Schizosaccharomyces pombe

• Schizosaccharomyces pombe (fission yesst)

• Oftast einlitna, sem auðveldar að sjá hvort stökkbreyting hefur orðið eða ekki.

Myndun þéttlittnis

• S.pombe inniheldur langa strngi þéttlittnis á litningsendum, við þráðhaft og á silent mating type svæðum.

• Myndun þéttlittnis á þessum stöðum krefst breytinga á litninu sem kallar síðan á tvö histónbindandi prótein, Swi6 sem er homólog við manna og bananaflugu HP1 próteinið, og Chp1

RNAi

• Þegar slökkt er á genum með RNAi leiðnni er notast við tvíþátta RNA (dsRNA)

• Dicer ensím klippir tvíþátta RNAið niður í stuttar raðir (um 22 núkleótíð).

• (siRNAs) hlaða sér síðan á prótein flóka sem kallast RISC (RNA induced silancing complex)

• Flókinn inni hleldur prótein úr Argonaute/PIWI fjölskyldunni sem sigtar út samsvarandi/samstofna mRNA og óvirkjar þau.

RNAi

• Þættir sem taka þátt í RNAi leiðinni í öðrum lífverum eru einngi nauðsynlegir í S.pombe,

• Úrfelling (deletion) á einhverjum þessara þátta eins og Dicer(dcr1+), Argonaute (ago1+) og RNA háðum RNA pólýmerasa (rdp1+) trufflar myndun þéttlittnis.

Stuðningur við kenningar um að RNAi taki þátt í myndun þéttlittnis.

• Báðir DNA þættir þráðhafts endurtekninga í S.pombe eru umritaðir og hafa fundist siRNAs sem passa við þráðhafts endurtekningarnar.

• Nýlegar tilraunir hafa gefið í skyn að tilbúin (gerð af manna höndum) dsRNA gerð úr hárlykkju cunstruct geti slökkt á hómólóg röðum með því að mynda þéttlitni þar sem RNAi er nauðsynlegt.

• Í þessar rannsókn er leytast við að svara þeirri lykil spurningu hvernig litill RNA mynduð út frá RNAi leiðinni koma af stað myndun þéttlitnis í fission yeast (klofnings gersvepum).

• Til að bera kensl á þá þætti sem eru mikilvægir í RNAi stýrðum tengslum við þéttlitnisflóka, var gengið út frá því að þessir þættir myndu virka snemma í myndun þéttlitnis

• Væru nauðsynlegir við þéttlitninssérhæfðar histón breytingar.

• Chp1 er binst þráðhafts endurtekningum og er nauðsynlegt fyrir methylleringu H3-K9(methyllering á lysin 9) og sem kallar síðan á Swi6.

• Til að kanna hvort Chp1 tæki þátt í tengslunum milli RNAi og myndun þéttlitnins var notast við TAP ( tandem affinity purification procidure)

• Gerðir voru stofnar sem framleiddu TAP merkt Chp1 til að bera kensl á þá þætti sem eiga samskipti við Chp1. Mynd 1

• Nokkrar prótein tegundir af stærðunum 65, 90, 100 og 120 kD voru sérstaklega hreinsluð úr Chp1-TAP stofnum

• Mass spectrometry á böndum teknum úr gelinu ásamt prótein mixture báru kensl á 120 og 100 kD böndin sem Chp1, 90 kD sem Ago1 og 65 kD bandið var áður óskylgreint prótein SPBC83.03c sem hópurinn skýrði Tas 3 (targeting complex subunit 3)

• Stærðinn á Chp1 böndunum var breytileg milli tilrauna sem gefur til kynna að 100 kD bandið sé niðbrots afurð Chp1

http://www.asms.org/whatisms/p4.html

• Til að komast að því hvort Chp1, Ago1 og Tas3 séu saman í próteinflóka var hannaður S.pombe stofn sem framleiddi flull virk Tas3-TAP prótein.

• Affinity purification og mass spectrometry squencing var sýnt fram á að Chp1 og Ago1 tengdust Tas3 Mynd 2

• Hreinsunartilraunir með Chp-TAP og Tas-TAP sýndu fram á að Chp1, Ago1 og Tas3 séu saman í próteinflóka sem hópurinn kallaði RITS.

• Sýnt hefur verið fram á að Chp1 og Ago1 ásamt annara þátta RNAi leiðarinnar taka þátt í myndun þéttlitnis og þögglun á reporter genum sem sett hafa verið sett inn á þéttlittnis svæðum.

• Í stofni þar sem tas3 hafði verið slegið út en innihélt ura4+ reporter gen á innermoste og outermoste þráðhaftsendurtekningasvæðum á litningi 1 var sýnt fram á að þögglun virkaði ekki á þessum reporter genum. Mynd 2 D á svipaðan hátt og þegar slökkt var á sir2, chp1 og ago1 genum.

• Enn frekar sýndi litnis immunoprecipitation fram á að Tas3 er nauðsynlegt fyrir methylleringu á H3-k9 og

• Swi6 staðsetningu á ura4+ geninu sem sett var inn á fyrrgreindum stöðum. Mynd 2 E.

litnis immunoprecipitation

• Próteinið látið bindast við DNA með formaldehyde.

• Litni einangrað• Mótefni, sértæk fyrir

próteinið.• Prótein hreinsað af• PCR og greining á DNA• Mynd.

www.biolynx.ca/promotions/chipit.html