sejtvonal specifikus monoklonalitÁs ...aok.pte.hu/docs/phd/file/dolgozatok/2010/jakso_pal_phd...a...
TRANSCRIPT
Doktori (PhD) értekezés
SEJTVONAL SPECIFIKUS MONOKLONALITÁS
VIZSGÁLATOK MIELODISZPLÁZIÁBAN ÉS MIELOPROLIFERATÍV BETEGSÉGEKBEN
Jáksó Pál
Doktori iskola: Klinikai Orvostudományok
Doktori Iskola vezetője: Dr. Komoly Sámuel
Program: Molekuláris pathomorfológia
Programvezető, témavezető: Dr. Pajor László
Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar
Pathologiai Intézet
Pécs, 2009.
1
TARTALOMJEGYZÉK
...........................................................................................................BEVEZETÉS 4
....................................................................................................CÉLKITŰZÉSEK 7
...Sejtvonal specifikus klonalitás vizsgálatok X kromoszóma inaktivációs esszével 8
..............................................Sejtvonal specifikus mikroszatellita-PCR vizsgálatok 11
...........................................Sejtvonal specifikus JAK2V617F mutációs vizsgálatok 13
.......................VIZSGÁLATI MINTÁK ÉS ALKALMAZOTT MÓDSZEREK 14
........................................................................................................Vizsgálati minták 14
..........................................................................Áramlási citometriás sejtszortírozás 15
..............................................................................................................DNS izolálás 17
...........................................................Humán androgén receptor esszé – HUMARA 18
...............................................................................Mikroszatellita-PCR vizsgálatok 22
.............................................................................JAK2V617F mutációs vizsgálatok 25
.......................................................................................................EREDMÉNYEK 27
A HUMARA kiértékelési kritériumainak, specifitásának és szenzitivitásának ............................................................................................................meghatározása 27
..........................................................................HUMARA – klonalitás eredmények 33
..............................................................................Mikroszatellita-PCR eredmények 36
...................................Párhuzamos HUMARA és mikroszatellita-PCR eredmények 40
.................................Párhuzamos JAK2V617F mutáció és HUMARA eredmények 42
.....................................................................................................MEGBESZÉLÉS 44
.....................................................................................................Irodalmi áttekintés 44
......................................................................................Saját eredmények értékelése 47
.............................................................................................................Összefoglalás 53
..........................................................ÚJ EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA 55
.................................................................................KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS 57
2
..........................................................................IRODALOMI HIVATKOZÁSOK 58
..................................AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁT KÉPEZŐ PUBLIKÁCIÓK 70
........................................................................................EGYÉB PUBLIKÁCIÓK 72
........................................................................................................RÖVIDÍTÉSEK 77
3
BEVEZETÉS
A neoplasztikus hematológiai betegségek patomechanizmusának
megértéséhez, megfelelő diagnosztikájához, valamint prognosztikus és terápiás
szempontból is fontos szempont, hogy az adott lézió a hemopoézis mely pontjáról
indul ki. Vagyis, hasznos annak megállapítása, hogy a betegség pluripotens, vagy
elkötelezett őssejt eredetű-e. A molekuláris patogenezisre vonatkozó ismereteket a
WHO klasszifikációja is alapelvként használja a neoplasztikus hematológiai
betegségek besorolásában. A tumor kiindulópontjának meghatározása segíthet annak
a kérdésnek a megválaszolásában, hogy a tüneti kezelésen túli, valódi gyógyulási
lehetőséget nyújtó, kuratív terápiaként alkalmazható-e kemoterápia, vagy csak az
allogén csontvelő transzplantáció jelentheti-e az egyedüli megoldást. Elkötelezett
őssejt eredetű betegség esetén a kemoterápia is eredményezhet teljes gyógyulást,
mivel ha a terápiával sikerül elpusztítani a tumoros elkötelezett őssejteket, akkor a
pluripotens őssejtekből még regenerálódhat a normális hemopoézis. Ezzel szemben,
ha pluripotens őssejt szintről indul ki a betegség, akkor célzott terápia hiányában a
teljes gyógyulás valószínűleg csak a összes hemopoetikus sejt elpusztításától
várható, amit viszont a terápia utáni idegen donoros csontvelő transzplantációnak
kell követnie a hemopoézis helyreállítása érdekében.
A különböző sejtvonalak érintettségének vizsgálatával, következtethetünk
arra, hogy a tumor a hemopoézis mely pontjáról indulhatott ki. Az egyes sejtvonalak
érintettségét igazolhatjuk többféle módszerrel. Egyrészt vizsgálhatunk betegségre
jellemző molekuláris eltéréseket (pl. pontmutációk, deléciók), másrészt
használhatunk klonalitás vizsgálatokat, amelyek egyúttal segíthetik a diagnózist is,
mivel a monoklonalitás kimutatása egyéb marker hiányában is a tumoros folyamat
lehetőségét támasztja alá.
A mielodiszpláziák (MDS) betegségcsoportja olyan klonális hematológiai
betegségeket foglal magába, amelyeket klinikai és morfológiai szempontból
ineffektív hemopoézis jellemez1-5. Ezek a betegségek egy krónikus jellegű
monoklonális proliferációval járó preneoplasztikus fázis után gyakran akut leukémiás
fázisba kerülnek. A WHO osztályozás6-7 a következő típusokat definiálja: refrakter
anémia (RA), RA ringed szideroblasztokkal (RARS), RA ringed szideroblasztokkal-
4
trombocitózissal (RARS-t), refrakter citopénia több sejtvonal diszpláziájával
(RCMD), refrakter citopénia több sejtvonal diszpláziájával és ringed
szideroblasztokkal (RCMD-RS), RA blaszt szaporulattal (RAEB-I. és RAEB-II.), 5q-
szindróma, és nem klasszifikálható MDS (MDS-u). A nemzetközi irodalom az MDS-
t hemopoetikus őssejt eredetű betegségnek tartja. Egyértelmű az álláspont abban a
tekintetben, hogy a hemopoézis mieloid vonala érintett és monoklonális
proliferációval jellemezhető. Ezzel szemben ellentmondóak az adatok abban a
tekintetben, hogy a limfoid vonal mennyire érintett a neoplasztikus folyamatban8-17 .
A mieloproliferatív neopláziák (MPN) a mieloid tumorok másik nagy
csoportját képezik. Ezekre a betegségekre a csontvelői sejtek abnormális, fokozott
proliferációja jellemző. Morfológiailag a különböző típusokban más-más sejtvonal
dominál, de bizonyított, hogy több csontvelői sejtvonal is érintett az abnormális
proliferációban kisebb-nagyobb mértékben. A WHO osztályozás6-7 szerinti altípusok
a következők: krónikus mieloid leukémia (CML) (Ph-kromoszóma pozitív),
elsődleges mielofibrózis (PMF), policitémia vera (PV), esszenciális trombocitémia
(ET), hízósejtes betegség (MCD), krónikus neutrofil-sejtes leukémia (CNL), nem
kategorizálható krónikus eozinofil-sejtes leukémia (CEL-NOC), hipereozinofiliás
szindróma (HES) és a nem klasszifikálható mieloproliferatív betegségek (MPN-u).
A korábbi, 2001-es WHO besorolás szerint még a mieloproliferatív betegségek közé
sorolt és molekuláris eltéréssel rendelkező eozinofíliákat új csoportként definiálták:
eozinofíliával járó mieloid neopláziák PDGFRA, PDGFRB, vagy FGFR1
abnormalitással. Az MPN-eket is elsősorban őssejtbetegségnek tarják, de az egyes
sejtvonalakat érintő molekuláris klonalitási vizsgálatok az MDS-hez hasonlóan
ebben a betegség csoportban sem egyértelműek a limfoid vonal érintettsége
szempontjából8-10, 18-26.
A hagyományos morfológiai, citológiai vizsgálatok nagy segítséget nyújtanak
az egyes sejtvonalak érintettségének meghatározásában, de egyértelmű bizonyítékot
nem tudnak szolgáltatni morfológiai jelek hiánya esetén. A tumorokra jellemző
genetikai aberrációk vizsgálatához citogenetikai, illetve molekuláris genetikai
módszerek szükségesek. Ezen technikák segítségével a daganatos betegségek kiváltó
okainak közvetlen vizsgálata lehetséges. Különböző genetikai aberrációk ismertek
mindkét fenti betegségcsoportban6-7, de ezek előfordulása alacsony, így ezekben a
5
betegségekben kevés jól használható patognomikus genetikai markert ismerünk.
Kivételt képez a CML, amely esetében a jelenlévő Philadelphia-kromoszóma
diagnosztikus kritérium, illetve a JAK2V617F pontmutáció, amely 50-95%-ban
fordulhat elő MPN-ken belül PV-ben, PMF-ben és ET-ben, ill. a mielodiszpláziák
egy altípusában, RARS-t-ben.27-29. Az eddigi irodalmi adatok alapján egyéb genetikai
rendellenességek is ismertek ezen betegségek de novo formájában, pl. a 20-as
kromoszóma hosszú karjának deléciója, ami mindössze az esetek kb. 10-15 %-ában
fordul elő policitémia vera-ban, valamint hasonló előfordulást mutat az 5q deléció
MDS-ben. A többi genetikai aberráció ezekben a betegségekben ritkábban fordul elő,
mint pl. a 8-as, 9-es, 1-es kromoszómák triszómiája, 7-es monoszómia és még
ritkábbak a del(13q), del(11q), del(12p), -Y, +6, +13, +21. Kivételt képez a terápia-
indukált MDS-ek csoportja, ahol a del(5q) az 50%-os gyakoriságot is elérheti6,7,30.
Az újabban felfedezett molekuláris eltérések közé tartoznak 5% alatti előfordulással
a JAK2V617F negatív PV-ben a JAK2 gén 12-es exonjában előforduló
pontmutációk, valamint PMF-ben és ET-ben az MPLW515L/K mutációk 31-35.
6
CÉLKITŰZÉSEK
Vizsgálataink elsődleges célja az volt, hogy az egyes sejtvonalak
érintettségének vizsgálatán keresztül megállapítsuk, hogy MDS-ben és MPN-ben a
betegség a hemopoézis melyik stádiumából indulhat ki. Feltételeztük, hogy ha csak
mieloid érintettséget találunk, akkor valószínűleg mieloid irányban elkötelezett
őssejtből indul ki a betegség. Ha viszont limfoid érintettség is előfordul, akkor
pluripotens őssejt eredet lehet a háttérben. A sejtvonal érintettség megállapításához
három módszert használtunk fel. Elsőként, genetikai markertől független, klonalitás
vizsgálatára alkalmas HUMARA (human androgen receptor assay) X kromoszóma
inaktivációs esszét használtunk fel, áramlási citometriásan szortírozott limfoid és
mieloid sejteken. A második módszer a del(20q) és del(5q) vizsgálata volt
mikroszatellita-PCR (MS-PCR) technika segítségével, szintén szortírozott
sejtvonalakon. A sejtvonal érintettségen túl az MS-PCR vizsgálatokkal arra is választ
kerestünk, hogy a hagyományos metafázis citogenetikánál jóval kisebb deléciók
kimutatására alkalmas MS-PCR technikával sikerül-e a fent említett előfordulási
arányoknál magasabb százalékban kimutatni ezeket a deléciókat. Végül szintén
sejtvonal specifikusan vizsgáltuk a JAK2V617F pontmutáció jelenlétét MPN-es
betegekben mutáció-specifikus PCR technika segítségével.
7
Sejtvonal specifikus klonalitás vizsgálatok X kromoszóma inaktivációs esszével
A nőkben bekövetkező X kromoszóma inaktiváció (XI) folyamata jól ismert
jelenség. Ennek során az ún. Lyon hipotézis36-39 szerint a korai embriogenezis során,
feltehetően a késői blasztociszta stádiumban, komplex szabályozási mechanizmusok
hatására az X kromoszóma inaktiváció sejtenként véletlenszerűen érinti a két X
kromoszóma egyikét. A későbbi mitózisok alkalmával az utódsejtekben az
inaktivációs mintázat stabilan továbbadódik. Ennek következtében a női szervezet
sejtjei mozaicitást mutatnak abban a tekintetben, hogy a testi sejtekben felváltva hol
az anyai, hol az apai X kromoszóma inaktivált. Ideális esetben a két X kromoszóma
50-50%-ban aktív ill. inaktív.
Monoklonális proliferáció esetén azonban, pl. tumorokban, az összes sejt a
kiindulási klón inaktivációs mintázatát fogja hordozni. Ennek a jelenségnek a legelső
felhasználása klonalitás vizsgálatára tumorokban, Gartler és Linder nevéhez
fűződik40, akik az X kromoszómán kódolt glükóz-6-foszfát dehidrogenáz (G6PD)
izoenzimek expresszióját használták fel a két X kromoszóma megkülönböztetésére.
Ugyanezzel a módszerrel mutatták ki Fialkow és munkatársai, hogy a CML, PV és
ET klonális betegségek és hemopoetikus őssejtből indulnak ki41-43. Később jóval
elterjedtebbé vált az ún. short tandem repeat polimorfizmusok (STRP) és restrikciós
fragment hosszúság polimorfizmusok (RFLP) használata, valamint ezek metilációs
mintázatának vizsgálata. Elsőként Vogelstein és munkatársai írták le a hipoxantin-
guanin foszforiboziltranszferáz (HPRT) gén ilyen irányú felhasználását, majd
további lókuszok is bekerültek az X kromoszóma inaktivációs vizsgálatok
repertoárjába: a foszfoglicerát kináz (PGK) gén; egy nem expresszálódó lókusz a
DXS225 (más néven: M27β); a palmytoilated membrane protein (p55) génben és az
iduronát-2-szulfatáz (IDS) génben előforduló polimorf szakaszok; legújabban pedig
a humán androgén receptor gén8, 44-48. Mivel ezek a polimorf szekvenciák az
inaktivációnak megfelelően metilálódnak, ezért metilációs státuszuk vizsgálatával
következtetni lehet arra, hogy a két X kromoszóma egyenlő arányban inaktiválódik-e
vagy sem. Metodikai szempontból a különböző módszereknek vannak előnyei és
hátrányai is. Az egyik legfontosabb szempont a módszer kiválasztásánál a
polimorfizmus mértéke, ami az informatív vizsgálatok arányát határozza meg. Ebből
8
a szempontból a PGK és HPRT gének vizsgálatán alapuló tanulmányok együttesen is
csak 50%-ban informatívak. Sokkal jobb ebből a szempontból az M27β, amely 90%-
ban ad informatív eredményt, viszont tumorokban gyakran hipermetilált, így nem
megbízható markere az X-inaktivációnak. A leghasználhatóbb módszer ebből a
szempontból a humán androgén receptor génre épülő HUMARA, amely közel 90%-
ban informatív és metilációja megbízhatóan tükrözi az X-inaktivációt. Mindezek a
módszerek a DNS metiláció-szenzitív restrikciós emésztését használják fel a
metilációs státusz vizsgálatához, amely azonban magában hordozza a részleges
emésztés lehetőségét. Az ebből adódó bizonytalanságot küszöbölik ki az RNS alapú
módszerek, amelyek a valódi X-inaktivációt mutatják. Ilyen, expresszió alapú
vizsgálatokat dolgoztak ki a p55, IDS, és PGK esetében, amelyek esetében azonban
heterozigozitás alacsony (50% alatti), így csak az esetek kis részében használhatók44,
48,49. Leírták a HUMARA expressziós változatát is47,49, amelynek azonban az
alkalmazhatóságát nagyban befolyásolja a gén expressziója, ami tumoronként és
szövetenként is igen változó, így ma, a leggyakrabban alkalmazott X inaktivációs
vizsgálati módszer mégis a DNS alapú HUMARA.
A HUMARA módszer esetében, azonban több tanulmány felveti egy
bizonytalansági tényező jelenlétét. Ez pedig a nem véletlenszerű X-inaktiváció (non-
random X-inactivation - fNRXI). Ez azt jelenti, hogy egészséges nőkben is előfordul
az elméleti 50-50%-os inaktivációs arányoktól való eltérés, amely utánozhatja a
monoklonalitást. Champion és munkatársai tanulmányában50 egészséges nők
vizsgálata során ezt elsősorban idősebb nők esetében találták jellemzőnek. Mivel az
MPN és MDS elsősorban idős korban jelentkező és manifesztálódó betegségek, ezért
arra hívják fel a figyelmet, hogy ezekben a betegségekben a HUMARA használata
megfelelő óvatosságot igényel. Ezzel szemben olyan közlemény is van, amelyben
nagyszámú egészséges nő vizsgálata során nem találtak összefüggést az életkor és az
NRXI között51. Több tanulmány veti fel, hogy az esetleges NRXI kiküszöbölésére,
valamilyen kontroll szövet alkalmazása lenne hasznos, amihez viszonyítani lehetne a
két androgén receptor allél inaktivációjának arányát45,46,52,53. Ebben a kérdésben sincs
konszenzus. Alapvetően olyan kontroll szövetre lenne szükség a beteg személytől,
amely biztosan nem érintett a hematológiai tumorban. A kérdést tovább bonyolítja,
hogy Gale és munkatársai46 arról számolnak be, hogy a NRXI jelensége nem
9
egyformán jelentkezik a különböző szövetekben. Ezért több kutató azt javasolja,
hogy minél “közelebbi rokonságban” lévő szövetet lenne célszerű alkalmazni
kontrollként. El-Kassar és munkatársai53 ET-s betegek sejtvonal érintettségének
tanulmányozása során T-limfocitákat javasolják kontroll céljára. Azonban ez a
megközelítés alapvetően kizárja annak a lehetőségét, hogy feltételezzük a T-sejtek
involvációját a tumoros folyamatban.
Vizsgálatainkhoz a fentiekben ismertetett előnyök és hátrányok mérlegelése
után, a DNS alapú HUMARA-t használtuk fel klonalitás megállapítására áramlási
citometriával szortírozott limfoid és mieloid sejtekben. A HUMARA eredmények
megfelelő értékeléséhez kontrolltól független, sejtvonal specifikus kritériumokat
dolgoztunk ki. Továbbá teszteltük módszer korlátait a specificitás és érzékenység
tekintetében.
