SELEKSİYONA YARDIMCI MARKERLAR(Marker Assisted Selection)

Geleneksel olarak bireylerin kendisini, atalarını ve varsa döllerinin bilgilerini içeren kriterlere göre seleksiyon yapılmaktadır. Elde edilen tüm bu bilgiler geliştirilmiş istatistik metotlar ile değerlendirilerek bireyin damızlık değeri elde edilir.

Son yıllarda moleküler genetik biliminde meydana gelen gelişmeler sayesinde belirli bir özellik için seleksiyon DNA işaretleyicilerinin sağladığı bilgiye göre yapılabilmektedir.

MAS

Seleksiyona yardımcı işaretleyiciler seleksiyonda sağlanan ilerlemeyi iki şekilde artırmaktadır bunlar;

1. İstenen özellik için hangi hayvanın en iyi nitelikte olduğu daha isabetli tahmin edilir. Böylece gerçekten nitelikli hayvanların seçimindeki isabet artar.

2. Generasyon aralığı kısalır Seleksiyona yardımcı markerlar gelecekte geleneksel

seleksiyon yönteminin yerini almasa da seleksiyona ek bilgi sağlaması bakımından önemlidir (DeNise, 1994).

MAS

Bazı durumlarda DNA’nın bir bölgesi bireyin tam olarak fenotipini belirlemektedir. Bu tip DNA bölgeleri büyük etkili kantitatif karakter lokuslarıolarak adlandırılır.

Avusturalya merinosu koyunlarında bulunan Booroola geni, Belçika mavi sığırında bulunan Çift kaslılık geni bu genlere örnek olarak verilebilir.

GEN AKTARIMI

Genomda istenilen bir dizinin izole edilip başka bir genoma aktarılması ile gerçekleştirilmektedir.

Bu teknolojide gen veya genler döllenmiş yumurtaya aktarılır.

Gen Aktarımının Çiftlik Hayvanları Yetiştiriciliğini Etkileyeceği AlanlarGenom haritalarının çıkarılması ile genler

arasındaki ilişkiler, işleyiş mekanizmaları ve Kantitatif Karakter Lokusları belirlenebilmektedir.

Hastalıklara ve parazitlere karşı direnç sağlayan genlerin hayvanlara aktarılması

insan genlerinin hayvanlara aktarımı sağlanarak insan için yararlı tıpta kullanılacak biyomedikal maddeler, hücreler, dokular ve organlar elde edilebilir.

Cinsiyetin belirlenmesinde rol alan genlerin aktarılması ile cinsiyetin kontrolü mümkün olabilecektir.

1990 yılında Tracy adında bir koyuna, insanlarda bazı akciğer hastalıklarının tedavisinde kullanılan alpha-1-antitrypsin (AAT) enziminin genetik kodu aktarılmıştır. Ve Tracy büyüdükten sonra sütünün her litresinde yaklaşık 40 gram AAT salgılamaya başlamıştır.

(http://www.yildizindunyasi.net/bilim%20dunyasi/klonlama-2.htm )

GEN AKTARIMI

Büyüme Hormonu Aktarılmış Atlantik Salmon BalığıGEN AKTARIMI

GENETİK KOPYALAMA

Bir canlının bütün özellikleri o canlının her hücresinin çekirdeğindeki genlerinde bulunur.

Her canlının DNA yapısı farklı dolayısıyla özellikleri de farklıdır. Genetik kopyalama bir canlı ile aynı genetik bilgiye yani aynı DNA yapısına dolayısı ile aynı özelliklere sahip başka bir canlı üretmektir.

1997 yılında İskoçya'nın Edinburg şehrindeki RoslinEnstitüsünden Dr. Ian Wilmut ve ekibi bir koyunun meme bezinden aldıkları hücrenin çekirdeğini metafazsafhasındaki yumurta hücresine aktararak genetik kopyalamayı gerçekleştirmişler ve bunun sonucunda Dolly adlı kuzu dünyaya gelmiştir.

KOPYALAMA

Meme hücresinin alınması Hücre Çekirdeği

Ergin Koyundan Yumurta Hücresinin

Alınması

Yumurta Hücresinin Çekirdeğinin Çıkarılması

Yumurta Hücresi

İki Hücre Elektik Şoku ile Birleştirilmesi

Birleştirilmiş Hücre

Birleştirilmiş Hücrenin Normal Olarak Bölünmeye başlaması

Embriyo

Embriyonun Taşıyıcı Hayvana verilmesi

Taşıyıcı Hayvan

Klonlanmış Kuzu

Verici Hayvan

Hayvancılıkta Genetik Kopyalama

Moleküler biyoloji ve istatistik bilimindeki son

gelişmeler

Büyük etkili kantitatif karakter lokuslarının (QTL)

tanımlanması ve kullanılması

Genomik varyasyonun tanımlanmasını ve

kullanılması

Hayvansal üretimde hayvanların bireysel olarak tanımlanmasıhayvan ıslahı programları için oldukça önemlidir.

