Číslo dokumentu: sk patentovÝ spis 287626

SLOVENSKÁ REPUBLIKA

(19) SK

PATENTOVÝ SPIS

(11) Číslo dokumentu:

287626

ÚRAD PRIEMYSELNÉHO VLASTNÍCTVA SLOVENSKEJ REPUBLIKY

(21) Číslo prihlášky: 50019-2009 (22) Dátum podania prihlášky: 26. 5. 1999 (24) Dátum nadobudnutia

účinkov patentu: 5. 4. 2011 Vestník ÚPV SR č.: 4/2011

(31) Číslo prioritnej prihlášky: 98110356.7 (32) Dátum podania prioritnej prihlášky: 5. 6. 1998 (33) Krajina alebo regionálna

organizácia priority: EP (40) Dátum zverejnenia prihlášky: 10. 5. 2001

Vestník ÚPV SR č.: 05/2001 (47) Dátum sprístupnenia

patentu verejnosti: 23. 3. 2011 (62) Číslo pôvodnej prihlášky

v prípade vylúčenej prihlášky: 1823-2000 (67) Číslo pôvodnej prihlášky úžitkového vzoru v prípade odbočenia: (86) Číslo podania medzinárodnej prihlášky

podľa PCT: PCT/EP99/03642 (87) Číslo zverejnenia medzinárodnej prihlášky

podľa PCT: WO99/64604 (96) Číslo podania európskej patentovej prihlášky:

(13) Druh dokumentu: B6

(51) Int. Cl. (2011.01):

C12N 15/00 A61K 35/00 C12N 7/00 A61K 48/00 C12Q 1/00

(73) Majiteľ: BOEHRINGER INGELHEIM VETMEDICA GMBH, Ingelheim am Rhein, DE; (72) Pôvodca: Meyers Gregor, Walddorfhaeslach, DE; (74) Zástupca: Majlingová Marta, Ing., MAJLINGOVÁ & PARTNERS, Bratislava, SK;

(54) Názov: Spôsob detegovateľného značenia pestivírusov (57) Anotácia:

Je opísaný spôsob detegovateľného značenia pestivírusov, pri ktorom je inaktivovaná RNázová aktivita, ktorej nosite-ľom je glykoproteín ERNS, pričom RNázová aktivita je inak-tivovaná deléciami a/alebo mutáciami najmenej jednej aminokyseliny uvedeného glykoproteínu, s podmienkou, že aminokyselinami v polohách 297 a/alebo 246, ako sú zná-zornené na obrázku 1 pre CSFV Alfort kmeň ako príklad, alebo v zodpovedajúcich polohách glykoproteínu v iných kmeňoch, nie sú lyzíny, pričom inaktivovanie RNázovej aktivity, ktorej nositeľom je ERNS glykoproteín, vedie k oslabenému pestivírusu.

SK 2

8762

6 B

6

SK 287626 B6

2

Oblasť techniky Predložený vynález sa týka spôsobu detegovateľného značenia pestivírusov inaktiváciou ribonukleázovej aktivity (RNázovej aktivity), ktorej nositeľom je glykoproteín ERNS. 5 Doterajší stav techniky Pestivírusy sú príčinnými agensmi ekonomicky dôležitých ochorení zvierat v mnohých krajinách po ce-lom svete. Doteraz známe vírusové izoláty boli rozdelené do troch odlišných druhov skupín, ktoré spolu tvo-10 ria rod v čeľadi Flaviridae. I. Bovinný virálny hnačkový vírus (BVDV) spôsobuje vírusovú hnačku hovädzieho dobytka (BVD) a ocho-renie sliznice (MD) teliat (Baker, 1987; Moennig a Plagemann, 1992; Thiel a ďalší, 1996). II. Vírus klasickej horúčky ošípaných (CSFV), predtým nazývaný vírus cholery ošípaných, je zodpovedný za klasickú horúčku ošípaných (CSF) alebo choleru ošípaných (HC) (Moennig a Plagemann, 1992, Thiel a ďal-15 ší, 1996). III. Vírus hraničnej choroby (BDV) sa typicky vyskytuje u oviec a spôsobuje hraničnú chorobu (BD). Po-dobné symptómy ako pri MD teliat boli opísané aj po intrauterinnej infekcii jahniat s BDV (Moennig a Pla-gemann, 1992, Thiel a ďalší, 1996). Alternatívna klasifikácia pestivírusov sa nachádza v Becher a ďalší (1995) alebo inde. 20 Pestivírusy sú malé obalené vírusy s jednoreťazcovým RNA genómom s kladnou polaritou, ktorým chýba tak sekvencia 5' čiapočky, ako aj sekvencia 3' poly(A). Vírusový genóm kóduje polyproteín s dĺžkou približ-ne 4000 aminokyselín, z ktorého vznikajú finálne štiepne produkty prostredníctvom kotranslačného a po-sttranslačného spracovania, na ktorých sa podieľajú bunkové a vírusové proteázy. Vírusové proteíny sú zora-dené v polyproteíne v nasledujúcom poradí NH2-Npro-C-ERNS-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A- 25 -NS5B-COOH (Rice, 1996). Proteín C a glykoproteíny ERNS, E1 a E2 predstavujú štrukturálne zložky pesti-vírusového viriónu (Thiel a ďalší, 1991). Zistilo sa, že E2 a v menšom rozsahu ERNS sú cieľmi protilátkovej neutralizácie (Donis a ďalší, 1988; Paton a ďalší, 1992; van Rujn a ďalší, 1993; Weiland a ďalší, 1990, 1992). ERNS nemá membránové ukotvenie a je vylučovaný v značných množstvách z infikovaných buniek. O tomto proteíne sa publikovalo, že vykazuje RNázovú aktivitu (Hulst a ďalší; 1994; Schneider a ďalší, 30 1993; Windisch a ďalší 1996). Funkcia tejto enzymatickej aktivity v životnom cykle vírusu nie je v súčasnos-ti známa. V prípade CSFV vakcínového kmeňa sa publikovalo, že výsledkom experimentálnej deštrukcie RNázy miestne špecifickou mutagenézou je cytopatogénny vírus, ktorého rastové charakteristiky v bunkovej kultúre sú rovnaké ako rastové charakteristiky divého typu vírusu (Hulst a ďalší, 1998). Enzymatická aktivita závisí od prítomnosti dvoch aminokyselinových sekvencií, ktoré sú konzervované medzi pestivírusovou ERNS 35 a rôznymi známymi RNázami rastlinného a hubového pôvodu. Obe tieto konzervatívne sekvencie obsahujú histidínový zvyšok (Schneider a ďalší, 1993). Výsledkom zámeny každého z týchto zvyškov za lyzín v ERNS proteíne CSFV vakcínového kmeňa bola deštrukcia RNázovej aktivity (Hulst a ďalší, 1998). Zavedenie tých-to mutácií do genómu CSFV vakcínového kmeňa neovplyvnilo životaschopnosť vírusu alebo jeho rastové vlastnosti, ale viedol k vírusu, ktorý vykazoval mierne cytopatogénny fenotyp (Hulst a ďalší, 1998). 40 Generovali sa a v súčasnosti sa používajú CSFV a BVDV vakcíny, ktoré obsahujú oslabené alebo usmr-tené vírusy alebo vírusové proteíny exprimované v heterológnych expresných systémoch. Štrukturálny základ oslabenia týchto vírusov používaných ako živé vakcíny nie je známy. To vedie ku riziku nepredpoklada-teľných revertantov po vakcinácii spätnou mutáciou alebo rekombináciou. Na druhej strane je schopnosť inaktivovaných vakcín alebo hetorológne exprimovaných vírusových proteínov (podjednotkové vakcíny) vy-45 volať imunitu dosť nízka. Vo všeobecnosti by živé vakcíny s definovanými mutáciami ako základom oslabenia, mohli eliminovať nevýhody súčasnej generácie vakcín. V súčasnosti nie sú dostupné potenciálne ciele pre oslabovacie mutácie v pestivírusoch. Ďalšia výhoda uvedených oslabovacích mutácií spočíva v ich molekulovej unikátnosti, ktorá umožňuje 50 ich použitie ako rozlišovacích značiek pre oslabené pestivírusy a na ich odlíšenie od pestivírusov z prostre-dia. Keďže je dôležitá účinnosť a bezpečnosť, ako aj detegovateľná profylaxia a liečba pestivírusových infek-cií, existuje silná potreba živých a špecificky oslabených vakcín s vysokým potenciálom indukovať imunitu, ako aj s definovaným základom oslabenia, ktorý umožní aj ich odlíšenie od patogénnych pestivírusov. 55 Preto je technickým problémom, ktorý rieši predložený vynález, poskytnúť špecificky oslabené a detego-vateľne značené pestivírusy na použitie ako živé oslabené vakcíny s veľkou schopnosťou indukovať imunitu, ktoré, ako výsledok tejto metódy, môžu byť aj odlíšiteľné od patogénnych pestivírusov z prostredia.