10
Sejtvonal specifikus mikroszatellita-PCR vizsgálatok
A genomban előforduló mikroszatellita régiók (<200bp) 1-4 bázispárnyi
ismétlődésekként fordulnak elő. Az ismétlődések száma általában nagyon változó,
vagyis a mikroszatellita szakaszok nagyon polimorfak. Egy ilyen mikroszatellita
régiót tartalmazó szekvencia PCR technikával történő amplifikációja és
elektroforézise után, elkülöníthető egy adott allél apai és anyai változata az
ismétlődés-számok eltérése alapján. Tumorok vizsgálata során, a genomban ismert
helyzetű mikroszatellita régiók felhasználhatók az adott lókusz deléciójának, ill.
amplifikációjának vizsgálatára, ugyanis a mikroszatellita régiók PCR amplifikációját
követően a termékek mennyiségének kvantitálásával következtetni lehet a két allél
előfordulására 54,55. Ennek megfelelően deléció esetén, ha a vizsgált sejtek
mindegyikében bekövetkezik a deléció és a homológ kromoszómapárnak csak egyik
tagját érinti, akkor csak egy allélt detektálhatunk. Ha a deléciót hordozó sejtek
mellett normál sejtek is vannak a mintában, vagy az egyik allél amplifikációja
következik be, akkor a két allél mennyiségi aránya (gyakorisága) megváltozik a
normál 1-1 arányhoz képest és allélikus kiegyensúlyozatlanságot (allelic imbalance -
AI) okoz. Természetesen ilyen vizsgálatok esetében mindig szükség van ugyanazon
személy egészséges szövetéből származó kontrollra, amihez a tumorból kapott allél
arányokat viszonyítani lehet.
A tanulmányban az MPN-ben leírt, leggyakoribb genetikai aberrációnak
tartott 20q deléciót56-60, illetve MDS-ben szintén a leggyakoribb defektusok közé
tartozó 5q deléciót61-63 vizsgáltuk áramlási citometriával szortírozott limfoid és
mieloid sejteken MS-PCR technikával. Mindkét deléciónál az irodalmi adatoknak
megfelelően választottuk ki az alkalmazott mikroszatellita markereket, úgy hogy
azok a leggyakrabban deletált szakaszokon (common deleted region - CDR)
helyezkedjenek el. Green58 és Le Beau59 munkacsoportja végeztek úttörő munkát a
deletálódó 20q régió minél pontosabb feltérképezésében és a CDR-t kb. 250 kb-ra
szűkítették le. A del(20q) CDR területén több gén és ismeretlen funkciójú
expresszálódó szekvencia is található, köztük pl. a KRS2 gén, amely egy szerin-
treonin kinázt kódol és apoptózis szabályozásban játszik szerepet. Egy ilyen gén
defektusa vezethet apoptózis deregulációhoz, amelynek sok tumor kialakulásában
11
bizonyított szerepe van. Hasonló vizsgálatok zajlottak az del(5q) CDR
feltérképezésével kapcsolatban is. Horrigan és munkatársai61 kb. 700 kb-ra
szűkítették le a régiót, amelyben 9 gént és 5 ismeretlen funkciójú expresszálódó
szekvenciát azonosítottak. Vizsgálatainkban a két CDR-ből a 20q11.2-q13.2 régiót
vizsgáltuk a D20S607, D20S170, D20S110, D20S96 és D20S119 lókuszokon,
valamint az 5q31 régióban a D5S476 és D5S414 lókuszokat.
12
Sejtvonal specifikus JAK2V617F mutációs vizsgálatok
2005-ben több egymástól független publikációban írták le először a JAK2 gén
V617F mutációját krónikus mieloproliferatív betegségekben64-68. A JAK2 fehérje a
kulcsszerepet tölt be a sejtnövekedést és differenciációt szabályozó JAK-STAT
jelátviteli folyamatokban. A mutáció következtében a 9-es kromoszóma rövid karján
elhelyezkedő, tirozin-kinázt kódoló JAK2 gén 14-es exonjában egy G>T báziscsere
következik be (1. ábra). A pontmutáció a JAK2 fehérjében valin-fenilalanin
aminosav cserét okoz a 617-es pozícióban, a protein pszeudokináz doménjében. A
mutált JAK2 fehérje konstitutív tirozin-kináz aktivitást, ill. hiperszenzitivitást mutat
az őt aktiváló szignálokkal szemben29,32,69-74.
1. ábra. A JAK2 gén szerkezete. A piros nyíl mutatja a pontmutáció helyét.
A JAK2V617F mutáció a szakirodalom szerint MPN-eken belül PV-ben
90-95%, PMF-ben 55-60% és ET-ben 50% gyakorisággal, illetve a mielodiszpláziák
egy ritka szubtípusában RARS-t-ben, 50% körüli gyakorisággal fordul elő 74 . 2007-
ben a Clinical Advisory Committee for the revision of the WHO Classification of the
Myeloid Neoplasms azt javasolta, hogy a JAK2V617F mutáció előfordulása
szerepeljen major kritériumként a krónikus mieloproliferatív betegségek
diagnosztikájában31. Végül a legfrissebb 2008-ban kiadott WHO klasszifikációba ezt
a javaslatot be is építették 7.
Áramlási citometriásan szortírozott MPN-es betegek mintáiban
megvizsgáltuk a JAK2V617F mutáció jelenlétét sejtvonal specifikusan limfoid és
mieloid sejtekben. A vizsgálatokat a JAK2V617F mutációra specifikus primert
alkalmazó PCR segítségével végeztük.
13
VIZSGÁLATI MINTÁK ÉS ALKALMAZOTT MÓDSZEREK
Vizsgálati minták
A vizsgálati minták MDS-sel és MPN-nel diagnosztizált betegek EDTA-val
alvadásgátolt perifériás vér és csontvelő aspirátum mintái voltak. Az eseteket a WHO
klasszifikáció alapján, a klinikai és patológiai diagnózis egybevetése után soroltuk be
a megfelelő betegségcsoportba. Az MS-PCR vizsgálatokhoz egészséges szövetből
származó kontroll mintaként szájnyálkahártya kaparékot gyűjtöttünk a betegektől. A
HUMARA kiértékelési kritériumainak meghatározásához 27 egészséges nő és 4 B-
sejtes krónikus limfoid leukémiás (B-CLL) nő EDTA-val alvadásgátolt perifériás vér
mintáját is felhasználtuk. MS-PCR és JAK2V617F mutációs vizsgálatokhoz a fenti
női mintákon túl férfi betegekből is gyűjtöttünk mintát.
A HUMARA-hoz 143 nőbetegtől gyűjtöttünk mintákat és végeztük el
a vizsgálatokat. Százhárom MPN-es betegből 34 nem volt informatív, a vizsgált
androgén receptor allélek homozigozitása, vagy a két allél túl kicsi méretkülönbsége
miatt. A 69 informatív eset betegség típus szerinti megoszlása a következő volt: 34
ET, 10 PV, 2 PMF és 15 MPN-u, 8 HES. Negyven MDS-es betegből 11 nem volt
informatív. A 29 informatív eset megoszlása 6 MDS-RA, 3 MDS-RAEB, 3 MDS-ből
transzformálódott AML és 17 MDS-u volt.
35 esetben végeztünk MS-PCR-t, amiből 20 esetben párhuzamos HUMARA
vizsgálatok is készültek. Hét MDS-u, 4 MDS-RA, 1 MDS-RAEB, 2 MPN-PV, 2
MPN-PMF, 9 MPN-ET, 5 MPN-u, 4 MPN-HES, és 1 MPN/MDS-CMML volt az
MS-PCR vizsgálatokban a betegség szerinti megoszlás.
27 MPN esetben készült JAK2V617F mutáció vizsgálat, amiből tizenkettőt
párhuzamosan végeztünk a HUMARA-val. Hat PMF, 9 PV, 12 ET és 1 MPN-u volt
a betegség szerinti megoszlás.
Az összes vizsgálatot áramlási citometriásan szortírozott sejteken végeztük. A
betegek életkora 12 és 82 év közé esett.
14
Áramlási citometriás sejtszortírozás
A vér és csontvelő mintákból áramlási citométerrel szortíroztunk limfoid és
mieloid sejteket. Az HES esetekben a limfoid és mieloid sejteken kívül eozinofil
sejteket is szortíroztunk. Egy MDS-RAEB esetben blasztokat is szortíroztunk. A
szortírozás alapja a sejtek CD45 expressziójának intenzitása és granularitása volt.
Ezen két paraméter alapján egy kétdimenziós diagrammon jól meghatározott
mintázat szerint elkülöníthetők a limfoid sejtek (magas CD45 expresszió és
kismértékű granularitás), mieloid sejtek (közepes CD45 expresszió és közepes-
magas granularitás), eozinofil sejtek (magas autofluoreszcencia a zöld FL1 és
narancs FL2 csatornában, valamint magas granularitás) és a blasztok (közepes CD45
expresszió és alacsony-közepes granularitás). A 2. ábrán példaként a mieloid sejtek
szortírozás előtti és utáni áramlási citometriás diagrammja látható. A HUMARA
módszer szenzitivitásának meghatározásához, B-CLL-es betegekből CD5/CD23,
vagy CD5/CD19 kettős pozitív monoklonális limfóma sejtek és poliklonális mieloid
sejtek meghatározott arányú keverékeit szortíroztuk egy lépésben: 100% CLL,
75-80% CLL + 20-25% mieloid, 50% CLL + 50% mieloid, 20-25% CLL + 75-80%
mieloid and 100% mieloid. A keverési arányt a limfóma és mieloid kapuk
pozícionálásával állítottuk be a szortírozás kezdetekor, majd a áramlási citométert
vezérlő programban szortírozás közben folyamatosan ellenőriztük.
15
2. ábra. Mieloid sejtek áramlási citometriás szortírozása. A különböző színnel
jelzett régiók mellett a bennük előforduló sejtek százalékos aránya van feltüntetve.
A CD5, CD19, CD23 és CD45 immunjelöléseket CD5-FITC, CD23-RPE,
CD19-RPE-Cy5 és CD45-RPE-Cy5 (DAKO A/S, Denmark) antitestekkel végeztük a
gyártó instrukcióinak megfelelően. A szortírozást BD FACSort típusú áramlási
citométerrel végeztük (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA,
USA). Betegenként általában 105 sejtet szortíroztunk sejtvonalanként. A szortírozott
minták tisztasága a szortírozni kívánt sejtek tekintetében áramlási citometriás
visszamérés alapján 95%-nál nagyobb volt. A szortírozott sejteket 500 µl TE8
pufferben, ill. 200 µl PBS-ben –20°C-on lefagyasztva tároltuk a DNS izolálásáig.
16
DNS izolálás
A szortírozott sejtekből proteináz-K-s emésztés és fenol-kloroformos
extrahálás módszerével, illetve Qiagen Blood Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)
segítségével nyertünk DNS-t. A fenol-kloroformos izolálás során 500 µl TE8
pufferben lefagyasztott sejtekhez 10mg/ml koncentrációban adtunk proteináz-K-t és
SDS-t (1% végkoncentráció), majd 56°C-on éjszakán át emésztettük. Ezután azonos
térfogatú fenollal, majd kloroformmal extraháltuk a DNS-t, végül a vizes fázisból
2,5-szeres térfogatú 100%-os etanollal kicsaptuk, majd centrifugálás és szárítás után
TE8 pufferben oldottuk fel úgy, hogy a szortírozott sejtszámot figyelembe véve kb.
3000 sejtnek megfelelő DNS legyen 1 µl-ben. A PBS-ben lefagyasztott szortírozott
sejtminták esetében a DNS izolálást a Qiagen Blood Mini kittel végeztük a gyártó
előírásának megfelelően és végül a DNS-t 50 µl AE pufferben tároltuk. A DNS
mintákat +4°C-on tároltuk felhasználásig, majd -20°C-on archiváltuk.
17
Humán androgén receptor esszé – HUMARA
Az esszé az egyik X kromoszóma inaktivációjan alapul és nők esetében
alkalmas specifikus genetikai marker néküli monoklonalitás vizsgálatra45. A módszer
egy metiláció-szenzitív restrikciós emésztést és egy PCR reakciót kombinál. A
vizsgált androgén receptor szekvencia egy mikroszatellita régiót tartalmaz, amelyben
CAG trinukleotid ismétlődések vannak. Az ismétlődések száma változó és kb. 90%-
os a valószínűsége, hogy az apai és anyai X kromoszómán a CAG ismétlődések
száma eltér. Az eltérő ismétlődésszám következtében a vizsgált androgén receptor
allél heterozigozitást mutat. Az X kromoszóma inaktivációja metilációval történik,
aminek megfelelően az aktív X kromoszóma hipometilált, míg az inaktív
hipermetilált. A vizsgált szekvencia tartalmaz metilációs pontokat, amelyeket
metilációs státusztól függően metiláció-szenzitív HhaI, ill. HpaII restrikciós
enzimekkel hasítani lehet, vagy sem. Heterozigóta nőkben, metiláció-szenzitív
hasítás nélkül két eltérő hosszúságú androgén receptor szekvenciát (kb. 220 bp)
amplifikálunk PCR-rel, míg a homozigóta nők mintái nem informatívak, mert nem
különíthető el az apai és az anyai X kromoszómának megfelelő allél egymástól,
ezáltal a poliklonális és monoklonális minták sem – ezt szemlélteti az alábbi 3. ábra.
3. ábra. Androgén receptor PCR metiláció-szenzitív hasítás nélkül.
18
Normál női szövet poliklonális sejtjeiben az X-inaktiváció véletlenszerű, vagyis
elvileg a sejtek 50-50%-ban egyik, vagy a másik X kromoszómát hordozzák aktív
(metiláció-szenzitív enzimekkel hasítható) formában. Ha egy heterozigóta nő,
poliklonális szöveti sejtjeiből végezzük el a metiláció-szenzitív hasítást és ezt
követően a PCR amplifikációt, akkor kétféle mólsúlyú terméket fogunk látni a gélen,
mivel mindkét X kromoszómából marad nem hasított, amplifikálható templát.
Monoklonális proliferáció esetén a tumoros klónból származó sejtek azonos
metilációs mintázatot hordoznak, tehát minden sejtben ugyanaz az X kromoszóma
hasítódik a metiláció-szenzitív enzimekkel. A hasítás után a PCR csak az egyik allélt
tudja amplifikálni, ennek következtében csak egy sávot kapunk az elektroforézis
után. Ez alapján a mintát monoklonálisnak tekinthetjük. A 4. ábra szemlélteti a
restrikciós emésztéssel kombinált PCR reakciót monokonális és poliklonális minták
esetén.
4. ábra. HUMARA: metiláció-szenzitív emésztés és PCR.
A PCR reakciót az Allen és munkatársai által leírt protokoll45 alapján
dolgoztuk ki, néhány ponton módosítva azt. Első lépésben kb. 10000 sejtnek
megfelelő DNS-t emésztettünk 10U HhaI enzimmel Multi-Core pufferben (Promega,
Madison, WI, USA) 0,1mg/ml BSA jelenlétében 20µl térfogatban. Az emésztést
37°C-on, éjszakán át történő inkubálással végeztük. Emésztés után a DNS-t 2,5-
19
szeres térfogatú etanollal kicsaptuk és szárítás után 10 µl desztillált vízben feloldva
vittük a PCR reakcióba.
A 20 µl térfogatú PCR reakcióelegy 10 µl vízben oldott DNS-en túl
tartalmazott 200 µM-t minden dNTP-ből (GibcoBRL, Invitrogen Corporation,
Carlsbad, CA, USA), 0,5 egységnyi RedTaq DNS polimerázt (Sigma, St. Louis,
Missouri, USA), RedTaq puffert és 10 pmol-t mindegyik primerből (5' GCT GTG
AAG GTT GCT GTT CCT C 3', 5' AGA GGC CGC GAG CGC AGC ACC TC 3').
Az amplifikációt MJR Minicycler (MJ Research, Watertown, Massachusetts, USA),
ill. BioRad iCycler (BioRad Laboratiories, Hercules, CA, USA) PCR készülékkel
végeztük a következő programot használva: elődenaturáció: 94°C 5 perc; 40 ciklus
denaturació: 94°C 40 mp., primer kapcsolódás: 68°C 40 mp., extenzió: 72°C 1 perc;
végső elongáció: 72°C 5 perc.
Amplifikáció után a teljes 20 µl PCR elegyet felvittük 8%-os, nem denaturáló
poliakrilamid gélre és 120V-on, 25 mA mellett éjszakán át futtatuk, addig amíg a
jelzőfestékként használt xilén-cianol a 24 cm hosszú gél aljára nem ért. A gélt SYBR
Gold DNS festékkel (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) festettük a gyártó által előírt
koncentrációban, végül UV transzilluminátort használva polaroid, vagy digitális
kamerával lefényképeztük. Polaroid képek esetén a fotót szkenner segítségével
digitalizáltuk.
Azokban az informatív esetekben, ahol az emésztést követően mindkét
allélről történt amplifikáció, a gélfotókat az ImageJ 1.4 program segítségével
denzitometráltuk. Azokat a mintákat, amelyekben a PCR 100%-ban csak az egyik
allélt tudta amplifikálni és így a fotón csak az egyik allélnek megfelelő sáv volt jelen,
denzitometrálás nélkül is monoklonálisnak fogadtuk el.
20
A B
5. ábra. HUMARA gélfotók. L: limfoid, M: mieloid, +: HhaI-gyel emésztett minta,
-: HhaI-gyel nem emésztett minta.
Az 5. ábrán látható gélfotókon az A esetben csak az M+ mintában csökkent
jelentősen az egyik allél mennyisége, így csak a mieloid sejtek tekinthetők
monoklonálisnak. A B esetben az L+ és M+ mintákban is csak az egyik allélnek
megfelelő sáv látható, ezért mindkét sejtvonal sejtjei monoklonálisak.
A minták jelentős részében azonban nem egyértelmű az egyik allél arányának
nagy mértékű csökkennése, ezért ezeket a mintákat csak denzitometriás analízis
alapján tudtuk besorolni poliklonális, ill. monoklonális kategóriákba. A nemzetközi
irodalomban gyakran alkalmazott kritérium szerint, ha a két allél aránya legalább
3:1, vagy ennél jobban eltérő, akkor a minta monoklonálisnak tekinthető44,52,75.