Hayvanların tanımlaması için başlangıçta kullanılan kangruplarının tiplendirilmesi ve biyokimyasal polimorfizmlerinizlenmesi, DNA işaretleyicileri (marker) kadar etkili olmamıştır.

Bu DNA baz dizisinde meydana gelen varyasyonunu tanımlamak için DNA temeline dayalı çeşitli teknolojiler geliştirilmiştir. Bu teknolojiler moleküler genetik işaretleyiciler (Marker) olarak bilinmektedir.

Moleküler Markerların

kullanımı

DNA baz sıralarının

belirlenmesiBabalık testleri

Gen haritaları

çıkarılması

Genlerin tespiti

RekombinantDNA

teknolojisiQTL Tespiti

Hayvasal ürünlerin

orjinlerinin belirlenmesi

Evrim tarihi

Genetik Varyasyon

tanımlanması

RAPDRastgele

Çoğaltılmış Polimorfik

DNA

RAPDRastgele

Çoğaltılmış Polimorfik

DNA

RFLPKesilmiş Parça

Uzunluk Polimorfizmi

RFLPKesilmiş Parça

Uzunluk Polimorfizmi

AFLPÇoğaltılmış

Parça Uzunluk Polimorfizmi

AFLPÇoğaltılmış

Parça Uzunluk Polimorfizmi

STRMikrosatellit

STRMikrosatellit

SNPTek NükleotitPolimorfizmi

SNPTek NükleotitPolimorfizmi

RAPD Yöntemi (Rasgele Çoğaltılmış Polimorfik DNA)

İlk olarak Williams ve arkadaşları tarafından 1990 yılında insan DNA’sında kullanılan RAPD yöntemi nükleotit dizileri hakkında herhangi bir bilgiye gereksinim duyulmadan şansa bağlı primerler kullanılarak her canlı türünde uygulanabilmektedir.

Bu teknikte genellikle 10 nükleotid uzunluğundaki primer(başlatıcı) kullanılarak genom üzerinde rastgele bölgelerin DNA amplifikasyonu gerçekleştirilir.

Reaksiyon şartlarının spesifik olmaması rastgele çoğaltıma izin verir.

Üretimi yapılan DNA parçaları (amplikon) agaroz jel üzerinde elektroforeze tabi tutulduğunda bazı parçaların bazı genotiplerde üretilip bazılarında üretilmediği gözlenir

DNA üzerinde tesadüfi bölge çoğaltılmasını sağlar Düşük miktarda DNA yeterlidir (5–50ng)Çabuk sonuç veren bir analiz yöntemidir Diğer tekniklere göre düşük maliyetlidir Yüksek polimorfizm gösterirÇok yönlü bantlar üretir Diğer yöntemlerin aksine radyoaktif madde kullanılmaz

RAPD YÖNTEMİNİN AVANTAJLARI

RAPD YÖNTEMİNİN DEZAVANTAJLARI

Saf, yüksek molekül ağırlıklı DNA gerektirir DNA parçalarının çoğaltılabilmesi için tesadüfi primerler

kullanılır Reaksiyon hassas olduğundan deneme için kullanılan

yöntemin son derece standartize olması gerekir Polimorfizm oranı diğer işaretleyicilerden düşüktür Tekrarlanabilirliği zayıftır.

RAPD YÖNTEMİNİN HAYVANCILIKTA KULLANIMI

Genetik Çeşitlilik Çalışmaları Binbaş ve Cemal, 2006; Elmacı ve ark., 2007; Ali, 2003; Kumar ve ark., 2008

Akrabalık Düzeyinin Belirlenmesi Bhattacharya, 2003Genom Haritalarının Çıkarılması Botstein ve ark., 1980.Genetik Markerların Tespiti Rao, ve ark., 1996Hayvansal Ürünlerin OrjinlerininBelirlenmesi

Ahmed, 2005

RFLP YÖNTEMİ(Kesilen Parça Uzunluk Polimorfizmi)

RFLP yöntemi 1960’lı yıllarda restriksiyon endonükleazlarınkeşfini takiben geliştirilmiştir.

İlk başarılı genetik haritalama çalışmalarında RFLP işaretleyicileri kullanılmıştır.

DNA’da oluşan mutasyonları veya polimorfizmi ortaya koyan ve restriksiyon enzimi ile kesim sonucu oluşan değişik boydaki DNA segmentlerini belirlemeye yönelik bir yöntemdir.

Restriksiyon enzimleri, restriksiyon bölgeleri olarak bilinen çift zincirli DNA'nın sadece spesifik baz dizilerini tanımakta ve diziyi bu bölgelerden kesmektedir.