60

SK 287626 B6

3

Podstata vynálezu Prekvapujúco sa zistilo, že pestivírusy je možné špecificky oslabiť inaktiváciou RNázovej aktivity, ktorej nositeľom je glykoproteín ERNS. Predmetom vynálezu je spôsob detegovateľného značenia pestivírusov, pri ktorom je inaktivovaná RNá-5 zová aktivita, ktorej nositeľom je glykoproteín ERNS, pričom RNázová aktivita je inaktivovaná deléciami a/alebo mutáciami najmenej jednej aminokyseliny uvedeného glykoproteínu, s podmienkou, že aminokyseli-nami v polohách 297 a/alebo 346, ako sú znázornené na obrázku 1 pre CSFV Alfort kmeň ako príklad, alebo v zodpovedajúcich polohách glykoproteínu v iných kmeňoch, nie sú lyzíny, pričom inaktivovanie RNázovej aktivity, ktorej nositeľom je ERNS glykoproteín, vedie k oslabenému pestivírusu. 10 Vo výhodnom uskutočnení sú delécie a/alebo mutácie lokalizované v aminokyselinových polohách 295 až 307 a/alebo 338 až 357, ako je znázornené na obrázku 1 pre CSFV Alfort kmeň ako príklad, alebo v zod-povedajúcich polohách glykoproteínu v iných kmeňoch. V ešte výhodnejšom uskutočnení je RNázová aktivita inaktivovaná deléciou alebo mutáciou aminokyse-liny v polohe 346, ako je znázornené na obrázku 1 pre CSFV Alfort kmeň ako príklad, alebo v zodpovedajú-15 cej polohe glykoproteínu v iných kmeňoch. V ďalšom výhodnom uskutočnení je RNázová aktivita je inaktivovaná deléciou histidínového zvyšku v polohe 346, ako je znázornené na obrázku 1 pre CSFV Alfort kmeň ako príklad, alebo v zodpovedajúcej po-lohe glykoproteínu v iných kmeňoch. Výraz „inaktivácia RNázovej aktivity, ktorej nositeľom je uvedený glykoproteín“ znamená, že modifiko-20 vaný glykoproteín ERNS nie je schopný alebo má zníženú schopnosť hydrolyzovať RNA v porovnaní s nemo-difikovaným divým typom uvedeného glykoproteínu ERNS. Inaktivácia RNázovej aktivity, ktorej nositeľom je glykoproteín ERNS sa môže dosiahnuť deléciami a/alebo mutáciami najmenej jednej aminokyseliny uvedeného glykoproteínu, ako bolo demonštrované tu a v publikácii Hulst a ďalší (1998). Preto sa výhodné uskutočnenie predloženého vynálezu týka živých vakcín, v 25 ktorých je uvedená RNázová aktivita inaktivovaná deléciami a/alebo mutáciami najmenej jednej aminokyse-liny uvedeného glykoproteínu. Ukázalo sa, že glykoproteín ERNS vytvára homodimér viazaný disulfidovou väzbou s veľkosťou približne 97 kD, pričom každý monomér pozostáva z 227 aminokyselín zodpovedajúcich aminokyselinám 268 až 494 CSFV polyproteínu, ako bol opísaný v Rümenapf a ďalší (1993). Prvých 495 aminokyselín, ako sú exprimo-30 vané Alfort kmeňom CSFV je znázornených na obrázku 1 len z referenčných dôvodov. Genómová sekvencia Alfort kmeňa CSFV je dostupná v GeBank/EMBL databáze pod prístupovým číslom J04358; alternatívne je možné zistiť aminokyselinovú sekvenciu BVDV kmeňa CP7 v GenBank/EMBL databáze (prístupové číslo U63479). V glykoproteíne ERNS, ako aj v niektorých rastlinných a hubových proteínoch s RNázovou aktivi-tou sú značne konzervované dve oblasti aminokyselín (Schneider a ďalší, 1993). Tieto dve oblasti sú veľmi 35 dôležité pre RNázovú enzymatickú aktivitu. Prvá oblasť pozostáva z oblasti aminokyselín v polohe 295 až 307 a druhá oblasť pozostáva z aminokyselín v polohe 338 až 357 uvedeného vírusového proteínu, ako je ilu-strovaný na obrázku 1 znázorňujúcom Alfort kmeň CSFV (číslovanie podľa publikovanej odvodenej amino-kyselinovej sekvencie CSFV kmeňa Alfort (Meyers a ďalší, 1989). Aminokyseliny, ktoré sú výnimočne dô-ležité pre RNázovú aktivitu, ako bolo uvedené, v žiadnom prípade nie sú obmedzené presnou polohou, ako je 40 definovaná pre Alfort kmeň CSFV, ktorý je len použitý ako príklad na uvedenie výhodných aminokyselín, ktoré sú v polohe zodpovedajúcej polohe v iných kmeňoch, ako napríklad v BVDV, BDV a všeobecne v pes-tivírusoch, keďže táto sekvencia je vysoko konzervatívna. Pri pestivírusoch, ktorými nie je CSFV Alfort kmeň, sa číslovanie polôh výhodných aminokyselín často líši, ale priemerný odborník v oblasti molekulárnej biológie pestivírusov bude vedieť jednoducho identifikovať tieto výhodné aminokyseliny prostredníctvom 45 polohy vysoko konzervatívnych aminokyselín daného glykoproteínu. V jednom konkrétnom, neobmedzujú-com príklade poloha CSFV Alfort 346 zodpovedá polohe 349 v BVDV kmeni cp7. Predložený vynález demonštruje, že pestivírusy sú životaschopné a kódujú ERNS proteín bez RNázovej aktivity, keď je histidínový zvyšok v polohe 346 vírusového proteínu (číslovanie podľa publikovanej sekven-cie CSFV Alfort/Tübingen (Meyers a ďalší, 1989)), ktorý predstavuje jedno z konzervatívnych možných ak-50 tívnych zvyškov ERNS RNázy, deletovaný. V tomto vynáleze sa tiež demonštrovalo, že výsledkom deletova-nia zodpovedajúceho histidínu v ERNS BVD pestivíruse (poloha 349, číslovanie podľa sekvencie BVDV CP7 GenBank/EMBL databáze (prístupové číslo U63479)) je životaschopný vírus, v ktorom ERNS glykoproteín stratil RNázovú aktivitu. Na rozdiel od bodových mutácií zamieňajúcich jednu aminokyselinu za inú, delečný mutant je vo všeobecnosti oveľa viac stabilný, čo sa týka tvorby revertantov. Infekcia ošípaných s mutantom 55 patogénneho CSFV Alfort/Tübingen exprimujúcim ERNS s deléciou neviedla k horúčke alebo iným typickými klinickými príznakom CSFV infekcie, zatiaľ čo výsledkom infekcie divým typom vírusu bola horúčka, hnač-ka, anorexia, apatia, zníženie počtu B-buniek a poruchy centrálneho nervového systému. Ošípané boli usmr-tené 14 dní po inokulácii, v štádiu umierania, pričom silno krvácali z pokožky a z vnútorných orgánov. Oší-pané infikované mutantom nevykazovali ani virémiu, ani zníženie počtu B-buniek, čo bolo testované na 3, 5, 60