Viszont több tanulmányban is kimutatták, hogy egészséges nőkben is eltérhetnek az
allélarányok az 1:1-től és a 3:1 arány sem mindig jelent megbízható kritériumot a
monoklonalitás megállapítására37,44,51. Annak érdekében, hogy megfelelően
specifikus legyen a módszerünk, saját kritériumokat dolgoztunk ki a HUMARA
eredmények kiértékelésére, amihez egészséges nők véréből szortírozott limfoid és
mieloid sejteken is elvégeztük a HUMARA-t. A módszer szenzitivitásának
megállapításához a HUMARA-t teszteltük B-CLL-es betegekből szortírozott
monoklonális limfóma sejtek és poliklonális mieloid sejtek ismert arányú keverékein
is, hogy megállapítsuk mi az a minimális monoklonális sejtarány, aminél a
HUMARA még ki tudja mutatni a monoklonalitást.
21
Mikroszatellita-PCR vizsgálatok
Ezeket a vizsgálatokat 1999-2000-ben kollaborációban végeztük a
Heidelbergi Egyetemen Prof. Dr. Kovács Gyula laboratóriumában. A PCR
amplifikációk MJR PTC-100 és PTC-200 típusú (MJ Research, Watertown,
Massachusetts, USA) PCR készülékeken történtek a következő programot használva:
elődenaturáció: 94°C 2 perc; 35 ciklus denaturáció: 94°C 40 mp., primer
kapcsolódás: 55°C 30 mp., extenzió: 72°C 40 mp.; végső elongáció: 72°C 5 perc. A
PCR reakcióelegy tartalmazott kb. 10000 sejtnek megfelelő DNS-t, 0,5 egységnyi
Taq polymerase-t (GibcoBRL, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA), 50mM
KCl-ot, 10 mM TRIS-t (pH:8,3), 1,5mM MgCl2-ot, 200 µM-t mindegyik dNTP-ből,
és 5-5 pmol primert. Az egyik primer mindig jelölve volt Cy5 fluoreszcens festékkel
(MWG-BIOTECH AG, Ebersberg, Germany). A következő primereket használtuk:
D20S607: AAA ATG TCC AGG CAA CAG AG és ATT GAC AAA TTT CTG GGC
TG; D20S170: TTC TCA GGC TCC TGG C és GGG GGC TTC CAT GAG T;
D20S96: CAC TGC AAC TCT AAC CTG GG és CCT GTA TGC TGC ATT TCC
TG; D20S119: CTG ACA CAG TTT CAG TAT CTC TAT C és TTT CCA GAT TTA
GGG GTG TAT G; D20S110: TTG ACA GCC AAA TGA ATT TA és CTA GAC
TTA GGT TGA CAT TCT CG; D5S414: GGC CAG TTC AGT CAA GTG és TGG
TTC CAG CAT ATA GCG; D5S479: GCA ATA GCA AGA CTC TGA CC és TTC
CTG TGT GCC TTA CAG TT. A primer szekvenciákat a Whitehead Institute Center
for Genome Research (http://www-genome.wi.mit.edu/) és a The Genome Database
(http://gdbwww.dkfz-heidelberg.de/) web-es adatbázisából választottuk. A fenti
mikrolszatelliták adatai jelenleg ellenőrizhetők a http://www.ensembl.org/
Homo_sapiens/Info/Index címen, elhelyezkedésük pedig 6. ábrán látható.
22
D20S607 D20S170 D20S110 D20S96 D20S119
D5S476 D5S414
6. ábra. A vizsgált mikroszatellita lókuszok elhelyezkedése a kromoszómákon.
A PCR reakciók termékeinek detektálását és kvantitálását ALFexpress DNA
Analysis System (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ, USA) típusú
automata DNS szekvenáló készülékkel végeztük 5%-os denaturáló poliakrilamid
gélen futtatva a termékeket, 1500 V, 38 mA, 15W, 55°C paraméterek mellett. A
kiértékelést a készülék szoftvere által készített denzitometriás görbék alapján
végeztük. Az egyes alléleknek megfelelő csúcsok jelenléte, illetve területe alapján
(7. ábra) értékeltük a mintákat, majd megtartott (retained-R), deletált (D), és allélikus
kiegyensúlyozatlanságot (allelic imbalance-AI) kategóriákba soroltuk. A
kategóriákba soroláshoz egy 0-tól 4-ig terjedő skálát használtunk. Nulla értéket,
vagyis R besorolást kaptak a kontroll szájnyálkahártyával megegyező minták.
Négyes, vagyis D besorolást azok a minták, amelyekben az egyik allél teljesen
23
elveszett. Az AI kategóriában kettes értéket kapott egy minta, ha a kontrollban
látható csúcshoz képest a mintában a deletálódó allélnek megfelelő csúcs relatív
aránya kb. 50%-ra csökkent a kotrolléhoz képest. Ezt a következőképpen számoltuk
ki:
1. egy mintán belül a csúcsok százalékos arányát az egyes csúcsok területe és két
csúcs területének összegének hányadosával kaptuk meg.
2. A vizsgált mintákban kontrollhoz képest csökkenő csúcs (deletálódó allél)
százalékos arányát elosztottuk a kontrollban ugyanezen allél százalékos arányával.
Hármas AI értéket adtunk egy mintának, ha 50%-nál jelentősen nagyobb volt a
relatív allélarány eltolódás, de nem volt teljes deléció. Egyes AI értéket kapott a
minta, ha 50%-nál jelentősen kevesebb volt az allélarány eltolódás. A PCR reakció és
a fluoreszcens detektálás pontatlansága miatt az AI 1-es besorolást, csak akkor
tekintettük egy mintában elfogadhatónak, ha legalább 2 lókuszon is előfordult
párhuzamosan. A fenti MS-PCR értékelési rendszert Langbein és munkatársai cikke
nyomán alkalmaztuk76.
7. ábra. MS-PCR görbék. Az A és B ábrákon két beteg mintái láthatók.
Mindkét esetben felül van a kontroll szájnyálkahártya (SZ), középen a limfoid (L) és
alul a mieloid (M) sejtek görbéje. Az A ábrán a limfoid és mieloid sejtvonalban is
megtartott (R) a mikrolszatellita allélek aránya. A B ábrán a limfoid sejtek allélikus
kiegyensúlyozatlanságot (AI) mutatnak, míg a mieloidokban teljes deléció (D)
látható.
24
JAK2V617F mutációs vizsgálatok
Baxter és munkatársai67 leírása alapján a következő PCR primereket használtuk (8.
ábra): mutáns allélre specifikus forward primer (5’AGC ATT TGG TTT TAA ATT
ATG GAG TAT ATT3’), belső kontrollként alkalmazott forward primer (5’ATC TAT
AGT CAT GCT GAA AGT AGG AGA AAG3’), és egy közös reverz primer (5’CTG
AAT AGT CCT ACA GTG TTT TCA GTT TCA3’). A két forward és egy reverz
primer két PCR termék egyidejű amplifikációját teszi lehetővé. A belső kontrollként
szereplő primer és a reverz primer egy 364 bázispár hosszúságú terméket ad, amely
kontrollként alkalmas a DNS templát minőségének megítélésére. Ha a vizsgált DNS
mintában nincs jelen a mutáció, akkor csak a belső kontroll terméket kapjuk meg.
Amennyiben a DNS templát tartalmazza a JAK2V617F mutációt, akkor a mutációra
specifikus primer is PCR terméket eredményez és egy második, 203 bázispárnyi
amplikont is kapunk a 364 bázispárnyi kontroll mellett.
8. ábra. JAK2V617F mutáció-specifikus PCR sematikus ábrázolása. Kék színű
sáv a templát DNS-t jelöli. A G/T a mutáció helye. P1: kontroll forward primer. P2:
reverz primer. P3: mutáció-specifikus forward primer. A sárga sáv a kontroll
terméket, a rózsaszín sáv a mutáció-specifikus terméket jelzi.
A PCR reakció komponensei 25 µl végtérfogatban a következők voltak: kb. 10000
sejtnek megfelelő DNS TE8, vagy AE pufferben, 1 egységnyi Sigma Genomic
RedTaq DNS polimeráz (Sigma, St. Louis, MO, USA), 3 mM MgCl2, 200µM dNTP,
25
12.5 pmol reverz primer, 6.25 pmol belső kontroll forward primer, 6.25 pmol
mutáció-specifikus forward primer, valamint Sigma Redtaq puffer. A PCR reakció a
következő program szerint futott: 95°C elődenaturálás 5 perc; 40 ciklus 95°C
denaturálás 30 mp., 53°C primer kapcsolódás 30mp., 72°C extenzió 1perc; 72°C
végső elongáció.
Néhány esetben, ahol kevés DNS maradt a HUMARA vizsgálatok elvégzése után és
biztosak akartunk lenni a JAK2V617F mutáció vizsgálat sikerességében, teljes
genom amplifikációt végeztünk a maradék DNS-ből Qiagen REPLI-g Kit-tel
(Qiagen, Hilden, Germany) a gyártó által ajánlott protokoll szerint, majd 1 µl
amplifikált DNS-t használtuk a JAK2V617F PCR-hez. A PCR termékeket 2%-os
agaróz gélen szeparáltuk, SYBR Gold DNS festés után, UV megvilágítás mellett és
digitális fénykép formájában dokumentáltuk. A kiértékelés során a fényképen
szemmel látható termék megléte, ill. hiánya alapján soroltuk a mintákat JAK2V617F
mutációra pozitív és negatív kategóriába (9. ábra).
9. ábra. JAK2V617F mutáció-specifikus PCR gélfotója. A bal szélső minta a
molsúly marker. Középen egy negatív minta látható a 364 bázispár hosszúságú
kontroll termékkel. A jobb szélső minta a mutációra pozitív, mert a kontroll termék
mellett megtalálható benne a 203 bázispárnyi mutációra specifikus amplikon is.
26
EREDMÉNYEK
A HUMARA kiértékelési kritériumainak, specifitásának és szenzitivitásának
meghatározása
A 10. ábrán egy HUMARA gélelektroforézis fotó és ennek denzitometriás
görbéi láthatók. A két AR allél inaktivációjának aránya a denzitometriás görbén
látható csúcsok alatti területek arányával jellemezhető. Az arány kiszámításához az
egyes csúcsok területét elosztottuk a két csúcs összterületével. Az X kromoszóma
inaktiváció számszerű jellemzéséhez a kisebb molsúlyú allél százalékos arányát
használtuk fel, amely értéket X inaktivációs számnak neveztünk el - XISZ. A XISZ
értéke 0% és 100% mozoghat. Teljesen véletlenszerű XI-t feltételezve a XISZ
értékének 50%-nak kell lennie. Azonban nem véletlenszerű XI esetén a XISZ eltér az
50%-tól. Homogén monoklonális mintában a XISZ értéke 0%, vagy 100%.
10. ábra. HUMARA gélfotó és denzitometriás görbék. Az a és b, ill a’ és b’ a két
allélt jelöli a denzitometriás görbéken és a gélen. M: mieloid. L: limfoid. NE:
metiláció-szenzitív enzimmel nem emésztett minta. E: metiláció-szenzitív enzimmel
emésztett minta.
27
Huszonhét egészséges nő mintáit megvizsgálva 21-et találtunk
heterozigótának és így a vizsgálatra alkalmasnak. Az 1. táblázatban a 21 informatív
egészséges nő XISZ értékei láthatók a szortírozott limfoid és mieloid sejtvonalakban.
1. táblázat. Egészséges nők HUMARA eredményei.
minta azonosító kor (év)
L(XISZ)
M(XISZ)
1 37 90 782 40 60 613 50 83 834 57 51 395 40 34 556 62 63 827 60 70 568 37 30 499 22 85 8610 50 67 7311 55 39 3812 32 73 7513 39 - 514 56 80 10015 32 100 7516 51 71 5917 63 71 5518 30 59 3719 50 59 7320 23 87 8521 48 56 82
átlag+S.D. 44,5 65,2±20.0 64,1±22,4 L: limfoid, M: mieloid.
Az 1. táblázat adatai szerint gyenge eltolódás mutatkozik a kisebb molsúlyú
allél javára a XISZ értékekben, ami nem véletlenszerű XI-re utalhat. A XISZ átlaga
65,2% és 64,1% a limfoid és mieloid sejtvonalakban, jelentős mértékű sztenderd
deviáció (S.D.) mellett (20,0%, ill. 22.4%). Az 50%-nál magasabb XISZ-nek a nem
véletlenszerű XI-n kívül lehet technikai jellegű magyarázata is, ugyanis a magas
PCR ciklusszám (40) miatt a kisebb allél előnyre tehet szert az amplifikáció során.
Ezt okozhatja, hogy az amplifikált szakasz magas GC tartalma miatt viszonylag
stabil másodlagos struktúrák alakulhatnak ki, ami jobban érinti a nagyobb CAG
28
ismétlődés számot tartalmazó allélt, így annak amplifikációjára negatív hatással
lehet77.
Annak érdekében, hogy megfelelően értékeljük a betegmintákat, amelyekben
monoklonális sejtek okozhatják a nem véletlenszerű XI-t, olyan XISZ határértékeket
kellett meghatároznunk amelyek még elfogadható álpozitivitást adnak a kontrollként
vizsgált egészséges nők poliklonális mintáiban, vagyis elegendően specifikusak (2.
táblázat).
1. Megvizsgáltuk, hogy milyen specificitást adnak a XISZ átlag ± 1 S.D. és a
XISZ átlag ± 2 S.D. határértékek. A XISZ átlag ± 1 S.D. kritérium specificitását
alacsonynak találtuk (80%, 76%). A XISZ átlag ± 2 S.D. kritérium túl szigorúnak
bizonyult, mert az elvi 100%-os maximum XISZ értéket is meghaladó
határértékeket adott.
2. Az irodalmi adatok szerint gyakran alkalmazott 3:1-es allélarány
kritériumot megvizsgálva a limfoid sejtekben 70%, mieloidokban 52% volt a
specificitás. Tehát ez a klonalitás kritérium bizonyult a leggyengébb specificitásúnak.
3. Annak érdekében, hogy megfelelően specifikus kritériumokat kapjunk
meghatároztunk egy olyan poliklonális XISZ tartományt alsó és felső határértékekkel
a limfoid és a mieloid sejtek esetében is, amely magában foglalta kontroll minták
90%-át, vagyis ezen a tartományon belül kisebb, mint 10%-os az álpozitivitás, ami
legalább 90%-os specificitást jelent. A tartomány határétékeit úgy határoztuk meg,
hogy egyenlő arányban hagytuk el mind az alsó, mind a felső extrém XISZ értékeket
a kontroll nőkben mért XISZ értékek közül.
2. táblázat. Különböző határértékeket használó klonalitás kritériumok
specificitása.
Limfoid sejtekLimfoid sejtek Mieloid sejtekMieloid sejtekXISZ tartomány specificitás XISZ tartomány specificitás
átlag ±1S.D45,2-85,2
80%átlag ±1S.D41,7-86,5
76%
átlag ±2S.D.25,2-105,2
100%átlag ±2S.D.19,3-108,9
95%
3:1 arány 70% 3:1 arány 52%34-90 90% 37-86 90%
29
4. Végül mivel mérsékelten erős korrelációt (korrelációs koefficiens=0.646)
találtunk a limfoid és a mieloid XISZ értékek között, megvizsgáltuk, hogy vajon
lehet-e őket használni kölcsönösen, egymás kontrolljaként abban az esetben, ha csak
az egyik sejtvonalban alakul ki monoklonális proliferáció. Amennyiben csak az
egyik sejtvonal monoklonális, akkor annak XISZ értéke feltehetően jelentősen el fog
térni a másik, poliklonális sejtvonal XISZ értékétől. Megkerestük azt a XISZ
különbség értéket az egészséges, kontroll nők limfoid és a mieloid sejtei között,
amelynél nagyobb érték nem fordult elő az esetek 90%-ában. Ez a különbség érték
26-nak adódott. Ennél nagyobb különbség a limfoid és mieloid sejtek XISZ értékei
között a kontroll nők kevesebb, mint 10%-ban fordult elő, ezért ezt a típusú
kritériumot is legalább 90%-os specificitásúnak fogadtuk el. Meg kell azonban
jegyezni, hogy csak ezt a kritériumot használva egyértelműen nem lehet
megállapítani, hogy a két sejtvonal közül melyik a monoklonális.
A HUMARA szenzitivitásának meghatározásához monoklonális limfóma
sejtek és poliklonális mieloid sejtek ismert arányú keverékeit vizsgáltuk meg 4 B-
CLL-es beteg mintáiban. A 3. táblázat adatai és a 11. ábra azt mutatja, hogy ha a
vizsgált mintában legalább 75% volt a monoklonális sejtek aránya, akkor a
monoklonalitás egyértelműen meghatározható, mivel a XISZ értéke 0%, vagy 100%.
Kevesebb mint 75% monoklonális sejt esetén alkalmazhatóak a fentiekben
meghatározott kritériumok (3. és 4. pont). A 3. táblázatban az 1-es minta esetében
50-60%-nyi monoklonális sejt esetén 53% a XISZ értéke, ami a limfoid sejtekre
érvényes poliklonális tartomány (XISZ=34-90%) szerint a poliklonális tartományba
esik, viszont a limfoid-mieloid XISZ különbséget figyelembe vevő kritérium alapján
a keverék mintát az ismert XISZ értékű (8%) poliklonális mieloid sejtekhez
viszonyítva, a két XISZ érték különbsége több mint 26% és így ez a minta is
monoklonálisnak tekinthető. A 3. táblázatban 2,3,4-es minták monoklonálisnak
tekinthetők (XISZ=30%, 23%, 27%), mert kívül esnek a 34-90%-os poliklonális
tartományon, habár a 2-es mintában a XISZ különbség kritérium nem teljesül. A
20-25% CLL-es sejtet tartalmazó keverékekben az 1-es esetben a 19%-os XISZ érték
30
alapján monoklonálisnak kéne tekinteni a mintát, de a XISZ különbséget figyelembe
vevő kritérium szerint nem, mert a keverék minta és a poliklonális minta XISZ
különbsége csak 8%. A 2,3,4-es mintákban egyik kritérium alapján sem igazolható a
monoklonalitás. Ezen adatok alapján megállapítható, hogy az 50-60% monoklonális
sejtet tartalmazó minták mindegyikében legalább 1 kritérium alapján monoklonalitás
volt igazolható. Ezzel szemben a csak 20-25% monoklonális sejtet tartalmazó
mintákban a 4 esetből csupán az egyikben és ott is csak az egyik kritérium alapján
merült fel a monoklonalitás lehetősége.
