformatike u predviđanju
metaboličkog potencijala sojeva i pomaže u izboru bolje starter kulture (Diaz-Muniz i sar., 2006).
Rod Lactobacillus je najbrojniji u okviru BMK i podeljen je u tri grupe:
1) Obligatni homofermentativni laktobacili koji poseduju enzim aldolazu i gotovo isključivo
(>85%) fermentišu heksoze do mlečne kiseline glikolitičkim putem, a ne fermentišu pentoze i
glukonat zbog nedostatka fosfoketolaze. Grupa obuhvata 17 vrsta, a najpoznatije su
Lactobacillus delbrueckii (ssp. bulgaricus, delbrueckii, lactis), Lactobacillus acidophilus,
Lactobacillus helveticus koje ulaze u sastav starter kultura u mlečnim proizvodima i
probiotskim preparatima.
2) Fakultativni heterofermentativni laktobacili poseduju aldolazu i fosfoketolazu tako da
fermentišu heksoze i pentoze, a često i glukonat. Najznačajniji predstavnici su vrste
Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus plantarum
Lactobacillus sakei i Lactobacillus rhamnosus i one se takođe koriste kao probiotici i starter
kulture u proizvodnji sireva, kobasica i drugih proizvoda.
3) Obligatni heterofermentativni laktobacili fermentišu heksoze pentoza fosfatnim putem do
mlečne kiseline, etanola i/ili sirćetne kiseline i CO2. Pentoze takođe mogu da fermentišu
7
ovim putem. Vrste Lactobacillus brevis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus fermentum,
Lactobacillus kefir i Lactobacillus sanfranciscensis koriste se za prezervaciju hrane, kao
probiotici i kao starter kulture za proizvodnju kefira i kiselog testa.
Ove grupe laktobacila nisu u saglasnosti sa filogenetskim odnosima u okviru roda. Collins
i sar. (1991) su na osnovu srodnosti među vrstama, rod Lactobacillus podelili u tri grupe: Lb.
delbrueckii grupa, Lb. casei-Pediococcus grupa (danas sa manjim podgrupama: Lb. buchneri, Lb.
casei, Lb. plantarum, Lb. reuteri i Lb. salivarius grupa) i Leuconostoc grupa.
1.1.2. Rod Leuconostoc
Vrste roda Leuconostoc su Gram-pozitivni, nepokretni, asporogeni i katalaza negativni
kokoidni oblici bakterija. To su oblikatno heterofermentativne BMK koje metabolišu glukozu
putem pentoza fosfata, gde se pored D(-) oblika mlečne kiseline oslobađa i etanol, CO2 i sirćetna
kiselina (Endo i Okada, 2008). Neke vrste mogu da rastu na niskim vrednostima pH i
temperature. Poznati su uzročnici kvarenja proizvoda od mesa. U prirodi se mogu naći na
biljkama, a prisutni su i u mleku i mlečnim proizvodima, mesnim proizvodima (kobasice), u vinu i
fermentisanom povrću (krastavac, kupus, masline), gde učestvuju u spontanoj fermentaciji ili se
koriste kao starter kulture. U industrijskoj proizvodnji od značaja je metabolizam citrata u
prisustvu fermentabilnih ugljenih hidrata i produkcija mlečne kiseline, sirćetne kiseline, diacetila
i acetoina koji daju karakterističnu aromu i teksturu krajnjeg proizvoda. Diacetil je važno
aromatično jedinjenje (aroma maslaca) u mlečnim proizvodima i ima antimikrobnu aktivnost
protiv nekoliko Gram-pozitivnih i Gram-negativnih bakterija i kvasaca (Ray i Daeschel, 1992).
Dokazano je i da nekoliko vrsta roda Leuconostoc produkuje bakteriocine koji su aktivni protiv
patogena koji se prenose hranom, uključujući vrstu Listeria monocytogenes i zato su korisni za
prirodnu zaštitu protiv kvarenja hrane (Trias i sar., 2008).
Rod Leuconostoc obuhvata 12 vrsta. Najpoznatije su vrste Leuconostoc lactis,
Leuconostoc carnosum, Leuconostoc citreum, Leuconostoc kimchii i Leuconostoc mesenteroides
(Slika 3), sa tri podvrste. Ove podvrste su ujedno najpoznatije: Lc. mesenteroides ssp. cremoris
učestvuje u fermentaciji mlečnih proizvoda i vina, Lc. mesenteroides ssp. dextranicum u
8
fermentisanim biljnim proizvodima, mesu, mleku i mlečnim proizvodima i vinu i L.mesenteroides
ssp. mesenteroides spontano fermentiše u svežim biljnim sirovinama (vanila, kafa i kakao) ili se
dodaje kao starter kultura pri proizvodnji voća, povrća, mesa, mleka i vina. Poslednje dve
podvrste produkuju dekstrane, polimere glukoze koji se upotrebljavaju kao dodaci i zamena za
krvnu plazmu.
Slika 3. Leuconostoc mesenteroides
1.1.3. Rod Carnobacterium
Ćelije bakterija roda Carnobacterium su Gram-pozitivni, nesporulišući, kratki i tanki
štapići koji se obično pojavljuju pojedinačno ili u parovima, retko u kratkim lancima. Vrste ovog
roda su fakultativno anaerobne i heterofermentativne BMK, katalaza i oksidaza negativne. To su
mezofilne i psihrotolerantne bakterije, koje rastu na temperaturi od 0 °C i na neutalnoj pH
vrednosti. Vrste roda Carnobacterium su do sada izolovane iz četiri staništa: meso (i mesni
proizvodi), živina, riba i morska voda. Neobrađeno meso kao i neki mesni proizvodi predstavljaju
jedno od glavnih staništa vrsta Carnobacterium divergens i Carnobacterium piscicola. Ove vrste
dominiraju tokom prve dve nedelje u vakumiranom goveđem i svinjskom mesu koje se čuva na
niskim temperaturama. Smatra se da je produkcija antimikrobnih supstanci, u prvom redu
bakteriocina, važan faktor koji doprinosi ranoj dominaciji ovih vrsta u mesu koje sadrži mešovitu
prirodnu populaciju BMK. S obzirom na to da vrste iz roda Carnobacterium u manjem stepenu
smanjuju pH vrednost proizvoda u odnosu na druge BMK, predlaže se njihova upotreba u
razvoju konzervanasa.
9
1.1.4. Rod Weisella
Vrste roda Weisella su Gram-pozitivni, katalaza-negativni, asporogeni kratki štapići sa
zaobljenim konusnim krajevima ili ovoidne ćelije (Collins i sar., 1993; Bjorkroth i sar., 2009).
Pojavljuju se u parovima ili u kratkim lancima i neke vrste imaju tendenciju prema
pleomorfizmu. To su fakultativno anaerobne, hemoorganotrofne, heterofermentativne
bakterije, koje fermentišu glukozu putem pentoza fosfata i 6-fosfoglukonat/fosfoketolaznim
putem. Krajnji proizvodi fermentacije su mlečna kiselina, CO2, etanol i/ili acetat. Vrste iz ovog
roda se mogu pronaći u prehrambenim proizvodima od povrća, ribe i mesa. Vrste Weissella
viridescens, Weissella halotolerans i Weissella hellenica imaju korisne uloge u fermentisanim
kobasicama (Samelis i sar., 1994), ali su takođe povezane i sa kvarenjem mesa (Borch i sar.,
1996). Zabeleženo je da vrsta (W. viridescens), koja je za razliku od ostalih BMK otporna na
toplotu, može izazvati kvarenje suhomesnatih proizvoda. Produkcija bakteriocina zabeležena je
kod sojeva Weissella cibaria i Weissella. paramesenteroides (Papathanasopoulos i sar., 1997;
Srionnual i sar., 2007). Vrsta W. cibaria proizvodi velike količine H2O2 pod anaerobnim uslovima.
1.2. Antimikrobne supstance
Većina organizama proizvodi antimikrobne komponente koje predstavljaju deo prirodnog
imunog sistema u cilju zaštite od drugih mikroorganizama. Termin antimikrobne supstance
obuhvata različite klase lekova koji sprečavaju rast i razmnožavanje ili ubijaju mikroorganizme
(Musumeci i Puglisi, 2013). Većina antimikrobnih supstanci je aktivna samo protiv bakterija
(antibakterijski agensi), a manji broj deluje na gljive (antifungalni agensi), viruse (antiviralni agensi),
protozoe (antiprotozoalni agensi, protozoici) i crevne parazite (antihelmintici). Antimikrobni agensi
koji se koriste u kliničkoj medicini ne deluju na spore bakterija i gljiva, kao ni na proviruse
(Greenwood i sar., 2012). U terapiji se koriste prirodni produkti mikroorganizama-antibiotici,
hemijski obrađene prirodne supstance-polusintetički antibiotici i sintetske supstance-
hemoterapeutici. Zajednička karakteristika ovih supstanci je da ubijaju bakterije (baktericidni
efekat), inhibiraju rast i razmnožavanje (bakteriostatski) ili liziraju bakterijske ćelije (bakteriolitski).