SK 287626 B6

4

7, 10, 14 deň po infekcii, zatiaľ čo CSFV sa jednoducho izoloval zo vzoriek krvi odobratých ošípaným, ktoré boli inokulované divým typom vírusu. Delečný mutant sa zjavne replikoval v živočíchoch, čo vyplýva z in-dukcie neutralizačných protilátok (pozri príklad 3, tabuľka 3c). Imunitná odpoveď na mutantný vírus bola dostatočná na to, aby umožnila prežitie letálnej dávky s 2x105 TCID50 vysokopatogénnej infekcie s CSFV kmeňom Eystrup (König, 1994), ktorý je heterológny vzhľadom na kmeň Alfort. Navyše testované zvieratá 5 nemali po vyzývacej infekcii žiadne klinické príznaky CSFV infekcie, ako horúčku, hnačku, krvácanie, zni-žovanie počtu B-buniek alebo anorexiu. Tieto údaje demonštrujú, že infikovanie ošípaných s delečným mu-tantom indukuje imunitnú odpoveď, ktorá je dostatočná na ochranu proti silnej dávke. Inaktivácia RNázovej aktivity, ktorej nositeľom je glykoproteín ERNS, poskytuje prekvapujúci a nový spô-sob na detegovateľné značenie pestivírusov. Ďalší predmet predloženého vynálezu poskytuje spôsob detego-10 vateľného značenia pestivírusov, ktorý spočíva v tom, že sa inaktivuje RNázová aktivita, ktorej nositeľom je glykoproteín ERNS. Znak, že chýba RNázová aktivita, ktorej nositeľom je glykoproteín ERNS pestivírusov podľa vynálezu, teraz umožňuje detegovateľné značenie týchto pestivírusov. Označené a neoznačené pestiví-rusy alebo vylučovanie ERNS z pestivírusových infikovaných buniek do telesných tekutín je možné zrejmým spôsobom odlíšiť tým, že chýba alebo je prítomná RNázová aktivita glykoproteínov ERNS pri ich izolácii a 15 testovaní tejto enzymatickej aktivity. Množstvo ďalších techník je možné použiť pre pestivírusy s inaktivovanou RNázovou aktivitou, ktorej nositeľom je glykoproteín ERNS, prostredníctvom delécie a/alebo mutácie. Takéto pestivírusy je možné jed-noducho detegovať, vďaka štrukturálnym dôsledkom, ktoré sú výsledkom delécií a/alebo mutácií. Napríklad rozdiely v sekvencii nukleovej kyseliny zmeneného glykoproteínu ERNS je možné detegovať technikami sek-20 venovania nukleovej kyseliny alebo PCR technikami (polymerázová reťazová reakcia), ako je demonštrova-né v príklade 8. Zmenenú proteínovú sekvenciu je možné detegovať špecifickými monoklonálnymi protilát-kami, ktoré nerozoznávajú nezmenené proteíny. Vice versa, je možné detegovať zmenené, a tým štrukturálne značené proteíny aj tým, že sa na ne neviažu špecifické monoklonálne protilátky, ktoré rozoznávajú nezme-nené glykoproteíny ERNS s tou podmienkou, že prítomnosť pestivírusov je možné stanoviť iným spôsobom. A 25 samozrejme výsledkom delécií a/alebo mutácií rušiacich RNázovú aktivitu v označených vírusoch budú od-lišné imunitné odpovede živočíchov v porovnaní s odpoveďami, ktoré sú výsledkom infekcií neoznačeným pestivírusom. 30 Stručný prehľad obrázkov Obrázok 1 Prvých 495 aminokyselín, ako sú exprimované Alfort kmeňom CSFV Sekvencia znázorňuje prvých 495 aminokyselín, ako sú exprimované Alfort kmeňom CSFV (Meyers a 35 ďalší, 1989). Jeden monomér glykoproteínu ERNS uvedeného kmeňa zodpovedá aminokyselinám 268 až 494, ako boli opísané v Rümenapf a ďalší (1993). Podčiarknuté sú zvyšky 295 až 307 a 338 až 357, ktoré predsta-vujú oblasti homologické s rastlinnými a hubovými RNázami (Schneider a ďalší, 1993). Obrázok 2 40 Krivka rektálnej teploty zvierat po testovacej infekcii Denne sa zaznamenávala rektálna teplota od 2. do 18. dňa po infekcii. Podrobne sú uvedené krivky rek-tálnej teploty pre každé zviera skupiny infikovanej vírusom V(pA/CSFV) (neprerušovaná čiara) odvodeným od plazmidu pA(CSFV), alebo vírusom V(pA/C-346-d) odvodeným od plazmidu pA/C-346-d (čiarkovaná čiara). 45 Obrázok 3 Krivka rektálnej teploty zvierat po vyzývacej infekcii Denne sa zaznamenávala rektálna teplota od 1. do 21. dňa po vyzývacej vírusovej infekcii. Zvieratá, ktoré boli infikované vyzývacími letálnymi dávkami CSFV vyzývacieho kmeňa Eystrup, boli 69 dní predtým infi-50 kované mutantným kmeňom C-346-d (V(pA/C-346-d)), ako je podrobne uvedené v texte. Krivka rektálnej teploty je uvedená podrobne pre každé zviera skupiny, ktoré bolo infikované 2x105 TCID50 CSFV vyzývacím infekčným kmeňom Eystrup. Obrázok 4 55 Krivka rektálnej teploty zvierat po testovacej infekcii Denne sa zaznamenávala rektálna teplota od 0. do 18. dňa po infekcii. Krivka rektálnej teploty je podrob-ne uvedená pre každé zviera dvoch skupín infikovaných buď C-346-d (V(pA/C-346-d)) (čiarkovaná čiara), alebo opraveným vírusom C-346-d/RS (V(pA/C-346-d/RS) (spojitá čiara). 60

SK 287626 B6

5

Obrázok 5 Rektálna teplota po vyzývacej infekcii v živočíšnom experimente 2 Denne sa zaznamenávala rektálna teplota od 1. do 10. dňa po vyzývacej vírusovej infekcii. Zvieratá, ktoré boli infikované letálnou dávkou (2x105 TCID50) CSFV vyzývacieho kmeňa Eystrup, boli 37 dní predtým in-fikované mutantom C-346-d. 5 Obrázok 6 Rektálna teplota zvierat ošetrených dvojitým mutantom podľa príkladu 6 Denne sa zaznamenávala rektálna teplota pred vyzývacou vírusovou infekciou a po vyzývacej vírusovej infekcii s mutantom V(pA/C-297-L/346-L). 10 Obrázok 7 Rozlíšenie medzi C-346-d a CSFV bez delécie histidínového kodónu 346 prostredníctvom RT-PCR podľa príkladu 8 a) Pár primérov OI H-3/OI EmsStop umožňuje špecifickú amplifikáciu pásu odvodeného od RNA, v ktorej 15 je deletovaný kodón 346 (C-346-d), ako je podrobne opísané v príklade 8. Na rozdiel od toho, RNA, ktorá nemá túto deléciu, neinteraguje s týmto párom primérov (C-WT, C-346-L, C-346-K). b) a c) Iné dve kombinácie primérov (OI H+2 a OI H+3) amplifikujú pásy odvodené od RNA, v ktorej nie je deletovaný kodón 346. Ak je ako templát použitá RNA z 346-delečného mutantu C-346-d, nie je pozoro-vaný žiaden pás. 20 Príklady uskutočnenia vynálezu Príklad 1 25 Generovanie RNáza-negatívnych pestivírusových mutantov Subklony sa generovali vychádzajúc z kompletnej cDNA klonov pA/CSFV (Meyers a ďalší, 1996a) alebo pA/BVDV (Meyers a ďalší, 1996b), z ktorých je možné získať infekčnú cRNA in vitro transkripciou. Pri CSFV sa klonoval XhoI/SspI fragment pA/CSFV do pBluescript SK+, ktorý bol poštiepený s XhoI a SmaI. Pri BVDV sa klonoval XhoI/BglII fragment z pA/BVDV do plazmidu pCITE-2C, ktorý bol poštiepený rov-30 nakými enzýmami. Z týchto konštruktov sa vyrobila jednoreťazcová DNA spôsobom podľa Kunkela (Kunkel a ďalší, 1987) použitím E. coli CJ 236 buniek (BioRad) a VCMS jednoreťazcového fága (Stratagene). Jedno-reťazcová DNA sa konvertovala na dvojreťazcovú použitím „Phagemid in vitro Mutagenesis Kit“ (fagemi-dového in vitro mutačného kitu) (BioRad). Niektoré syntetické oligonukleotidy, ktoré boli použité ako primé-ry na generovanie požadovaných pestivírusových mutantov, sú uvedené neskôr, pričom sú uvedené ako prí-35 klady: C-297-L: AGGAGCTTACTTGGGATCTG C-346-L: GGAACAAACTTGGATGGTGT C-297-K: ACAGGAGCTTAAAAGGGATCTGGC C-346-K: ATGGAACAAAAAGGGATGGTGTAA 40 C-346-d: GAATGGAACAAAGGATGGTGTAAC B-346-d: CATGAATGGAACAAAGGTTGGTGCAACTGG Dvojvláknová plazmidová DNA sa použila na transformáciu E. coli XL1-Blue buniek (Stratagene). Bak-teriálne kolónie nesúce plazmidy sa izolovali prostredníctvom ampicilínovej selekcie. Pripravila sa plazmi-dová DNA a ďalej sa analyzovala nukleotidovým sekvenovaním použitím T7 polymerázového sekvenačného 45 kitu (Pharmacia). Plazmidy, ktoré obsahovali požadované mutácie a nemali žiadne zmeny na iných miestach, sa použili na konštrukciu kompletných cDNA klonov. V prípade CSFV sa XhoI/NdeI fragment z mutovaného plazmidu začlenil spolu s NdeI/BglII fragmentom odvodeným od plazmidu 578 (pCITE 2A, obsahujúci XhoI/BglII fragment z pA/CSFV) do pA/CSFV poštiepeného XhoI a BglII. Na získanie BVDV CP7 mutantu sa XhoI/BglII fragment obsahujúci deléciu zaviedol do pA/BVDV poštiepeného s XhoI a NcoI spolu s 50 BglII/NcoI fragmentom izolovaným z pA/BVDV/Ins-. Z konštruktu pA/BVDV/Ins- sa transkribovala cRNA, z ktorej, keď sa transfekuje do vhodných buniek, vzniká necytopatogénny BVDV (Meyers a ďalší, 1996b). Amplifikovali sa rôzne klony s úplnou dĺžkou a izolovali sa plazmidy. Prítomnosť požadovaných mutácií sa dokázala DNA sekvenovaním. Po linearizovaní so SrfI (CSFV klony s úplnou dĺžkou) alebo so SmaI (BVDV klony s úplnou dĺžkou) sa transkribovala cRNA, ako bolo predtým opísané (Meyers a ďalší, 55 1996ab). RNA sa purifikovala gélovou filtráciou a fenol/chloroformovou extrakciou a použila sa na transfek-ciu obličkových buniek ošípaných (PK15) alebo obličkových buniek hovädzieho dobytka (MDBK klon B2) (CSFV, respektíve BVDV konštrukty). Transfekcie sa analyzovali imunofluorescenciou antisérami špecific-kými pre vírus. V prípadoch, keď sa mohli izolovať vírusy (pozitívny výsledok imunofluorescencie), sa tieto amplifikovali pasážovaním na rovnakej bunkovej línii, ako bola použitá na transfekčné experimenty. Ďalšia 60

