1

PROYECTO FINAL DE SERVICIO SOCIAL

Nombre: AVILA CASTAÑEDA AURORA

Matrícula: 96225466

Teléfono: 57606289

Licenciatura: Biología

División: Ciencias Biológicas y de la Salud (CBS).

Unidad Universitaria: Iztapalapa

Trimestre lectivo: 02-P

Titulo del Proyecto de Investigación: “Simbiosis Micorrícica Arbuscular en Helechos”.

Titulo del trabajo de Servicio Social: Aplicación de diferentes técnicas para larealización de cultivos axénicos y monoxénicos de hongos micorrícicosarbusculares (HMA) con gametófitos de helechos.

Nombre del asesor: M. en C. Irma Reyes Jaramillo.

Lugar de realización: Laboratorio de Edafología AS-104 y S-159. En la UAM-Iztapalapa,Av. San Rafael Atlixco 186, Col. Vicentina, Iztapalapa. 09340. México. D.F.

Clave de registro: B.023.02

2

Nombre: AVILA CASTAÑEDA AURORA

Matrícula: 96225466

Licenciatura: Biología

Título del Proyecto: APLICACIÓN DE DIFERENTES TÉCNICAS PARA LA REALIZACIÓN DECULTIVOS AXÉNICOS Y MONOXÉNICOS DE HONGOS MICORRÍCICOS ARBUSCULARES(HMA) CON GAMETÓFITOS DE HELECHOS.

Registro del Servicio Social y fecha de entrega: B. 023.02 - 27/01/03

Nombre y adscripción del asesor: M. en C. IRMA REYES JARAMILLO Departamento deBiología, D-CBS, UAMI.

Objetivo

1.- Realizar cultivos axénicos y monoxénicos con diferentes especies de hongosmicorrícicos arbusculares y de gametófitos de helechos, para probar su eficiencia en laobtención de inóculo.

2.- Aplicar diferentes técnicas para obtener los cultivos axénicos y monoxénicos ypreservación del material biológico empleado.

Resultados

De macetas trampa se aislaron esporas de HMA de los géneros Gigaspora gigantea yGlomus spp. Se hicieron cultivos axénicos de gametófitos de Blechnum occidentale y deTectaria mexicana. Estos cultivos se inocularon con las esporas de los HMA y seestablecieron así, cultivos monoxénicos, se hizo el seguimiento, se observo abundantecrecimiento micelial durante los primeros seis meses, no se ha observado esporulación.

Por otra parte, se hicieron cultivos axénicos con raíces de jitomate y tomate.Finalmente con raíces de plantas de maíz cultivadas en mesetas trampa, se hicieron

tinciones con azul de Trypan, y de las preparaciones logradas se tomaron microfotografías dehifas, vesículas, esporas intraradicales y arbúsculos

Conclusión

La dificultad de observar y estudiar a los HMA en el suelo ha propiciada que losinvestigadores diseñen distintos medios de cultivo in vitro. A la fecha se han logrado obtenersepas puras empleando raíces transformadas y no transformadas, lográndose así, una granproducción de esporas libres de contaminación que permiten realizar estudios de diferenteíndole. La inoculación de gametófitos de helecho es una propuesta experimental nueva quepretende, aprovechar las características de estas microplantas para producir también inoculóde HMA in vitro. Para lograrlo se requiere seguir experimentando con diferentes especiestanto de helechos como de los HMA, lo cual no se resuelve en un corto plazo.

3

APLICACIÓN DE DIFERENTES TÉCNICAS PARA LA REALIZACIÓN DE CULTIVOSAXÉNICOS Y MONOXÉNICOS DE HONGOS MICORRÍCICOS ARBUSCULARES (HMA)CON GAMETÓFITOS DE HELECHOS.

Introducción

La historia de la micorriza arbuscular se remonta a 460 millones de años, en el períodoDevónico. Evidencias fósiles (Taylor et al., 1995) y moleculares (Simon et al., 1993) señalanesta época como el principio de la asociación entre los antecesores de las actuales plantasterrestres y los actuales hongos formadores de micorrizas arbusculares (HMA) (Zigomicota,orden Glomales) (Morton y Benny, 1990). Desde entonces, los hongos MA y las plantas hanevolucionado conjuntamente hasta nuestro tiempo. El hecho de que, en la actualidad, más del80% de las plantas terrestres formen MA en condiciones naturales (Smith y Read, 1997) dauna idea del éxito de la simbiosis entre ambos organismos (Bago et al., 2000).