10
One su toksične za bakterije, ali ne i za ćelije domaćina i deluju u veoma malim koncentracijama (1-
10 µm/ml) (Petrović i sar., 2007).
Antimikrobni agensi se ne koriste samo u medicini i veterini već i kao aditivi u hrani.
Zloupotreba antibiotika u humanoj terapiji dovodi do rezistencije na antibiotike, odnosno može
imati toksične efekte na kopnene i vodene organizme koji se nađu u okolini tretirane životinje
(Musumeci i Puglisi, 2013).
1.2.1. Antimikrobne supstance BMK
Bakterije mlečne kiseline produkuju veliki broj antimikrobnih jedinjenja niske molekulske
mase uključujući, kiseline, alkohole, ugljen-dioksid, diacetil, acetaldehid, acetoin, vodonik-peroksid,
kao i jedinjenja visoke molekulske mase, bakteriocine. Mnogi od ovih metabolita imaju širok
spektar aktivnosti na druge vrste i njihova produkcija u velikoj meri zavisi od sastava hranljive
podloge (Helander i sar., 1997). Upoznavanje sinergističkih efekata između različitih antimikrobnih
supstaci BMK proširilo je njihovu potencijalnu upotrebu. Međutim, osim snižavanja pH, drugi
pristupi kontrole patogena za sada nisu uspešni. Jedino kombinacija različitih starter kultura i
kombinacija različitih antimikrobnih faktora prirodnog porekla mogu rezultovati optimalnim
produktom.
Slabe organske kiseline koje produkuju BMK-mlečna, sirćetna, limunska, mravlja,
propionska, buterna, važna su jedinjenja koja inhibiraju širok spektar mikroorganizama. Najbitnije i
najbolje okarakterisane su mlečna i sirćetna kiselina. Ove kiseline dovode do snižavanja pH
vrednosti sredine što predstavlja primarnu inhibitornu aktivnost BMK. Tip i količina kiseline koja se
produkuje tokom fermentacije zavisi od osobina vrste, celokupne mikrobne populacije i uslova
sredine. Inhibitorni efekat nedisociranih organiskih kiselina je 10-600 puta jači od njihovih
disociranih oblika, a stepen disocijacije je direktno određen pH vrednošću. Nedisocirani oblici
mlečne, limunske i sirćetne kiseline imaju jaku antimikrobnu aktivnost. Smanjenje ekstracelularne
pH vrednosti dovodi do acidifikacije citoplazme jer nedisocirani oblici kiselina kao lipofilni molekuli
pasivno difunduju preko membrane u citoplazmu (Kashket, 1987). Kiseline generalno ostvaruju svoj
antimikrobni efekat ometanjem potencijala ćelijske membrane, sprečavanjem aktivnog transporta i
11
inhibiranjem raznih metaboličkih funkcija (Ross i sar., 2002). Acidifikacija, kao metoda prezervacije
hrane, se široko koristi u proizvodnji fermentisanog mleka, povrća i kobasica.
Ugljen-dioksid produkuju uglavnom heterofermentativne BMK. Svoju antimikrobnu
aktivnost ostvaruje zamenom molekularnog kiseonika i stvaranjem anaerobnih uslova. Ovakva
sredina onemogućava reakcije dekarboksilacije i remeti permeabilnost membrane akumulacijom
ugljen-dioksida između lipidnog dvosloja. Ugljen-dioksid sprečava rast mnogih uzročnika kvarenja
hrane, posebno Gram-negativnih psihotrofnih bakterija. Stepen inhibicije znatno varira između
različitih organizama.
Heterofermentativne BMK produkuju acetaldehid dekarboksilacijom piruvata. Ovaj
produkt, u reakciji sa piruvatom daje α-acetolaktat koji se konvertuje u diacetil. S druge strane,
produkt dekarboksilacije α-acetolaktata i redukcije diacetila je acetoin. Diacetil ima širok spektar
antimikrobne aktivnosti u koncentracijama 300-1000 µg/m³, ali ograničavajući faktor njegove
upotrebe je činjenica da produkuje karakteristični ukus maslaca samo u koncentracijama 2-4
µg/m³. Shodno tome, nivo diacetila koji je prirodno pronađen u fermentisanoj hrani (0,2-1,5
µg/m³) je previše nizak da bi bio efikasan, a njegov ukus maslaca sprečava upotrebu u čistoj formi
(Helander i sar., 1997). Gram-negativne bakterije pokazuju veću osetljivost na delovanje diacetila
od Gram-pozitivnih bakterija. U odgovarajućoj koncentraciji, diacetil inhibira rast vrsta iz rodova
Listeria, Salmonella, Yersinia, Aeromonas, kao i vrste Escherichia coli. Slično diacetilu, acetaldehid,
koji je obično prisutan u fermentisanim mlečnim proizvodima u koncentracijama nižim od
inhibitorne, takođe igra ulogu u kontroli kontaminenata, zajedno sa drugim antimikrobnim
metabolitima BMK. U koncentracijama 10-100 µg/m³ inhibira rast vrsta Staphylococcus aureus,
Salmonella typhimurium i E. coli u mlečnim proizvodima (Piard i Desmazeaud, 1991).
Vodonik-peroksid se produkuje tokom aerobnog rasta bakterija redukcijom molekula
kiseonika sa dva elektrona pri čemu je reakcija katalizovana brojnim oksidazama. Većina
heterofermentativnih vrsta poseduje flavoprotein oksidazu, koja katalizuje redukciju kiseonika, što
dovodi do nagomilavanja vodonik-peroksida (Šušković i sar., 2010). Veliki broj laktobacila može da
produkuje vodonik-peroksid oksidacijom laktata. Količina vodonik-peroksida koju produkuju BMK
je promenljiva i zavisi od soja i dostupnosti kiseonika. Kao vrlo reaktivan i toksičan nusprodukt
oksidativnih procesa, može imati jak oksidativni efekat na membranske lipide i ćelijske proteine.
12
Denaturacijom membranskih proteina povećava se permeabilnost membrane i remeti
funkcionisanje ćeije. Vodonik-peroksid može biti i prekursor za produkciju slobodnih radikala kao
što su superoksid (O2-) i hidroksil (OH-) radikal koji oštećuju DNK. Baktericidni efekat vodonik-
peroksida zavisi od primenjenih koncentracija i od faktora sredine kao što su pH vrednost i
temperatura. Sporicidni efekat takođe zavisi od temperature i jači je na višim vrednostima.
Dokazano je da vrste rodova Lactobacillus i Lactococcus produkuju vodonik-peroksid koji inhibira
rast vrste St. aureus, vrsta iz roda Pseudomonas sp. i drugih psihotrofnih mikroorganizama u hrani.
Produkcija vodonik-peroksida od strane BMK ima potencijalnu primenu u zaštiti od urogenitalnih
infekcija.
Bakteriocini su antimikrobne supstance proteinske prirode koje pokazuju uzak spektar
delovanja uglavnom na blisko srodne bakterijske vrste, a prema kojima soj proizvođač ima
specifičan mehanizam samozaštite. Međutim, oni mogu promeniti svoju formu i imati baktericidni
efekat izvan vrsta koje su blisko povezane ili ograničene istom ekološkom nišom. Primarni oblik
bakteriocina je po definiciji protein, ali postoje i proteinski kompleksi sa lipidima, ugljenim
hidratima ili kombinacije različitih proteina. Bakteriocini svoje antimikrobno delovanje ispoljavaju
pre svega permeabilizacijom plazma membrane (Cotter et al., 2013), iako mnogi od njih imaju
indirektno delovanje na membranu tako što se vezuju za različite membranske receptore
(Gabrielsen et al., 2012). Mehanizam delovanja bakteriocina zavisi od primarne strukture njihovih
peptida, tako bakteriocini koji pripadaju istoj klasi imaju i slične mehanizme delovanja. S obzirom
na to, primarna struktura peptida je, pored biohemijske i genetičke karakterizacije, uzeta kao
osnov klasifikacije bakteriocina. Oni se generalno mogu podeliti na postranslaciono modifikovane
bakteriocine klase I (lantibiotici) i nemodifikovane ili minimalno modifikovane termostabilne
bakteriocine klase II, velike termolabilne proteine klase III (bakteriolizini) i kompleksne bakteriocine
koji sadrže hemijske grupe poput lipida i ugljenih hidrata klase IV. Neki od karakterističnih
predstavnika su nizin, pediocin i helveticin. Do danas nisu uočena nikakva neželjena dejstva
bakteriocina na ljudske ćelije, a ovo se može objasniti niskim koncentracija kojima deluju na
senzitivne ćeliju (u piko- i nano-molarnim koncentracijama) i proteinskom prirodom bakteriocina
zbog čega su podložni degradaciji u organizmu čoveka, kao i u drugim ekološkim sredinama, a time
je i sticanje rezistencija kod bakterija svedeno na minimum. Upravo iz tog razloga su mnoga
13
istraživanja usmerena na definisanje komponenti koje bi bile adekvatna zamena antibiotika ili koje
bi bar imale sinergistički efekat sa njima (Uzelac, 2014). Bakteriocini koje proizvode BMK su od
velikog interesa u industriji fermentisane hrane kao prirodni konzervansi zbog njihove sposobnosti
da inhibiraju rast mnogih uzročnika kvarenja hrane i patogenih bakterija, uključujući vrste L.