SK 287626 B6

6

analýza CSFV mutantov zahŕňala stanovenie jednokrokových rastových kriviek a charakterizáciu RNA Nor-thern blotom s cDNA sondami špecifickými pre vírus, ako aj transkripčnú polymerizačnú reťazovú reakciu (RT-PCR) a následné sekvenovanie PCR fragmentov, aby sa overila prítomnosť požadovaných mutácií vo vírusovom genóme. Vo všetkých prípadoch sa potvrdila prítomnosť požadovanej mutácie. Všetky izolované vírusy rástli rovnako dobre a produkovali rovnaké množstvo RNA presne ako vírus odvodený od plazmidu s 5 divým typom sekvencie. Životaschopnosť BVDV mutantu sa dokazovala transfekciou príslušnej cRNA a 3 dni potom visiatím bu-niek. Časť buniek sa vysiala na misky s priemerom 3,5 cm, jeden deň potom sa fixovala zmesou acetónu a metanolu a imunofluorescenčne sa analyzovala zmesou BVDV-špecifických monoklonálnych protilátok (Weiland a ďalší, 1989). Zistilo sa, že všetky bunky boli pozitívne, zatiaľ čo kontrolné bunky transfekované 10 neinfekčnou RNA nedávali žiadny signál. Z časti buniek transfekovaných príslušnou cRNA sa vyprodukoval extrakt jedným cyklom zmrazenia a roztopenia. Týmto extraktom sa infikovali čerstvé bunky a dokázalo sa BVDV špecifickou imunofluorescenciou 3 dni po infekcii, že sú BVDV pozitívne. Tabuľka 1 sumarizuje rôzne zmeny zavádzané do konzervatívnych sekvencií ERNS predstavujúcich prav-depodobné aktívne miesto RNázy, ktoré sú kódované uvedenými vírusovými mutantami. 15 Tabuľka 1

Meno Sekvencia v RNázovom motíve Aktivita RNázy

Životaschop-nosť mutantu

pA/CSFV ...SLHGIWPEKIC... ...RHEWNKHGWCNW... + + C-297-L ...SLLGIWPEKIC... ...RHEWNKHGWCNW... - + C-346-L ...SLHGIWPEKIC... ...RHEWNKLGWCNW... - + C-297-L/346-L ...SLLGIWPEKIC... ...RHEWNKLGWCNW... - + C-297-K ...SLKGIWPEKIC... ...RHEWNKHGWCNW... - + C-346-K ...SLHGIWPEKIC... ...RHEWNKKGWCNW... - + C-297-d ...SL_GIWPEKIC... ...RHEWNKHGWCNW... - - C-346-d ...SLHGIWPEKIC... ...RHEWNK_GWCNW... - + C-296/7/8-d ...S___IWPEKIC... ...RHEWNKHGWCNW... - - C-345/6/7-d ...SLHGIWPEKIC... ...RHEWN___WCNW... - - C-345/6-d ...SLHGIWPEKIC... ...RHEWN__GWCNW... - - C-346/7-d ...SLHGIWPEKIC... ...RHEWNK__WCNW... - - C-342-d ...SLHGIWPEKIC... ...RH_WNKHGWCNW... - - C-342/6-d ...SLHGIWPEKIC... ...RH_WNK_GWCNW... - - C-301-d ...SLHGIW_EKIC... ...RHEWNKHGWCNW... - - C-295-S/G ...GLHGIWPEKIC... ...RHEWNKHGWCNW... - + C-300-W/G ...SLHGIGPEKIC... ...RHEWNKHGWCNW... - + C-302-E/A ...SLHGIWPAKIC... ...RHEWNKHGWCNW... - - C-305-C/G ...SLHGIWPEKIG... ...RHEWNKHGWCNW... - - C-300-W/G-302-E/A ...SLHGIGPAKIC... ...RHEWNKHGWCNW... - - C-340-R/G ...SLHGIWPEKIC... ...GHEWNKHGWCNW... - - C-343-W/G ...SLHGIWPEKIC... ...RHEGNKHGWCNW... - - C-345-K/A ...SLHGIWPEKIC... ...RHEWNAHGWCNW... - - C-297-K/346-K ...SLKGIWPEKIC... ...RHEWNKKGWCNW... - + C-297-K/346-L ...SLKGIWPEKIC... ...RHEWNKLGWCNW... - + pA/BVDV ...SLHGIWPEKIC... ...RHEWNKHGWCNW... + + B-346-d ...SLHGIWPEKIC... ...RHEWNK_GWCNW... - + Legenda k tabuľke 1: Test RNázovej aktivity sa uskutočňoval v prechodnom teste. BHK21 bunky sa infikovali vakcínovým ví-20 rusom TF7-3 (Fuerst a ďalší, 1986 a potom sa transfekoval príslušným cDNA konštruktom (5 μg DNA, transfekcia použitím Superfectu podľa odporúčaní dodávateľa (Qiagen)). Po 10 hodinách inkubovania pri 37 °C v CO2 inkubátore sa transfekované bunky lyzovali a spracovali sa na stanovenie RNázovej aktivity, ako je opísané. Životaschopnosť sa stanovila, ako je opísané. 25 Príklad 2 Účinok rôznych mutácií na RNázovú aktivitu ERNS Na testovanie účinku rôznych mutácií na RNázovú aktivitu ERNS sa príslušné bunky infikovali mutantný-mi vírusmi. Pri CSFV sa infekcia uskutočňovala viacnásobnou infekciou (m.o.i.) s hodnotou 0,01. Infekcia divým typom vírusu slúžila ako pozitívna kontrola, pričom neinfikované bunky boli použité ako negatívna 30 kontrola. V 48. hodine po infekcii sa bunky premyli dvakrát fosfátom tlmeným fyziologickým roztokom a

SK 287626 B6

7

lyzovali sa 0,4 ml lyzačného tlmivého roztoku (20mM Tris/HCl; 100mM NaCl, 1mM EDTA, 2 mg/ml hovä-dzieho sérového albumínu 1 % Triton X100; 0,1 % kyselina deoxycholová; 0,1 % dodecylsulfát sodný). Ly-zát sa dal do 1,5ml reakčných skúmaviek, sonifikoval sa (Branson sonifikátor B12, 120 Wattov, 20 sekúnd vo vodnom kúpeli), vyčistil sa centrifugáciou (5 min., 14000 ot./min., Eppendorfová centrifuga, 4 °C) a su-pernatant sa ultracentrifugoval (Beckmann stolová ultracentrifuga, 60 min. pri 4 °C a 45 000 ot./min. v TLA 5 45 rotore). Stanovovanie RNázovej aktivity sa uskutočňovala v celkovom objeme 200 μl obsahujúcom 5 ale-bo 50 μl supernatantu z druhého centrifugačného kroku a 80 μg Poly(rU) (Pharmacia) v RNázovom testova-com tlmivom roztoku (40mM Tris-octan (pH 6,5), 0,5mM EDTA, 5mM ditiotreitol (DTT)). Po inkubovaní reakčnej zmesi pri 37 °C 1 hodinu sa pridalo 200 μl 1,2M kyseliny perchlórovej a 20mM NaSO4. Po 15 mi-nútach inkubovania na ľade sa zmes centrifugovala 15 minút pri 4 °C a 14 000 ot./min. v Eppendorfovej cen-10 trifúge. Ku supernatantu sa pridali 3 objemy vody a analyzovali sa alikvóty zmesi meraním optickej hustoty pri 260 nm použitím Ultrospec 3000 spektrofotometra (Pharmacia). Vo všetkých prípadoch mutácie zavedené do Ems génu úplne zrušili RNázovú aktivitu (tabuľka 1). BVDV mutantná RNázová aktivita sa testovala s materiálom získaným po transfekcii RNA bez pasážo-vania izolovaných vírusov. Bunky transfekované príslušnou RNA sa vysiali 72 hodín po transfekcii na dve 15 misky. O 24 hodín neskôr sa z jednej misky pripravili bunkové extrakty a analyzovala sa ich RNázová aktivi-ta, ako je opísané. Na dôkaz infekcie sa bunky z druhej misky analyzovali imunoflurescentiou s BVDV špe-cifickými monoklonálnymi protilátkami (Weiland a ďalší, 1989) a zistilo sa, že 100 % bolo pozitívnych. Transfekcia sa uskutočňovala s RNA transkribovanou z pA/BVDV/Ins- a z pA/B-346-d, čo je plazmid ekvi-valentný s pA/BVDV/Ins- s tým rozdielom, že obsahuje deléciu kodónu zodpovedajúceho kodónu 346 v 20 CSFV Alfort genóme. Netransfekované MDBK bunky slúžili ako negatívna kontrola. Tabuľka 2a - Stanovenie RNázovej aktivity rôznych vírusov

Alfort C-WT C-297-L C-346-L C-346-d C-346-d/Rs kontrola OD260 2,4 2,3 1,1 1,1 1,1 2,3 1,1

Alfort C-WT C-297-L C-346-L C-297-K C-346-K C-297-L/346-L

OD260 2,09 2,16 0,715 0,77 0,79 0,766 0,77 C-297-K/346-L C-297-K/346-K C-346-d kontrola