Las micorrizas son simbiosis entre hongos y raíces de plantas superiores. Las plantassuministran al hongo fuentes de carbono procedentes del producto de la fotosíntesis, ademásde un nicho ecológico protegido de los fenómenos de antagonismo microbiano en la rizosfera.Por su parte, el hongo ayuda a la planta a absorber nutrimentos del suelo, principalmentefósforo, y nitrógeno entre otros (Azcón et al., 1980).

La infección vesículo arbuscular (VA) origina pocos cambios morfológicos en la raíz.La infección se desarrolla a partir de clamidosporas (esporas de resistencia formadas por elhongo) o bien a partir del micelio originado en una raíz previamente infectada. Lasclamidosporas, que resisten condiciones adversas en el suelo, tales como el calor y la sequía,germinan cuando las circunstancias son favorables, pero los tubos de germinación producidosmueren al no infectar una raíz huésped. En este caso, el tubo de germinación, o la hifainfectiva, forma un apresorio sobre la superficie de la raíz, produciéndose así la penetracióndel hongo, que tiene lugar normalmente entre dos células epidérmicas. A continuación, la hifainvasora se ramifica intercelularmente, de forma rápida, en las células corticales de la raíz, sininvadir endodermis, tejidos vasculares ni meristemos (Azcón et al., 1980).

Poco tiempo después de iniciada la infección se desarrollan los arbúsculos medianteramificaciones dicotómicas de hifas intracelulares. En algunos géneros se forman unasestructuras ovoides llamadas vesículas, que contienen material lipídico de reserva, que sepueden forman intra o intercelularmente y tanto fuera como dentro de la raíz (Azcón et al.,1980).

El interés por el micelio externo de la MA no es reciente, hay diferentes estudios dondese han centrado en la descripción de sus características morfológicas y fisiológicas másrelevantes. Los cuales han puesto de manifiesto que por cada metro de raíz colonizada seproducen entre 7 y 250 m de hifas externas de HMA (Barea et al., 1991;Smith y Read,1997),dependiendo de la especie de hongo implicado y de las condiciones de crecimiento. De igualmanera, el micelio extraradical ha mostrado ser capaz de captar eficazmente nutrimientos(Gianinazzi-Pearson y Azcón-Aguilar, 1991; Smith y Read, 1991; George et al., 1995), enespecial el fósforo (Harrison y Van Buursen, 1995; Jakobsen, 1995), nitrógeno (Johansen etal., 1992, 1993; Tobar et al., 1994), y algunos micronutrimentos esenciales para la planta(George et al., 1995), citados por Bago et al., (2000).

4

En los trabajos arriba citados utilizaron suelo como sustrato de crecimiento. Aunquedefinitivamente el suelo es el sustrato más natural para llevar a cabo estos ensayos, ladificultad de controlar sus cualidades físicas y químicas y su actividad biológica puedendificultar en ocasiones la interpretación de los resultados obtenidos. De igual manera, elestudio de la morfología y arquitectura de las hifas externas se complica por las partículas desuelo que ocultan, probablemente, las estructuras fúngicas más finas. El desarrollo en laúltima década de un sistema de cultivo que permite el crecimiento in vitro en mediosgelificados del hongo MA en simbiosis con una raíz hospedadora, ha contribuido de maneraimportante al estudio de la fisiología y la arquitectura del micelio extraradical de los Glomales(Bago et al., 2000).

Uno de los primeros hechos que se evidenciaron durante el estudio de los hongos MAes que estos organismos no son capaces de completar su ciclo de vida en ausencia de unaraíz hospedera, es decir, en condiciones axénicas (Azcón-Aguilar et al., 1991, 1998). Ningunode los medios de cultivo comúnmente utilizados en el laboratorio para el crecimiento demicroorganismos parece cubrir las necesidades básicas de los hogos MA, lo que ha llevado aconsiderarlos como simbiontes obligados (Azcón-Aguilar et al., 1991,1998). Tras estaconstatación, los siguientes pasos consistieron en intentos para llevar a cabo cultivos dualesen medios gelificados, es decir, cultivos en los que, además del hongo, esté presente la raízde una planta hospedera: es lo que se denomina cultivos monoxénicos (es decir dosorganismos en cultivo puro) (Williams, 1992; Azcón-Aguilar et al., 1998), citados por Bago etal., (2000).