monocytogenes, St. aureus, Bacillus cereus i Clostridium botulinum (Bredholt i sar., 2001). Iako je u
poslednje dve do tri decenije otkriveno na stotine bakteriocina, nizin A i pediocin PA-1 su do sada
jedini bakteriocini čije je korišćenje dozvoljeno u prehrambenoj industriji u većem broju zemalja
(Chen and Hoover, 2003). Nizin, bakteriocin klase I koji proizvode određeni sojevi bakterije Lc.
lactis, efikasan je u mnogim prehrambenim proizvodima inhibirajući rast širokog spektra Gram-
pozitivnih bakterija.
14
2. Ciljevi rada
Uzimajući u obzir značaj sinteze antimikrobnih jedinjenja BMK u industriji hrane,
odnosno uticaj na kvalitet i rok trajanja proizvoda, ciljevi ovog istraživanja su:
1. Ispitivanje antimikrobne aktivnosti suspenzija, supernatanata i neutralisanih
supernatanata BMK izolovanih iz peglane kobasice na odabrane indikator sojeve;
2. Određivanje minimalne inhibitorne koncentracije (MIK) supernatanata BMK;
3. Ispitivanje mehanizama antimikrobne aktivnosti BMK.
15
3. Materijal i metode
3.1. Materijal
3.1.1. Bakterijski sojevi
U ovom radu su korišćeni bakterijski sojevi BMK izolovani iz peglane kobasice i
identifikovani do nivoa vrsta: Lactobacillus sakei (M16, PF3, PF6, PF18, PF19), Lactobacillus
curvatus PK4, Leuconostoc mesenteroides ssp. dextranicum (PK15, PK16A), Weissella viridescens
M1, Carnobacterium divergens PK3 i Carnobacterium maltaromaticum M2.
Antimikrobna aktivnost BMK je ispitivana na osnovu dejstva na odabrane indikator
sojeve: Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Salmonella
typhimurium i Bacillus cereus.
Svi sojevi su aktivirani iz stokova čuvanih na -20 °C presejavanjem na odgovarajuću
podlogu. Sojevi BMK gajeni su na čvrstoj MRS hranljivoj podlozi (Torlak, Srbija), sa dodatkom
1,5% agara. Indikator sojevi gajeni su na MH podlozi (Himedia, India), koncentracije 0,7%. Kao
radne kulture sojeva korišćene su prekonoćne kulture zasejane na odgovarajućoj tečnoj podlozi i
inkubirane na određenoj temperaturi. Petri ploče sa sojevima BMK inkubirane su na temperaturi
od 30°C, a indikator sojevi na 37 °C.
3.2. Metode
3.2.1. Agar difuziona metoda
MRS hranljiva podloga razlivena je u Petri ploče i formirani su bunarići prečnika 0,5 cm uz
pomoć plastičnih kalupova. Za svaki indikator soj korišćene su po dve Petri ploče sa po pet i šest
bunarića (za jedanaest sojeva BMK). Nakon što se podloga stegla, kalupi su izvađeni sterilnom
pincetom. U bunariće je dodato po 50 μl prekonoćnih kultura BMK. Nakon zasejavanja, ploče su
ostavljene jedan sat na sobnoj temperaturi. Po 200 μl prekonoćnih kultura indikator sojeva je
inokulisano u 8 ml rastopljene MH podloge. Inokulumi su snažno vorteksovani i razliveni u Petri
16
ploče sa BMK. Petri ploče su inkubirane 24 h na temperaturi od 30 °C, nakon čega su lenjirom
očitavane zone inhibicije (Slika 4). Bakterije koje su najosetljive na dejstvo BMK pokazuju
najveće zone inhibicije, dok kod rezistentnih bakterija ne postoje zone inhibicije. Na isti način je
određena antimikrobna aktivnost čistog i neutralisanog supernatanta BMK, kao i međusobno
dejstvo BMK. Supernatanti BMK su dobijeni centrifugiranjem prekonoćnih kultura na 3500 g, 10
min. Neutralisani supernatanti su dobijeni dodavanjem 10 NaOH, a merenje je vršeno pH
metrom.
Slika 4. Zone inhibicije vrste B. cereus u prisustvu suspenzija BMK
3.2.2. Mikrodiluciona metoda
Za određivanje minimalne inhibitorne koncentracije (MIK) korišćena je mikrodiluciona
metoda. MIK je najniža koncentracija antimikrobnog agensa koja inhibira rast bakterija nakon
prekonoćne inkubacije. U ovom radu određena je minimalna inhibitorna koncentracija
supernatanata BMK na indikator sojeve.
Supernatanti BMK dobijeni su centrifugiranjem prekonoćnih kultura na 3500 g, 10 min.
Od prekonoćnih kultura ispitivanih indikator sojeva napravljene su bakterijske suspenzije u
sterilnom fiziološkom rastvoru i turbidimetrijskom metodom je broj mikroorganizama
standardizovan na 0,5 McFarlanda. Nakon toga je u mikrotitar ploči sa 96 bunarića napravljena
serija duplih razblaženja supernatanta BMK. U prvu kolonu naliveno je po 200 μl supernatanata
17
BMK, a u ostale kolone po 100 μl fiziološkog rastvora. Razređenja su pravljena prebacivanjem po
100 μl iz prve u drugu kolonu, zatim iz druge u treću, sve do poslednje kolone, iz koje je izbačeno
100 μl rastvora. U bunariće je dodato po 10 μl suspenzija indikator sojeva bakterija i 90 μl MH
bujona, tako da je finalni volumen bio 200 µl i finalna koncentracija bakterija 5x106 CFU/ml, a
koncentracija supernatanta od 100 do 0 %. Mikrotitarske ploče su zatim inkubirane 24h na 37˚C.
Najniža koncentracija pri kojoj nije bilo vidljivog rasta uzeta je za minimalnu inhibitornu
koncentraciju (MIK).
3.2.3. Kvantitativno određivanje vodonik peroksida
Testirani sojevi BMK Lc. mesenteroides ssp. dextranicum PK15, Lb. curvatus PK4, Lb. sakei
PF18 gajeni su 72 h u MRS bujonu, a zatim centrifugirani na 3000 g, 15 min. 5 mg/ml 0,1 N NaOH
i proteaza su dodati da neutrališu uticaj mlečne kiseline i bakteriocina. Dobijeno je 10 ml
supernatantna i dodato 8 ml razblažene sumporne kiseline. Titracija je izvršena sa 0.1 M kalijum
permanganatom. Svaki mililitar 0,1 M kalijum permanganata je ekvivalentan 1,79 mg vodonik
peroksida. Prvi trenutak obezbojavanja uzorka uziman je kao krajnja tačka titracije.
3.2.4. Kristal violet metoda
Promena u permeabilnosti ćelijske membrane detektovana je kristal violet metodom,
gde veći procenat usvajanja boje ukazuje na veću permeabilnost membrane (Devi i sar., 2010).
Supernatanti Lc. mesenteroides ssp. dextranicum PK15 i Lb. sakei PF18, čiji je uticaj na
membranu indikator sojeva ispitivan, dobijeni su centrifugiranjem prekonoćnih kultura na 3500
g, 10 min. Prekonoćne kulture indikator sojeva (E. coli, L. monocytogenes i B. cereus)
centrifugirane su na 6700 g 5 min na 21 °C. Talozi su isprani dva puta i resuspendovani u 10 mM
PBS-u (Phosphate Buffered Saline), pH 7,4. Ćelije su opet centrifugirane i napravljene su
suspenzije u sterilnom fiziološkom rastvoru podešene na 1 McFarland. Po 1 ml svake suspenzije
je prebačen u dve Eppendorf epruvete (ukupno šest), centrifugirano i resuspendovano u 6 ml
supernatanata BMK. Kao negativna kontrola korišćene su ćelije bez tretmana. Kao pozitivna
18
kontrola za izolat Lc. mesenteroides ssp. dextranicum PK15 korišćen je hloramfenikol u
koncentraciji od 10 µg/ml. Epruvete su inkubirane na 37 °C. Na 0, 2 i 4 h uzimano je po 1 ml
svake suspenzije, centrifugirano na 6700 g 5 min i resuspendovano u PBS-u (10 mM, pH 7,4) koji
sadrži 10 µg/ml kristal violet boje (Slika 5). Nakon inkubacije od 15 min na 37 °C, suspenzije su
centrifugirane na 13 000 g 15 min i merena je apsorbanca supernatanta na 595 nm
spektrofotometrijski.