OD260 0,725 0,835 0,8 0,84 25 Opis tabuľky 2a: PK15 bunky sa infikovali uvedenými vírusmi v m.o.i (viacnásobná infekcia) s hodnotou 0,01, inkubovali sa pri 37 °C 48 hodín v CO2 inkubátore a potom sa lyzovali a podrobili sa RNázovému testu. Kyslá rozpustná RNA, ktorá bola výsledkom inkubovania s rôznymi bunkovými extraktmi, sa kvantifikovala meraním optic-kej hustoty pri 260 nm. Pozorované rozdiely v RNázovej aktivite neboli spôsobené rôznymi množstvami 30 ERNS proteínu vo vzorkách, pretože po kvantifikácii ERNS rádioaktívnym značením, imunoprecipitáciou a ana-lýzou rádioaktivity s fosforimagerom sa získali podobné hodnoty. Okrem toho zníženie Ems koncentrácie v teste až na jednu desatinu zvyčajného množstva významne nezmenilo výsledné OD hodnoty, z čoho vyplýva, že za zvolených podmienok bol test saturovaný s Ems. CSFV kmeň Alfort; všetky ostatné vírusy sa izolovali z RNA transkribovanej in vitro z plazmidov: napr. 35 C-WT z pA/CSFV; C-297-L z pA/C-297-L; a pod.; C-346-d/Rs vírus sa izoloval z pA/C-346-d/Rs (genero-vaný reverziou mutácie v pA/C-346-d zámenou zodpovedajúceho cDNA fragmentu za ekvivalentný frag-ment odvodený od pA/CSFV); kontrola: extrakt neinfikovaných PK15 buniek. Tabuľka 2b 40

B-WT B-346-d kontrola OD260 2,5 1,1 1,1

Opis tabuľky 2b: MDBK bunky sa infikovali in vitro transkribovanou RNA, vysiali sa 72 hodín po transfekcii a o 24 hodín neskôr sa analyzovala ich RNázová aktivita. Infekcia buniek sa dokázala imunofluorescenčnou analýzou, ako je opísané v texte. 45 B-WT: vírus izolovaný z pA/BVDV/Ins-; B-346-d: vírus izolovaný z pA/B-346-d; kontrola: extrakt z ne-infikovaných MDBK buniek.

SK 287626 B6

8

Príklad 3 Patogenita CSFV po inaktivácii RNázy Na testovanie toho, či deštrukcia RNázovej aktivity ovplyvňuje patogenitu pestivírusov v ich prirodze-nom hostiteľovi, konali sa živočíšne experimenty s mutantom V(pA/C-346-d) (C346-d v tabuľkách). Vírus izolovaný z klonu CSFV s kompletnou dĺžkou bez mutácie (V(pA/CSFV)) slúžil ako pozitívna kontrola (C- 5 -WT v tabuľkách). Pre každý mutant sa použili tri mladé ošípané (plemeno: Nemecký landrace; telesná hmotnosť približne 25 kg). Infekčná dávka bola 1x105 TCID50 na zviera; dve tretiny inokulátu sa podávalo intranazálne (jedna tretina do každej nosnej dierky), jedna tretina sa podávala intramuskulárne. Dve skupiny prebývali v oddelených izolačných jednotkách. Krv sa odoberala zo zvierat dvakrát pred infekciou a na 3., 5., 7., 10., 12. a 14. deň. Okrem toho sa denne merala teplota (obrázok 2). Zvieratá infikované divým typom ví-10 rusu mali typické symptómy klasickej horúčky ošípaných, ako horúčku, ataxiu, anorexiu, hnačky, poruchy centrálneho nervového systému, krvácanie kože (tabuľka 3a). Vírus bolo možné z krvi izolovať na 3 deň (zviera č. 68) a na 5., 7., 10. a 14. deň (zvieratá č. 68, č. 78, č. 121) (tabuľka 3b). Zvieratá sa usmrtili v štádiu umierania na 14. deň po infekcii. V tom čase nebolo možné detegovať žiadne protilátky neutralizujúce vírus. Na druhej strane, zvieratá infikované mutantom nemali klinické symptómy (tabuľka 3a). Teplota ostala nor-15 málna (obrázok 2) počas celého experimentu a zvieratá nikdy neprestali prijímať potravu. Z krvi nebolo možné izolovať vírus. Napriek tomu bolo zrejmé, že zvieratá boli infikované a vírus sa pravdepodobne repli-koval, keďže všetky zvieratá produkovali neutralizujúce protilátky (tabuľka 3c). Tabuľka 3a - Klinické znaky po testovacej infekcii 20

Živočíšny experiment 1

č. zv. infikované

Klinické príznaky

horúčka hnačka poruchy CNS anorexia

krváca-nie ko-

že apatia

umieranie v čase eu-

tanázie

pri nek-ropsii krvá-

canie or-gánov

68 C-WT + + + + + + + + 78 C-WT + + + + + + + + 121 C-WT + + + + + + + + 70 C-346-d - - - - - - - n.a. 72 C-346-d - - - - - - - n.a. 74 C-346-d - - - - - - - n.a.

Opis tabuľky 3a: V štúdii bolo zahrnutých 6 mladých ošípaných (nemecká landrace; s približnou telesnou hmotnosťou 25 kg) v dvoch skupinách (každá skupina žila oddelene). 3 zvieratá sa infikovali s CSFV-WT (1x105 TCID50) a 3 zvieratá s C-346-d (1x105 TCID50). Zaznamenávala sa rektálna teplota a klinické príznaky, ako je podrobne 25 uvedené v tabuľke; n.a.: neuskutočnila sa nekropsia. Tabuľka 3b - Virémia v krvných bunkách po testovacej infekcii

Živočíšny experiment 1 č. zvieraťa infikované Virémia v uvedený deň po infekcii

3 5 7 10 14 68 C-WT + + + + + 78 C-WT - + + + +

121 C-WT - + + + + 70 C-346-d - - - - - 72 C-346-d - - - - - 74 C-346-d - - - - -

Opis tabuľky 3b: 30 Virémia v krvných bunkách sa detegovala spoločnou kultiváciou krvi s PK15 bunkami. Po inkubovaní pri 37 °C počas 72 hodín sa bunky premyli s PBS, fixovali sa so studenou zmesou acetónu a metanolu v ľade a analyzovalo sa ich infikovanie imunofluorescenciou s monoklonálnou protilátkou špecifickou pre glykopro-teín E2 (mAb A18, Weiland a ďalší, 1990). 35

SK 287626 B6

9

Tabuľka 3c - Vývoj CSFV špecifického sérového neutralizačného titra deň p. i. -3 0 17 25 69 76 79 87

č. 70 - - 1 : 18 1 : 162 1 : 162 1 : 162 1 : 486 1 : 1458 č. 72 - - 1 : 18 1 : 54 1 : 486 1 : 1458 1 : 1458 1 : 4374 č. 74 - - 1 : 6 1 : 54 1 : 162 1 : 162 1 : 486 1 : 1458

Opis tabuľky 3c: Protilátkové titre ošípaných infikovaných s vírusovým mutantom C-346-d sa stanovovali v rôznych časo-vých bodoch počas živočíšneho experimentu: 5 50 μl nariedeného séra sa zmiešalo s 50 μl média obsahujúceho 30 TCID50 vírusu (CSFV Alfort/Tübin- gen). Po 90 minútach inkubovania pri 37 °C sa pridalo 100 μl buniek (1,5x104 buniek) a zmes sa vysiala na 96 jamkové platne. Po 72 hodinách sa bunky fixovali s ľadom vychladenou zmesou acetónu a metanolu, a analyzovalo sa či sú infikované prostredníctvom imunofluorescencie s monoklonálnou protilátkou špecific-kou pre glykoproteín E2 (mAb A18, Weiland a ďalší 1990). Na 69. deň po infekcii sa zvieratá infikovali 10 2x105 TCID50 CSFV kmeňa Eystrup. V tabuľke sú uvedené najvyššie sérové riedenia, ktorých výsledkom bo-la neutralizácia vstupného vírusu. Príklad 4 Indukcia ochrannej imunity prostredníctvom infekcie s RNáza negatívnym vírusom 15 Aby sa analyzovalo, či infekcia mutantným vírusom vedie k ochrannej imunite, uskutočnil sa infekčný experiment, približne 9 dní po infekcii s CSFV mutantom, použitím vysoko patogénneho heterológneho CSFV kmeňa (kmeň Eystrup, pôvodne od Behring). Na infekciu sa použilo 2x105 TCID50 vírusu. V niekoľ-kých predchádzajúcich experimentoch sa zistilo, že toto množstvo vírusu je dostatočné na indukciu letálneho ochorenia (König, 1994). Ale zvieratá, ktoré boli predtým infikované s CSFV RNázovým mutantom, nevy-20 kazovali symptómy ochorenia po infekcii. Nemohla byť detegovaná ani horúčka (obrázok 3), ani virémia, ale detegoval sa vzrast neutralizačných protilátok, z čoho vyplýva produktívna infekcia a replikácia infikujúceho vírusu. Príklad 5 25 Potvrdenie oslabovacieho princípu Aby sa dokázalo, že skutočnou príčinou pozorovaného oslabenia mutantného vírusu je delécia histidínu v polohe 346 polyproteínu, a že to nie je následok neidentifikovanej mutácie na inom mieste, znova sa zostavil divý typ sekvencie zámenou 1,6kb XhoI/NdeI fragmentu z klonu pA/C-346-d s úplnou dĺžkou za zodpoveda-júci fragment z pA/CSFV nesúci divý typ sekvencie. Fragment vystrihnutý z pA/C-346-d sa analyzoval nuk-30 leotidovým sekvenovaním, aby sa stanovili mutácie. Okrem delécie tripletu kódujúceho histidín 346 polypro-teínu, nezistil sa žiadny rozdiel oproti sekvencii divého typu. Z cDNA konštruktu z opraveného mutantu mo-hol byť znova vyprodukovaný vírus V(pA/C-346-d/Rs), ktorý rastie rovnako dobre ako divý typ vírusu a má rovnakú RNázovú aktivitu (tabuľka 2A). V druhom živočíšnom pokuse sa na infekciu ošípaných použil opravený vírus. Ako kontrola bol použitý 35 delečný mutant. Znova sa použili dve skupiny pozostávajúce z troch zvierat. Keďže zvieratá boli mladšie (nemecká landrace, s hmotnosťou približne 20 kg) ako tie v prvom experimente, použilo sa 5x104 TCID50 ví-rusu na infekciu. Opäť, zvieratá infikované mutantom nemali žiadne klinické príznaky (tabuľka 5, obrázok 4). Len jedno zviera malo jeden deň horúčku. Napriek tomu vytvárali tieto zvieratá neutralizujúce protilátky a boli chránené proti letálnej CSFV infekcii. Infekcia sa uskutočňovala s 2x105 TCID50 infekčného kmeňa 40 Eystrup. Po infekcii zvieratá nemali klinické príznaky a teplota ostávala rovnaká (obrázok 5). Na rozdiel od ošípaných infikovaných delečným mutantom vykazovali zvieratá inokulované opraveným vírusom divého typu fatálnu klasickú horúčku ošípaných. Jedno zviera muselo byť usmrtené na 11. deň po infekcii a ďalšie dve o tri dni neskôr. Všetky zvieratá mali typické symptómy klasickej horúčky ošípaných, tzn. horúčku, hnačky, anorexiu a patologické znaky ako krvácanie z rôznych orgánov vrátane obličiek. 45