La relación entre micorrizas (VA) y varios grupos de plantas ornamentales es benéfica,se ha observado que en los gametofitos de los helechos puede tener lugar esta asociacióncon hongos endofíiticos, como ocurre en gametófitos subterráneos, aclorofílicos depteridofitas.

En los protalos de los helechos, el hongo micorrícico penetra a través de los rizoides,desarrolla apresorios y en las células protalicas puede formar vesículas y arbúsculos. Loshongos endofíticos infectan las raíces primarias de los esporofitos de manera similar que enlos gametofitos (Schmid y Oberwinkler, 1995).

Las asociaciones micorrícicas son comunes en las raíces de esporofitos de helechos yde pteridofitas, como se conoce desde Rayner (1927). Los hongos endofíticos en gametófitosde briofitas y de peridofitas se iniciaron con Gallaud (1905). Las micorrizas arbusculares degametófitos clorofílicos de helechos es la que menos se conoce, se han estudiado enMarattiaceae, Gleicheniaceae y más recientemente en Gleichenia bifida (Willd.) Spreng(Schmid & Oberwinkler, 1995), citados por Reyes J. I. (2001).

5

Objetivo

1.- Realizar cultivos axénicos y monoxénicos con diferentes especies de hongosmicorrícicos arbusculares y helechos, para probar su eficiencia en la obtención deinóculo.

2.- Aplicar diferentes técnicas para obtener los cultivos axénicos y monoxénicos ypreservación del material biológico empleado.

Metodología

1. Aislamiento de esporas de suelo por el método de decantación (Gerdemann yNicolson,1963; Brundrett et al.,1996) Anexo l.

2. Selección y limpieza de las esporas aisladas, bajo microscopio estereoscópico.

3. Esterilización en superficie y germinación de las esporas de los HMA (Chabot et al.,1992) Anexo ll.

4. Preparación de medios de cultivo Thompson (Klekowski, 1969) Anexo lll, M, MW(Bécard et al., 1988) Anexo V, agar, (Bago et al., 1998).

5. Esterilización y siembra de esporas de helechos (Warne T. R. et al., 1986) Anexo lV.

1. Cultivos axénicos de raíces no transformadas (Chabot et al., 1992; Bago et al., 1998)Anexo Vl.

2. Cultivos monoxénico (Bago et al., 1998) Anexo Vll.

3. Seguimiento de los cultivos.

4. Tinción y observación de estructuras micorrícicas en raíces (Phillips y Hayman, 1970;Brundrett et al.,1996) Anexo Vlll.

5. Microfotografías de preparaciones de raíces micorrizadas obtenidas de macetastrampa.

6. Resultados.

6

Plan de trabajo desarrollado durante el servicio social.

Etapas durante el servicio social 2002-2003

Actividades Agosto Septiembre Octubre Noviembre Diciembre EneroRevisión bibliográfica v v v v v vAislamiento de esporasobtenidas de suelo demacetas trampa por elmétodo de decantación.

v v v v

Selección de y limpieza delas esporas aisladas, bajomicroscopio estereoscópico.

v v v v

Esterilización en superficie ygerminación de las esporasde los HMA.

v v v v

Preparación de medios decultivo.

v v v

Esterilización y siembra deesporas de helechos

v v v v

Seguimiento de los cultivos. v v v v v vTinción y observación deestructuras micorrícicas enraíces.

v v v v

Macrofotografías deestructuras micorrícicas.

v

Cultivos de raíces notrasformadas.

v v v

Evaluación de losresultados.

v v

Objetivos y metas alcanzados

Se realizaron cultivos axénicos de dos especies de helechos Blechnum occidentale yTectaria mexicana, en medios de cultivo el de Thompson y el MW, también se realizaroncultivos axénicos con raíces no transformadas de tomate y jitomate.

Se inocularon cultivos de helechos, con diferentes especies de hongos micorrícicosarbusculares, se observo la germinación y crecimiento de hifas de estos.