3. táblázat. XISZ értékek a monoklonális CLL + poliklonális mieloid sejt keverékekben.
XISZ értékek a CLL + mieloid keverékekben (%)XISZ értékek a CLL + mieloid keverékekben (%)XISZ értékek a CLL + mieloid keverékekben (%)XISZ értékek a CLL + mieloid keverékekben (%)XISZ értékek a CLL + mieloid keverékekben (%)minta
azonosító 100%CLL 75-80%CLL 50-60%CLL 25-20%CLL 0%CLL
1 100 100 53 19 82 - 0 30 41 523 0 0 23 63 824 0 0 27 47 70
11. ábra. HUMARA a monoklonális+poliklonális keverék mintákban.
A XISZ értékek és a monoklonális sejtarány viszonya a keverék mintákban (A). A
különböző keverékek gélfotója (B) és a denzitometriás görbéi (C). A denzitometriás
görbéken az NE a metiláció-szenzitív enzimmel nem emésztett mintát jelöli, az E
pedig az emészett mintákat.
31
Végül megvizsgáltuk a korrelációt, az ismert arányú monoklonális sejtet
tartalmazó keverékekben a valódi és a mért XISZ értékekből számított monoklonális
sejtarányok között. Az alábbi algoritmus alapján az tisztán monoklonális (XISZM) és
tisztán poliklonális minták XISZ értéke (XISZP), valamint a keverék mintában mért
XISZ értéke (XISZmért), alapján számítható ki a mintában lévő monoklonális sejtek
aránya (M%).
€
M%100
× XISZM +100−M%100
× XISZP = XISZmért
M%: a mintában lévő monoklonális sejtek százalékos aránya
XISZM: a tisztán monoklonális minta XISZ értéke (100% CLL)
XISZP: a tisztán poliklonális minta XISZ értéke (100% mieloid)
XISZmért: keverék minta mért XISZ értéke (CLL + mieloid)
A vizsgált 20-60% monoklonális sejteket tartalmazó mintákban, a számított és a
valódi monoklonális sejtarányok között erős korrelációt találtunk (r=0.86), ami
alátámasztja a módszer kvantitatív jellegét és alkalmasságát keverék minták
vizsgálatára (4. táblázat).
4. táblázat. Valódi és számított monoklonális sejtarányok korrelációja,
különböző arányú monoklonális sejtet tartalmazó keverékekben.
minta azonosító
valódi monoklonális sejtarány (%)
számított monoklonális sejtarány (%)
1 25 122 20 32.83 20 21.24 20 23.21 50 48.92 60 613 60 42.34 60 72
korreláció r=0.86r=0.86
32
HUMARA – klonalitás eredmények
A vizsgálatok sikerességét tekintve a következő eredményeket kaptuk. A 143-
ból 98 (69%) eset volt heterozigóta és informatív. Negyvenöt eset (31%) a két
androgén receptor allél homozigozitása, vagy a gél feloldóképességénél kisebb
méretkülönbsége miatt, ill. gyenge PCR reakció miatt nem volt informatív. Az összes
informatív HUMARA eredményt foglalja össze az 5. táblázat.
Az informatív esetek közül 29 volt MDS. Hat eset volt MDS-RA, amelyekből
2-ben mindkét sejtvonal monoklonálisnak bizonyult, míg 4 esetben csak mieloid
monoklonalitást tapasztaltunk limfoid poliklonalitás mellett. Három MDS-RAEB-ből
2 monoklonalitást mutatott mindkét sejtvonalban, 1 esetben, ahol blasztokat is
tudtunk izolálni, csak a blasztok voltak monoklonálisak. Tizenhét MDS-u esetből 4
esetben mind a limfoid, mind a mieloid vonalat monoklonálisnak találtuk, 6 esetben
csak a mieloid sejtek voltak pozitívak, 3 esetben csak a limfoidok voltak
monoklonálisak, 2 esetben nem sikerült kimutatni monoklonalitást és 1 esetben a
csak a mieloid sejtek monoklonalitása volt kimutatható, a limfoidokból technikai
okok miatt nem kaptunk eredményt. Három MDS-ből transzformálódott AML-ben, 1
esetben kettős monoklonalitást, 1 esetben csak mieloid monoklonalitást találtunk és 1
esetben mindegyik sejtvonal poliklonálisnak bizonyult.
Az MPN-es betegek közül 69 volt informatív a HUMARA vizsgálatra. Ezen
esetek közül 34 volt ET. Tíz ET-ben találtuk monoklonálisnak mindkét sejtvonalat,
14 ET-s esetben csak a mieloid sejtek voltak monoklonálisak. Két ET-s esetben
poliklonálisnak bizonyult mindkét sejtvonal. 5 ET-s esetben csak a mieloid sejtekből
tudtuk elvégezni a vizsgálatot, amelyekben ezek monoklonálisak bizonyultak. Tíz
PV-s esetből 5-ben mindegyik sejtvonal monoklonális volt, 4 esetben csak a
mieloidok voltak monoklonálisak és egy esetben csak a mieloid sejtekből sikerült
elvégezni a vizsgálatot, ahol azok monoklonálisak voltak. Nyolc HES esetből
mindegyikben vizsgáltuk az eozinofil granulocitákat is. Két HES-ben mindhárom
sejtvonal monoklonális volt. Egy HES-ben limfoid-mieloid monoklonalitást találtunk
poliklonális eozinofilek mellett, egy másikban mieloid-eozinofil monoklonalitás volt
kimutatható poliklonális limfocitákkal. Két HES-ben a 3 sejtvonalból csak a
mieloidok voltak monoklonálisak. Szintén 2 HES-ben mindhárom sejtvonal
33
poliklonálisnak bizonyult. Két PMF esetből az egyikben mindkét sejtvonal, a
másikban csak a limfoid sejtek voltak monoklonálisak. Tizenöt MPN-u-ból 5-ben
mindegyik sejtvonal monoklonális volt, 6 esetben csak a mieloidok, 1 esetben csak a
limfoidok voltak monoklonálisak, 1 esetben mindkét sejtvonal poliklonális volt és 2
esetben a limfoidok sikertelen vizsgálata mellett találtunk monoklonális mieloidokat.
5. táblázat. Az egyes betegség típusokban kapott HUMARA klonalitás
eredmények.
Klonalitás a sejtvonalakbanKlonalitás a sejtvonalakbanKlonalitás a sejtvonalakbanKlonalitás a sejtvonalakbanKlonalitás a sejtvonalakbanKlonalitás a sejtvonalakbanKlonalitás a sejtvonalakbanEset szám
L+M+L+M+
L- M+L-
M+L+M-
L-M-
LnkM+
MDS-RA 6 22 44MDS-RAEB 3 22 B+:1
MDS-u 17 44 66 3 2 2MDS-AML 3 11 11 1MDS összes 29 99 1111 3 4 2
MPN-ET 34 1010 1313 6 5MPN-PV 10 55 44 1
MPN-PMF 2 11 1MPN-u 15 55 66 1 1 2
MPN-HES 8 Eo+: 2 Eo-: 1 Eo+:1 Eo-: 2 Eo-: 2MPN összes 69 2424 2626 2 9 8
L+: limfoid monoklonális, L-: limfoid poliklonális, Lnk: limfoidokból nem készült
vizsgálat, M+: mieloid monoklonális, M-: mieloid poliklonális, B+: blaszt
monoklonális, Eo+: eozinofil monoklonális, Eo-: eozinofil poliklonális
Összességében MDS-ben és MPN-ben hasonló arányokat kaptunk
monoklonalitás tekintetében. A kettős limfoid-mieloid monoklonális esetek aránya
31% volt MDS-ben és 35% MPN-ben. A csak mieloid monoklonalitást mutató esetek
aránya mindkét betegség csoportban 38% volt. Kizárólag limfoid monoklonális
esetek 10%-ban fordultak elő MDS-ben és 3 %-ban MPN-ben. Az MDS-ek 18%-a,
az MPN-ek 13%-a volt poliklonális. Mieloid monoklonalitás 76%-ban fordult elő
MDS-ben és 85%-ban MPN-ben. A limfoid monoklonalitás aránya 41% volt MDS-
ben és 38% MPN-ben. Bármilyen sejtvonalban jelentkező monoklonalitás az MDS -
ek 82%-ára, az MPN-ek 87%-ára volt jellemző.
34
Az MDS átlag értékektől valamelyest eltértek az MDS-RA esetek arányai,
ahol 8%-kal kisebb arányú limfoid (33%) és jelentősen, 24%-kal magasabb arányú
mieloid (100%) monoklonalitást találtunk. Azonban az MDS-RA eredmények
mindössze 6 esetből származnak, így ezek az eltérések nem tekinthetőek
statisztikailag megbízhatónak.
Az átlagos MPN értékektől szintén eltértek az ET-s és PV-s esetek. ET-ben
9%-kal volt alacsonyabb (29%), PV-ben 12%-kal volt magasabb (50%) a limfoid
monoklonális arány az MPN átlaghoz képest. A mieloid sejtek monoklonalitása
tekintetében csak a PV mutatott jelentősebb eltérést az átlagtól, ugyanis 100%-ban
monoklonálisak voltak mieloid sejtek. PMF-ben csak 2 esetet vizsgáltunk, így ezek
jelentős eltérését az átlagtól nem tartjuk megbízhatónak.
35
Mikroszatellita-PCR eredmények
Harmincöt esetben készültek MS-PCR vizsgálatok. Ezen vizsgálatok
segítségével a szortírozott limfoid és mieloid populációkban előforduló 5q és 20q
deléciókat vizsgáltuk.
Tizenkettő vizsgált MDS esetből 1 MDS-RA esetében (8%) mutattunk ki
teljes 5q deléciót az D5S476 lókuszon, amely csak a mieloid sejteket érintette. Egy
MDS-u-ban (8%) 20q deléciót találtunk a D20S96 és AI 1-et a D20S110 lókuszokon
a mieloid sejtekben (6. táblázat).
6. táblázat. MDS-es betegek MS-PCR eredményei.
diagnózis minta azonosító D20S607 D20S170 D20S110 D20S96 D20S119 D5S476 D5S414
MDS-RAEB 2M R R NI NI R R NI
MDS-RA 12L R NI R R R R NIMDS-RA 12M R NI R R R R NI
MDS-RA 13L NI NI R R R R NIMDS-RA 13M NI NI R R R R NI
MDS-RA 16L NI NI NI NI R 0 NIMDS-RA 16M NI NI NI NI R D NI
MDS-RA 52L ND ND ND ND ND ND NDMDS-RA 52M R R R R R R NI
MDS-u 11L R R NI NI NI R RMDS-u 11M R R NI NI NI R R
MDS-u 14L NI NI NI NI R R NIMDS-u 14M NI R NI R R R NI
MDS-u 19L R R NI NI R NI RMDS-u 19M R R NI NI R NI R
MDS-u 23L NI R NI R R NI NIMDS-u 23M NI R NI R R NI NI
MDS-u 27L R R R NI R NI RMDS-u 27M R R R NI R NI R
MDS-u 31L R R R NI R R RMDS-u 31M R R AI 1 D R NI R
MDS-u 55L R NI R R R NI RMDS-u 55M R NI R R R NI R
A vizsgált lókuszok a 20q-n: D20S607, D20S170, D20S110, D20S96, D20S119. A
vizsgált lókuszok az 5q-n: D5S476, D5S414. A minta azonosítóknál a szám az esetet,
az L a limfoid, az M a mieloid mintákat jelenti. A szürkével jelölt cellák mutatják a
delécióra utaló eredményeket. R: megtartott, AI: allélikus kiegyensúlyozatlanság, D:
deléció, NI: nem informatív, ND: nem készült vizsgálat
36
Huszonhárom MPN-es esetet vizsgáltunk MS-PCR-ral az 5q és 20q deléció
szempontjából (7. táblázat).
Hat MPN-ben (26%) mutattunk ki 20q deléciót, vagy allélikus
kiegyensúlyozatlanságot. Ezek közül 3 esetben (13%) a limfoid és mieloid sejtvonal
egyaránt érintett volt, míg a másik 3 MPN-ben (13%) csak a limfoid sejtek voltak
érintettek.
Huszonkét MPN-ből 3 esetben (13%) találtunk 5q érintettséget. Mindhárom
esetben érintett volt a mieloid vonal, míg a limfoidok csak egy esetben.
Egy esetben (4%) fordult elő egyszerre 20q és 5q érintettség egy HES-es
betegben, azonban a 20q deléció csak limfoidokban, az 5q AI csak mieloidokban volt
kimutatható.
37
7. táblázat. MPN-es betegek MS-PCR eredményei
diagnózis minta azonosító D20S607 D20S170 D20S110 D20S96 D20S119 D5S476 D5S414
PV 5L NI R NI NI NI NI NIPV 5M NI R NI NI NI NI NI
PV 30L R R R R R R AI 1PV 30M R R R R R R R
PMF 6L AI 3 R R AI 3 R R RPMF 6M R R NI R R R R
PMF 41L NI R NI R R R RPMF 41M NI R NI R R R R
ET 9L NI R NI NI R NI NDET 9M NI R NI NI R D D
ET 25L NI R NI R R ND NDET 25M NI R NI R R AI 1 NI
ET 33L R R R R R R RET 33M R R R R R R R
ET 36L R NI R R R R NIET 36M R NI R R AI 1 R NI
ET 40L R R NI R R R RET 40M R R NI R R R R
ET 44L R R NI R NI R AI 1ET 44M R R NI R NI NI AI 3
ET 46L R R R R AI 1 R NIET 46M R R R R R R NI
ET 51L NI R AI 1 R AI 1 NI NIET 51M NI R AI 1 AI 1 AI 1 NI NI
ET 54L R R R R R ND RET 54M R R R R AI 1 ND R
MPN-u 15L R NI R AI 1 R R NIMPN-u 15M R NI R R R R NI
MPN-u 18L AI 1 NI ND AI 1 ND ND NDMPN-u 18M AI 1 NI ND AI 1 NI ND ND
MPN-u 43L R R ND R R AI 1 NDMPN-u 43M R R R R R R R
MPN-u 45L AI 1 AI 1 NI R NI R NDMPN-u 45M D D D D D R ND
MPN-u 48T NI R R R NI ND NIMPN-u 48M NI R R R R ND NI
HES/CEL20T AI 1 NI R NI R R NI
HES/CEL 20M NI NI R NI R R NIHES/CEL20Eo NI NI R NI R R NI
HES 28L R D NI R NI R NDHES 28M AI NI NI R NI AI 1 AI 2
HES56L R R R R NI ND NI
HES 56M R R R R R ND NIHES56Eo R R R R R ND NI
HES57L NI AI 2 R NI AI 1 ND NI
HES 57M R R R R AI ND NIHES57Eo NI R R NI NI ND NI
MPN/MDS
CMML
7L R R NI R R NI RMPN/MDS
CMML7M R R NI R R NI R
MPN/MDS
CMML 7Mo R R NI R R NI R
A vizsgált lókuszok a 20q-n: D20S607, D20S170, D20S110, D20S96, D20S119. A
vizsgált lókuszok az 5q-n: D5S476, D5S414. A minta azonosítóknál a szám az esetet,
38
L a limfoid, az M a mieloid mintákat jelenti. A szürkével jelölt cellák a normáltól
(egészségestől) eltérő eredményeket mutatják. R: megtartott, AI: allélikus
kiegyensúlyozatlanság, D: deléció, NI: nem informatív, ND: nem készült vizsgálat
39
Párhuzamos HUMARA és mikroszatellita-PCR eredmények
Húsz esetben készült párhuzamos HUMARA és MS-PCR vizsgálat. Tizenkét
MPN-t (8. táblázat) és 8 MDS-t (9. táblázat) vizsgáltunk.
Tizenkét MPN-ből 4 esetben (33%), 1 ET-ben, 2 MPN-u-ban és 1 HES-ben
fordult elő MS-PCR-rel kimutatható deléció, vagy allélikus kiegyensúlyozatlanság és
HUMARA-val kimutatható monoklonalitás párhuzamosan. MS-PCR-rel kimutatható
érintettség csak olyan esetekben fordult elő, amelyek HUMARA-val monoklonálisak
voltak, fordítva soha.
8. táblázat. Párhuzamos MS-PCR és HUMARA vizsgálatok eredményei MPN-
ben.
diagnózis minta azonosító D20S607 D20S170 D20S110 D20S96 D20S119 D5S476 D5S414 HUMARA
ET9L NI R NI NI R NI ND P
ET 9M NI R NI NI R D D M
ET25L NI R NI R R ND ND NI
ET 25M NI R NI R R AI 1 NI M
ET40L R R NI R R R R M
ET 40M NI R NI R R R R M
ET46L R NI R R AI 1 R R NI
ET 46M R NI R R R R R M
MPN-PV5L NI R NI NI NI NI NI P
MPN-PV 5M NI R NI NI NI NI NI M
PMF41L AI R NI R R R R M
PMF 41M NI R NI R R R R M
MPN-u18L AI 1 NI ND AI 1 ND ND ND M
MPN-u 18M AI 1 NI ND AI 1 NI ND ND M
MPN-u43L NI R ND NI R AI 1 ND M
MPN-u 43M R R R NI R R R M
MPN-u45L AI 1 AI 1 NI R NI R ND P
MPN-u 45M D D D D D R ND M
MPN-u48L NI R R R NI NI NI M
MPN-u 48M NI R R R NI NI NI M
HES20L AI 1 NI R R R R NI M
HES 20M NI NI R R NI R NI MHES20Eo NI NI R R R R NI M
HES56L R R R R NI NI NI NI
HES 56M R R R R R NI NI MHES56Eo R R R R R NI NI M
HES57L NI AI 2 R NI AI 1 NI NI M
HES 57M R R NI R NI NI NI MHES57Eo NI R NI R NI NI NI M
A vizsgált lókuszok a 20q-n: D20S607, D20S170, D20S110, D20S96, D20S119. A
vizsgált lókuszok az 5q-n: D5S476, D5S414. A minta azonosítóknál a szám az esetet,
40
az L a limfoid, az M a mieloid mintákat jelenti. A szürkével jelölt cellák a normáltól
(egészségestől) eltérő eredményeket mutatják. R: megtartott, AI: allélikus
kiegyensúlyozatlanság, D: deléció, NI: nem informatív, ND: nem készült vizsgálat.