SK 287626 B6

10

Tabuľka 5a Klinické príznaky po testovacej infekcii

Živočíšny experiment 2

č. zv. infikované

Klinické príznaky

horúčka hnačka poruchy CNS anorexia

krvá-canie kože

apatia umieranie v čase eu-

tanázie

pri nek-ropsii krvá-

canie or-gánov

43 C-346-d +* - - - - - - n.a. 47 C-346-d - - - - - - - n.a. 87 C-346-d - - - - - - - n.a.

27 C-346-d/RS + + + + + + + +

28 C-346-d/RS + + + + + + + +

30 C-346-d/RS + + + + + + + +

* horúčka len jeden deň Tabuľka 5a: 5 V štúdii bolo zahrnutých 6 mladých ošípaných (nemecká landrace; s telesnou hmotnosťou približne 20 kg) v dvoch skupinách (každá skupina žila oddelene v podmienkach izolácie). 3 zvieratá sa infikovali mutantom C- -346-d (5.104 TCID50) a 3 zvieratá s C-346/RS (5.104 TCID50). C-346-d/RS bol odvodený od mutanta C-346- -d opravením sekvencie ERNS génu na divý typ. Zaznamenávali a sumarizovali sa rektálna teplota a klinické príznaky; n.a.: neuskutočnila sa žiadna nekropsia. 10 Tabuľka 5b - Diagnostický RNázový test s vírusmi izolovanými z infikovaných zvierat počas virémie

Alfort zv. č. 3 C-297-K

zv. č. 5 C-297-K

zv. č. 27 C-346-d/RS

zv. č. 28 C-346-d/RS

zv. č. 30 C-346-d/RS

kontrola

OD260 1,84 0,60 0,56 1,84 1,93 1,94 0,49 Vírusy izolované z krvi zvierat 3 a 5 na 5. deň po infekcii a z krvi zvierat 27, 28 a 30, čo boli zvieratá ži-vočíšneho experimentu 2 (opísaný v príklade 5), na 7 deň po infekcii sa množili v tkanivovej kultúre, titrovali 15 sa a testovala sa ich RNázová aktivita, ako bolo opísané. Neinfikované PK15 bunky a bunky (kontrola) infi-kované s divým typom CSFV (Alfort) slúžili ako kontroly. Zvieratá 3 a 5 boli infikované mutantom C-297-K, zatiaľ čo zvieratá 27, 28 a 30 boli infikované mutantom C-346-d/RS, ako je uvedené v tabuľke. Príklad 6 20 Účinky dvojitej mutácie ERNS Na testovanie účinkov dvojitej mutácie ERNS z hľadiska schopnosti príslušného vírusu replikovať sa v je-ho prirodzenom hostiteľovi a z hľadiska patogenicity, uskutočnil sa živočíšny experiment s mutantom V(pA/C-297-L/346-L). Vírus izolovaný z klonu kompletného CSFV bez mutácie (V(pA/CSFV) slúžil ako pozitívna kontrola. Pre každý mutant sa použili tri mladé ošípané (plemeno: nemecký landrace; telesná 25 hmotnosť približne 25 kg). Infekčná dávka bola 1x105 TCID50 na zviera; dve tretiny inokulátu sa podávalo intranazálne (jedna tretina do každej nosnej dierky), jedna tretina sa podávala intramuskulárne. Krv sa odobe-rala zo zvierat pred infekciou (deň 0) a na 5., 8., 12. a 20. deň. Okrem toho sa denne merala teplota (obrázok 6). Zvieratá infikované dvojitým mutantom nemali žiadne klinické symptómy a nikdy neprestali prijímať po-travu. Počas celého experimentu zvieratá nemali horúčku (zvieratá 45/2 a 45/3) okrem zvieraťa 45/1, ktoré 30 malo na 8. deň horúčku pravdepodobne kvôli bakteriálnej infekcii spôsobenej poranením na pravej zadnej nohe. Po ošetrení tohto zvieraťa s antibiotikami na 10. deň sa teplota vrátila na normálnu hodnotu do jedného dňa (obrázok 6). Z krvi všetkých zvierat sa na 5. deň izoloval vírus, zatiaľ čo neskoršie sa už nedetegovala žiadna virémia (tabuľka 6a). Všetky zvieratá tvorili neutralizačné protilátky (tabuľka 6b). U zvieraťa 45/1 sa neutralizačný titer stanovoval znova po približne 4,5 mesiaci po infekcii a zistilo sa, že je 1:4374. Takže vý-35 sledkom infekcie dvojitým mutantom je dlhotrvajúca imunologická pamäť.

SK 287626 B6

11

Tabuľka 6a - Test virémie Dni po infekcii 5 8 12

ošípaná 45/I + - - ošípaná 45/II + - - ošípaná 45/III + - -

Tabuľka 6b - Neutralizačné titre

Zviera deň 0 20. deň po infekcii 45/1 - 1 : 128 45/2 - 1 : 256 45/3 - 1 : 256

Príklad 7 5 Imunogénnosť a oslabovací princíp BVDV vírusu „B-346-d“ Tento experiment bol navrhnutý, aby sa preskúmal oslabovací princíp, ako aj imunogénnosť BVDV víru-su „B-346-d“ izolovaného z pA/B-346-d jeho porovnaním s „B-WT“ vírusom izolovaným z pA/BVDV/Ins-. Je samozrejmé, že vírus „B-346-d“ je mutovaný v pôvodnej BVDV polohe 349, ale je označený „B-346-d“, aby bola uvedená poloha vo vzťahu k CSFV Alfor polohe 346 na obrázku 1. 10 Vybrali sa tri skupiny BVDV sérumnegatívnych zvierat vo veku 3 až 6 mesiacov. Skupiny 1 a 2 obsaho-vali po 5 zvierat a skupina 3 obsahovala 3 zvieratá. Zvieratá skupiny 1 boli infikované podaním 2x106 TCID50 B-346-d a zvieratá skupiny 2 boli infikované podaním 2x106 TCID50 B-WT v objeme 5 ml na poda-nie. Zvieratá sa infikovali intramuskulárne (gluteálny sval), intranazálne a subkutánne (nad lopatkou). V priebehu 14 dní po infekcii sa monitorovala virémia oboch skupín prostredníctvom parametrov ako virémia v 15 krvných bunkách a rozšírenie vírusu v nosných steroch. Okrem toho boli monitorované klinické parametre ako rektálna teplota, počet bielych krviniek a všeobecné zdravotné parametre. Ochranná imunita proti infekcii s antigeneticky hetorológnym a virulentným BVDV izolátom (č. 13) sa skúmala prostredníctvom vyzývacej infekcie 77 dní po infekcii zvierat skupiny 1 s B-346-d. Zvieratá skupiny 3 slúžili ako kontrola vyzývacej infekcie a boli infikované v súlade s postupom použitým pre zvieratá skupi-20 ny 1 s virulentným BVDV izolátom. BVDV vírus (č. 13) patrí do odlišnej antigenetickej skupiny (typ II), za-tiaľ čo B-346-d vírus patrí do antigenetickej skupiny typu I podľa klasifikácie opísanej v Pellerin, C. a ďalší, 1994. Zvieratá skupiny 1 a 3 boli infikované podaním 2x106 TCID50 BVDV izolátu v objeme 5 ml na poda-nie. Zvieratá sa infikovali intramuskulárne (gluteálny sval), intranazálne a subkutánne (nad lopatkou). V priebehu 14 dní po infekcii sa monitorovala virémia oboch skupín prostredníctvom parametrov ako virémia v 25 krvných bunkách a rozšírenie vírusu v nosných steroch. Okrem toho boli monitorované klinické parametre ako rektálna teplota, počet bielych krviniek a všeobecné zdravotné parametre. Po infekcii s B-346-d zvieratá nemali žiadne typické klinické symptómy BVDV infekcie, ako napríklad zvýšenie rektálnej teploty (tabuľka 7a), ani žiadne respiračné klinické symptómy (neuvedené). Zo zníženia virémie v krvných bunkách (tabuľka 7b) a z redukovaného výskytu vírusu v nosných steroch 30 (tabuľka 7c) zrejmým spôsobom vyplýva oslabenie B-346-d v porovnaní s B-WT. Virulentný BVDV izolát č. 13 indukoval u zvierat skupiny 3 silnú virémiu s typickými známkami BVDV infekcie, ako sú zvýšenie rektálnej teploty počas niekoľkých dní (tabuľka 7d), silná leukopénia (tabuľka 7e), rozšírená virémia krvných buniek (tabuľka 7f) a rozšírenie vírusu v nosnej sterovej tekutine (tabuľka 7g). Na rozdiel od toho, zvieratá skupiny 1, ktoré boli vakcinované infikovaním s B-346-d, nemali takmer žiadne kli-35 nické príznaky typické pre BVDV infekciu po vyzývacej infekcii s BVDV izolátom č. 13. Nevyskytol sa žiadny významný vzrast rektálnej teploty po infekcii (tabuľka 7d). Pozorovaná leukopénia bola veľmi okra-jová čo do rozsahu a trvania (tabuľka 7e). Z krvi nebolo možné izolovať žiadny BVDV (tabuľka 7f) a len jedno zviera malo vírus rozšírený v nosnom sterovom sekréte (tabuľka 7g). Z toho vyplýva, že infekcia s B-346-d indukuje silnú imunitu, ktorá zrejmým spôsobom redukuje klinické 40 príznaky, rozšírenie vírusu a virémiu krvných buniek po vyzývacej infekcii heterológnym BVDV izolátom. Tabuľka 7a - Priemerné rektálne teploty v skupine 1 (B-346-d) a 2 (B-WT) Deň štúdie 0 1 2 3 4 5 6