RAPD yöntemine göre iki kat fazla bilgi sağlar Prob olarak cDNA klonları kullanılabilir. Laboratuarlar arasındaki uyum oldukça iyidir

RFLP YÖNTEMİNİN AVANTAJLARI

Diğer marker metotlarına göre pahalı ve zaman alıcıdır. Her prob ile sadece bir polimorfizm ortaya konmaktadır. Bazı durumlarda mutasyonlar restriksiyon endonükleaz

tanımlama bölgesinde herhangi bir değişime neden olmaz bu nedenle bazı mutasyonlar bu yöntemle tanımlanamazlar

RFLP YÖNTEMİNİN DEZAVANTAJLARI

RFLP YÖNTEMİNİN HAYVANCILIKTA KULLANIMI

Genetik PolimorfizmlerinTanımlanması

Yılmaz ve ark., 2014a; Yılmaz ve ark., 2014b; Yılmaz ve ark., 2013; Sevim ve ark., 2012, Cemal ve ark., 2009; Ahmed, 2005

Rekombinant DNA teknolojisi Solak ve ark., 2000Genom Haritalarının Çıkarılması Botstein ve ark., 1980.

AFLP YÖNTEMİ(Çoğaltılmış Parça Uzunluk Polimorfizmi)

Bu yöntem SRAF (Selective Restriction FragmentAmplification) olarak da bilinmektedir.

Genomik DNA’nın restriksiyon enzimi ile kesimi sonucu oluşan DNA parçalarının bir grubunun selektif çoğaltılması esasına dayanan bir genotipleme metodudur

Bu teknik RFLP'den daha hızlı çalışır ve Değişken sayılı bitişik tekrar (VNTR) polimorfizmlerine dayalı alellerayırdedilir, bunlar poliakrilamit jel elektroforezi ile ayrıştırılır.

Bantlar gümüş boyaması ile görülür. Analiz jelde yapıldığı için, çok yüksek sayılı tekrarlar jelin üst kısmında sıkışabilirler ve birbirlerinden ayırdedilmeleri zor olabilir.

AFLP YÖNTEMİNİN AVANTAJLARI

Daha önceden baz dizilerinin bilinmesine gereksinim yoktur.

Her reaksiyonda çok fazla miktarda polimorfizmtanımlanabilir.

Güvenilir bir yöntemdir. Standardizasyonu sağlanabilir. Elde edilen ürün sürekli olarak çoğaltılabilir.

AFLP YÖNTEMİNİN DEZAVANTAJLARI

Sadece seçilen alleller tanımlanır.Genomların büyüklüğüne göre adapte edilebilen farklı

kitlere gereksinim duyarlar.

AFLP

AFLP YÖNTEMİNİN HAYVANCILIKTA KULLANIMI

Genetik PolimorfizmlerinTanımlanması

Foulley ve ark., 2006; Shengve ark., 2004

Parmak izi teknolojisi Marsan ve ark., 1997; Negrinive ark., 2007; Utsunomiya ve ark., 2014

Mikrosatelitlerin bulunması Nijiman ve ark., 1999, Santanave ark., 2009

Genetik haritalama ve QTL tarama

Otsen ve ark., 1996; Barendseve ark., 1994

MİKROSATELİTLER (STR)

Birçok ökaryotik genomunda nispeten homojen aralıklarla bulunan, 2-5 bazlık ardışık basit tekrarlardan oluşan kısa DNA zincirleri mikrosatellit olarak adlandırılmaktadır.

Yapılan çalışmalarda mikrosatelitlerin genellikle dinükleotittekrarları şeklinde olduğu bildirilmiştir

Mikrosatellitler standart PCR yöntemleri ile çoğaltılabilirler Yüksek düzeyde polimorfizm gösteren mikrosatellitler

mutasyonların detaylı olarak analizine olanak tanır.

Mikrosatellitlerle yapılan analizlerde, alleller arasındaki küçük farklılıklar oldukça önemlidir bu nedenle alleluzunluklarının belirlenmesinde genetik analizörler gibi otomasyon sistemlerinin kullanılması çalışmanın hassasiyetini artırmaktadır.

Mikrosatellitler; DNA’nın kodlanmayan bölgelerinde tüm genoma yayılmış durumda bulunurlar ve çok sayıda kodominant allele sahiptirler.