A 8 MDS-ből csak 1 MDS-RA esetben tudtunk kimutatni párhuzamosan 5q
érintettséget MS-PCR-rel és monoklonalitást HUMARA-val a mieloid sejtvonalban.
A többi esetben nem találtunk MS-PCR-ral eltérést a normál kariotípustól.
9. táblázat. Párhuzamos MS-PCR és HUMARA vizsgálatok eredményei MDS-
ben.
diagnózis minta azonosító D20S607 D20S170 D20S110 D20S96 D20S119 D5S476 D5S414 HUMARA
MDS RAEB 2M R R R NI R R NI M
MDS-RA 12L R NI R R R R NI PMDS-RA 12M R NI R R R R NI M
MDS-RA 13L NI R R R R R NI PMDS-RA 13M NI R R R R R NI M
MDS-RA 16L NI NI NI NI R R NI PMDS-RA 16M NI NI NI NI R D NI M
MDS-RA52L ND ND ND ND ND ND ND NI
MDS-RA 52M R R R R R R NI P
MDS-u 19L R R NI R R NI R MMDS-u 19M R R NI R R NI R P
MDS-u 23M NI R NI R R NI NI PMDS-u 23M NI R NI R R NI NI M
MDS-u 55L R NI R R R NI R MMDS-u 55M R NI R R R NI R M
A vizsgált lókuszok a 20q-n: D20S607, D20S170, D20S110, D20S96, D20S119. A
vizsgált lókuszok az 5q-n: D5S476, D5S414. A minta azonosítóknál a szám az esetet,
az L a limfoid, az M a mieloid mintákat jelenti. A szürkével jelölt cellák a normáltól
(egészségestől) eltérő eredményeket mutatják. R: megtartott, AI: allélikus
kiegyensúlyozatlanság, D: deléció, NI: nem informatív, ND: nem készült vizsgálat.
41
Párhuzamos JAK2V617F mutáció és HUMARA eredmények
Összesen 28 MPN esetben végeztünk sejtvonal specifikusan JAK2V617F
allélspecifikus PCR-t és ezek közül 11-ben párhuzamosan HUMARA is készült.
Olyan eseteket vizsgáltunk, amelyekről a rutin patológiai diagnosztikai eljárás során,
teljes vérből végzett vizsgálattal kiderült, hogy hordozzák a JAK2V617F mutációt.
A JAK2V617F mutáció az összes esetben kimutatható volt a mieloid
sejtekben. Hat PMF-ből 5 (83%), 9 PV-ből 8 (89%), 12 ET-ből 8 (67%) és 1 MPN-u
esetben a limfoid sejtek is hordozták a mutációt.
Az 10. táblázatban összehasonlítottuk, hogy sejtvonal specifikusan végezve a
két vizsgálatot, mennyire fedik át egymást a JAK2V617F mutációs és klonalitás
eredmények. A 11 esetből 7-ben (64%) egyezést mutatott a két vizsgálat sejtvonal
szinten a JAK2V617F mutáció előfordulása és a monoklonalitás szempontjából.
Négy esetben (36%) fordult elő, hogy a JAK2V617F mutációt mutató sejtvonalban a
HUMARA vizsgálat nem tudott monoklonalitást igazolni.
A HUMARA vizsgálat 10 esetben (91%) igazolt mieloid, 4 esetben (36%) a
mieloiddal párhuzamos limfoid monoklonalitást és 1 esetben (9%) poliklonalitást
mutatott mindkét sejtvonalban.
42
10. táblázat. Párhuzamos JAK2V617F mutáció és HUMARA vizsgálatok
eredményei.
DiagnózisPMFPMFPMFPMFPMFPMFPVPVPVPVPVPVPVPVPVETETETETETETETETETETETET
MPN-u
minta azonosító JAK2 L/M HUMARA L/M225 +/+ NI233 +/+ ND234 +/+ ND235 -/+ ND236 +/+ ND237 +/+ ND137 +/+ -/+152 +/+ +/+163 +/+ +/+177 +/+ -/+203 -/+ -/+218 +/+ +/+224 +/+ ND227 +/+ -/+238 +/+ ND135 +/+ NI136 -/+ -/+146 -/+ -/+192 -/+ -/-222 +/+ ND239 +/+ ND240 +/+ ND241 +/+ ND242 +/+ ND243 +/+ ND244 -/+ ND245 +/+ ND217 +/+ +/+
L/M: limfoid és mieloid sejtvonal párhuzamos ereményei. NI: nem informatív, ND:
nem készült vizsgálat. HUMARA esetén a negatív eredmény poliklonalitást, a
pozitív eredmény monoklonalitást jelent. A JAK2V617F vizsgálatnál a negatív
eredmény a mutáció hiányát, a pozitív eredmény a mutáció jelenlétét jelenti. A
szürkével jelölt esetek mindkét vizsgálattal egyforma eredményt adtak.
43
MEGBESZÉLÉS
Irodalmi áttekintés
A nemzetközi szakirodalomban nem egyértelműen eldöntött kérdés, hogy
MDS-ben és MPN-ben a neoplasztikus folyamat kiindulópontjának a hemopoézis
mely stádiuma felel meg. Egyre több adat mutat abba az irányba, hogy őssejt eredetű
folyamatokról van szó. A mieloid neopláziák a WHO besorolás szerint is
hemopoetikus őssejt betegségek. Viszont nem egyértelműen tisztázott, hogy a tumor
mieloid irányban elkötelezett, vagy pluripotens őssejtből indul-e ki, illetve, hogy
betegség típusonként vannak-e különbségek.
Knuutila9-10 két összefoglaló tanulmányában az egyes hematológiai tumorok
sejtvonal érintettségét vizsgálta, amelyben az irodalmi adatokat és saját eredményeit
foglalta össze. Ezek szerint MDS esetében bizonyított a mieloid vonal érintettsége,
amit különböző citogenetikai eltérésekkel, valamint X-inaktivációs klonalitás
vizsgálatok segítségével igazoltak, viszont a limfoid sejtek a legtöbb esetben nem
hordoznak kromoszóma eltérést. Néhány beszámolót említ, ahol B-sejtekben is
kimutattak genetikai aberrációt, de csak a sejtek kis részében, vagy Epstein-Barr
vírussal (EBV) transzformált limfoid sejtvonalakon. Ezen utóbbi adatok a
pluripotens eredet lehetőségére irányítják a figyelmet. Konklúzióként megállapítja,
hogy az MDS őssejt eredetű betegség és bizonyítottan az összes mieloid vonal
érintett, de limfoid érintettség is előfordulhat az esetek kis részében. MPN esetében
kevesebb tanulmány lelhető fel, de ezekben is egyértelmű a folyamat mieloid iránya
és limfoid érintettséget is leírnak, amely pluripotens eredetre utal.
Raskind8 1998-as összefoglaló cikkében a mieloproliferatív betegségek
patogeneziséről ír. Ő is kihangsúlyozza, hogy néhány PV és ET esetben az EBV
transzformált limfoid sejtek túlnyomó többségében, ugyanazt a G6PD klónt sikerült
kimutatni, mint a tumoros mieloid sejtekben. Ezek a megfigyelések is a pluripotens
őssejt eredet lehetőségét támogatják, de csak ritka esetekben.
Heaney összefoglalójában1 azt emeli ki, hogy MDS-ben a neoplasztikus
esemény a legtöbb beteg esetében valószínűleg mieloid irányban elkötelezett
44
őssejtben következik be. Ezt támasztja alá az is, hogy MDS-ben extrém ritkán
következik be limfoblasztos transzformáció78. Mindezek mellett létezik olyan
álláspont is, amely MDS-ben a pluripotens eredet dominanciáját hangsúlyozza. Ez
utóbbit támasztja alá, hogy Tsukamoto és munkatársai13 6-ból 6 MDS esetében
demonstrálták a T-limfociták és granulociták együttes monoklonalitását X-
inaktivációs módszerekkel. Egy tanulmány Nilsson16 és munkatársaitól szintén a
pluripotens őssejt eredetet bizonyítja direkt módszerekkel 5q deléciót hordozó MDS-
es betegekben. Kimutatták, hogy míg perifériás limfocitákban nem volt jelen az 5q
deléció, addig a csontvelőből izolált CD34+/CD38- pluripotens őssejtek szinte
100%-ban pozitívak voltak minden betegben, valamint 5-ből 3 esetben CD34+/
CD19+ pro-B sejtek is hordozták a deléciót, méghozzá nagy arányban. Egy betegben
a szortírozott CD34+/CD7+ pro-T sejtek is 5q deléciót mutattak.
Annak, hogy MDS esetében a legtöbb tanulmányban nem mutatható ki
limfoid érintettség, vagy csak kis arányban, több magyarázata is lehet. Előfordulhat,
hogy a tumoros és normál pluripotens őssejtek együtt léteznek a csontvelőben, de
amíg a mieloid vonal esetében a tumoros klón differenciálódni képes, addig a limfoid
sejtek ebből a klónból nem tudnak differenciálódni, hanem a reziduális normál
őssejtekből származnak. Ez magyarázhatja, hogy sok esetben miért nem detektálnak
genetikai aberrációt a perifériás limfoid sejtekben. Az a néhány eset, amikor limfoid
sejtekben is kimutatható abnormalitás, bizonyítja, hogy pluripotens őssejt érintett a
neoplasztikus folyamatban. A vizsgálati módszerek is okai lehetnek annak, hogy a
limfoid érintettséget nem lehet kimutatni. A legtöbb esetben ugyanis valamilyen
kromoszómális rendellenességet (pl. 20q deléciót) használtak markerként, viszont a
tumorfejlődés folyamata során ezek az aberrációk nem feltétlenül jellemzők a tumort
megalapozó klónra, lehet, hogy csak később jelentkeznek. A hematológiai tumorok
között a CML az egyik klasszikus példája annak, hogy a Philadelphia kromoszóma a
tumorgenezisnek csak egy későbbi fázisában jelentkezik, így szerepe van a
malignizációban, de az azt megelőző “pre-malignus” proliferációban nincs
jelen8,79,80 . Hasonló módon, az MDS-ben és MPN-ben leggyakoribb citogenetikai
markerként használt 20q és 5q deléció is megjelenhet a patogenezisnek egy késői
lépésében, így nem feltétlenül mutatja ki a tumor valódi sejtvonal reprezentációját.
Ezt támogatja Hellström-Lindberg és munkatársai4 tanulmánya, amely szerint az
45
MDS-ben visszatérő citogenetikai aberrációk, amelyeket régebben a betegség primer
okaiként tartottak számon, feltehetőleg valójában inkább szekunder események és a
betegség többlépcsős genetikai progressziója során később jelentkeznek. A hipotézis
szerint a primer lézió(k) citogenetikailag nem észlelhető(k), de a neoplasztikus klón
monoklonális proliferációját és expanzióját indukálhatja(-ák), majd a kialakuló
genetikai instabilitás eredményezi a később jelentkező szekunder, tercier, stb.
aberrációkat, mint pl. a jellemző 5q, 20q stb. deléciókat. Boultwood és munkatársai
2001-es összefoglalójukban17 megállapítják, hogy a legtöbb tanulmányban tapasztalt
mieloid restrikció nem zárhatja ki a betegség pluripotens őssejt eredetét az
előzőekben tárgyalt okok miatt. Továbbá hangsúlyozzák azon vizsgálatok
eredményeit, amelyek pluripotens és elkötelezett hemopoetikus őssejtek direkt
vizsgálataiból származnak, amelyek arra utalnak, hogy MDS-ben gyakoribb a
pluripotens őssejt érintettség, mint eddig gondolták.
A JAK2V617F mutáció felfedezése óta MPN-ben több tanulmányban
vizsgálták, hogy a mutáció mely sejtvonalakban fordul elő. Ishii21 PV-ben kimutatta
a mutációt az esetek kis részében T és B-limfocitákban is, valamint minden esetben
CD34+ őssejtekben. Jamieson és munkatársai81 igazolták a mutációt CD34+CD38-
CD90+Lin- fenotípusú elkötelezetlen hemopoetikus őssejtekben PV-s betegekben.
Bogani23 tanulmányában a vizsgált PMF-es betegek felében kimutatták a mutációt
perifériás B és T-limfocitákban, viszont NK-sejtekben és CD34+ sejtekben minden
esetben előfordult a mutáció. Delhommeau és kollégái24 PMF-ben szintén jelentős
arányú limfocita (B,T,NK), valamint 100%-os limfoid progenitor érintettséget
mutattak ki. Larsen cikkében25 10 PV-s betegből 8-ban jelen volt a JAK2V617F
mutáció B-, vagy T-limfocitákban.
46
Saját eredmények értékelése
A HUMARA módszer használatával kapcsolatos ellentmondások
kiküszöbölése érdekében, kontrolltól független és sejtvonalra jellemző klonalitási
kritériumok meghatározását tűztük ki célul. Új klonalitási kritériumokat állítottunk
fel a HUMARA X-inaktivációs vizsgálathoz, valamint meghatároztuk a módszer
szenzitivitását és teszteltük a módszer kvantitatív jellegét. Az X-inaktiváció mértékét
a két androgén receptor allél relatív arányát tükröző X-inaktivációs számmal (XISZ)
jellemeztük. Huszonegy informatív egészséges nő perifériás véréből áramlási
citométerrel szortírozott limfoid és mieloid sejteken, 4 különböző klonalitási
kritériumot tesztelve vizsgáltuk a HUMARA specificitását. Ezekhez a következő
vizsgálatokat végeztük el:
1. A XISZ átlagértékét és sztenderd deviációt felhasználva megállapítottuk
hogy, ha azokat a mintákat tekintjük monoklonálisnak, amelyekben XISZ értéke
kívül esik az egészséges minták XISZátlag±1S.D. tartományán, akkor limfoid
sejtekben 80%-os, a mieloidokban 76%-os specificitást kapunk. A XISZátlag±2S.D.
kritérium viszont túl szigorúnak bizonyult, mert a jelentős szórás miatt a 100%-os
elvi maximumot is meghaladó XISZ határértékeket eredményezett. A fentiek alapján
a XISZ átlaga és a sztenderd deviáció alapján képzett klonalitási tartományokat
elvetettük a nem elégséges specificitás, vagy a túl szigorú határértékek miatt.
2. A szakirodalomban gyakran használt, monoklonalitás jelének tekintett 3:1-
es androgén receptor allélarány a limfoid sejteknél csak 70%-os, a mieloidoknál
pedig még kisebb, 52%-os specificitást adott az egészséges kontroll mintákban. Így
ez a kritérium sem bizonyult megfelelőnek.
3. A fentiek miatt meghatároztunk egy olyan poliklonális XISZ tartományt a
limfoid és a mieloid sejtek esetében is, amelyektől legalább 90%-os specificitást,
vagyis 10%-nál kisebb álpozitivitást vártunk el. Ehhez az egészséges nőkben mért
összes XISZ értéket figyelembe véve, egyenlő arányban elhagytuk a legszélső XISZ
értékeket a tartomány mindkét végéről úgy, hogy az egészséges nők 90%-a az alsó és
felső határértékek között maradjon. Ez alapján a későbbiekben monoklonálisnak
tekintettük azokat a mintákat, amelyek XISZ értéke limfoid sejtek esetében 34-90%,
míg a mieloidoknál 37-86% XISZ tartományon kívül esett.
47
4. Az 3. pontban leírt 90%-os specificitást eredményező kritériumon túl
felállítottunk még egy monoklonalitást igazoló kritériumot. Ehhez abból indultunk
ki, hogy a kontroll egészséges nők mintáiban mérsékelt korreláció volt a limfoid és a
mieloid sejtek XISZ értékei között, ezért feltételeztük, hogy ugyanazon egyén
limfoid és mieloid sejtjei egymás kontrolljaként szolgálhatnak. Vagyis amennyiben
csak az egyik sejtvonal monoklonális a kettő közül, akkor a két sejtvonal XISZ
értéke jelentősen el fog térni egymástól. Így megvizsgáltuk a kontroll nőkben a
limfoid és mieloid sejtek XISZ értékének különbségét. 90%-os specificitásra
törekedve, a legmagasabb XISZ különbség értékeket elhagytuk az összes kontroll
minta eredményéből úgy, hogy a kontroll minták 90%-a a határérték alá essen.
Eszerint, ha a XISZ különbség nagyobb 26%-nál, akkor a vizsgált limfoid és mieloid
vonal közül valamelyik 90%-os valószínűséggel monoklonálisnak tekinthető. Fontos
azonban kiemelni, hogy ez alapján nem lehet megmondani, hogy melyik sejtvonal a
monoklonális. Így ez a kritérium inkább kiegészítő jellegű lehet az 3. pontban
meghatározott kritérium mellett.
5. Az általunk felállított kritériumokkal teszteltük HUMARA módszer
érzékenységét is, hogy meg tudjuk mondani milyen arányú reaktív háttér mellett
képes kimutatni a monoklonalitást a vizsgálat. Ehhez 4 B-CLL-es beteg leukémiás
sejtjeinek (CD5/CD23, vagy CD5/CD19 koexpresszót mutató sejtek) és poliklonális
mieloid sejtjeinek áramlási citométerrel szortírozott, meghatározott arányú
keverékeit vizsgáltuk. A 75% és 100% arányban leukémiás sejteket tartalmazó
keverékekben a XISZ érték 0%, vagy 100% volt, vagyis a HUMARA egyértelműen
monoklonalitást mutatott. Az 50-60% monoklonális sejtet tartalmazó mintákból 4-
ből 3 eset XISZ értékei estek kívül a limfoid sejtekre érvényes 34-90% poliklonális
XISZ tartományon és bizonyultak monoklonálisnak. A 4. esetben a XISZ érték a
poliklonális tartományba esett, viszont a XISZ különbségeket használó kritérium
alapján ebben az esetben is ki tudtuk mutatni a monoklonalitást. A 20-25%
monoklonális sejtet tartalmazó mintákban már nem tudtunk monoklonalitást igazolni
az általunk felállított kritériumok segítségével. Tehát a HUMARA módszer
érzékenységéről elmondható, hogy a legalább 50-60% monoklonális sejtet
tartalmazó minták mindegyikében legalább az egyik kritérium alapján képes volt
kimutatni a monoklonalitást.