Procenat usvajanja kristal violet boje od strane indikator sojeva iz uzoraka izračunat je uz
pomoć jednačine:
Usvajanje boje () = (1 −Vrednost apsorbance uzorka
Vrednost apsorbance kristal violet boje) × 100,
pri čemu vrednost apsorbance kristal violet boje iznosi A=2,533.
Slika 5. Uzorci vrste L. monocytogenes u kristal violet boji
3.2.5. Bradfordova metoda
Integritet ćelije je ispitan određivanjem oslobađanja ćelijskih proteina u supernatant
metodom koju su opisali Lv, Liang, Yuan i Li (2010), i Diao, Hu, Zhang i Xu (2014) sa nekim
modifikacijama. Ćelije indikator sojeva (E. coli, L. monocytogenes i B. cereus) iz radne kulture su
sakupljene centrifugiranjem na 5000 g 10 min, isprane tri puta 0,1 M PBS-om pH 7,2 i
resuspendovane u istom puferu. Zatim su ćelije resuspendovane u fiziološkom rastvoru tako da
je koncentracija podešena na 1 McFarland (1010 ćelija). U tri epruvete je naliveno po 8 ml
supernatanta BMK (10, 17 i 55) u MIK koncentraciji (ukupno devet epruveta). Po 80 µl
suspenzije indikator sojeva je dodato u svaki supernatant tako da je konačna koncentracija bila
19
108 ćelija/ml. Epruvete su inkubirane na 37 °C i po 1 ml uzorka je uzimano na 0, 4 i 8 h. Uzorci su
centrifugirani na 10 000 g 5 min. Po 0,1 ml svakog uzorka je pomešan sa po 5 ml Coomasie
brilliant blue G-250 bojom i merena je apsorbanca na 595 nm. Koncentracija oslobođenih
proteina je određena kalibracionom krivom uz pomoć albumina.
3.2.6. Time-kill analiza
Baktericidni efekat supernatanata BMK ispitan je Time-kill analizom koju su opisali Joray i
saradnici (2011) sa određenim modifikacijama. Ovom metodom se prati smanjenje broja ćelija
indikator sojeva tokom vremena pod uticajem određene koncentracije (MIK) inhibitornog
agensa. Suspenzije E. coli, L. monocytogenes i B. cereus koncentracije 5x106 ćelija/ml u MH
bujonu inkubirane su sa supernatantima BMK Lc. mesenteroides ssp. dextranicum PK15, Lb.
curvatus PK4, Lb. sakei PF18 MIK koncentracije. Suspenzije indikator sojeva u MH bujonu
pomešane sa sterilnim fiziološkim rastvorom korišćene su kao kontrola. Analiza je vršena na
svaka tri sata (0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24 h). U miktoritar ploči sa 96 bunarića napravljena je
serija od šest razređenja uzoraka. Određivanje broja bakterija vršeno je drop-count tehnikom
zasejavanja na hranljive podloge. Po 10 µl od drugog do šestog razređenja zasejano je na Petri
ploče sa hranljivim agrom. Nakon inkubacije 24 h na 37 °C, određen je ukupni broj kolonija na
pločama.
20
4. Rezultati i diskusija
U konceptu sigurnosti hrane stalna su nastojanja za što trajnijim rešenjima radi zaštite
zdravlja potrošača od štetnih mikroorganizama. Istraživanja i razvoj zaštitnih tehnologija u
prehrambenoj industriji sve su intenzivnija, a posebni interes pridaje se primeni zaštitnih kultura
mikroorganizama i njihovih antimikrobnih metabolita (Zdolec i sar., 2007). U tom pogledu
proučavanje principa mikrobnih interakcija prirodne mikroflore fermentisanih proizvoda može
imati praktičnu primenu u proizvodnji sigurnije hrane.
Grupa BMK sadrži veliki broj vrsta koje se izoluju iz različitih fermentisanih proizvoda i
pokazuju širok spektar antimikrobne aktivnosti na patogene vrste i uzročnike kvarenja hrane. U
ovom radu ispitivana je antimikrobna aktivnost jedanaest izolata BMK izolovanih iz peglane
kobasice.
Do sada nije proučavana mikrobna flora peglane kobasice tako da se u literaturi ne mogu
pronaći podaci o antimikrobnoj aktivnosti izolata BMK izolovanih iz peglane kobasice. Međutim,
postoje brojna istraživanja inhibitornog delovanja BMK izolovanih iz drugih fermentisanih
namirnica.
4.1. Antimikrobna aktivnost BMK
Za ispitivanje osetljivosti indikator sojeva agar difuzionom metodom korišćene su
suspenzije BMK, supernatanti prekonoćnih kultura niske pH vrednosti i neutralisani
supernatanti. Suspenzije BMK sadrže žive ćelije koje u kompeticiji sa indikator sojevima mogu
osloboditi različite produkte metabolizma i dati im kompetitivnu prednost. Osim toga,
antimikrobni agensi mogu biti neki od krajnjih produkata fermentacije BMK koji se oslobađaju u
spoljašnju sredinu. Ovi produkti nastaju prilikom rasta bakterija u hranljivoj podlozi i nalaze se u
supernatantu centrifugirane bakterijske kulture. Supernatant BMK je kisele reakcije zbog
prisustva organskih kiselina u velikom procentu. Ove kiseline mogu da budu ključni faktor koji
uništava ćelije indikator sojeva. Da bi se ispitalo da li postoji i drugi faktor osim kiseline, koji
ubija ćelije indikator sojeva, supernatant se neutrališe i na taj način se uklanja njen efekat.
21
Agar difuzionom metodom merene su zone inhibicije oko bunarića u kojima su bile
suspenzije BMK. Na osnovu izmerenih zona inhibicije (Tabela 1), može se zaključiti da suspenzije
testiranih izolata BMK inhibiraju rast indikator sojeva, sa izuzetkom izolata Lb. sakei PF3 i Lc.
mesenteroides ssp. dextranicum PK15 koji nisu pokazali inhibitorno dejstvo na vrstu E. coli i
izolata Lb. sakei PF6 i Lb. curvatus PK4 koji nisu inhibirali rast vrste B. cereus. Generalno, najveću
rezistentnost pokazala je vrsta E. coli sa srednjom vrednošću zona inhibicije 12,8 mm, a najveću
osetljivost vrsta L. monocytogenes, čija je srednja vrednost zona inhibicije 17,2 mm. Suspenzija
izolata C. divergens PK3 pokazala je najveću antimikrobnu aktivnost sa srednjom vrednošću zona
inhibicije od 17,4 mm, a suspenzije izolata Lc. mesenteroides ssp. dextranicum PK15 najmanju
srednju vrednost zona inhibicije koja iznosi 9,2 mm.
Supernatanti BMK pokazali su najjaču inhibitornu aktivnost s obzirom na to da su svi
ispitivani indikator sojevi pokazali osetljivost (Tabela 2). Gram-pozitivne bakterije St. aureus, L.
monocytogenes i B. cereus imaju jednaku srednju vrednost zona inhibicije (15 mm) i
najosetljivije su na dejstvo supernatanata. Najveća vrednost zona od 20 mm javila se kod vrste
B. cereus, kao najosetljivije na supernatante izolata C. divergens PK3 i Lb. sakei PF3. Srednja
vrednost zona inhibicije kod vrste S. typhimurium iznosi 14 mm, dok je vrsta E. coli pokazala
najveću rezistentnost na supernatante, sa srednjom vrednošću zona inhibicije od 12 mm. Pored
toga, najveću antimikrobnu aktivnost na ispitivane supernatante imaju izolati C. divergens PK3 i
Lc. mesenteroides ssp. dextranicum PK15, a najmanji efekat pokazali su izolati W. viridescens M1
i Lb. sakei PF18.