MİKROSATELLİT YÖNTEMİNİN HAYVANCILIKTA KULLANIMI

Irk içi ve ırklar arası genetik çeşitliliğin saptanmasında

Yilmaz ve ark., 2014; Yilmazve ark., 2015; Cemal ve ark., 2013; Öner ve ark., 2014; Hoda ve Marsan, 2012; Özşensoy ve Kurar, 2014

Babalık Testleri Yılmaz ve Karaca, 2012; Araujo ve ark., 2010; Tian ve ark., 2008; Sherman ve ark., 2004

Tehlike altındaki populasyonlarındurumlarının belirlenmesinde

Whitehouse ve Harley, 2001; Mahmoudi ve ark., 2012; Mahmoudi ve ark., 2013

Genom Haritalama Groenen ve ark., 2000; Rohrerve ark 1994;

DNA’daki tek nükleotit değişiklikleri olarak adlandırılır. Genetik koddaki tek bir nükleotit değişimine bağlı olması

nedeniyle SNP’deki DNA varyasyonunun formu mikrosatellitlere göre daha basittir.

SNP (Tek Nükleotit Polimorfizmi)

Genetik varyasyonun %90’ını oluşturan SNP’lerotomasyona yüksek düzeyde uyum sağlamaları ve diğer işaretleyicilere göre daha duyarlı analizlerin yapılmasına olanak tanımaları nedeniyle hayvancılıkta son yıllarda oldukça geniş bir kullanım alanı bulmuşlardır.

Gen kodlayan bölgelerde görülen SNP varyantları, bir proteinin amino asit sekansını değiştirmekte ve protein fonksiyonunu doğrudan etkilemektedir

Gen kodlayan bölgelerdeki SNPs’in sayısının 10000-50000 dolaylarında olduğu tahmin edilmektedir.

Günümüzde aynı anda çok fazla sayıda SNP’in analizine olanak tanıyan otomasyon sistemleri geliştirilmiştir.

Meydana gelen bu gelişmeler sayesinde yüksek çözünürlüğe sahip SNP çipleri sayesinde genom boyu ilişki analizleri gerçekleştirilebilmektedir.

Elde edilen bilgiler ışığında genomik seleksiyon olanaklı bir hale gelmiştir.

SNP YÖNTEMİNİN HAYVANCILIKTA KULLANIMI

Genetik Çeşitlilik Pariset ve ark., 2006; Pryce ve ark., 2012

Babalık Testleri Hill ve ark., 2008; Harlizius ve ark., 2011; Heaton ve ark., 2014

Genomik Seleksiyon Çalışmaları Daetwyler ve ark., 2012; Eggen, 2012; Goddard ve Hayes, 2007; Slack-Smith ve ark., 2010

Genom Haritalama Kijas ve ark., 2009

RAPD RFLP AFLP STR SNPTarama Yöntemi

PCR PCR PCR PCR PCR

Primer Tipi Rastgele Primer

Diziye Özel Primer

Diziye Özel Primer

Diziye Özel Primer

Diziye ÖzelPrimer

Polimorfizm Tipi Orta-Yüksek

Düşük Orta-Yüksek

Yüksek Yüksek

Otomasyona uyum

Evet Evet Evet Evet Evet

Güvenilirlik Düşük Yüksek Orta Yüksek YüksekFenotipikifadesi

Dominant Kodominant

Dominant Kodominant

Kodominant

MOLEKÜLER İŞARETLEYİCİLERİN KARŞILAŞTIRILMASI

DNA DİZİ ANALİZİ ?Gen yapısı ve genetik kontrol

mekanizmaları hakkında bir çok bilgi edinmemizi sağlamıştır

Herhangi bir canlıya ait DNA örneğindeki baz diziliminin ortaya çıkartılması işlemidir.

Bir bölgenin dizilimi çıkartılabileceği gibi canlıya ait tüm genom dizilişi de çıkartılabilmektedir

DNA Dizi Analizi İle İlgili Çalışmalar1964- Robert HOLLEY 74 nükleotidlik bir tRNA molekülünün dizi analizi1977- Allan MAXAM - Walter GILBERT1977- Frederick SANGER1982- Akiyoshi WADA (Otomatik Analiz Önerisi)1986- Leroy HOOD ve Llyod SMITH -Tam otomatik analiz makinasının

bulunması1990 -Edward UBERBACHER tarafından bir gen bulma programı olan

GRAİL kullanılmaya başlanmıştır1992- 21. kromozomun DNA Dizi Analizi tamamlanmıştır2000- İnsan Genom Projesi katılımcıları ve Celera’ nın insan gen

haritası taslağını tamamladığı açıklanmıştır.2003- yılında Whitehead Enstitüsünde görevli David PAGE ve

arkadaşları Y kromozomunun dizi analizini tamamlamışlardır

DNA DİZİ ANALİZİDNA DİZİ ANALİZİ

Geleneksel Yöntem Geleneksel Yöntem 

Maxam ‐ GilbertMaxam ‐ Gilbert Sanger ‐ CoulsonSanger ‐ Coulson

Yeni Nesil YöntemlerYeni Nesil Yöntemler

Her iki geleneksel yöntem üç temel basamaktan oluşmaktadır.• DNA’nın hazırlanması• Reaksiyonlar• Yüksek voltajlı jel elektroforezi

Günümüzde Sanger – Coulson yöntemi daha yaygın kullanılmaktadır.