48
6. Kimutattuk, hogy a módszer monoklonális sejteket tartalmazó
keverékekben kvantitatív jellegű. Ezt a keverékek ismert monoklonális sejtaránya és
a keverékekben mért XISZ értékekből számított monoklonális sejtarányok erős
korrelációja igazolta (r=0,86).
Igyekeztünk hozzájárulni az irodalomban látható ellentmondások
tisztázásohoz az MDS-ek és MPN-ek sejtvonal érintettségének vonatkozásában. A
sejtvonal érintettséget három különböző módszerrel vizsgáltuk: 1. HUMARA
klonalitási teszttel, 2. 5q és 20q deléció kimutatásásra alkalmas MS-PCR-rel és 3.
JAK2V617F mutációra specifikus PCR-rel.
Áramlási citométerrel szortírozott limfoid és mieloid sejteken végeztünk
HUMARA X-inaktivációs klonalitás tesztet, 98 informatív női betegben. A
HUMARA X-inaktivációs klonalitás vizsgálatokkal arra kerestük a választ, hogy
MDS-ben és MPN-ben szenvedő betegekben érintett-e a limfoid és mieloid sejtvonal
a monoklonális proliferációban. Ha csak a mieloid vonal klonális, akkor ez arra utal,
hogy a neoplasztikus folyamat mieloid irányban elkötelezett őssejtből indulhatott ki.
Mivel azonban csak indirekt következtetésre van lehetőségünk, ezért nem zárható ki
a pluripotens őssejt eredet csak mieloid érintettség esetén sem. Előfordulhat például,
hogy a tumoros klón gátolt a limfoid irányú differenciációban, vagy hogy a tumort
indukáló mutáció(k) csak a mieloid vonalnak biztosítanak proliferációs előnyt, ezért
a limfoid sejtek a reziduális egészséges őssejtekből származhatnak. Viszont mindkét
sejtvonal egyidejű klonalitása egyértelműen a pluripotens őssejt eredetet bizonyítja.
A HUMARA vizsgálataink eredményei MDS esetében az irodalomnak
megfelelő adatokat mutatták, ill. a két szélsőséges álláspont közé sorolhatók. Az
egyik véglet szerint a limfoid vonal sejtjeiben nem mutatható ki érintettség, vagy
csak nagyon ritka esetekben, ami a mieloid irányban elkötelezett őssejt eredetet
támogatja. A másik álláspont szerint az MDS-es esetek jóval nagyobb részében
fordul elő a limfoidok érintettsége, ami pluripotens kiindulási klónt feltételez.
Eseteink 38 %-ában csak a mieloid sejtek bizonyultak monokonálisnak, ami mieloid
irányban elkötelezett folyamatot valószínűsít. Viszont az esetek további 31%-ában
fordult elő monoklonális HUMARA eredmény mindkét sejtvonalban, ami a betegség
49
egyértelműen pluripotens őssejt eredetére utal. Szintén pluripotens őssejt eredetre
utal az is, hogy az MDS-ek 10%-ában csak limfoid monoklonalitás igazolódott,
poliklonális mieloidok mellett. Ez utóbbi eredmény magyarázható azzal, hogy a
mieloid vonalban a monoklonális sejtek aránya nem érte el a módszer szenzitivitását
(50-60%).
Mieloproliferatív neopláziákban az irodalmi adatok szerint nagyobb arányban
fordul elő limfoid érintettség, mint MDS-ben. Saját vizsgálatainkban 69 MPN esetet
vizsgáltunk HUMARA módszerrel. Eredményeink szerint az MDS-hez hasonló
gyakorisággal fordul elő MPN-ben a HUMARA-val kimutatható pluripotens őssejt
eredetre utaló együttes limfoid-mieloid monoklonalitás. Az összes MPN eset 35%-
ban találtunk kettős és 38%-ban kizárólagos mieloid monoklonalitást. Egyedül az
PV altípus mutatott az átlagnál magasabb arányú (50%) kettős limfoid-mieloid
monoklonalitást.
Összegezve saját HUMARA klonalitási vizsgálataink eredményeit,
feltételezhető, hogy MDS-ben és MPN-ben, több mint az esetek egyharmadában
pluripotens hemopoietikus őssejtből indul ki a tumor. Az eredmények és a módszer
megbízhatóságát alátámasztja, hogy a klonalitás eredményeink jól megfeleltethetők a
két nagy betegségcsoportban felállított patológiai diagnózisnak, MDS-ben 82%-ban,
MPN-ben 87%-ban tudtunk igazolni monoklonalitást valamelyik sejtvonalban.
Következésképpen az olyan MDS és MPN esetekben, amelyekben egyéb
patognomikus marker nem mutatható ki, a HUMARA diagnosztikus szerepű lehet
női betegekben.
A sejtvonal érintettséget vizsgáltuk szortírozott limfoid és mieloid sejteken
20q és 5q deléció tekintetében mikroszatellita-PCR technikával a D20S607,
D20S170, D20S110, D20S96 és D20S119, D5S476 és D5S414 lókuszokon 35 beteg
esetében. Tizenkét MDS-ből 1 esetben mutattunk ki del(5q)-t és 1 másik esetben
del(20q)-t csak a mieloid sejtekben.
23 MPN-t vizsgálva az MPN-re nem jellemző del(5q)-t 3 esetben (13%)
sikerült kimutatni, kizárólag a mieloid sejtekben. A del(20)-t 6 esetben, 26%-ban
sikerült kimutatni, 3 esetben csak limfoidokban és 3 esetben mindkét sejtvonalban.
50
Egy HES esetben megjelent mindkét deléció, viszont a del(20q) csak a limfoid, a
del(5q) csak a mieloid sejtekben.
A vizsgált minták közül del(5q)-t, vagy del(20q)-t csak a mieloid sejtekben
mutattuk ki MDS-ben, ami utalhat arra, hogy a betegség mieloid irányban
elkötelezett őssejtből indulhatott ki. Azonban nem zárható ki a pluripotens őssejt
eredet sem, mert a deléciók létrejöhettek a tumorfejlődésnek egy későbbi pontján is
egy mieloid irányban elkötelezett őssejtben és csak a malignizációban, ill. a betegség
manifesztációjában fontosak. Ez jól magyarázná azt is, hogy miért csak a mieloid
vonal sejtjeiben jelennek meg morfológiai, citológiai eltérések a normál állapothoz
képest.
Az MPN-ben kapott MS-PCR eredményeink a del(5q) sejtvonal
érintettségének tekintetében hasonlóak az MDS-hez, vagyis a del(5q) csak mieloid
sejtekben fordult elő, ami ezekben a betegekben szintén mieloid irányban
elkötelezett kiindulású betegségre utalhat. Viszont a del(20q) sejtvonal előfordulása
más képet mutatott. A del(20q)-t hordozó esetek fele kettős limfoid-mieloid, másik
fele csak limfoid érintettséget mutatott. A kettős érintettség egyértelműen a
pluripotens őssejt eredet lehetőségét támogatja. A kizárólagos limfoid érintettség
magyarázható az MS-PCR módszer alacsony érzékenységével amely hasonló, mint a
HUMARA-é, hiszen ugyanúgy két allél mennyiségi viszonyaiban beálló változást
kell kimutatni. Így lehetséges, hogy a mieloid vonalban előforduló, deléciót hordozó
sejtek gyakorisága ezen esetekben a módszer érzékenysége alá esett és valójában
ezekben az esetekben is pluripotens őssejt eredetről van szó.
A HUMARA és MS-PCR vizsgálatok informatív esetei közül 20-ból
készültek párhuzamos vizsgálatok. Nyolc MDS-ből 1-ben találtunk párhuzamos
del(5q)-t és HUMARA monoklonalitást, további 5 esetben csak a HUMARA
mutatott monoklonalitást. Tizenkét MPN-ben az összes esetben igazolható volt
HUMARA-val monoklonalitás és 4 eset mutatott párhuzamosan deléciót MS-PCR-
rel ugyanazon sejtvonalakban. Az a jelenség, hogy feltehetően hasonló kimutatási
érzékenység mellett jóval kevesebb esetben jelent meg deléció, mint monoklonális
proliferáció tovább erősíti azt a feltételezést, hogy a vizsgált del(5q) és del(20q) a
tumorfejlődés egy későbbi lépéseként alakulhatnak ki egy monoklonális proliferáció
talaján.
51
Az MS-PCR vizsgálatokkal arra is kerestük a választ, hogy a hagyományos
citogenetikai módszereknél jóval kisebb deléciók kimutatására is alkalmas
molekuláris technika segítségével esetleg nagyobb arányban kimutatható-e a 20q és
5q deléció MDS-ben és MPN-ben. Eredményeink szerint MDS-ben nem volt
gyakoribb egyik deléció sem. MPN-ben viszont sikerült 13%-ban kimutatnunk a
del(5q)-t, ami nem jellemző erre a betegség csoportra. Valamint a del(20q) kb.
kétszer akkora gyakoriságot mutatott (26%), mint a hagyományos metafázis
citogenetikával kimutatható előfordulás.
Sejtvonal specifikus JAK2V617F mutáció vizsgálatokat végeztünk 28
MPN-es betegből, akiknél a rutin diagnosztikai eljárás során a teljes vérből készült
vizsgálat mutációt igazolt. Ezek közül 11 esetben a JAK2V617F mutáció sejtvonal
szintű előfordulását összevetettük HUMARA-val kimutatható monoklonalitással is.
A JAK2V617F mutáció minden esetben kimutatható volt a mieloid sejtekben. A
limfoid sejtek érintettsége 80% feletti volt PMF-ben és PV-ben, míg ET-ben is
előfordult az limfoidok kétharmadában. Mindez arra utal, hogy a JAK2V617F
mutáció az esetek jelentős többségében pluripotens őssejtben következik be.
A párhuzamos HUMARA vizsgálatok sejtvonal szintű monoklonalitás
eredményei MPN-ben 11-ből 7 esetben (64%) megegyeztek a JAK2 mutációs
érintettséggel. A maradék 4 esetben a HUMARA nem tudott monoklonalitást
igazolni, valamelyik sejtvonalban, ahol a JAK2 mutációs vizsgálat pozitív volt. Ez
magyarázható azzal, hogy a JAK2V617F PCR érzékenysége magasabb, mint a
HUMARA-é, amelynél a pozitív eredményhez 50-60% monoklonális sejt szükséges
a mintában. Ez utóbbi arra utal, hogy JAK2V617F pozitív esetekben a JAK2V617F
mutációs vizsgálat hatékonyabban alkalmazható sejtvonal érintettség vizsgálatra,
mint a HUMARA.
52
Összefoglalás
A HUMARA X-inaktivációs vizsgálathoz új, 90%-os specificitású
kritériumokat dolgoztunk ki, valamint meghatároztuk a módszer érzékenységét. A
HUMARA vizsgálatok a patológiai diagnózissal összhangban, a vizsgált esetek több,
mint négyötödében monoklonalitást igazoltak, így a HUMARA az általunk használt
új kritériumokkal a diagnosztikában is alkalmazható monoklonalitás tesztnek
bizonyult. A sejtvonal specifikus HUMARA X-inaktivációs vizsgálatok eredményei
alapján arra lehet következtetni, hogy az MDS és az MPN esetek több mint
egyharmadában pluripotens őssejt eredetű a betegség.
Szintén sejtvonal specifikus MS-PCR segítségével kimutattuk, hogy a del(5q)
mindkét betegségcsoportban elsősorban mieloid sejtekben jelentkezik, míg a
del(20q) megtalálható a perifériás limfoid sejtekben. A del(20q) limfoid megjelenése
a del(5q)-nál korábbi, pluripotens őssejt szintjén bekövetkező delécióra utal. Mivel a
HUMARA-val kimutatható monoklonalitás gyakorisága nagyobb, mint az MS-PCR-
rel kimutatható deléciók gyakorisága, ezért feltételezzük, hogy a del(5q) és del(20q)
a tumorfejlődés egy későbbi lépéseként jelenik meg, egy már fennálló monoklonális
proliferáció talaján. A deléciók előfordulási gyakorisága szempontjából az MS-PCR
módszer nem mutatott különbséget hagyományos citogenetikához képest MDS-ben.
Azoban MPN-ben, ahol a del(5q) ritkán fordul elő, 13%-ban találtuk meg az eltérést.
MPN-ben a del(20q) esetében a hagyományos citogenetikával kimutatott előfordulási
arányoknál magasabb, kb. 2-szeres gyakoriságot (26%) mutattunk ki.
A sejtvonal specifikus JAK2V617F mutációs vizsgálatok PMF-ben és PV-ben
80% feletti arányban, ET-ben az esetek kétharmadában a mutáció pluripotens őssejt
eredetét igazolták mindkét sejtvonal érintettsége révén.
Konklúzióként elmondható, hogy 3 különböző vizsgálati módszerrel, illetve
ezek kombinációjával is sikerült igazolnunk, hogy az MDS-ek és MPN-ek jelentős
része - betegség típustól függően 31-89% arányban - pluripotens őssejt eredetű
betegségeknek tekinthetők. Valószínűsíthető, hogy a JAK2V617F mutáció az esetek
többségében a betegség korai, pluripotens őssejtet érintő stádiumában jelenik meg. A
del(20q), ahol előfordul, ott szintén pluripotens őssejtben jelentkezik az MPN-ekben.
53
Az MPN-ek nagyobb részében a del(20q) és del(5q) jelenléte nélkül is kimutatható a
HUMARA-val monoklonalitás, ezért valószínű, hogy ezek a deléciók szekunder
elváltozásként jelennek meg a tumorfejlődésben.
54
ÚJ EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA
1. Új, 90%-os specificitású, kontroll szövetet nem igénylő, limfoid és mieloid
sejtvonalra specifikus klonalitási kritériumokat határoztunk meg a HUMARA X-
inaktivációs vizsgálathoz. Meghatároztuk a HUMARA szenzitivitását, mely szerint
a módszer legalább 50-60% monoklonális sejtet tartalmazó mintákban alkalmas
klonalitás vizsgálatra. Teszteltük és igazoltuk a HUMARA módszer kvantitatív
jellegét poliklonális és monoklonális sejteket tartalmazó keverék mintákon.
2. HUMARA klonalitási eredményeink alapján, kettős limfoid-mieloid
monoklonalitás kimutatásával igazoltuk, hogy MDS-ben és MPN-ben egyaránt, a
vizsgált esetek több, mint egyharmadában pluripotens hemopoetikus őssejtből indult
ki a tumor.
3. MS-PCR segítségével kimutattuk, hogy az del(5q) mindkét betegségcsoportban
elsősorban mieloid sejtekben jelentkezik, míg a del(20q) megtalálható a perifériás
limfoid sejtekben is. A del(20q) limfoid megjelenése a del(5q)-nál korábbi,
pluripotens őssejt szintjén bekövetkező delécióra utal. A HUMARA-val kimutatható
monoklonalitás gyakorisága nagyobb volt, mint az MS-PCR-rel kimutatható deléciók
gyakorisága, ezért feltételezzük, hogy a del(5q) és del(20q) a tumorfejlődés egy
későbbi lépéseként, addícionálisan jelennek meg, egy már fennálló monoklonális
proliferáció talaján.
4. A vizsgált 5q és 20q deléciók előfordulási gyakorisága szempontjából az MS-PCR
módszer nem mutatott különbséget hagyományos citogenetikához képest MDS-ben.
Sikerült azoban kimutatni 13% arányban a del(5q)-t MPN-ben, amely csak ritkán
fordul elő ebben a betegségcsoportban. MPN-ben a del(20q) esetében a
hagyományos citogenetikával kimutatott előfordulási gyakoriságnál kb. kétszer
magasabb, 26%-os gyakoriságot kaptunk.
5. Sejtvonal specifikus JAK2V617F mutációs vizsgálatokkal igazoltuk, hogy PMF-
ben és PV-ben 80% feletti arányban, ET-ben a vizsgált esetek kétharmadában a
55
mutáció pluripotens őssejtben következett be, mivel előfordult a limfoid és a mieloid
sejtekben is. Eredményeink alapján a JAK2V617F mutációt hordozó MPN-ek
túlnyomó többsége pluripotens őssejt eredetűnek tekinthető.
56
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
Szeretnék köszönetet mondani témavezetőmnek, Dr. Pajor László Professzor Úrnak,
aki munkám feltételeit megteremtette és az elejétől a végéig támogatta, ösztönözte.
Köszönöm Dr. Kovács Gyula Professzor Úrnak, hogy az MS-PCR vizsgálatok
elvégzését a Heidelbergi Egyetemen lehetővé tette.
Köszönettel tartozom Dr. Kereskai Lászlónak a patológiai diagnózisokért.
Köszönöm Radvánszky Lajosnének az áramlási citometriai mérések készítése során
nyújtott segítségét, valamint Alpár Donátnak és Lacza Ágnesnek az értékes
tudományos konzultációkat.
Végül köszönöm családom sokéves támogatását.
57
IRODALOMI HIVATKOZÁSOK
1. Heaney ML, Golde DW. Myelodysplasia
N Engl J Med. 1999 May 27;340(21):1649-60.
2. Anderson JE, Gilliland DG, List AF et. al. Myelodysplastic syndrome.
Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 1998:296-312.
3. Gilliland DG, Silverstein MN, Anderson JE et. al. Myeloproliferative disorders
and myelodysplastic syndromes
Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 1997:166-176.
4. Hellström-Lindberg E, Willmann C, Barrett AJ et. al. Achievements in
understanding and treatment of myelodysplastic syndromes
Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2000:110-131.
5. C Rosenfeld, A List. A hypothesis for the pathogenesis of myelodysplastic
syndromes: implications for new therapies
Leukemia. 2000 Jan;14(1):2-8.
6. Jaffe ES, Harris NK, Stein H, Vardiman JW eds. World Health Organization,
Pathology and Genetics of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. IARC
Press, Lyon, 2001
7. Swerdlow SH, Campo E, Harris NL, Jaffe ES, Pileri SA, Stein H, Thiele J,
Vardiman JW eds. World Health Organization, Pathology and Genetics of Tumours
of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. IARC Press, Lyon, 2008
8. Raskind WH, Steinmann L, Najfeld V. Clonal development of myeloproliferative
disorders: clues to hematopoietic differentiation and multistep pathogenesis of
cancer.