Se hicieron preparaciones fijas de raíces micorrizadas obtenidas de macetas trampa,de las cuales se fotografiaron las diferentes estructuras de los hongos micorrícicosarbusculares, que se asociaron a su rizosfera.

7

Resultados

Se obtuvieron esporas de Gigaspora gigantea (Nicol. & Gerd.) Gerd & Trappe y deGlomus sp. de diferentes macetas trampa, con suelo traído de Valle Nacional, Oaxaca y deRincón de Ugarte, Tejupilco de Hidalgo, México. Las esporas se esterilizaron en superficie yse sembraron para su germinación en agar al 8%. Se inocularon con ellas cultivos degametófitos de T. mexicana y B.occidentale, se observo la germinación de las esporas HMA, yel crecimiento de hifas asociándose con los gametófitos de los helechos.

Fig. 1. Preparación fija de esporas de Gigaspora gigantea. e:espora entera, p: pared celular, pi: pared interna, h: hifa desustentación. A la derecha espora rota .

Fig.2. Cultivo de gametófitos de Tectariamexicana inoculado con esporas deHMA.

Se realizaron diferentes medios de cultivo de Thompson y MW donde se sembraronesporas de B. occidentale y T. mexicana.

40 X51.2 X

h p

pi

e

8

Fig. 3. Cultivo de gametófitos de Blechnum occidentale en medio de Tohmpson.

Se hicieron cultivos de raíces de tomate y de jitomate, de los cuales se obtuvo unamejor adaptación de las raíces de tomate.

Fig. 4. Raíces de tomate creciendo en medio MW.

De las macetas trampa con suelo de Rincón de Ugarte y de Morelos, se tiñeron lasraíces de maíz por el método de Phillips y Hayman (1970). Se hicieron preparaciones fijas enlactoglicerol, para observar las estructuras micorrícicas.

Fig. 5. Raíces de maíz teñidas con Trypan azul.

9

En las preparaciones se observaron: vesículas, hifas que se conectan con lasvesículas, hifas de sustentación de las esporas, esporas, y arbúsculos. Las esporasintraradicales en los Glomales es poco frecuente, sin embargo se han encontrado en Glomusintraradices y Glomus agregatum.

Fig. 6. Microfotografía de raíz de maíz; conestructuras micorrícicas. e: espora, h: hifa desustentación, v: vesícula, c: células radicales.

Fig. 7. Vesículas encontradas en la raíz demaíz, suelo de Morelos.

Fig. 8. Hifa unida a una vesícula, paralela aesta estructura se encuentra un arbúsculo.

100.8 X 78.75 X

40.32 X

e

v

c

h

10

Fig. 9. Vesículas y esporas, intraradicalmente. Fig. 10. La flecha de la derecha nos señalauna espora con su hifa de sustentación, lade la izquierda nos señala una vesícula.

Fig. 11. Arbúsculo en raíz de maíz.

Figs. 12 y 13. Formación de esporas intraradicalmente de Glomus sp.

51.2 X 64 X

197 X

252 X75.6 X

arbúsculo

Célula cortical

espora parda

célula cortical

hifa desustentación

11

Discusiones y Conclusiones.

El interés que se ha tenido por los hongos micorricícos arbusculares, ha impulsado alos investigadores, a la formación de diferentes medios de cultivo para su obtención in vitro yasí lograr una sepa pura de las cual se pueda tener la mayor información de suscaracterísticas morfológicas y fisiológicas entre otras, además de hacer estudios de diferenteíndole. En la última década se a creado un sistema de cultivo que permite el crecimiento invitro en medios gelificados del hongo MA en simbiosis con una raíz hospedadora, hacontribuido de manera importante al estudio de la fisiología y a la arquitectura del micelioextraradical de los Glomales (Bago et al., 2000).

La obtención de inóculo de los hongos MA es difícil de tener por medios axénicos yaque se a observado que estos hongos no pueden completar su ciclo vida si no estánasociados en simbiosis con una raíz. Por lo anterior es que se trabaja con cultivosmonoxénicos, donde dos organismos, la raíz de una planta y los HMA interaccionan. De estamanera se a podido obtener inóculo bajo condiciones controladas evitando la contaminaciónpor hongos y bacterias, lo cual no es fácil y menos cuando se extraen esporas del suelo y nose conocen incluso su clasificación.