skup. 1 38,8 39,1 39,0 38,7 38,8 38,7 38,7 skup. 2 38,8 39,0 38,9 38,6 38,6 38,7 38,6

Deň štú-

die 7 8 9 10 11 12 13 14

skup. 1 38,5 38,7 38,5 38,5 38,5 38,4 38,9 38,7 skup. 2 38,4 39,1 38,4 38,7 38,6 38,7 38,6 38,6

SK 287626 B6

12

Zvieratá skupiny 1 sa infikovali v deň 0 s 6x106 TCID50 B-346-d, zatiaľ čo zvieratá skupiny 2 sa infikova-li s 6x106 TCID50 B-WT. Tabuľka 7b - Virémia krvných buniek v skupine 1 a 2 5

Sk. Zviera Prvý deň zazname-nania výskytu v no-

se

Posledný deň za-znamenania výskytu

v nose

Trvanie zaznamená-vania v nose (dni)

Priemerné trvanie v skupine (dni)

1 1 6 6 1 1,4 2 4 6 2 3 5 5 1 4 - - 0 5 6 9 3 2 6 4 8 5 4,4 7 4 7 4 8 4 7 4 9 4 7 4 10 4 8 5

EDTA vzorky krvi sa odoberali do 10 dňa po infekcii s B-346-d, respektíve B-WT. 0,2 ml krvi sa pridalo do každej z troch kultúr (Cte) buniek teľacích semenníkov s médiom obsahujúcim heparín (1 jednotka na ml, aby sa zabránilo zrážaniu). Po inkubovaní cez noc sa inokulum/médium nahradilo čerstvým médiom bez he-parínu. Po 4 až 6 dňovej inkubácii sa BVDV infikované bunky detegovali imunofluorescenciou s polyklonál-10 nym sérom špecifickým pre BVDV. Negatívne kultúry sa zmrazili a následne rozmrazili. 0,2 ml z nich sa dvakrát prepasážovalo na Cte bunkách, aby sa potvrdila neprítomnosť BVDV. Tabuľka 7c - Výskyt vírusu v nosnej tekutine


se


v nose

Počet dní, kedy bol vírus detegovaný v

sekréte

Priemerný počet dní, kedy bol vírus dete-govaný, na skupinu

1 1 4 8 4 2,6 2 6 6 1 3 4 4 1 4 5 7 3 5 3 6 3 2 6 6 8 3 3,6 7 5 7 3 8 5 8 4 9 5 6 2 10 3 9 6

15 Nosný sekrét sa centrifugoval (1000 ot./min.), aby sa odstránili veľké nečistoty a kontaminanty. Superna-tantová tekutina sa odobrala a 0,2 ml z nej sa vysialo do každej z troch bunkových kultúr. Po inkubovaní cez noc sa inokulum/médium nahradilo čerstvým médiom. Po 4 až 6 dňovej inkubácii sa BVDV infikované bun-ky detegovali imunofluorescenciou s polyklonálnym sérom špecifickým pre BVDV. 20 Tabuľka 7d - Priemerné rektálne teploty skupín 1 a 3 Deň štúdie -2 -1 0 1 2 3 4 5

skup. 1 38,4 38,6 38,5 38,5 38,6 38,4 38,4 38,4 skup. 3 38,8 39,1 38,8 39,1 39,4 39,7 40,2 40,2

Deň štúdie 6 7 8 9 10 12 14

skup. 1 38,3 38,4 38,4 38,4 38,4 38,4 38,5 skup. 3 40,4 41,3 40,2 40,1 40,2 40,8 40,4

Rektálne teploty sa merali do 16 dní po vyzývacej infekcii. Zvieratá skupiny 1 a 3 sa infikovali 6x106 TCID50 virulentného BVDV izolátu č. 13. 25

SK 287626 B6

13

Tabuľka 7e - Priemerný počet bielych krviniek Deň štúdie -2 -1 0 1 2 3 4 5

skup. 1 11,9 11,9 11,3 10,8 9,2 8,2 8,9 9,9 skup. 3 11,7 15,8 13,8 11,1 7,7 9,8 7,4 6,8

Deň štúdie 6 7 8 9 10 12 14

skup. 1 11,2 11,6 11,6 10,6 10,8 10,8 9,4 skup. 3 7,5 8,7 7,0 8,1 6,2 6,4 6,2

EDTA vzorky krvných buniek sa odoberali denne odo dňa -2 do dňa 14 po vyzývacej infekcii z každého 5 zvieraťa v oboch skupinách. Počty bielych krviniek v EDTA krvných vzorkách sa stanovili použitím Sysmex Micro-Cell Counter F800. Tabuľka 7f - BVDV izolovaný z krvných vzoriek 10

Sk. Zviera Prvý deň detegova-nia vírusu v krvi

Posledný deň dete-govania vírusu v kr-

vi

Trvanie zaznamená-vania v krvi (dni)

Priemerné trvanie (dni)

1 1 - - 0 0 2 - - 0 3 - - 0 4 - - 0 5 - - 0

3 11 3 10 8 9,7 12 3 14 12 13 3 9 9

EDTA vzorky krvi sa odoberali do 10 dňa po vyzývacej infekcii. 0,2 ml krvi sa pridalo do každej z troch kultúr (Cte) buniek teľacích semenníkov s médiom obsahujúcim heparín (1 jednotka na ml, aby sa zabránilo zrážaniu). Po inkubovaní cez noc sa inokulum/médium nahradilo čerstvým médiom bez heparínu. Po 4 až 6 dňovej inkubácii sa BVDV infikované bunky detegovali imunofluorescenciou s polyklonálnym sérom špeci-15 fickým pre BVDV. Negatívne kultúry sa zmrazili a následne rozmrazili. 0,2 ml z nich sa dvakrát prepasážo-valo na Cte bunkách, aby sa potvrdila neprítomnosť BVDV. Tabuľka 7g - Rozšírenie vírusu v nosnej tekutine 20


se


v nose

Trvanie výskytu v nose (dni)

Priemerné trvanie (dni na skupinu)

1 1 3 4 2 0,8 2 - - 0 3 - - 0 4 - - 0 5 4 5 2

3 11 3 14 12 10 12 3 14 12 13 3 8 6

Nosný sekrét sa centrifugoval (1000 ot./min.), aby sa odstránili veľké nečistoty a kontaminanty. Superna-tantová tekutina sa odobrala a 0,2 ml z nej sa vysialo do každej z troch bunkových kultúr. Po inkubovaní cez noc sa inokulum/médium nahradilo 2 ml čerstvého média. Po 4 až 6 dňovej inkubácii sa BVDV infikované bunky detegovali imunofluorescenciou s polyklonálnym sérom špecifickým pre BVDV. 25 Príklad 8 Rozlíšenie medzi C-346-d a CSFV bez delécie histidínového kodónu 346 prostredníctvom RT-PCR RNA sekvencia kódujúca konzervatívny RNázový motív v CSFV glykoproteíne ERNS je vysoko konzer-vovaná. Nezistila sa žiadna nukleotidová zámena medzi všetkými známymi CSFV sekvenciami v oblasti 30 zodpovedajúcej zvyškom 1387 až 1416 zverejnenej sekvencie CSFV Alfort kmeňa (Meyers a ďalší, 1987).