58
Leukemia. 1998 Feb;12(2):108-16.
9. Knuutila S, Teerenhovi L, Larramendy ML, Elonen E, Franssila KO, Nylund SJ,
Timonen T, Heinonen K, Mahlamaki E, Winqvist R, et al. Cell lineage involvement
of recurrent chromosomal abnormalities in haematological neoplasms.
Genes Chromosomes Cancer. 1994 Jun;10(2):95-102.
10. Knuutila S. Lineage specifity in haematological neoplasms.
Br J Haematol. 1997 Jan;96(1):2-11.
11. Abrahamson G, Boultwood J, Madden J, Kelly S, Oscier DG, Rack K, Buckle
VJ, Wainscoat JS. Clonality of cell populations in refractory anaemia using
combined approach of gene loss and X-linked restriction fragment length
polymorphism-methylation analyses
Br J Haematol. 1991 Dec;79(4):550-5.
12. Culligan DJ, Cachia P, Whittaker J, Jacobs A, Padua RA. Clonal lymphocytes are
detectable in only some cases of MDS
Br J Haematol. 1992 Jul;81(3):346-52.
13. Tsukamoto N, Morita K, Maehara T, Okamoto K, Karasawa M, Omine M,
Naruse T. Clonality in myelodsplastic syndromes: demonstration of pluripotent stem
cell origin using X-linked restriction fragment length polymorphisms
Br J Haematol. 1993 Apr;83(4):589-94.
14. Anan K, Ito M, Misawa M, Ohe Y, Kai S, Kohsaki M, Hara H. Clonal analysis of
peripheral blood and haemopoietic colonies in patients with aplastic anaemia and
refractory anaemia using polymorphic short tandem repeat on the human androgen-
receptor (HUMARA) gene
Br J Haematol. 1995 Apr;89(4):838-44.
59
15. Suzuki H, Asano H, Ohashi H, Kinoshita T, Murate T, Saito H, Hotta T. Cloanlity
analysis of refractory anaemia with ringed sideroblasts:simultaneousstudy of
clonality and cytochemistry of bone marrow progenitors
Leukemia. 1999 Jan;13(1):130-4.
16. Nilsson L, Astrand-Grundstrom I, Arvidsson I, Jacobsson B, Hellstrom-Lindberg
E, Hast R, Jacobsen SE. Isolation and characterization of hemapoietic progenitor/
stem cells in 5q-deleted myelodysplastic syndromes: evidence for involvement at the
hemapoietic stem cell level
Blood. 2000 Sep 15;96(6):2012-21.
17. Boultwood J, Wainscoat JS. Clonality in the myelodysplastic syndromes.
Int J Hematol. 2001 Jun;73(4):411-5.
18. Shih LY, Lin TL, Dunn P, Wu JH, Tseng CP, Lai CL, Wang PN, Kuo MC.
Clonality analysis using X-chromosome inactivation patterns by HUMARA-PCR
assay in female controls and patients with idiopathic thrombocytosis in Taiwan.
Exp Hematol. 2001 Feb;29(2):202-8.
19. Reeder TL, Bailey RJ, Dewald GW, Tefferi A. Both B and T lymphocytes may be
clonally involved in myelofibrosis with myeloid metaplasia.
Blood. 2003 Mar 1;101(5):1981-3.
20. Lasho TL, Mesa R, Gilliland DG, Tefferi A. Mutation studies in CD3+, CD19+
and CD34+ cell fractions in myeloproliferative disorders with homozygous
JAK2(V617F) in granulocytes.
Br J Haematol. 2005 Sep;130(5):797-9.
21. Ishii T, Bruno E, Hoffman R, Xu M. Involvement of various hematopoietic-cell
lineages by the JAK2V617F mutation in polycythemia vera.
Blood. 2006 Nov 1;108(9):3128-34.
60
22. Pardanani A, Lasho TL, Finke C, Mesa RA, Hogan WJ, Ketterling RP, Gilliland
DG, Tefferi A. Extending Jak2V617F and MplW515 mutation analysis to single
hematopoietic colonies and B and T lymphocytes.
Stem Cells. 2007 Sep;25(9):2358-62.
23. Bogani C, Guglielmelli P, Antonioli E, Pancrazzi A, Bosi A, Vannucchi AM. B-,
T-, and NK-cell lineage involvement in JAK2V617F-positive patients with idiopathic
myelofibrosis.
Haematologica. 2007 Feb;92(2):258-9.
24. Delhommeau F, Dupont S, Tonetti C, Massé A, Godin I, Le Couedic JP, Debili N,
Saulnier P, Casadevall N, Vainchenker W, Giraudier S. Evidence that the JAK2
G1849T (V617F) mutation occurs in a lymphomyeloid progenitor in polycythemia
vera and idiopathic myelofibrosis.
Blood. 2007 Jan 1;109(1):71-7.
25. Larsen TS, Christensen JH, Hasselbalch HC, Pallisgaard N. The JAK2 V617F
mutation involves B- and T-lymphocyte lineages in a subgroup of patients with
Philadelphia-chromosome negative chronic myeloproliferative disorders.
Br J Haematol. 2007 Mar;136(5):745-51.
26. Hussein K, Bock O, Theophile K, Schlue J, Ballmaier M, Kröger N, Göhring G,
Büsche G, Kreipe H. Biclonal expansion and heterogeneous lineage involvement in a
case of chronic myeloproliferative disease with concurrent MPLW515L/JAK2V617F
mutation.
Blood. 2009 Feb 5;113(6):1391-2.
27. Jones AV, Kreil S, Zoi K, Waghorn K, Curtis C, Zhang L, Score J, Seear R, Chase
AJ, Grand FH, White H, Zoi C, Loukopoulos D, Terpos E, Vervessou EC, Schultheis
B, Emig M, Ernst T, Lengfelder E, Hehlmann R, Hochhaus A, Oscier D, Silver RT,
Reiter A, Cross NC. Widespread occurrence of the JAK2 V617F mutation in chronic
myeloproliferative disorders.
61
Blood. 2005 Sep 15;106(6):2162-8.
28. Lippert E, Boissinot M, Kralovics R, Girodon F, Dobo I, Praloran V, Boiret-
Dupré N, Skoda RC, Hermouet S. The JAK2-V617F mutation is frequently present
at diagnosis in patients with essential thrombocythemia and polycythemia vera.
Blood. 2006 Sep 15;108(6):1865-7.
29. Vainchenker W, Constantinescu SN. A Unique Activating Mutation in JAK2
(V617F) Is at the Origin of Polycythemia Vera and Allows a New Classification of
Myeloproliferative Diseases.
Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2005:195-200.
30. Haase D. Cytogenetic features in myelodysplastic syndromes.
Ann Hematol. 2008 Jul;87(7):515-26.
31. Tefferi A, Thiele J, Orazi A, Kvasnicka HM, Barbui T, Hanson CA, Barosi G,
Verstovsek S, Birgegard G, Mesa R, Reilly JT, Gisslinger H, Vannucchi AM,
Cervantes F, Finazzi G, Hoffman R, Gilliland DG, Bloomfield CD, Vardiman JW.
Proposals and rationale for revision of the World Health Organization diagnostic
criteria for polycythemia vera, essential thrombocythemia, and primary
myelofibrosis: recommendations from an ad hoc international expert panel.
Blood. 2007 Aug 15;110(4):1092-7.
32. Levine RL, Wernig G. Role of JAK-STAT signaling in the pathogenesis of
myeloproliferative disorders.
Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2006:233-9, 510.
33. Skoda R. The genetic basis of myeloproliferative disorders.
Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2007;2007:1-10.
34. Mesa RA. Navigating the evolving paradigms in the diagnosis and treatment of
myeloproliferative disorders.
62
Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2007;2007:355-62.
35. Pardanani AD, Levine RL, Lasho T, Pikman Y, Mesa RA, Wadleigh M, Steensma
DP, Elliott MA, Wolanskyj AP, Hogan WJ, McClure RF, Litzow MR, Gilliland DG,
Tefferi A. MPL515 mutations in myeloproliferative and other myeloid disorders: a
study of 1182 patients.
Blood. 2006 Nov 15;108(10):3472-6.
36. Lyon MF. Sex chromatin and gene action in the mammalian X-chromosome.
Am J Hum Genet. 1962 Jun;14:135-48.
37. Belmont JW. Genetic control of X inactivation and processes leading to X-
inactivation skewing.
Am J Hum Genet. 1996 Jun;58(6):1101-8.
38. Diaz-Cano SJ, Blanes A, Wolfe HJ. PCR techniques for clonality assays.
Diagn Mol Pathol. 2001 Mar;10(1):24-33.
39. Chen GL, Prchal JT. X-linked clonality testing: interpretation and limitations.
Blood. 2007 Sep 1;110(5):1411-9.
40. Linder D, Gartler SM. Glucose-6-phosphate dehydrogenase mosaicism:
utilization as a cell marker in the study of leiomyomas.
Science. 1965 Oct 1;150(692):67-9.
41. Fialkow PJ, Gartler SM, Yoshida A. Clonal origin of chronic myelocytic
leukemia in man.
Proc Natl Acad Sci U S A. 1967 Oct;58(4):1468-71.
42. Adamson JW, Fialkow PJ, Murphy S, Prchal JF, Steinmann L. Polycythemia
vera: stem-cell and probable clonal origin of the disease.
N Engl J Med. 1976 Oct 21;295(17):913-6.
63
43. Fialkow PJ, Faguet GB, Jacobson RJ, Vaidya K, Murphy S. Evidence that
essential thrombocythemia is a clonal disorder with origin in a multipotent stem cell.
Blood. 1981 Nov;58(5):916-9.
44. Busque L, Gilliland DG. X-inactivation analysis in the 1990s: promise and
potential problems.
Leukemia. 1998 Feb;12(2):128-35.
45. Allen RC, Zoghbi HY, Moseley AB, Rosenblatt HM, Belmont JW. Methylation
of HpaII and HhaI sites near the polymorphic CAG repeat in the human androgen-
receptor gene correlates with X chromosome inactivation.
Am J Hum Genet. 1992 Dec;51(6):1229-39.
46. Gale RE, Wheadon H, Boulos P, Linch DC. Tissue specificity of X –chromosome
inactivation patterns.
Blood. 1994 May 15;83(10):2899-905.
47. Zhu J, Frosch MP, Busque L, Beggs AH, Dashner K, Gilliland DG, Black PM.
Analysis of meningiomas by methilation- and transcription based clonality assays.
Cancer Res. 1995 Sep 1;55(17):3865-72.
48. Harrison CN, Gale RE, Linch DC. Quantification of X-chromosome inactivation
patterns using RT-PCR of the polymorphic iduronate-2-sulphatase gene and
correlation of the results obtained with DNA based techniques.
Leukemia. 1998 Nov;12(11):1834-9.
49. Busque L, Zhu J, DeHart D, Griffith B, Willman C, Carroll R, Black PM,
Gilliland DG. An expression based clonality assay at the human androgen receptor
locus (HUMARA) on chromosome X.
Nucleic Acids Res. 1994 Feb 25;22(4):697-8.
64
50. Champion KM, Gilbert JG, Asimakopoulos FA, Hinshelwood S, Green AR.
Clonal haemopoiesis in normal elderly women: implications for the
myeloproliferative disorders and myelodysplastic syndromes.
Br J Haematol. 1997 Jun;97(4):920-6.
51. Racchi O, Mangerini R, Rapezzi D, Rolfo M, Gaetani GF, Ferraris AM. X
chromosome inactivation patterns in normal females.
Blood Cells Mol Dis. 1998 Dec;24(4):439-47.
52. Tonon L, Bergamaschi G, Dellavecchia C, Rosti V, Lucotti C, Malabarba L,
Novella A, Vercesi E, Frassoni F, Cazzola M. Unbalanced X-chromosome
inactivation in haemopoietic cells from normal women.
Br J Haematol. 1998 Sep;102(4):996-1003.
53. El-Kassar N, Hetet G, Briere J, Grandchamp B. Clonality analysis of
hematopoiesis in essentila thrombocythemia: advantages of studying T lymphocytes
and platelets.
Blood. 1997 Jan 1;89(1):128-34.
54. Horrigan SK, Westbrook CA, Kim AH, Banerjee M, Stock W, Larson RA.
Polymerase chain reaction-based diagnosis of del(5q) in acute myeloid leukemia and
myelodysplastic syndrome identifies a minimal deletion interval.
Blood. 1996 Oct 1;88(7):2665-70.
55. Naidoo R, Chetty R. The application of microsatellites in molecular pathology.
Pathol Oncol Res. 1998;4(4):310-5.
56. Asimakopoulos FA, White NJ, Nacheva E, Green AR. Molecular analysis of
chromosome 20q deletions assosiated with myeloproliferative disorders and
myelodysplastic syndromes.
Blood. 1994 Nov 1;84(9):3086-94.
65
57. Asimakopoulos FA, Green AR. Deletions of chromosome 20 and the
pathogenesis of myeloproliferative disorders.
Br J Haematol. 1996 Nov;95(2):219-26.
58. Bench AJ, Nacheva EP, Hood TL, Holden JL, French L, Swanton S, Champion
KM, Li J, Whittaker P, Stavrides G, Hunt AR, Huntly BJ, Campbell LJ, Bentley DR,
Deloukas P, Green AR. Chromosome 20 deletions in myeloid malignancies:
reduction of the common deleted region, generation of a PAC/BAC contig and
identification of candidate genes.
Oncogene. 2000 Aug 10;19(34):3902-13.
59. Wang PW, Eisenbart JD, Espinosa R 3rd, Davis EM, Larson RA, Le Beau MM.
Refinement of the smallest commonly deleted segment of chromosome 20 in
malignant myeloid deseases and development of a PAC-based physical and
transcription map.
Genomics. 2000 Jul 1;67(1):28-39.
60. Bench AJ, Aldred MA, Humphray SJ, Champion KM, Gilbert JG,
Asimakopoulos FA, Deloukas P, Gwilliam R, Bentley DR, Green AR. A detailed
physical and trancriptional map of the region of chromosome 20 that is deleted in
myeloproliferative disorders and refinement of the commonly deleted region.
Genomics. 1998 May 1;49(3):351-62.
61. Horrigan SK, Arbieva ZH, Xie HY, Kravarusic J, Fulton NC, Naik H, Le TT,
Westbrook CA. Delineation of a minimal interval and identification of 9 candidates
for a tumor suppressor gene in malignant myeloid disorders on 5q31.
Blood. 2000 Apr 1;95(7):2372-7.
62. Zhao N, Stoffel A, Wang PW, Eisenbart JD, Espinosa R 3rd, Larson RA, Le Beau
MM. Molecular delineation of the smallest commonly deleted region of the
chromosome 5 in malignant myeloid diseases to 1-1,5 Mb and preparation of a PAC-
based physical map.
66
Proc Natl Acad Sci U S A. 1997 Jun 24;94(13):6948-53.
63. Boultwood J, Fidler C, Strickson AJ, Watkins F, Gama S, Kearney L, Tosi S,
Kasprzyk A, Cheng JF, Jaju RJ, Wainscoat JS. Narrowing and genomic annotation of
the commonly deleted region of the 5q- syndrome.
Blood. 2002 Jun 15;99(12):4638-41.
64. Kralovics R, Passamonti F, Buser AS, Teo SS, Tiedt R, Passweg JR, Tichelli A,
Cazzola M, Skoda RC. A gain-of-function mutation of JAK2 in myeloproliferative
disorders.
N Engl J Med. 2005 Apr 28;352(17):1779-90.
65. Levine RL, Wadleigh M, Cools J, Ebert BL, Wernig G, Huntly BJ, Boggon TJ,
Wlodarska I, Clark JJ, Moore S, Adelsperger J, Koo S, Lee JC, Gabriel S, Mercher T,
D'Andrea A, Frohling S, Dohner K, Marynen P, Vandenberghe P, Mesa RA, Tefferi
A, Griffin JD, Eck MJ, Sellers WR, Meyerson M, Golub TR, Lee SJ, Gilliland DG.
Activating mutation in the tyrosine kinase JAK2 in polycythemia vera, essential
thrombocythemia, and myeloid metaplasia with myelofibrosis.
Cancer Cell. 2005 Apr;7(4):387-97.
66. James C, Ugo V, Le Couedic JP, Staerk J, Delhommeau F, Lacout C, Garcon L,
Raslova H, Berger R, Bennaceur-Griscelli A, Villeval JL, Constantinescu SN,
Casadevall N, Vainchenker W. A unique clonal JAK2 mutation leading to
constitutive signalling causes polycythaemia vera.
Nature. 2005 Apr 28;434(7037):1144-8.
67. Baxter EJ, Scott LM, Campbell PJ, East C, Fourouclas N, Swanton S, Vassiliou
GS, Bench AJ, Boyd EM, Curtin N, Scott MA, Erber WN, Green AR; Cancer
Genome Project. Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in human
myeloproliferative disorders.
Lancet. 2005 Mar 19-25;365(9464):1054-61. Erratum in: Lancet. 2005 Jul
9-15;366(9480):122.
67
68. Zhao R, Xing S, Li Z, Fu X, Li Q, Krantz SB, Zhao ZJ. Identification of an
acquired JAK2 mutation in polycythemia vera.
J Biol Chem. 2005 Jun 17;280(24):22788-92.
69. Kralovics R, Teo SS, Buser AS, Brutsche M, Tiedt R, Tichelli A, Passamonti F,
Pietra D, Cazzola M, Skoda RC. Altered gene expression in myeloproliferative
disorders correlates with activation of signaling by the V617F mutation of Jak2.
Blood. 2005 Nov 15;106(10):3374-6.
70. Tefferi A. V617F “JAKs” up myeloproliferative signal.
Blood. 2005 Nov 15;106(10):3335-6.
71. Schafer AI. Molecular basis of the diagnosis and treatment of polycythemia vera
and essential thrombocythemia.
Blood. 2006 Jun 1;107(11):4214-22. Epub 2006 Feb 16.
72. Macdonald D, Cross NC. Chronic myeloproliferative disorders: the role of
tyrosine kinases in pathogenesis, diagnosis and therapy.
Pathobiology. 2007;74(2):81-8.
73. Malcovati L, Cazzola M. Myelodysplastic/myeloproliferative disorders.
Haematologica. 2008 Jan;93(1):4-6.