En la propuesta de realizar cultivos monoxénicos de gametófitos de helechos y HMAse tiene que resolver varios aspectos relacionados con los medios de cultivo, debido a que porseparado in vitro cada uno tiene necesidades diferentes, y al tratarse de organismosautótrofos fotosintéticos, los helechos no pueden crecer en la oscuridad como ocurre en loscultivos monoxénicos con raíces.

Para resolver esto se realizaron medios de cultivo axénicos para los gametófitos de B.occidentale y T. mexicana en medio de Thompson. Por otra parte también se sembraron enmedio MW que es el mas utilizado para los HMA que contiene diferentes micro y macronutrimentos, así como sacarosa, lo cual propicio una mayor contaminación de los cultivos degametófitos.

Otro factor que se ha observado en otras investigaciones como las de Mosse (1962),es que existe una bacteria en los suelos que ayuda a que se lleve a cabo tal simbiosis entrelos HMA y la raíz hospedera, por lo que se han intentado realizar cultivos dixénicos, es decircon tres organismos implicados en un mismo medio de cultivo (Bago et al., 2000), esta puedeser otra razón por la cual la simbiosis en nuestros cultivo sea más lenta y difícil de que suceda.

En las preparaciones de raíces de maíz se pudieron observar con claridad todas lasestructuras micorrícicas de los HMA, aunque no se tiene identificada la especie,probablemente se trate de Glomus intraradices o Glomus agregatum, por la esporulaciónintraradical que se observó.

La aplicación de técnicas y métodos in vitro para la obtención del inóculo micorrícico,nos da información del comportamiento morfológico y fisiológico que presentan los HMA y nospermite experimentar, así como conocer las relaciones que se pueden presentar en cadaespecie, ya sea creciendo con una raíz con otro organismo como los gametófitos de helecho.

La inoculación de gametofitos de helecho no se ha experimentado y se piensa quepuede ser otra forma de obtener inóculo in vitro de HMA, ya que estos son diminutos, tienenestructuras más simples que las raíces (los rizoides), son autótrofos, realizan fotosíntesis y sepueden obtener en gran cantidad a partir de las esporas que por miles se producen en lashojas de los esporofitos. Al tener éxito con los cultivos monoxénicos de los gametófitos y HMA,

12

seria muy fácil hacer el seguimiento de la simbiosis, por la sencillez y transparencia de susestructuras. Sin embargo, todavía hay dificultades en su obtención y se requiere seguirexperimentando con diferentes especies de ambos organismos.

Criterios de evaluación.

La evaluación esta en función del desempeño del estudiante en las diferentesactividades que se llevaron a cabo durante el estudio que se esta realizando. En suparticipación y criterio en diferentes etapas, así como en la elaboración de preparaciones fijas,cultivos, fotografías, etc.

Bibliografía

Azcón, R. 2000. Papel de la simbiosis micorrícica y su interacción con otros microorganismosrizosféricos en el crecimiento vegetal y sostenibilidad agrícola, pp 1-15. In: A, Alarcón y R.Ferrera-Cerrato (eds.). Ecología, Fisiología y Biotecnología de la Micorriza Arbuscular.IRENAT-Colegio de Potsgraduados. Montecillo, México.

Azcón-Aguilar, G. C y Barea, J. M. 1980. Micorrizas. Investigación y Ciencia. 47: 8-16.

Bago, B., Azcón-Aguilar, C., Shachar-Hill, Y. y Pfeffer, P. 2000. El micelio externo de la micorrizaarbuscular como puente simbiótico entre la raíz y su entorno. Pp. 78-92. In: A, Alarcón y R.Ferrera-Cerrato (eds.). Ecología, Fisiología y Biotecnología de la Micorriza Arbuscular.IRENAT-Colegio de Potsgraduados. Montecillo, México.

Bago, B., Azcón-Aguilar, C., Goulet, A. y Piché, Y. 1998. Branched absorbing structures (BAS): afeature of the extraradical mycelium of symbiotic arbuscular mycorrhizal fungi. New Phytol.139: 375-388.

Bago, B., Zipfel, W., Williams, R. M., Chamberland, H., Lafontaine, J. G., Webb, W. W. y Piché, Y.1998. In vivo studies on the nuclear behavior of the arbuscular mycorrhizal fungus Gigasporarosea grown under axenic conditions. Protoplasma. 203: 1-15.