GELENEKSEL YÖNTEMLER

MAXAM‐GİLBERT YÖNTEMİ(Kimyasal Kırılma Yöntemi)

Allan MAXAM ve Walter GILBERT tarafından geliştirilmiş bir yöntemdir.

DNA’nın kimyasal yöntemlerle istenen bazlardan kırılması ve hedef nükleotidlerden kırılmış DNA parçaları elde edilmesine dayalı bir yöntemdir.

Walter GILBERT

Purin bazlarının (G-A) kırılmasında dimetilsülfat

Pirimidin bazlarının (C-U-T) kırılması ise hidrazinenzimi ile yapılır.

a. Baz sıraları saptanması istenen DNA, spesifik restriksiyon endonukleaz (Örn., EcoRI) ile kesilerek değişik boylarda çift iplikçikli DNA fragmentleri elde edilir.

b. Nükleotid dizisi saptanacak olan DNA fragmenti 5’-ucundan 32P ile ya da floresan bir boya ile işaretlenir.

c. Radyoktif fosforla işaretli olan bu çift iplikçikler çeşitli yöntemlerle (ısı, NaOH, vs.) denatüre edilerek tek iplikçiklihale getirilirler. • Bu denatüre süspansiyon, 4 eşit kısma ayrılarak tüplere

taksim edilirler. • Tüplerin her birine, çok kontrollü miktar ve süre de spesifik

bazları parçalayan bazı kimyasal maddeler (dimetil sulfat, hidrazin, formik asit, piperidin, vs.) katılarak etkilemeleri sağlanır. Bu maddeler, bir DNA segmentinde sadece bir tür baza etkileyecek tarzda ayarlanmışlardır.

Birinci tüpteki işaretli ve tek iplikçik DNA fragment süspansiyonuna guaninine (G) etkileyen dimetil sülfat (DMS) eklersek bu madde bir segmentte bulunan guaninlerden birine etkileyecek diğerleri ise sağlam kalacaktır.

İkinci tüpe hem guanin (G) ve hem de adenini (A) etkileyen kimyasal maddeler katılır ve reaksiyonunun sağlanması beklenir. Reaksiyonunun sonunda DNA segmentlerindeki hem guanin ve hem de adenin bazları parçalanır.

Üçüncü tüpe sadece timini (T) etkileyen madde katılır. Bu baz parçalanır.

Dördüncü tüpe ise hem timin (T) ve hem de sitozini(C) etkileyen maddeler katılarak reaksiyona bırakılır. Bu tüpte timin ile sitozinbazları parçalanır.

G G+A T T+C

Bu 4 tüpte reaksiyonların sonunda çok değişik boylarda DNA segmentleri meydana gelecektir. Ancak, bunların içinde uçları 32P ile işaretlenmiş

olanlar önemlidir. Birinci tüpte değişik boyda ve sadece G-

bazlarından kesilmiş segmentler bulunacaktır, İkinci tüpte, hem G ve hem de A bazlarından

kesilmiş fragmentler vardır.Üçüncü tüpte,sadece T-bazlarından kesilmiş

fragmentler bulunur. Dördüncü tüpte de, hem T- ve hem C bazlarından

kesilmiş DNA segmentleri vardır.

Bu tüpler ayrı ayrı agarosegel elektroforezise (veya poliakrilamid gel elektroforezis, PAGE) tabi tutularak, elektriksel ortamda, boylarına göre (molekül ağırlıklarına göre) büyükten küçüğe doğru bir seperasyona tabi tutulurlar. Jel üzerinde, büyük segmentler baş tarafta ve küçük segmentler de karşı uç da yer alacaklardır.

Dört tüp için elde edilen bantlar birbirleriyle karşılaştırılır ve değerlendirilmesi yapılır.

1.tüpe ait sütunda, 3 tane G bandı, 2. tüpe ait sütunda, 3 tane G bandı ve 3 tane de A bandı (toplam 6 bant), 3. tüpe ait sütunda, 2 tane T bantı, 4. tüpe ait sütunda, 2 tane T bantı ve 2 tane de C bandı bulunacaktır (toplam 4 bant).

GCAGTACGAT

GCAGTACGAT

SANGER‐COULSON YÖNTEMİ(Zincir Sonlandırma Yöntemi)

DNA dizi analizinde kullanılan diğer bir yöntem de Fred SANGER ve arkadaşlarının geliştirdiği yöntem olan zincir sonlanma yöntemidir (Sanger et al., 1977).

Bu yöntem enzimatik DNA sentezine dayanır ve günümüzün en yaygın kullanılan DNA dizi analizi tekniğidir.