22
Tabela 1. Zone inhibicije rasta indikator sojeva u prisustvu suspenzija BMK izražene u mm
Izolat E. coli St. aureus L.
monocytogenes B. cereus
S. typhimurium
Lb. sakei
M16 17 17 17 15 15
PF3 / 19 18 17 18
PF6 15 20 20 / 16
PF18 13 18 17 16 16
PF19 15 16 18 17 17
Lb. curvatus
PK4 18 14 19 / 18
Lc. mesenteroides
PK15 / 9 15 14 8
PK16A 17 16 18 13 17
W. viridescens
M1 12 18 16 20 14
C. divergens
PK3 19 16 18 16 18
C. maltaromaticum
M2 15 18 14 18 18
23
Tabela 2. Zone inhibicije rasta indikator sojeva u prisustvu supernatanata BMK izražene u mm
Izolat E. coli St. aureus L.
monocytogenes B. cereus
S. typhimurium
Lb. sakei
M16 12 15 14 19 14
PF3 10 16 16 20 14
PF6 12 14 18 15 13
PF18 10 14 11 13 13
PF19 12 15 16 14 12
Lb. curvatus
PK4 11 15 14 17 16
Lc. mesenteroides
PK15 13 17 16 18 16
PK16A 15 16 14 18 16
W. viridescens
M1 12 12 14 12 12
C. divergens
PK3 16 16 16 20 14
C. maltaromaticum
M2 14 16 16 15 14
Indikator sojevi pokazali su najveću rezistentnost na neutralisane supernatante BMK
(Tabela 3). Svi sojevi su rezistentni bar na jedan supernatant, a kod vrste St. aureus nije bilo zona
inhibicije za šest od jedanaest ispitivanih supernatanata. Vrsta St. aureus pokazala je najveću
rezistentnost sa srednjom vrednošću zona inhibicije od 6 mm, a vrsta B. cereus je najosetljivija,
pri čemu je srednja vrednost zona inhibicije bila 12,6 mm. Najveću antimikrobnu aktivnost
pokazao je neutralisani supernatant izolata C. divergens PK3, a najmanje vrednosti zabeležene
su kod izolata W. viridescens M1 i Lb. sakei PF6.
24
Tabela 3. Zone inhibicije rasta indikator sojeva u prisustvu neutralisanih supernatanata BMK izražene u mm
Izolat E. coli St. aureus L.
monocytogenes B. cereus
S. typhimurium
Lb. sakei
M16 14 14 11 10 14
PF3 10 / / 12 /
PF6 16 / 12 14 12
PF18 / / 14 12 10
PF19 14 / 14 12 14
Lb. curvatus
PK4 / 14 12 12 13
Lc. mesenteroides
PK15 16 / 12 / /
PK16A 12 10 15 14 15
W. viridescens
M1 10 / / 12 /
C. divergens
PK3 / 14 16 14 16
C. maltaromaticum
M2 12 14 13 15 /
U mnogim istraživanjima dokazana je antimikrobna aktivnost supernatanata BMK u
kojima je dominantni antimikrobni agens bila mlečna kiselina. Inhibitorni efekat supernatanata
devetnaest sojeva roda Lactobacillus sp,. izolovanih iz turskih mlečnih proizvoda, na bakterije E.
coli i St. aureus pripisan je mlečnoj kiselini u kombinaciji ili bez delovanja H2O2 (Aslim i sar.,
2004). Kod tri izolata čiji su supernatanti neutralisani i tretirani katalazom zabeležena je slaba
inhibitorna aktivnost na vrstu E. coli i srednja inhibitorna aktivnost na vrstu St. aureus tako da se
njihovo dejstvo pripisuje bakteriocinima.
25
U ovom radu su supernatanti svih izolata pokazali antimikrobnu aktivnost na ispitivane
indikator sojeve i veće zone inhibicije u odnosu na neutralisane supernatante. Neutralisani
supernatanti izolata Lc. mesenteroides ssp. dextranicum PK16A i Lb. sakei M16 pokazali su
antimikrobnu aktivnost na sve indikator sojeve te se može predpostaviti da njihovo dejstvo
može biti i posledica delovanja drugih supstanci kao što su bakteriocini, tako da je dalja analiza
ovih izolata neophodna kako bi se utvrdilo poreklo aktivnosti.
Različite koncentracije prečišćene mlečne kiseline pokazale su antimikrobnu aktivnost na
vrste E. coli, St. aureus, L. monocytogenes i B. cereus (Stanojević-Nikolić, 2015). S druge strane,
Ibrahim i sar. (2008) otkrili su da mlečna kiselina u niskoj koncentraciji (2 mg/ml) inhibira rast
Salmonella spp. i E. coli O157:H7. Slično tome, Yesillik i sar. (2011) pokazali su da mlečna kiselina
u koncentraciji od 9 mg/ml inhibira rast S. typhimurium (sa zonom inhibije od 22,6 mm), dok na
vrste E. coli i St. aureus nije pokazala efekat. Dobijeni rezultati pokazuju da supernatanti BMK
pokazuje veću efikasnost protiv Gram-pozitivnih (L. monocytogenes, St. aureus i B. cereus) nego
protiv Gram-negativnih bakterija (E. coli i S. typhimurium), što je u saglasnosti sa rezultatima
drugih autora (Savadogo i sar., 2004; Mezaini i sar., 2009). Razlog tome je drugačija strukturna i
hemijska kompozicija spoljašnjih ćelijskih omotača i razlika u toleranciji pojedinačnih
mikroorganizama. Mehanizmi rezistencije Gram-negativnih bakterija su složeniji zbog toga što
su njihove ćelije obavijene spoljašnjom hidrofobnom membranom koja blokira ulazak hidrofilnih
molekula male molekulske mase kao što su kiseline, alkoholi, vodonik-peroksid, ugljen-dioksid
koji mogu proći jedino kroz hidrofilne kanale (porine) u lipidnom dvosloju. S druge strane,
činjenica da Gram-pozitivne bakterije poseduju samo debeo peptidoglikanski omotač i lipidni
dvosloj može objasniti veću osetljivost ovih bakterija na mlečnu kiselinu.
Osim uticaja BMK na indikator sojeve, agar difuziona metoda je korišćena i za ispitivanje
međusobnog dejstva odabranih izolata BMK. Od svih izolata BMK, jedino je izolat Lb. sakei PF6
pokazao osetljivost na druge izolate. Zone inhibicije izolata Lb. sakei PF6 date su u Tabeli 4.
Izolat Lb. sakei PF6 pokazao je najveću osetljivost na rast izolata C. divergens PK3 , sa zonom
inhibicije od 17 mm. Rezistentnost je zapažena jedino pri rastu izolata Lc. mesenteroides ssp.
dextranicum PK16A.
26
Tabela 4. Zone inhibicije izolata Lb. sakei PF6 u prisustvu izolata BMK izražene u mm
Izolat Izolat Lb. sakei PF6
Lb. sakei
M16 13
PF3 13
PF18 14
PF19 14
Lb. curvatus
PK4 13
Lc. mesenteroides
PK15 13
PK16A /
W. viridescens
M1 14
C. divergens
PK3 17
C. maltaromaticum
M2 14
4.2. Određivanje minimalne inhibitorne koncentracije (MIK)
Metodom mikrodilucije određene su vrednosti MIK na indikator sojeve za supernatante
svih jedanaest izolata BMK. Rezultati su prikazani u Tabeli 5.
Većina dobijenih vrednosti MIK ispitivanih supernatanta bila je 50% početne
koncentracije supernatanta. Vrsta St. aureus pokazala je najveću rezistentnost na supernatante
BMK sa tri MIK vrednosti (za izolate Lb. sakei M16, Lb. sakei PF3 i Lb. sakei PF6) od 100%
(koncentrovan supernatant). Najveću osetljivost pokazale su vrste L. monocytogenes i S.
typhimurium, sa srednjom MIK vrednošću od 37,5%. Vrste St. aureus i S. typhimurium nisu
pokazale rast ni na jednoj koncentraciji supernatanta soja Lb. sakei PF19 što ukazuje na veliku
osetljivost.
27
Tabela 5. MIK vrednosti supernatanata MKB za indikator sojeve izražene u procentima
Izolat E. coli St. aureus L.
monocytogenes B. cereus
S. typhimurium
Lb. sakei
M16 50 100 50 50 50
PF3 25 100 25 50 25
PF6 50 100 50 50 50
PF18 25 50 50 50 50
PF19 50 0 50 50 0
Lb. curvatus
PK4 25 50 25 25 25
Lc. mesenteroides
PK15 50 50 25 50 50
PK16A 50 50 25 50 50
4.3. Ispitivanje mehanizama antimikrobne aktivnosti BMK
Da bi se detaljnije proučili mehanizmi pomoću kojih BMK ubijaju ćelije indikator sojeva,
odabrana su tri izolata (Lc. mesenteroides ssp. dextranicum PK15, Lb. curvatus PK4 i Lb. sakei
PF18). Ispitana je produkcija vodonik-peroksida kao i oštećenje membrane indikator sojeva E.
coli, L. monocytogenes i B.cereus.