Bécard G., Fortin A. J. 1988 Early events of vesicular-arbuscular mycorrhiza formation on Ri T-DNAtransformed roots. New Phytol. 108: 211-218.

13

Bécard, G. y Piché, Y. 1990. Physiological factor determining vesicular-arbuscular mycorrhizalformation in host and no host Ri T-DNA transformed roots. Can. J. Bot. 68: 1260-1264.

Bécard, G. y Piché, Y. 1992. Establishment of Vesicular-Arbuscular Mycorrhiza in Root Organ Cultura:Review and Proponed Methodology. Methods in Microbiology. 24: 33-42.

Brundrett, M., Bougher, N., Dell, B., Grove, T. & Malajazuk N. 1996. Working with mycorrhiza inforestry and agriculture. 374 pp.

Chabot, S., Bécard, G. y Piché, Y. 1992. Life cycle of Glomus intraradix in root organ culture.Mycologia. 84: 315-321.

Gerdemann, J.H. y Nicolson, T.H. 1963. Spores of mycorrhizal Endogone structured from soil by wetsieving and decanting. Trans. Br. Mycol. Soc. 43: 235-244.

Klekowski, E.J. Jr. 1969. Reproductive biology of the Pteridophyta. lll. A study of the Blechnaceae.Bot. J. Linn. Soc. 62: 361-372.

Phillips, J. M. y Hayman, D. S. 1970. Improved procedures for clearing roots and staining parasitic andvesicular-arbuscular mycorrhizas fungi for rapid assessment of infection. Trans, Br. Micol. Soc.55: 158-161.

Reyes, J. I., Aquiahuatl R. Ma. de los Angeles. 2001. Micorriza arbuscular en gametofitos y jóvenesesporofitos del helecho Dryopteris munchii (Drypteridaceae). XV Congreso Mexicano deBotánica.

Schmid E., Oberwinkler F. 1995. A light- and electron-microscopic study on a vesicular-arbuscularhost-fungus interaction in gametophytes and young sporophytes of the Gleicheniaceae(Filicales). New Phytol. 129:317-324.

Warne, T.R., Walker G., Hickok L.G. 1986. A novel Method for surface-sterilizing and sowing Fernspores. Am. Fern J. 76: 187-188.

14

ANEXO l

Extracción de esporas por decantación y gradiente de sacarosa (Gerdemann yNicolson,1963; Brundrett et al., 1996).

1. Se toma el suelo de una maceta trampa y se vacía en un recipiente de plástico, al cualse le agrega agua y se mueve vigorosamente con las manos disolviendo losagregados especialmente los retenidos por las raíces, para que así se liberen lasesporas y queden en la suspensión del suelo.

2. Posteriormente se deja sedimentar el suelo y posteriormente se decanta por medio deunos tamices.

3. El sobrenadante es tamizado a través de tres tamices de 2.38mm y 0.420mm, lo quequeda en el tercer tamiz de 0.050mm es vaciado a tubos de ensayo.

4. Los tubos con el sobrenadante se pusieron a peso constante para la centrifugación.

5. Se centrifuga durante 4 minutos a 2000 rpm.

15

6. Después, el sobrenadante se desecha ya que contiene esporas muertas y restosorgánicos.

7. Al suelo que queda en el fondo de los tubos, por medio de una pipeta se les agregan10 ml de una solución de sacarosa (70g/100ml), partiendo del fondo del tubo parapoder generar un gradiente, que ayude a la separación de las esporas del resto delsuelo.

8. Los tubos se vuelve a centrifugar durante 16 seg. a 2000rpm.9. De manera rápida el contenido de los tubos se vacía en un tamiz de 0.050 mm y se

enjuaga con abundante agua destilada. El material concentrado en el tamiz serecupera con ayuda de una pipeta en una caja de Petri.

10. Las esporas son separadas y clasificadas bajo el microscopio estereoscópico, pormedio de unas pinzas o una pipeta Pasteur.

11. Las esporas se colocan sobre papel filtro húmedo y sellando la caja de Petri conparafilm se pueden conservar en el refrigerador por varios días.

12. Las raíces que se retiraron de las macetas trampa se enjuagaron y se guardaron enfrascos de vidrio en FAA (200 ml de alcohol al 50% + 13 ml de formol + 0.5 ml de ácidoacético) ya que no se tiñen al momento de su extracción.