SK 287626 B6

14

Takže na detekciu všetkých CSFV izolátov je možné použiť oligonukleotidové priméry odvodené od konzer-vatívnej oblasti genómu na RT-PCR test (pozri obrázok 7). Z toho vyplýva, že neprítomnosť tripletu kódujú-ceho histidín 346 (nukleotidy 1399 až 1401) mohla byť detegovaná RT-PCR testom s vhodne navrhnutým primérom. Syntetizovali sa rôzne oligonukleotidy pokrývajúce konzervatívnu oblasť, ktoré buď obsahovali, alebo neobsahovali histidínový kodón. Tieto oligonukleotidy slúžili ako predné priméry v RT-PCR reakciách 5 s oligonukleotidovým ERNS-Stop zadným primérom. Ako templáty sa použili RNA purifikované z tkanivovej kultúry buniek infikovaných s C-346-d, C-WT, C-346-L alebo C-346-K. Reverzná transkripcia 2 μg teplom denaturovanej RNA (2 min. 92 °C, 5 min. na ľade v 11,5 μl vody v prítomnosti 30pMol reverzného priméra) sa uskutočňovala po pridaní 8 μl RT zmesi (125mM Tris/HCl pH 8,3, 182,5mM KCl, 7,5mM MgCl2, 25mM ditiotreitol, 1,25mM každý z dATP, dTTP, dCTP, dGTP), 15 U RNAguard (Pharmacia, Freiburg, Nemecko) 10 a 50 U Superscript (Life Technologies/BRL, Eggenstein, Nemecko) 45 minút pri 37 °C. Po ukončení reverz-nej transkripcie sa skúmavky umiestnili na ľad a pridalo sa 30 μl PCR zmesi (8,3mM Tris/HCl, pH 8,3; 33,3mM KCl; 2,2mM MgCl2; 0,42mM každého z dATP, dTTP, dCTP, dGTP; 0,17 % TritonX100; 0,03 % hovädzí sérový albumín; 5 U Taq polymerázy (Appligene, Heidelberg, Nemecko) a 16,7 % DMSO). Keď sa použil primér OI H+3, reakčná zmes na amplifikáciu neobsahovala DMSO. Amplifikácia sa uskutočňovala v 15 36 cykloch (30 sekúnd 94 °C, 30 sekúnd 57 °C, 45 sekúnd 74 °C). 1 μl amplifikačnej reakčnej zmesi sa na-niesol na 1 % agarózový gél, amplifikované produkty sa oddelili elektroforézou a vyfarbili etídium bromi-dom. Ako je demonštrované na obrázku 7, pár primérov OI H-3/OI EmsStop umožnil špecifickú amplifikáciu pásu odvodeného od RNA s deléciou kodónu 346, zatiaľ čo ďalšie dve kombinácie primérov vytvárali pro-dukty obsahujúce kodón 346 a neamplifikoval sa nimi žiadny pás, keď bola ako templát použitá RNA s delé-20 ciou tohto kodónu. Priméry pre RT-PCR: predné (upstream): OI H-3: TGGAACAAAGGATGGTGT 25 OI H+2: TGGAACAAACATGGATGG OI H+3: GAATGGAACAAACATGGA zadný (downstream): OI EmsStop GGAATTCTCAGGCATAGGCACCAAACCAGG 30 P A T E N T O V É N Á R O K Y 1. Spôsob detegovateľného značenia pestivírusov, v y z n a č u j ú c i s a t ý m , že je pri ňom inaktivovaná RNázová aktivita, ktorej nositeľom je glykoproteín ERNS, pričom RNázová aktivita je inaktivo-35 vaná deléciami a/alebo mutáciami najmenej jednej aminokyseliny uvedeného glykoproteínu, s podmienkou, že aminokyselinami v polohách 297 a/alebo 346, ako sú znázornené na obrázku 1 pre CSFV Alfort kmeň ako príklad, alebo v zodpovedajúcich polohách glykoproteínu v iných kmeňoch, nie sú lyzíny, pričom inaktivo-vanie RNázovej aktivity, ktorej nositeľom je ERNS glykoproteín, vedie k oslabenému pestivírusu. 2. Spôsob podľa nároku 1, v y z n a č u j ú c i s a t ý m , že delécie a/alebo mutácie sú lokalizova-40 né v aminokyselinových polohách 295 až 307 a/alebo 338 až 357, ako je znázornené na obrázku 1 pre CSFV Alfort kmeň ako príklad, alebo v zodpovedajúcich polohách glykoproteínu v iných kmeňoch. 3. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 alebo 2, v y z n a č u j ú c i s a t ý m , že RNázová aktivita je inaktivovaná deléciou alebo mutáciou aminokyseliny v polohe 346, ako je znázornené na obrázku 1 pre CSFV Alfort kmeň ako príklad, alebo v zodpovedajúcej polohe glykoproteínu v iných kmeňoch. 45 4. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3, v y z n a č u j ú c i s a t ý m , že RNázová akti-vita je inaktivovaná deléciou histidínového zvyšku v polohe 346, ako je znázornené na obrázku 1 pre CSFV Alfort kmeň ako príklad, alebo v zodpovedajúcej polohe glykoproteínu v iných kmeňoch. Zoznam sekvencií 50 <110> Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH <120> Oslabené pestivírusy <130> Oslabené pestivírusy - PCT/EP <140> PCT/EP99/03642 55 <141> 199-05-27 <150> EP 98110356.7 <151> 1998-06-05 <160> 27 <170> PatentIn Ver. 2.1 60

SK 287626 B6

15

<210> 1 <211> 494 <212> PRT <213> BVDV Erns delécia v polohe 346 5 <400> 1

SK 287626 B6

16

SK 287626 B6

17

<210> 2 <211> 495 <212> PRT <213> CSFV Erns mutant 295 G 5 <400> 2

10

SK 287626 B6

18

SK 287626 B6

19

<210> 3 <211> 492 <212> PRT <213> CSFV Erns mutant 296-7-8-delécia 5 <400> 3

10

SK 287626 B6

20

SK 287626 B6

21

<210> 4 <211> 494 <212> PRT 5 <213> CSFV Erns mutant 297-delécia <400> 4

10

SK 287626 B6

22

SK 287626 B6

23

<210> 5 <211> 495 <212> PRT 5 <213> CSFV Erns mutant 297 K <400> 5

10

SK 287626 B6

24

SK 287626 B6

25

<210> 6 <211> 495 <212> PRT 5 <213> CSFV Erns mutant 297 L <400> 6

SK 287626 B6

26

SK 287626 B6

27

<210> 7 <211> 494 <212> PRT <213> CSFV Erns mutant 301-delécia 5 <400> 7

SK 287626 B6

28

SK 287626 B6

29

<210> 8 <211> 495 <212> PRT

SK 287626 B6

30

<213> CSFV Erns mutant 302 A <400> 8

5

SK 287626 B6

31

<210> 9 <211> 495 <212> PRT

SK 287626 B6

32

<213> CSFV Erns mutant 305 G <400> 9

5

SK 287626 B6

33

SK 287626 B6

34


SK 287626 B6

35

SK 287626 B6

36

<210> 11 <211> 493 <212> PRT <213> CSFV Erns mutant 342-6-delécia 5 <400> 11

10

SK 287626 B6

37

SK 287626 B6

38


10

SK 287626 B6

39

SK 287626 B6

40


10

SK 287626 B6

41

SK 287626 B6

42


SK 287626 B6

43

SK 287626 B6

44

<210> 15 <211> 493 <212> PRT 5 <213> CSFV Erns mutant 345-6-delécia <400> 15

SK 287626 B6

45

SK 287626 B6

46

<210> 16 5

SK 287626 B6

47

<211> 495 <212> PRT <213> CSFV Erns mutant 345 A <400> 16 5

SK 287626 B6

48

SK 287626 B6

49


SK 287626 B6

50

SK 287626 B6

51


SK 287626 B6

52

SK 287626 B6

53

SK 287626 B6

54

<210> 19 <211> 495 <212> PRT <213> CSFV Erns mutant 346 K 5 <400> 19

SK 287626 B6

55

<210> 20 <211> 495 <212> PRT

SK 287626 B6

56

<213> CSFV Erns mutant 346 L <400> 20

SK 287626 B6

57

SK 287626 B6

58

<210> 21 <211> 495 <212> PRT <213> CSFV Erns mutant 297 K 346 K 5 <400> 21

SK 287626 B6

59

SK 287626 B6

60

<210> 22 <211> 495 <212> PRT <213> CSFV Erns mutant 297 K 346 L 5 <400> 22

SK 287626 B6

61

SK 287626 B6

62

<210> 23 <211> 495 5 <212> PRT <213> CSFV Erns mutant 297 L 346 L <400> 23

10

SK 287626 B6

63

SK 287626 B6

64

<210> 24 <211> 495 <212> PRT 5 <213> BVDV proteín Erns <400> 24

SK 287626 B6

65

SK 287626 B6

66

<210> 25 <211> 495 <212> PRT 5 <213> CSFV proteín Erns <400> 25

SK 287626 B6

67

SK 287626 B6

68

<210> 26 <211> 495 <212> PRT 5 <213> CSFV Erns mutant 300 G <400> 26

SK 287626 B6

69

<210> 27 <211> 495 <212> PRT 5 <213> CSFV Erns mutant 300 G 302 A <400> 27

SK 287626 B6

70

7 výkresov

SK 287626 B6

71

SK 287626 B6

72

SK 287626 B6

73

SK 287626 B6

74

SK 287626 B6

75

SK 287626 B6

76

Koniec dokumentu

Číslo dokumentu: sk patentovÝ spis 287626

Documents