Brojne vrste BMK produkuju vodonik-peroksid u malim koncentracijama. Od 87
ispitivanih izolata, pre svega iz roda Lactobacillus sp., kod svih je zabeležena produkcija u
koncentracijama između 0,003 mg/ml i 0,007 mg/ml (Hor i Liang, 2013). U radu objavljenom od
strane Adesokana i saradnika (2010), navodi se da sojevi BMK iz rodova Leuconostoc sp. i
Lactobacillus sp. produkuju vodonik-peroksid, pri čemu je najveća koncentracija zabeležena kod
vrste Leuconostoc mesenteroides, a najmanja kod Lactobacillus plantarum. U ovom radu,
kvantitativno određivanje vodonik peroksida izvršeno je titracijom sa 0.1 M kalijum
permanganatom. Kod sva tri izolata BMK potvrđena je produkcija vodonik-peroksida, pri čemu
28
je najveća koncentracija vodonik peroksida zabeležena kod soja Lb. sakei PF18, zatim kod soja
Ln. mesenteroides ssp. dextranicum PK15, a najmanja kod soja Lb. curvatus PK4 (Tabela 6).
Tabela 6. Produkcija vodonik-peroksida
Izolat KMnO4 (ml) H2O2 (mg)
PF18 2,05 3,67
PK4 0,85 1,52
PK15 1,65 2,95
Kristal violet metoda je korišćena za ispitivanje promene permeabilnosti membrane
indikator sojeva pod dejstvom supernatanata BMK. Sve veće usvajanje boje od strane ćelije,
odnosno smanjenje vrednosti apsorbance uzorka tokom vremena označava povećanje
permeabilnosti kao posledica oštećenja na membrani. Na osnovu dobijenih rezultata (Tabela 7)
može se zaključiti da permeabilnost membrane raste tokom vremena za većinu indikator sojeva,
a drastičan porast beleži se nakon 20 h inkubacije za izolat Lc. mesenteroides ssp. dextranicum
PK15. Mala odstupanja zabeležena su kod vrste L. monocytogenes za delovanje supernatanta
izolata Lc. mesenteroides ssp. dextranicum PK15 i kod vrsta L. monocytogenes i B.cereus za
delovanje supernatanta izolata Lb. sakei PF18. Kod kontrola se takođe uočava povećanje
permeabilnosti tokom vremena i značajna razlika u odnosu na uzorke.
29
Tabela 7. Vrednosti apsorbanci uzoraka u kristal violet metodi merene spektrofotometrijski
Na osnovu dobijenih vrednosti procenta usvajanja boje, konstruisani su grafici koji
pokazuju promenu procenta usvajanja boje u uzorcima tokom vremena za izolat Lc.
mesenteroides ssp. dextranicum PK15 (Slika 4) i za izolat Lb. sakei PF18 (Slika 5).
MKB Indikator soj Vreme
inkubacije (h) Uzorak
Negativna kontrola
Pozitivna kontrola
S PK15
E. coli
0 1.805 0.979 1.276
4 1.268 0.043 1.280
20 0.093 0.016 0.149
L. monocytogenes
0 1.764 0.888 1.409
4 1.830 0.041 1.337
20 0.109 0.034 0.214
B.cereus
0 1.782 1.248 1.235
4 1.780 0.075 1.541
20 0.083 0.047 0.214
S PF18
E. coli 0 1.735 1.875 /
4 1.696 1.397 /
L. monocytogenes
0 1.513 1.722 /
4 1.834 1.400 /
B.cereus 0 1.546 1.823 /
4 1.765 1.212 /
30
Slika 4. Vrednosti procenata usvajanja boje u uzorcima inkubiranim sa supernatantom izolata Lc. mesenteroides ssp. dextranicum PK15, tokom vremena
Tokom vremena se povećava oštećenje ćelijskih membrana indikator sojeva pod
uticajem supernatanta izolata Lc. mesenteroides ssp. dextranicum PK15, što dovodi do
povećanja procenta usvajanja kristal violet boje. Nakon 4 h inkubacije, primećeno je malo
povećanje procenta usvajanja kod vrste E. coli, smanjenje kod vrste L. monocytogenes i iste
vrednosti kod vrste B. cereus. Zatim procenat usvajanja boje kod sve tri vrste naglo raste, sve do
20 h kada je boja potpuno usvojena. Osim toga, oštećenje membrane vrste E. coli je najveće,
dok vrste L. monocytogenes i B. cereus pokazuju slične vrednosti.
Delovanje supernatanta izolata Lb. sakei PF18 na indikator sojeve određeno je samo
nakon 4 h inkubacije. Kod vrste E. coli nije došlo do promene procenta usvajanja u odnosu na
početak inkubacije, a kod vrsta L. monocytogenes i B. cereus se smanjio procenat usvajanja boje.
Na osnovu ovih rezultata može se reći da supernatant izolata Lb. sakei PF18 nije oštetio ćelijske
membrane ispitivanih indikator sojeva nakon 4 h inkubacije.
0.00
20.00
40.00
60.00
80.00
100.00
0 4 20
Pro
cen
at u
svaj
anja
bo
je (
)
Vreme inkubacije (h)
E. coli
Listeria
B.cereus
31
Slika 5. Vrednosti procenata usvajanja boje u uzorcima inkubiranim sa supernatantom izolata Lb. sakei PF18, tokom vremena
Bradfordova metoda je korišćena za ispitivanje integriteta ćelijske membrane
merenjem koncentracije ćelijskih proteina koji se oslobađaju u spoljašnju sredinu. Povećanje
vrednosti apsorbanci tokom vremena usled detekcije sve veće koncentracije Coomasie brilliant
blue boje koja se vezuje za proteine potvrđuje da se vremenom narušava struktura membrane
što dovodi do izlaska ćelijskih proteina i povećanja njihove koncentracije u supernatantu.
Na osnovu vrednosti apsorbanci poznatih koncentracija albumina određenih istom
metodom konstruisana je standardna prava (Slika 6).
Slika 6. Standardna prava vrednosti apsorbanci poznatih koncentracija albumina
0.00
10.00
20.00
30.00
40.00
50.00
0 4
Pro
cen
at u
svaj
anja
bo
je (
)
Vreme inkubacije (h)
E. coli
Listeria
B.cereus
y = 0.6295x
00.010.020.030.040.050.060.070.080.09
00.050.10.15
A5
95
c (mg/ml)
32
Iz jednačine standardne prave (y = 0,629x) određene su koncentracije uzoraka indikator
sojeva inkubiranih sa supernatantima BMK i konstruisani su grafici koji pokazuju promenu
vrednosti koncentracija tokom vremena (Slika 7, Slika 8, Slika 9).
Iz prikazanih rezultata se može videti da je integritet membrane najviše narušen u
uzorku vrste E. coli inkubirane sa supernatantom izolata Lb. sakei PF18, a da je najmanji uticaj na
membranu imao supernatant izolata Lc. mesenteroides ssp. dextranicum PK15. Maksimalna
aktivnost supernatanata bila je nakon četiri sata inkubacije. U uzorcima sa supernatantima
izolata Lb. curvatus PK4 i Lb. sakei PF18 zabeležene su znatno veće koncentracije proteina u
odnosu na ostale uzorke (Slika 7). Drugi mogući izvor velike koncentracije detektovanih proteina
je supernatant ispitivanih izolata, odnosno bakteriocini koji predstavljaju potencijalni
mehanizam njihove antimikrobne aktivnosti.
Slika 7. Vrednosti koncentracija proteina kod vrste E. coli inkubirane sa supernatantima BMK izražene u mg/ml
U uzorcima vrste L. monocytogenes inkubiranim sa supernatantima izolata Lb. curvatus
PK4 i Lc. mesenteroides ssp. dextranicum PK15 oslobođena je najveća količina proteina, pri čemu
je maksimalna količina zabeležena nakon četiri sata inkubacije. Količina proteina u uzorku sa
supernatantom izolata Lb. sakei PF18 se smanjila nakon inkubacije (Slika 8). Iz ovih podataka se
može zaključiti da integritet membrane vrste L. monocytogenes nije narušen, a deo proteina koji
je bio prisutan na početku inkubacije je denaturisan.
K
S PK15
S PK4
S PF18
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0 4 8
Ko
nce
ntr
acija
(m
g/m
l)
Vreme inkubacije (h)
33
Slika 5. Vrednosti koncentracija proteina kod vrste L. monocytogenes inkubirane sa supernatantima BMK izražene u mg/ml
Supernatant izolata Lc. mesenteroides ssp. dextranicum PK15 je u najvećoj meri narušio
integritet ćelijske membrane vrste B. cereus, dok je najmanje efikasan bio supernatant izolata
Lb. sakei PF18 (Slika 9).