16

ANEXO ll

Esterilización de esporas de HMA (Chabot et al., 1992).

ü Esterilización de las esporas en superficie

1. A partir de este paso se trabaja en condiciones estériles.2. Se prepararon las soluciones esterilizantes con cloramina y dos antibióticos.

a) Solución de cloramina T al 2%.b) Solución de gentamicina 10mg/100ml + estreptomicina 20mg/100ml.• Su preparación es con agua destilada estéril.

3. Se colocan las esporas en un frasco estéril con tapadera y se le agrega un poco de lasolución de cloramina T al 2%, se agita durante 10minutos.

4. Se vaciaron en un pequeño tamiz estéril y se coloca en una caja de Petri, donde seenjugaron con agua destilada estéril repetidas veces.

5. La esterilización se repite con antibióticos gentamicina + estreptomicina, se agitadurante 20 min. Se desecha la solución y se enjuaga repetidas veces con aguadestilada estéril.

6. Bajo campana de flujo laminar o bien trabajando cercas de un mechero las esporas sesiembran colocándolas en la superficie del agar contenido en cajas de Petri. Lascuales finalmente se sellan con parafilm y meten en la incubadora a 25°C, en laoscuridad.

17

ANEXO lll

Medio de Cultivo Thompson para Pteridophytas (Klekowski, 1969).

Macroelementos (solución stock)1.Nitrato de amonio NH4NO 32.Fosfato de potasio KH2PO43.Sulfato de manganeso MgSO4

. 7H2O4.Cloruro de calcio CaCl2

2.5 g /100 ml2 g /100 ml1 g /100 ml1 g /100 ml

Microelementos (solución stock)5.Sulfato de manganeso6.Sulfato de copper7.Sulfato de zinc8.Ácido borico9.Molibdeno de amonio10.Sulfato ferroso11.EDTA

0.022 g /l0.024 g /l0.029 g/ l

0.186 g /l0.0035 g /l2.5 g /l3.7 g /l

Ingredientes para el medio de crecimiento1. Un litro de agua destilada2. 10 g de agar3. Macroelementos de solución stock

1234

5 ml25 ml12 ml2 ml

4. Microelementos de solución stock567891011

10 ml10 ml10 ml10 ml10 ml10 ml10 ml

ü Se esteriliza 20 minutos a 120°C que es igual a 15ibü Se vacía en cajas de Petri estériles y se sellan con parafilm, se guardan en el

refrigerador.

18

ANEXO IV

Esterilización de esporas de helechos (Warne et al., 1986).

ü Esterilización de las esporas en superficie.

1. Se debe trabajar en condiciones asépticas.2. Preparar una solución de hipoclorito de sodio (blanqueador) en una relación 1:6.3. Se introducen las esporas en un frasco estéril con tapadera, y se añade un poco de la

solución esterilizante.

4. Mantener en agitación constante durante 2 minutos.5. Las esporas se extraen con una jeringa estéril y se hacen pasar por un filtro (millipor).

19

6. Con la misma jeringa se inyecta agua destilada estéril repetidas veces, para quitar elexceso de clorox.

7. Con unas pinzas estériles se toma el papel que contiene las esporas y se siembran encajas de Petri con medio de Tompson y MW.

8. Con una varilla de vidrio en forma de bastón estéril se esparcen las esporas en laplaca del cultivo.

9. Se sellan las cajas de Petri con parafilm y se guardan en bolsas transparente depolietileno y se exponen a la luz en una germinadora o en una ventana, para quegerminen.

ANEXO V

Medio de Cultivo M y MW para HMA (Bécard et al., 1988).

Reactivos M (1l) MW (1l)Macroelementos de M/MWNitrato de calcioNaFe/EDTAKIMicroelementosVitaminasSacarosaPhytogel o Agar

100 ml100 ml5 ml1 ml1 ml10 ml10 g3.5 g

100 ml100 ml

5ml1 ml1 ml10 ml30 g3.5 g

ü Ajustar el pH a 5.5 con NaOH O KOH; HCl.

20

ü Se esteriliza 20 minutos a 120°C que es igual a 15ib.ü Se vacía en cajas de Petri y se sellan con parafilm, se guardan en el refrigerador.