Bu yöntemde dizisi saptanacak olan DNA ipliği yeni sentezlenecek iplik için kalıp olarak kullanılır.

Fred SANGER

Bu yöntem için;dNTP’lereddNTP’lereTek iplikli kalıp DNA’yaKlenov, Taq DNA polimeraz , ters transkriptaz

veya sekuenaz enzimineSerbest OH grubu içeren primere ihtiyaç duyulur

Sanger metodu PCR’ın işleyişine benzemektedir. DNA tek zincir haline getirilir. Reaksiyona girecek olan

karışımda 4 çeşit normal nükleotid bol miktarda bulunur. Bunlar: dATP - dGTP – dCTP - dTTP

Karışımda aynı zamanda dizilimi rastgele sonlandırmak için farklı renklerde floresan ile işaretlenmiş dideoxynucleotidler bulunmaktadır. Bunlar ddATP –ddGTP – ddCTP - ddTTP

Sekanslama reaksiyon karışımı İşaretli primer Kalıp DNA’yı içerir. Hem çift, hem de tek zincirli

DNA kullanılabilir. Yöntemin birinci aşamasında polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tekniği ile elde edilen ve çoğaltılan DNA parçası kalıp DNA olarak adlandırılır

Sekanslanacak kalıp bölgesi

-3′ OHTCGACGGGC…

5′OP-

Primer

Kalıp DNA

Dideoksinükleotidler dört tüpün her birine ayrı ayrıilave edilmiştir

ddATP + ddADÖRT (4) dNTPs dAdGdCdTdGdCdCdCdG

ddCTP + dAdGddCdAdGdCdTdGddCdAdGdCdTdGdCddCdAdGdCdTdGdCdCddC

ddGTP + dAddGdAdGdCdTddGdAdGdCdTdGdCdCdCddG

ddTTP + dAdGdCddTdAdGdCdTdGdCdCdCdG

A

C

G

T

DÖRT (4) dNTPs

DÖRT (4) dNTPs

DÖRT (4) dNTPs

ddGTP ddATP ddCTP ddTTP

1.Tüp 2. Tüp 3. Tüp 4. Tüp

-3′ OH5′OP-

Primer

DNA Polimeraz

Kalıp DNA

dNTPs

Sanger Yöntemi

Enzim eklenir (DNA polymerase), primer ddNTP’lerkarşılaşıncaya kadar uzatılır.

Zincir ddNTP’lerin birleşmesi ile son bulur. Sonlanan zincirlerin sonunda reaksiyona eklenen

ddNTP’ler bulunmaktadır. Toplanan fragmentler sekanslama merdivenini

(sequencing ladder) oluşturur. Sonlanan zincirler elektroforez yöntemi ile gözlenebilir

G A T C

3′GGTAAATCATG5′

Uzun fragmentler

Kısa fragmentlerddG

ddG

YENİ NESİL YÖNTEMLER

Otomatik DNA cihazlarının gelişmesi ile poliakrilamid jellerin yerini polikarbon bileşikleri olan polimerler almıştır. Bu polimerler yoğunluklarına göre farklı ayrım gücüne sahiptirler.

Kullanılan polimer otomatik cihazlarda çapları milimetreden küçük olan cam kapilerler içine yüklenirler. Cihazlarda kapillerelektroforez gerçekleştirilir.

Kapiller elektroforez degrade DNA’larla yapılan çalışmalarda, düşük miktarda PCR ürünü bulunduğu durumlarda geleneksel jel elektroforezine göre daha etkin sonuç vermektedir.

Bu yöntemin standart sapması 0,075-0,1175 baz çifti arasında değişmektedir.

Bu nedenle kapiller elektroforez standart sapması 0,2 baz çifti olan geleneksel jel elektroforezinden daha etkin ayrım yapılabilmektedir.

ABI 310 Genetik Analiz Cihazı (5 farklı flüoresan) veya BeckmanCoulter cihazı (4 farklı flüoresan) rengi aynı anda algılayabilir. Bu özelliği nedeniyle dizi analiz reaksiyonu tek bir reaksiyon tüpünde gerçekleştirilir.

Genotip belirlemede çoklu renk algılama sistemi değişik renklerle işaretlenmiş çeşitli büyüklüklerdeki birden fazla PCR ürününü aynı anda inceleme imkanı sağlar.

Yeni nesil sekanlama yöntemlerinde Sanger’in DNA dizilimi çözme yöntemi geliştirilerek her bir tepkimede kullanılan ddNTP’ler değişik renkli floresanlarla etiketlenir.

Bu teknoloji ile binlerce nükleotidlik bir DNA’nın dizilimi birkaç saatte çözümlenmektedir.