Slika 9. Vrednosti koncentracija proteina kod vrste B. cereus inkubirane sa supernatantima BMK izražene u mg/ml
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0 4 8
Ko
nce
ntr
acija
(m
g/m
l)
Vreme inkubacije (h)
K
S PK15
S PK4
S PF18
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0.14
0 4 8
Ko
nce
ntr
acija
(m
g/m
l)
Vreme inkubacije (h)
K
S PK15
S PK4
S PF18
34
4.4. Ispitivanje baktericidnog efekta supernatanata BMK
Time-kill analiza, za razliku od mikrodilucione metode, obezbeđuje tačniji opis
antimikrobne aktivnosti određenog agensa tokom vremena. Prema tome, na ovaj način praćen
je uticaj supernatanata na ćelije indikator sojeva koje su brojive da bi se potvrdio njihov uticaj i
pojasnio mehanizam delovanja.
Na osnovu izbrojanih kolonija iz različitih razređenja, određen je ukupni broj ćelija u
uzorcima i rezultati su prikazani grafički. Kod vrste E. coli inkubirane sa supernatantom izolata
Lc. mesenteroides ssp. dextranicum PK15 nije zabeležen rast nakon 9 h inkubacije, a u uzorku sa
supernatantom izolata Lb. curvatus PK4 je rast prestao nakon 15 h inkubacije. Supernatant
izolata Lb. sakei PF18 nije inhibirao rast ćelija vrste E. coli, već je zabeleženo povećanje broja
ćelija nakon 24 h inkubacije (Slika 10).
Slika 10. Broj ćelija vrste E. coli inkubirane sa supernatantima BMK predstavljen logaritamski
Supernatant izolata Lb. sakei PF18 pokazao je najveću efikasnost u inhibiciji rasta ćelija
vrste L. monocytogenes, pri čemu nisu zabeležene vijabilne ćelije nakon 6 h inkubacije.
Prestanak rasta pod uticajem preostala dva izolata je zabeležen nakon 21 h inkubacije za
supernatanat vrste Lb. curvatus PK4, odnosno nakon 24 h za supernatant vrste Lc.
mesenteroides ssp. dextranicum PK15 (Slika 11).
1
100
10,000
1,000,000
100,000,000
0 3 6 9 12 15 18 21 24
l og
N
Vreme inkubacije (h)
K
PK15
PK4
PF18
35
Slika 11. Broj ćelija vrste L. monocytogenes inkubirane sa supernatantima BMK predstavljen
logaritamski
Supernatanti ispitivanih izolata BMK su bili najefikasniji u uzorcima vrste B. cereus (Slika
12). Rast ćelija je najpre prestao u uzorcima sa supernatantom vrste Lc. mesenteroides ssp.
dextranicum PK15 (nakon 6 h), zatim u uzorcima sa supernatantom vrste Lb. curvatus PK4
(nakon 12 h) i na kraju u uzorcima sa supernatantom vrste Lb. sakei PF18 (nakon 15 h).
Slika 12. Broj ćelija vrste B. cereus inkubirane sa supernatantima BMK predstavljen logaritamski
1
100
10,000
1,000,000
100,000,000
0 3 6 9 12 15 18 21 24
l og
N
Vreme inkubacije (h)
K
PK15
PK4
PF18
1
100
10,000
1,000,000
100,000,000
0 3 6 9 12 15 18 21 24
log
N
Vreme inkubacije (h)
K
PK15
PK4
PF18
36
5. Zaključci
Na osnovu rezultata predstavljenih u ovom radu mogu se doneti sledeći zaključci:
1. Supernatanti BMK pokazuju inhibitornu aktivnost na sve ispitivane indikator sojeve.
2. Supernatanti BMK pokazuju veću efikasnost protiv Gram-pozitivnih (L. monocytogenes, St. aureus i
B. cereus) nego protiv Gram-negativnih bakterija (E. coli i S. typhimurium).
3. Permeabilnost membrane većine indikator sojeva u prisustvu supernatanata BMK raste tokom
vremena, a drastičan porast beleži se nakon 20 h inkubacije.
4. Supernatanti BMK narušavaju strukturu membrane što dovodi do oslobađanja ćelijskih proteina u
supernatant.
5. Supernatanti BMK pokazuju najjači baktericidni efekat na vrstu B. cereus, a najslabiji na vrstu E.
coli.
37
6. Literatura
Bernardeau, M., Vernoux, J. P., Henri-Dubernet, S., & Gueguen, M., 2008: Safety assessment of dairy
microorganisms: The Lactobacillus genus. - International journal of food microbiology 126: 278-
285.
Björkroth, J.A., Dicks, L.M.T. & Holzapfel, W.H. (2009): Genus III. Weissella Collins, Samelis, Metaxopoulos
& Wallbanks 1994, 370VP (Effective publication: Collins, Samelis, Metaxopoulos & Wallbanks 1993,
597). In: de Vos, P., Garrity, G.M., Jones, D.et al. (eds), Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology,
2nd edn, Vol. 3: The Firmicutes. Springer, pp. 643-9.
Borch, E., Kant-Muermans, M.-L. & Blixt, Y. (1996): Bacterial spoilage of meat and cured meat products.
Int. J. Food Microbiol. 33:103–20.
Carr, F.J., Chill, D., Maida, N. (2002) The Lactic Acid Bacteria: A Literature Survey, Critical Reviews in
Microbiology, 28:4, 281-370
Chen, H., Hoover, D. G. (2003): Bacteriocins and their food applications.- Compr. Rev. Food Sci. Food
Safety. 2: 82-100.
Collins, M.D., Rodrigues, U.M., Ash, C. i sar. (1991): Phylogenetic analysis of the genus Lactobacillus and
related lactic acid bacteria as determined by reverse transcriptase sequencing of 16S rRNA. - FEMS
Microbiol. Lett. 77: 5–12.
Collins, M.D., Samelis, J., Metaxopoulos, J. & Wallbanks, S. (1993): Taxonomic studies on some
Leuconostoc-like organisms from fermented sausages: description of a new genus Weissella for the
Leuconostoc paramesenteroides group of species. J. Appl.Bacteriol. 75: 595–603.
Cotter, P. D., Ross, R. P., Hill, C. (2013): Bacteriocins - a viable alternative to antibiotics? Nat. Rev.
Microbiol. 11: 95–105.
Devi, K.P., Nisha SA, Sakthivel R, Pandian SK. (2010): Eugenol (an essential oil of clove) acts as an
antibacterial agent against Salmonella typhi by disrupting the cellular membrane . Journal of
Ethnopharmacology, 130(1): 107-115
Diao, W.R., Hu, Q.P., Zhang, H., Xu, J.G.(2014): Chemical composition, antibacterial activity and mechanism
of action of essential oil from seeds of fennel (Foenicul vulgare Mill.). Food Control, 35(1): 109-116
38
Diaz-Muniz, I., Banavara, D.S., Budinich, M.F. i sar. (2006): Lactobacillus casei metabolic potential to utilize
citrate as an energy source in ripening cheese: a bioinformatics approach. - J. Appl. Microbiol. 10:
872–82.
Endo, A., Okada, S. (2008): Reclassification of the genus Leuconostoc and proposals of Fructobacillus
fructosus gen. nov., comb.nov., Fructobacillus durionis comb. nov., Fructobacillus ficulneus comb.
nov. and Fructobacillus pseudoficulneus comb. nov. - Int. J. Syst. Evol. Microbiol 58: 2195–205.
Filipić, B., Golić, N., Jovčić, B., Ćupić Miladinović, D., Soković, S., Popović, D., & Kojić M, 2015: Rezistencija
na antibiotike kod bakterija mlečne kiseline. – rod Lactococcus - Vet. glasnik 69 (3-4): 219 – 229
Florou-Paneri, P., Christak, E., Bonos, E., 2013: Lactic Acid Bacteria as Source of Functional Ingredients. - J.
Marcelino Kongo, IntechOpen
Gabrielsen, C., Brede, D. A., Hernandez, P. E., Nes, I. F., Diep, D. B. (2012): The maltose ABC transporter in
Lactococcus lactis facilitates high-level sensitivity to the circular bacteriocin garvicin ML.
Antimicrob. Agents Chemother. 56: 2908-2915.
Greenwood, D., Barer, M., Slack, R., Irving, W. (2012): Medical Microbiology – A guide to Microbial
Infections: Pathogenesis, immunity, laboratory investigation and control. – Churchill Livingstone
Elsevier Limited.
Helander, I.M., Wright, A. von, Matilla-Sandholm, T-M. (1997): Potential of lactic acid bacteria and novel
antimicrobials against Gram-negative bacteria. - Elsevier Science Ltd. 8: 146-150.