ANEXO Vl

Cultivos axénicos de raíces no transformadas (Chabot et al., 1991; Bago et al., 1998).

ü Esterilización de semillas en superficie.

1. A partir de este paso se trabaja en condiciones estériles.2. Solución esterilizante de semillas: 50 ml de cloros + 50 ml de agua destilada.3. Se introducen las semillas en un tubo estéril con tapadera se le añade la solución

esterilizante.

21

4. Mantener en agitación constante durante 15 minutos.5. Se realizan tres lavados de 5, 10 y 15 minutos con agua destilada estéril, agitándose

suavemente y constantemente, se desecha el agua en cada lavada.6. Recuperar las semillas y distribuirlas en cajas de Petri que contengan medio M.

7. Sellar las cajas con parafilm y se incuban las cajas a 25°C en la oscuridad hasta quelas semillas hayan germinado y presentado una radícula de unos 4 a 5 cm.

a) Inicio de los cultivos

Con la ayuda de una pinza y un bisturí estériles se cortan las radículas de las semillasgerminadas y se transfieren a las cajas de Petri que contienen el medio MW. Posteriormentese sella la caja con parafilm y son incubadas en la oscuridad a 25°C de 3 a 5 días, hasta quelas raíces atraviesen completamente la placa del medio de cultivo y presente raícessecundarias.

22

b) Mantenimiento de los cultivos

Con la ayuda de una pinza y un bisturí estériles se cortan las zonas apicales de las raíces, setransfieren a nuevas cajas de Petri con medio de MW, estas son selladas y nuevamente seincuban durante 3 a 5 días.El paso anterior se repite tres veces, para “acostumbrar” a las raíces a sus nuevascondiciones in vitro. Tas este tiempo las raíces están preparadas para utilizarse en cultivosmonoxénicos.

ANEXO Vll

Cultivos monoxénico (Bago et al., 1998).

1. Se trabaja en condiciones estériles.2. Se utiliza un medio de cultivo de raíces no transformadas de tomate, jitomate y

gametofitos de helechos.3. En estos medios se colocan las esporas de los hongos micorrícicos arbusculares que

estaban germinando en las cajas de Petri con agar.4. Las caja son selladas con parafilm y se incuban a 25°C.

ANEXO Vlll

Procedimiento para teñir estructuras fungales en raíces de plantas (Phillips y Hayman,1970; Brundrett et al., 1996).

1. Se toman las raíces finas menores de 2 mm de diámetro y se lavan cuidadosamentepor medio de un tamiz. Cuando la tinción no se puede llevar a cabo de inmediato, sedeben guardar las raíces en solución de FAA: 200 ml de alcohol al 50% + 13 ml deformol + 0.5 ml de ácido acético.

23

2. Lavar las raíces si se fijaron en FAA,

3. Colocar las raíces en frascos de vidrio con hidróxido de potasio (KOH) al 10% ydejarlas de 2 a 3 días, esto dependerá de la especie,

4. Decantar la solución de KOH y lavar las raíces tres veces,5. Se cubren las raíces con peróxido de hidrógeno (H2 O2) [567 ml de agua + 30 ml de

peróxido de hidrógeno al 10% + 3 ml de hodróxido de amonio]; esto se debe preparardiariamente. Después de 10-20 minutos decantar la solución anterior y nuevamentelavar las raíces cuidadosamente con agua.

6. Las raíces e cubren con ácido clorhídrico (HCl) al 10% para neutralizar el KOH, seagita el frasco con las raíces y se dejan en el ácido por lo menos 15 minutos.Decantar el ácido y poner el colorante Trypan azul al 0.5% o 0.08% en lactofenolcompuesto de [ácido láctico + glicerol + agua en proporciones 1+1+1], se dejan enesta solución de 2 a 3 días ( hay especies que con menos de una hora se tiñen bien).Para acelerar la tinción se puede calentar en baño María a 90°C.

24

7. Se decanta el Trypan azul lactoglicerol y se reemplaza con lactoglicerol sin trypanazul. Si conserva el frasco bien cerrado la muestra se puede almacenar hasta 6meses.

8. Se separa el material que sirve para las preparaciones fijas bajo un microscopioestereoscópico, las preparaciones son fijadas con lactoglicerol, se eligen algunaspreparaciones y se toman algunas microfotografías en microscopio compuesto.