74. Hellström-Lindberg E, Cazzola M. The Role of JAK2 Mutations in RARS and
Other MDS.
Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2008;2008:52-9.
75. Kopp P, Jaggi R, Tobler A, Borisch B, Oestreicher M, Sabacan L, Jameson JL,
Fey MF. Clonal X-inactivation analysis of human tumours using the human androgen
receptor gene (HUMARA) polymorphism: a non-radioactive and semiquantitative
strategy applicable to fresh and archival tissue.
Mol Cell Probes. 1997 Jun;11(3):217-28.
68
76. Langbein S, Szakacs O, Wilhelm M, Sukosd F, Weber S, Jauch A, Lopez Beltran
A, Alken P, Kälble T, Kovacs G. Alteration of the LRP1B gene region is associated
with high grade of urothelial cancer.
Lab Invest. 2002 May;82(5):639-43.
77. Mutter GL, Boynton KA. PCR bias in amplification of androgen receptor allales,
a trinucleotide repeat marker used in clonality studies.
Nucleic Acids Res. 1995 Apr 25;23(8):1411-8.
78. Pajor L, Matolcsy A, Vass JA, Mehes G, Marton E, Szabo F, Ivanyi JL.
Phenotypic and genotypic analyses of blastic cell population suggest that pure B-
lymphoblastic leukemia may arise from myelodysplastic syndrome.
Leuk Res. 1998 Jan;22(1):13-7.
79. Fialkow PJ, Martin PJ, Najfeld V, Penfold GK, Jacobson RJ, Hansen JA.
Evidence
for a multistep pathogenesis of chronic myelogenous leukemia.
Blood. 1981 Jul;58(1):158-63.
80. Raskind WH, Ferraris AM, Najfeld V, Jacobson RJ, Moohr JW, Fialkow PJ.
Further evidence for the existence of a clonal Ph-negative stage in some cases of Ph-
positive chronic myelocytic leukemia.
Leukemia. 1993 Aug;7(8):1163-7.
81. Jamieson CH, Gotlib J, Durocher JA, Chao MP, Mariappan MR, Lay M, Jones C,
Zehnder JL, Lilleberg SL, Weissman IL. The JAK2 V617F mutation occurs in
hematopoietic stem cells in polycythemia vera and predisposes toward erythroid
differentiation.
Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Apr 18;103(16):6224-9.
69
AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁT KÉPEZŐ PUBLIKÁCIÓK
Közlemények
Jáksó P, Kereskai L, Molnár L, Pajor L. Lineage-specific clonality analysis of
chronic myeloproliferative disorders and myelodysplastic syndrome by human
androgen receptor assay.
Pathol Oncol Res. 2007;13(2):114-22. IF: 1.241
Pajor L, Lacza A, Kereskai L, Jáksó P, Egyed M, Iványi JL, Radványi G, Dombi
P, Pál K, Losonczy H. Increased incidence of monoclonal B-cell infiltrate in chronic
myeloproliferative disorders.
Mod Pathol. 2004 Dec;17(12):1521-30. IF: 3.643
Jáksó P, Pajor L. Advantages of CD45 vs. side scatter based gating in the course of
flow cytometric immuno-phenotyping in malignant hematologic diseases.
Orv Hetil. 1998 Oct 18;139(42):2509-13.
Idézhető absztraktok
Jáksó P, Pajor L. Sejtvonal specifikus monoklonalitás vizsgálatok myeloproliferatív
betegségekben és myelodysplasiában.
Magyar Belorvosi Archivum. 2001;54(Supplementum 2001/1):22.
Jáksó P, Pajor L. X-kromoszóma inaktivációs klonalitási tesztek krónikus
myeloproliferativ betegségekben és myelodysplasiaban.
Hematológia Transzfúziológia. 2005;38(Supplementum 2005/1):34-35.
Jáksó P, Nagy Z, Kereskai L, Alpár D, Kajtár B, Pajor L. Analysis of polycythemia
vera and essential thrombocythemia by lineage specific investigation of JAK2V617F
mutation and X-linked clonality assay.
Blood Reviews. 2007;21(Supplement 1):123 IF: 5.756
70
Kongresszusi poszterbemutatók
Jáksó P, Pajor L. A fényszórás alapján történő kapuzással kapcsolatban felmerülő
problémák az áramlási cytometriás immunfenotipizálás során, malignus hematológiai
kórképek esetén.
Pathológus Találkozó, Lillafüred, 1997
Jáksó P, Pajor L. Sejtvonal specifikus monoklonalitás vizsgálatok myeloproliferatív
proliferatív betegségekben és myelodysplasiában.
A Magyar Haematológiai és Transzfúziológiai Társaság XVIII. Kongresszusa, Pécs,
2001.
Jáksó P, Pajor L. X-kromoszóma-inaktivációs klonalitási tesztek krónikus
myeloproliferatív betegségekben és myelodysplasiában.
A Magyar Haematológiai és Transzfúziológiai Társaság XX. Kongresszusa,
Budapest, 2005.
Jáksó P, Nagy Z, Kereskai L, et al. Analysis of polycythemia vera and essential
thrombocythemia by lineage specific investigation of JAK2V617F mutation and X-
linked clonality assay.
International Society of Haematology, Congress of the European & African Division,
Budapest, 2007.
Előadások tudományos kongresszusokon
Jáksó P, Pajor L. Sejtvonal specifikus monoklonalitás vizsgálatok myeloproliferatív
betegségekben és myelodysplasiában.
A Magyar Haematológiai és Transzfúziológiai Társaság XVIII. Kongresszusa, Pécs,
2001.
Jáksó P, Pajor L. X-kromoszóma kötött molekuláris tesztek kelentősége a pathologiai
diagnosztikában. 61. Pathologus Kongresszus, Győr, 2002.
71
EGYÉB PUBLIKÁCIÓK
Közlemények
Pajor L, Szuhai K, Mehes G, Kosztolányi G, Jáksó P, Lendvai G, Szanyi I,
Kajtár P. Combined metaphase, interphase cytogenetic, and flow cytometric
analysis of DNA content of pediatric acute lymphoblastic leukemia.
Cytometry. 1998 Apr 15;34(2):87-94.
IF: 2.317
Tornóczky T, Kálmán E, Hegedűs G, Horváth OP, Sápi Z, Antal L, Jáksó P, Pajor
L. High mitotic index associated with poor prognosis in gastrointestinal
autonomic nerve tumour.
Histopathology. 1999 Aug;35(2):121-8.
IF: 1.900
Pajor L, Vass JA, Kereskai L, Szuhai K, Molnár L, Jáksó P. Silent Philadelphia
chromosome: a distinct developmental stage in a philadelphia
chromosome-positive chronic myeloproliferation?
Cancer Genet Cytogenet. 2000 Apr 1;118(1):14-9.
IF: 1.625
Pajor L, Vass JA, Kereskai L, Kajtár P, Szomor A, Egyed M, Iványi J, Jáksó P. The
existence of lymphoid lineage restricted Philadelphia chromosome-positive acute
lymphoblastic leukemia with heterogeneous bcr-abl rearrangement.
Leukemia. 2000 Jun;14(6):1122-6.
IF: 3.736
Lacza A, Jáksó P, Kereskai L, Szuhai K, Méhes G, Pajor L. Incidence and
distribution of t(12;21) in prognostic groups of pediatric acute lymphoblastic
leukemia.
Orv Hetil. 2000 Jul 2;141(27):1495-500.
72
Tornóczky T, Kálmán E, Jáksó P, Méhes G, Pajor L, Kajtár GG, Battyány I,
Davidovics S, Sohail M, Krausz T. Solid and papillary epithelial neoplasm arising in
heterotopic pancreatic tissue of the mesocolon.
J Clin Pathol. 2001 Mar;54(3):241-5.
IF: 1.866
Pajor L, Lacza A, Jáksó P, Kajtár B. Characteristics of TEL/AML-1 positive acute
lymphoblastic leukemia in Hungarian children.
Med Pediatr Oncol. 2001 Oct;37(4):409-11.
IF: 1.114
Bogar L, Tarsoly P, Jakso P. Characteristics of light and heavy polymorphonuclear
leukocytes.
Clin Hemorheol Microcirc. 2002;27(2):149-53.
IF: 0.623
Pajor L, Kereskai L, Zsdrál K, Nagy Z, Vass JA, Jáksó P, Radványi G. Philadelphia
chromosome and/or bcr-abl mRNA-positive primary thrombocytosis: morphometric
evidence for the transition from essential thrombocythaemia to chronic myeloid
leukaemia type of myeloproliferation.
Histopathology. 2003 Jan;42(1):53-60.
IF: 2.952
Brittig F, Ajtay E, Jaksó P, Kelényi G. Follicular dendritic reticulum cell tumor
mimicking inflammatory pseudotumor of the spleen.
Pathol Oncol Res. 2004;10(1):57-60.
Csernus B, Timár B, Fülöp Z, Bognár A, Szepesi A, László T, Jáksó P, Warnke R,
Kopper L, Matolcsy A. Mutational analysis of IgVH and BCL-6 genes suggests
thymic B-cells origin of mediastinal (thymic) B-cell lymphoma.
Leuk Lymphoma. 2004 Oct;45(10):2105-10.
IF: 1.147
73
Kajtár B, Méhes G, Jaksó P, Kereskai L, Iványi JL, Losonczy H, Egyed M, Tóth
P, Tóth A, Gasztonyi Z, Dömötör M, Pajor L. Cytogenetic and molecular monitoring
of chronic myeloid leukemia.
Orv Hetil. 2006 May 28;147(21):963-70.
Pajor L, Kajtár B, Jáksó P, Lacza A, László R, Radványi G, Mórocz I, Tóth A,
Varga G. Epstein-Barr virus-induced B-cell proliferation of Hodgkin's and Reed-
Sternberg cell pheno- and genotype may develop in peripheral T-cell lymphomas.
Histopathology. 2006 Nov;49(5):553-7.
IF: 3.216
Alpár D, Kajtár B, Kneif M, Jáksó P, László R, Kereskai L, Pajor L. Automated
detection of residual leukemic cells by consecutive immunolabeling for CD10 and
fluorescence in situ hybridization for ETV6/RUNX1 rearrangement in childhood
acute lymphoblastic leukemia.
Cancer Genet Cytogenet. 2007 Feb;173(1):23-30.
IF: 1.544
Kajtár B, Jáksó P, Kereskai L, Lacza A, Méhes G, Bodnár MA, Dombi JP,
Gasztonyi Z, Egyed M, Iványi JL, Kovács G, Marton E, Palaczki A, Petz S, Tóth P,
Sziládi E, Losonczy H, Pajor L. Complex analysis of prognostic factors in chronic
lymphocytic leukemia.
Orv Hetil. 2007 Apr 22;148(16):737-43.
Alpár D, Hermesz J, Pótó L, László R, Kereskai L, Jáksó P, Pajor G, Pajor L,
Kajtár B. Automated FISH analysis using dual-fusion and break-apart probes on
paraffin-embedded tissue sections.
Cytometry A. 2008 Jul;73(7):651-7.
IF: 2.978
74
Idézhető absztraktok
Alpár D, Kajtár B, Tóth J, Nagy Z, Jáksó P, László R, Kereskai L, Pajor L.
Automated evaluation of dual fusion and breakapart FISH probes on paraffin-
embedded tissue sections.
International Society of Heamatology, Congress of the European & African Division,
Budapest, 2007
IF: 5.756
Alpár D, Kajtár B, Hermesz J, Kereskai L, Jáksó P, Pajor G, Nagy Zs, László R,
Pajor L. Automated mapping of translocation i-FISH patterns on praffin-embedded
samples.
XXIV International Congress of the International Society for Analitical Cytology,
Budapest, 2008.
IF: 5.756
Poszterbemutatók tudományos kongresszusokon
Jáksó P, Pajor L. Apoptózis vizsgálatára alkalmas áramlási cytometriás módszerek.
Pathológus Találkozó, Lillafüred, 1997
Szanyi I, Szuhai K, Jáksó P, Pajor L. Chromosomális aneuploiditás vizsgálata
interpházis cytogenetikával (Gyermekkori acut lymphoid leukémia eseteinek
összehasonlító tanulmánya).
Pathológus Találkozó, Lillafüred, 1997
75
Jáksó P, Balázs M, Pajor L, Balogh P. A CD45 vs. SSC gating kiegészítése a RAT 1.7
Monoklonális antitest alkalmazásával malignus hematológiai kórképekben.
I. Magyar Sejtanalatikai Konferencia, Budapest, 1998.
Kálmán E, Jáksó P, Pakodi F, Pajor L. Primér peritoneális mesothelioma. Diagnózis,
modern módszertanok igénybevételével.
Pathológus Konferencia, Gyula,1998.
Jáksó P, Pietsch T, Kovács Gy. Frequent duplication of chromosome 20 in
hepatoblastomas.
Pathologus Találkozó, Sopron, 1999.
Jáksó P, Kálmán E. Megfelelő fluorokróm kiválasztásának jelentősége a flow
cytometriában : alacsony CD10 expresszió detektálása limfómák esetén.
III. Magyar Sejtanalitikai Konferencia, Budapest, 2002.
Kajtár B, Tóth J, Alpár D, Jáksó P, Kereskai L, László R, Nagy Z, Pajor L.
Simultaneous appearance of+8 in Ph+ and Ph- cells during imatinib treatment of
CML: a report of two cases.
International Society of Heamatology, Congress of the European & African Division,
Budapest, 2007
Előadások tudományos kongresszusokon
Jáksó P, Kereskai L, Pajor L. Antigén-expresszió és fényszórás intenzitások
mértékének jelentősége lymphomák flow cytometriás immunphenotipizálása során.
Pathológus Találkozó, Lillafüred, 2000.
76
RÖVIDÍTÉSEK
MDS: mielodiszpláziák (Myelodysplastic syndromes)
RA: refrakter anémia (Refractory anemia)
RARS: refrakter anémia ringed szideroblasztokkal (Refractory anemia with ring
sideroblasts)
RARS-t: refrakter anémia ringed szideroblasztokkal-trombocitózissal (Refractory
anemia with ring sideroblasts - thrombocytosis)
RCMD: refrakter citopénia több sejtvonal diszpláziájával (Refractory cytopenia with
multilineage dysplasia)
RCMD-RS: refrakter citopénia több sejtvonal diszpláziájával-ringed
szideroblasztokkal (Refractory cytopenia with multilineage dysplasia and ring
sideroblasts)
RAEB-I: refrakter anémia blaszt szaporulattal (Refractory anemia with excess blasts,
5-9% blasts)
RAEB-II: refrakter anémia blaszt szaporulattal (Refractory anemia with excess
blasts, 10-19% blasts)
MDS-u: nem klasszifikálható mielodiszpláziák (Myelodysplasia unclassifiable)
MPN: mieloproliferatív neopláziák (Myeloproliferative neoplasms)
CML: krónikus mieloid leukémia (Chronic myelogenous leukemia)
Ph-kromoszóma: Philadephia-kromoszóma
PMF: elsődleges mielofibrózis (Primary myelofibrosis)
PV: policitémia vera (Polycythemia vera)
ET: esszenciális trombocitémia (Essential thrombocythemia)
MCD: hízósejtes betegség (Mast cell disease)
CNL: krónikus neutrofil sejtes leukémia (Chronic neutrophilic leukemia)
CEL-NOC: nem kategorizálható krónikus eozinofil sejtes leukémia (Chronic
eosinophilic leukemia, not otherwise categorized)
HES: hipereozinofíliás szindróma (Hypereosinophilic syndrome)
MPN-u: nem klasszifikálható mieloproliferatív neopláziák (Myeloproliferative
neoplasms, unclassifiable)
77
PDGRFA: trombocita növekedési faktor receptor, alfa (Platelet-derived growth factor
receptor, alpha)
PDGRFB: trombocita növekedési faktor receptor, béta (Platelet-derived growth
factor receptor, beta )
FGFR-1: fibroblaszt növekedési faktor 1(Fibroblast Growth Factor Receptor 1)
JAK2: Janus kinase 2
JAK2V617F: JAK2 gén V617F mutációja
MPL: mieloproliferatív leukémia vírus onkogén (myeloproliferative leukemia virus
oncogene)
HUMARA: humán androgén receptor gén esszé (Human androgen receptor gene
assay)
PCR: polimeráz láncreakció (polimerase chain reaction)
MS-PCR: mikroszatellita-PCR (microsatellite-PCR)
XI: X kromoszóma inaktiváció (X chromosome inactivation)
G6PD: glükóz-6-foszfát dehidrogenáz (Glucose-6-phosphate dehydrogenase)
STRP: short tandem repeat polimorfizmus (short tandem repeat polimorphism)
RFLP: restrikciós fragment hosszúság polimorfizmus (restriction fragment length
polimorphism)
HPRT: hipoxantin-guanin foszforiboziltranszferáz (hypoxanthine-guanine
phosphoribosyltransferase)
PGK: foszfoglicerát kináz (Phosphoglycerate kinase)
p55: palmytoilated mebrane protein
IDS: iduronát-2 szulfatáz (Iduronate-2 sulfatase)
NRXI: nem véletlenszerű X kromoszóma inaktiváció (non-random X chromosome
inactivation)
AI: allélikus kiegyensúlyozatlanság (allelic imbalance)
CDR: leggyakrabban deletált szakasz (common deleted region)
EDTA: etiléndiamin-tetraecetsav (ethylenediaminetetraacetic acid)
B-CLL: B-sejtes krónikus limfoid leukémia (B-cell chronic lymphocytic leukemia)
AML: akut mieloid leukémia (Acute myeloid leukemia)
CMML: krónikus mielomonociter leukémia (Chronic Myelomonocytic Leukemia)
FITC: fluoreszcein-izotiocianát (Fluorescein isothiocyanate)
78
RPE: R-fikoeritrin (R-phycoerythrin)
RPE-Cy5: R-fikoeritrin-cianin-5 (R-Phycoerythrin-Cyanine 5)
TE8: 8-as pH-jú TRIS-EDTA puffer
SDS: nátrium-dodecil-szulfát (Sodium Dodecil Sulfate)
PBS: Phosphate buffered saline
mp.: másodperc
XISZ: X inaktivációs szám
S.D.: sztenderd deviáció
EBV: Epstein-Barr vírus
79