Holzapfel, W.H., Wood, B.J.B., 2014: Lactic Acid Bacteria - Biodiversity and Taxonomy. - John Wiley & Sons,
Ltd
Hor, Y.Y., Liong, M.T. (2013): Use of extracellular extracts of lactic acid bacteria and bifidobacteria for the
inhibition of dermatological pathogen Staphylococcus aureus, Taiwanese Dermatological
Association. 1-7.
http://cairomircen.com/ProductDetails.aspx?ID=154
https://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Leuconostoc_mesenteroides
Johnson-Green, P., 2002: Introduction to food biotechnology. - Boca Raton, Fla. : CRC Press
Joray, M.B., del Rollán, M.R., Ruiz, G.M., Palacios, S.M., Carpinella, M.C. (2011): Antibacterial activity of
extracts from plants of central Argentina-isolation of an active principle from Achyrocline
satureioides. Planta Med. 77(1): 95-100
39
Kashket, E.R. (1987): Bioenergetics of lactic acid bacteria: cytoplasmic pH and osmotolerance. FEMS
Microbiol. Rev. 46: 233-244.
Kong, Y.J., Park, B.K. and Oh, D.H. (2001): Antimicrobial activity of Quercus mongolica leaf ethanol extract
and organic acids against food-borne microorganisms. Korean J. Food Sci. Technol. 33: 178–183.
Konig, H., Unden, G., Frohlich, J., 2017: Biology of Microorganisms in Grapes, in Must and in Wine. -
Springer International Publishing, Switcherland.
Lv, F., Liang, H., Yuan, Q., Li, C.(2011): In vitro antimicrobial effects and mechanism od action of selected
plant essential oli combination against four food-related microorganisms. Food Research
International. 44(9): 3057-3064
Mani-Lopez, E., Garcia, H.S. and Lopez-Mal, A. (2011) : Organic acids as antimicrobials to control
Salmonella in meat and poultry products. J. Food Res. 10: 1016–1025.
Musumeci, T., Puglisi, G. (2013): Antimicrobial agents - Drug–biomembrane interaction studies. -
Woodhead Publishing Limited.
Papathanasopoulos, M.A., Krier, F., Revol-Junelles, A.M. et al. (1997): Multiple bacteriocin production by
Leuconostoc mesenteroides TA33a and other Leuconostoc/Weissella strains. Curr. Microbiol. 35:
331–5.
Petrović, O., Knežević, P., & Simeunović, J., 2007: Mikrobiologija: skripta za studente biologije. - Daniel
Print, Novi Sad
Piard, J.C., Desmazeaud, M. (1991): Inhibiting factors produced by lactic acid bacteria: 1. Oxygen
metabolites and catabolism end-products. Lait 71: 525-541.
Ray, B., Daeschel, M. (1992): Food Biopreservatives of Microbial Origin. Boca Raton, FL: CRC Press.
Ross, R.P., Morgan, S., Hill, C. (2002): Preservation and fermentation: past, present and future.
International Journal of Food Microbiology. 79: 3–16.
Samelis, J., Maurogenakis, F. & Metaxopoulos, J. (1994): Characterisation of lactic acid bacteria isolated
from naturally fermented Greek dry salami. Int. J. Food Microbiol. 23: 179–96.
Srionnual, S., Yanagida, F., Lin, L.H., Hsiao, K.N. & Chen, Y.S. (2007): Weissellicin 110, a newly discovered
bacteriocin from Weissella cibaria 110, isolated from plaa-som, a fermented fish product from
Thailand. Appl. Environ. Microbiol. 73: 2247–50.
40
Šušković, J., Brkić, B., & Matošić, S., 1997: Mehanizam probiotičkog djelovanja bakterija mliječne kiseline.
- Mljekarstvo 47 (1): 57-73
Šušković, J., Kos, B., Beganović, J., Lebo{ Pavunc, A., Habjani, K., Matošić, S. (2010): Antimicrobial Activity –
The Most Important Property of Probiotic and Starter Lactic Acid Bacteria. Food Technol.
Biotechnol. 48 (3): 296–307.
Tagg J.R., Dajani A.S., Wannamaker, L.W. (1976): Bacteriol. Rev. 40: 722-756
Tannock, G. W., 2004: A special fondness for lactobacilli. - Applied and environmental microbiology , 70(6):
3189-3194
Trias, R., Badosa, E., Montesinos, E. & Bańeras, L. (2008) : Bioprotective Leuconostoc strains against
Listeria monocytogenes in fresh fruits and vegetables. - Int. J. Food Microbiol. 127: 91–8.
Uzelac, G. (2014): Karakterizacija bakteriocina bakterija mlečne kiseline i mehanizmi delovanja na
senzitivne ćelije, PhD thesis - Poljoprivredni fakultet, Univerzitet u Beogradu.
Wood, B.J.B., Holzapfel W.H., 1995: The Genera of Lactic Acid Bacteria. – Springer Science+ Business Media
Dordrecht
Прилог 5/1
ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ
НИШ
КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА
Образац Q4.09.13 - Издање 1
Редни број, РБР:
Идентификациони број, ИБР:
Тип документације, ТД: монографска
Тип записа, ТЗ: текстуални / графички
Врста рада, ВР: мастер рад
Аутор, АУ: Сандра Станимиров
Ментор, МН: Наташа Јоковић
Наслов рада, НР: Антимикробна активност бактерија млечне киселине изолованих из пеглане кобасице
Језик публикације, ЈП: српски
Језик извода, ЈИ: енглески
Земља публиковања, ЗП: Р. Србија
Уже географско подручје, УГП: Р. Србија
Година, ГО: 2018.
Издавач, ИЗ: ауторски репринт
Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33.
Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/ слика/ табела)
6 поглавља, 40 стр., 12 слика, 7 табела
Научна област, НО: биологија
Научна дисциплина, НД: микробиологија хране
Предметна одредница/Кључне речи, ПО:
бактерије млечне киселине, антимикробна активност, механизам деловања
УДК 637.055:547.472.3+637.524:579.6
Чува се, ЧУ: библиотека
Извод, ИЗ: У овом раду испитивана је антимикробна активност једанаест изолата БМК, изолованих из пеглане кобасице, на потенцијално патогене бактерије, агар дифузионом методом, микродилуционом методом, кристал виолет методом, Брадфордовом методом и Тиме-килл анализом. Испитивани изолати припадају врстама Lactobacillus sakei (M16, PF3, PF6, PF18, PF19), Lactobacillus curvatus PK4, Leuconostoc mesenteroides ssp. dextranicum (PK15, PK16A), Carnobacterium divergens PK3, Carnobacterium maltaromaticum M2 и Weissella viridescens M1 Као индикатор сојеви коришћене су врстеEscherichia coli, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium и Bacillus cereus.
Датум прихватања теме, ДП: 05.09.2018.
Датум одбране, ДО:
Чланови комисије, КО:
Председник: Др Татјана Михајилов-Крстев
Члан: Др Зорица Стојановић-Радић
Члан, ментор: Др Наташа Јоковић
Прилог 5/2
ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ
НИШ
KEY WORDS DOCUMENTATION
Образац Q4.09.13 - Издање 1
Accession number, ANO:
Identification number, INO:
Document type, DT: monograph
Type of record, TR: textual / graphic
Contents code, CC: thesis
Author, AU: SandraStanimirov
Mentor, MN: Nataša Joković
Title, TI: Antimicrobial activity of lactic acid bacteria isolated from “peglana kobasica”
Language of text, LT: Serbian
Language of abstract, LA: English
Country of publication, CP: Republic of Serbia
Locality of publication, LP: Serbia
Publication year, PY: 2018
Publisher, PB: author’s reprint
Publication place, PP: Niš, Višegradska 33.
Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes)
6 chapters, 40 p., 12 pictures, 7 tables
Scientific field, SF: biology
Scientific discipline, SD: food microbiology
Subject/Key words, S/KW: lactic acid bacteria, antimicrobial activity, mechanisms of action
UC 637.055:547.472.3+637.524:579.6
Holding data, HD: library
Abstract, AB: In this paper work, the antimicrobial activity of eleven isolates of LAB isolated from “peglana kobasica”, against potentially pathogenic bacteria, was investigated by agar diffusion method, microdilution method, crystal violet assay, Bradford method and Time-Kill analysis. Isolates belong to the species Lactobacillus sakei (M16, PF3, PF6, PF18, PF19), Lactobacillus curvatus PK4, Leuconostoc mesenteroides ssp. dextranicum (PK15, PK16A), Carnobacterium divergens PK3, Carnobacterium maltaromaticum M2 and Weissella viridescens M1. Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium and Bacillus cereus were used as indicator strains.
Accepted by the Scientific Board on, ASB: 05.09.2018.
Defended on, DE:
Defended Board, DB:
President: Dr Tatjana Mihajilov-Krstev
Member: Dr Zorica Stojanović-Radić
Member, Mentor: Dr Nataša Joković