Bu sayede daha büyük DNA dizilimleri bulunmaya başlanmıştır

Yeni Nesil Analiz Sistemlerinden Bazıları

ABI 310 Beckman Coulter SEQ 8000-8800-GXP ABI Solid Illumina Solexa Roche 454 HeliScope Ion Torrent

Ion Torrent İle Gen Analizi

Full insan genom sekanslaması için çıkarılmıştır. Çalışma prensibi olarak pH metre ile aynı prensibi

kullanmaktadır. Çipin içine sekanslayacağımız örneği yükleriz. Yüklediğimiz örnek, çipin altındaki çok sayıdaki

kuyucuklara şansa bağlı bir şekilde dağılır.

Cihaz bu kuyucukların içine her bir seferde dNTP’lerden(A,T,C,G) birini gönderir.

İçerideki tek iplik halinde bulunan DNA’nın komplomentlerinioluştururken bağlanan baz ile birlikte H+ iyonu açığa çıkar.

Bu açığa çıkan H+ iyonu sayesindeki meydana gelen pHdeğişimi ile cihaz kuyuya gönderilen NTP (A,T,C,G) bazlarından hangisinin bağlandığını tespit eder.

Aynı bazın birden fazla bulunduğu durumlarda çıkan H+ iyonuna göre oluşan pik yüksekliği kaç bazın ard arda bulunduğunu gösterir.

Çiftlik Hayvanlarında DNA Dizi Analizi

Hayvan genomunda varyasyonların varlığının saptanmasından sonra moleküler genetikte verimlerden sorumlu genlerin yerlerinin tespitinde kullanılan başlıca yöntemler bağlantı ve asosiasyon analizlerini içeren LD (Linkage Disequilibrium) haritalaması yöntemleridir.

Bu yöntemlerin hedefi gen işlevi hakkında bir önbilgi olmadan verim veya hastalık ile ilişkili olan genlerin genomdaki adreslerinin belirlenmesidir.

DNA dizi analizi ile bütün genomun veya bazı DNA bölgelerinin dizilişi çıkartılarak verimle ilişkilendirilmeye çalışılmaktadır.

DNA dizi analizi temelli yeni yöntemler gen-verim veya gen-hastalık bağlantılarının kurulmasında LD-haritalama yöntemlerinin yerini almaya başlamıştır.

Genom diziliminin çıkartılması bireyler arası tek nükleotid farklılıklarının (SNP: Single Nucleotide Polymorphisms) belirlenmesine ve bu farklılıklarla verim ilişkilerinin belirlenmesine olanak tanımıştır.

Son zamanlarda geliştirilen SNP çipleri ile aynı anda bir DNA örneğinde yüz binlerce hatta birkaç milyon nükleotid farklılığının belirlenmesi, bu bilgilerin ıslah programlarında kullanılmasının yolunu açmıştır.

Tüm bu gelişmeler doğrultusunda DNA dizi analizinin çiftlik hayvanlarında uygulanması ile; Babalık testleri yapılabilmekte Irklar arası farklılık daha ayrıntılı tanımlanmakta Irklarda bireyler arası farklılıklar belirlenmekte SNP çipleri ile genotipleme yapılabilmekte Verimlerle ilgili genom bölgeleri belirlenebilmekte Akrabalık ilişkileri tanımlanabilmekte Fenotipe dayalı bilgilerin yanında genom bilgileri de

kullanılarak daha isabetli damızlık değer tahmini yapılabilmektedir.

Gen İfadesi (Ekspresyon)

Gen ifadesi veya gen ekspresyonu, genetik materyalde (DNA) şifrelenen bilginin ürüne dönüştürülmesini yani ilgili genin fonksiyonunu sergilemesidir. Transkripsiyon ve translasyon olaylarının toplamı olarak da tanımlanabilir.

Transkripsiyon: DNA’da saklanan genetik bilgilerin RNA molekülü (mRNA, tRNA, rRNA) sentezi ile kopyalanması veya yazılmasını ifade eder.

Translasyon: Transkripsiyon ile RNA’ya kopyalanan genetik bilginin bir polipeptit zincir (protein) haline dönüştürülmesini ifade eder.

Gen İfadesiDNA

Transkripsiyon (Okuma)

mRNA

Ribozom

Translasyon (Çeviri)

rRNA tRNA

PROTEİN

Figure 6-4 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

RNA(RiboNükleikAsit)

RNA Polimeraz

RNA

DNA kalıbının ilgili bölgesinin kopya dizilimi yani mesajcı RNA (mRNA) RNA Polimeraz enzimi aracılığıyla çıkartılır

Hücrede Protein Sentezi

Protein = Polipeptit zincir Polipeptid büyüklüğü Ortalama

500-550 aa En büyük polipeptid Titin 38138

kodon En küçük polipeptidler onlarca aa

(küçük hormonlar) (aa: amino asit)

DNA’dan Protein Sentezi Süreci

Figure 6-21 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

mRNA sentezi

• mRNA sentezi sırasında ilk elde edilen RNA molekülü “splicing” işlemi ile işlenerek olgun RNA molekülü elde edilir. Splicing işlemi sırasında “intron” bölgelerine ait bilgiler ayıklanır ve sadece “exon” bölgelerini içeren bilgiler kalır.

Diğer kodlama yapmayan RNA’lar telomer sentezi, X-kromozom inaktivasyonu, proteinlerin ER’ a transferi gibi süreçlerde rol oynarlar

RNA Tipleri ve GörevlerimRNA Haberci RNA, proteinleri kodlarrRNA ribozomal RNA, ribozomların yapısında yer alır ve protein sentezini katalize

edertRNA transfer RNA, aminoasitleri bağlayarak protein sentezinde rol oynarsnRNA küçük nüklear RNA, pre-mRNA kesilmesi ve diğer bazı nükleus içi süreçlerde

rol oynarsnoRNA küçük nükleolar RNA, rRNA modifikasyonunda rol oynarscaRNA küçük kajel RNA, snoRNA ve snRNA modifikasyonumiRNA mikro RNA, gen ekspresyonu regülasyonusiRNA küçük interferans RNA, gen ekspresyonu regülasyonu

DNA kalıbı kullanılarak tamamlayıcı yani komplementer RNA molekülünün

oluşturulmasına “transkripsiyon”, oluşan RNA molekülüne ise “transkript” denir.

Protein sentezinde görev alan 3 unsur:

•mRNA

•tRNA ve

•ribozomlar

Genetik kod

Gen Ekspresyonu analizleri• Gen ekspresyonu analizleri ile hangi dokularda hangi genlerin

aktif olduğu belirlenebilmektedir.

• Analizler için önce ilgili dokulardan RNA ekstraksiyonuyapılmaktadır.

• RNA ekstraksiyonu sonrasında mRNA’dan revers transkriptazenzimi kullanılarak tamamlayıcı yani komplementer(complementer) DNA (cDNA) sentezi yapılmaktadır.

• Ardından istenirse cDNA dizilimi (sekansı) çıkartılabilmekte veya bilinen DNA bölgelerinin var olup olmadığı problar aracılığıyla belirlenebilmektedir.

• Microarray çipler aracılığıyla aynı anda binlerce genin ekspresyon gösterip göstermediği belirlenebilmektedir.

Mikroarray çip ile gen ekspresyonu analizi

Mikroarray çiplerin yapıları

Çiftlik hayvanları bağlamında kantitatif teorileri temel alan fenotipik performans verilerine dayalı genotip tahminleri esas alınarak yürütülen klasik ıslah yöntemleri günümüzde de başvurulan en temel yöntemlerdendir.

Kantitatif genetik teoride hayvanların damızlık değerleri fenotipikveriler kullanılarak tahmin edilmektedir

Özellikle fertilite, ömür uzunluğu, yemden yararlanma yeteneği gibi karmaşık ve ölçülmesi zor özellikler söz konusu olduğunda klasik ıslah yöntemlerinin etkinliği azalmaktadır.

Türlerin genetiğine yönelik bilgilerin artması ve DNA düzeyinde tanımlamalara ulaşılması, fenotipe göre işletilen seleksiyon programlarına, genotipe yönelik bilgilerin de eklenmesi ile genetik ilerleme daha üst seviyelere çıkartılabilmektedir

Bu teknikler ile ırklar içi ve arası genetik varyasyon tanımlanabilmekte, gen haritaları çıkarılabilmekte, pedigrikayıtlarının doğrulukları kontrol edilebilmekte ve genomikseleksiyon çalışmaları gerçekleştirilebilmektedir.

Bu tekniklerin klasik ıslah yöntemleri ile birlikte kullanımı önemli bir bilgi birikimini birlikte getirecektir.

Genetik işaretleyicilerin devreye girmesi daha erken yaşlarda bazı özellikler bakımından genetik yapının tam doğrulukla belirlenmesine ve erken yaşta damızlık seçimine olanak tanıyabilmektedir.

29

Ülkemizde mevcut yerli ırkların moleküler genetik düzeyde tanımlanması, ve elde edilen bilgilerin yürütülen / yürütülecek ıslah çalışmalarında kullanılması önemli kazanımlar sağlayacaktır.

Yerli hayvanlarımıza ait DNA örneklerinin bir DNA bankasında depolanması sağlanmalıdır.

Hayvancılık için çok önemli olan ve halen etkin olarak devrede olan klasik ıslah yöntemlerinin DNA belirteçleri ile beraber kullanımı seleksiyon programlarını daha da etkin kılacaktır.

30