Cardiovasculaire weefselkweek

Verschillen tussen patiënten, invloed van zaaidichtheid en reproduceerbaarheid

BMTE 08.05

Stage Roel Lalieu

Januari 2007

Supervisors: Ing. W.L. van de Loo en dr. ir. M. Stekelenburg Stagedocent: Dr. ir. C.J.A.L Mentink Opleiding: Life Science Differentiatie: Biologie en Medisch Laboratoriumonderzoek Stagebedrijf: Technische Universiteit Eindhoven Faculteit: Biomedische technologie Afdeling: Soft tissue engineering Periode: September 2007 t/m januari 2008 School: Hogeschool Zuyd

ii

Samenvatting Het hart is één van de belangrijkste organen in het lichaam. Wanneer deze spier problemen vertoont, kunnen de gevolgen fataal worden. Een groot deel van de mensen met hartproblemen lijden aan een verstopte kransslagader of een niet goed functionerende hartklep. Een vrij nieuwe techniek om deze klachten te verhelpen is Tissue Engineering. Met deze techniek is het mogelijk om weefsels te maken die een lichaamsfunctie kunnen teruggeven. Het voordeel van Tissue Engineering is dat de cellen waarvan het weefsel wordt gemaakt, van de patiënt zelf zijn. Hierdoor kunnen een hoop complicaties voorkomen worden. Tijdens deze stage is er onderzoek gedaan naar gekweekte weefsels. Cellen van verschillende patiënten werden opgekweekt tot passage 6 en vervolgens met behulp van fibrine-gel op een dragermateriaal gebracht. Het dragermateriaal degradeerde tijdens de kweek en de cellen produceerde weefsel. Gedurende deze stage werden de weefsels op rechthoekige stripjes gekweekt. Na vier weken kweken werden de weefsels getest op hun rekbaarheid en sterkte. Ook werd er gekeken naar de concentratie DNA, glycosaminoglycan en hydroxyproline. Er zijn in totaal vier experimenten ingezet. In het eerste experiment is er gekeken naar de invloed van de zaaidichtheid. Hieruit is gebleken dat er een duidelijk optimum is voor deze zaaidichtheid. Wat ook is ondervonden, is dat deze verschilt per patiëntenmateriaal. Een tweede experiment was er om te achterhalen hoe rendabel de laatste week van het kweken is voor het weefsel. Dit experiment is mislukt door een infectie tijdens de kweek. Tijdens het derde experiment zijn de verschillen tussen de cellen en weefsels van de verschillende patiënten onderzocht. Hieruit is gebleken dat er veel verschillen zijn en dat er nog meer onderzoek naar gedaan zal moeten worden. In het laatste experiment is gekeken naar de reproduceerbaarheid van het kweken. Doordat er, achteraf beschouwd, te veel verschillen waren tijdens de verschillende kweken, is het met deze gegevens nog niet mogelijk een uitspraak over reproduceerbaarheid te doen. Wel is gebleken dat er al snel grote verschillen kunnen ontstaan.

iii

Voorwoord Dit verslag is gemaakt ten aanzien van mijn stageopdracht. Door middel van dit verslag wil ik mijn stage halen en daarmee de betreffende competenties. Tijdens de stage heb ik voornamelijk hulp gekregen van ing. Anita v/d Loo en dr. ir. Maria Stekelenburg. Deze wil ik daarvoor ook zeker bedanken. Ook mijn studiegenoot Karim Abdullah wil ik bedanken voor zijn gezelschap en de hulp tijdens de stage. Natuurlijk wil ik ook alle collega’s bedanken die mij geholpen hebben tijdens mijn stage.

iv

Lijst van afkortingen en symbolen Afkortingen: CAD Coronary Artery Disease CABG Coronary Artery Bypass Grafting CO2 Koolstofdioxide DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMSO Dimethylsulfoxide E Youngs’ modulus EtBr Ethidiumbromide FBS Foetal Bovine Serum HVSC Human Vena Saphena Cells MPa Mega Pascal O2 Zuurstof Opp Oppervlakte P4HB Poly-4-hydroxybutyrate PBS Phosphate buffered saline PGA Poly Glycolic Acid pH Zuurgraad RB Roller Bottle T150 Kweekfles met 150 cm2 gecoate oppervlakte TE Tissue Engineering TU/e Technische Universiteit Eindhoven UTS Ultimate Tensile Strength Symbolen: x 106 miljoen % procent ºC graden Celsius cm2 vierkante centimeter ml milliliter P1/2/3 passage 1/2/3

v

Inhoudsopgave Blz. Samenvatting…………………………………………………………………………….ii Voorwoord………………………………………………………………………………..iii Lijst van afkortingen en symbolen………………………….……………………….iv 1 Inleiding…………………………………………………………………………...1 2 Achtergrond informatie…………………………………………………………2 2.1 Coronaire arteriën 2

2.1.1 Coronary Artery Bypass Grafting 2 2.2 Hartkleppen 3 2.2.1 Hartklep prothesen 3 2.3 Tissue Engineering 4 3 Methodes…………………………………………………………………………..5 3.1 Inleiding 5 3.2 Cellen kweken 5 3.2.1 Cel afkomst 5

3.2.2 Eerste celkweek 6 3.2.3 Cellen overzetten 6

Experimenten…………………………………..…………………………………7 3.3 Experiment 1: Zaaidichtheid 7

3.3.1 Strips maken 7 3.3.2 Zaaien 7

3.4 Experiment 2: Zaaidichtheid in de tijd 8 3.5 Experiment 3: Patiënten studie 8 3.6 Experiment 4: Reproduceerbaarheids studie 9 Analyses…………………….…………………………………..…………………10 3.7 Trekproef 10 3.8 Biochemische assays 11 3.8.1 Glycosaminoglycan 11 3.8.2 Hydroxyproline 11 3.8.3 DNA 11 3.9 Kleuring 12 3.9.1 Coupes snijden 12 3.9.2 Masson Trichrome Kleuring 12 3.9.3 Toluidine Bleu 12 3.9.4 α-SMA 12 3.10 Real-time PCR 14 3.10.1 mRNA isoleren 14 3.10.2 cDNA 14 3.10.3 PCR 14 3.10.4 Elektroforese 15 3.10.5 Real-time PCR 15 3.11 Statistiek 15

vi

4 Resultaten………………………………………………………………………….16 4.1 Cellen van vijf patiënten 16 4.1.1 Groeisnelheid 16

4.1.2 α-SMA 18 4.1.3 Real-time PCR 19

4.2 Experiment 1: Zaaidichtheid 21 4.2.1 Trektest 21 4.2.2 Masson Trichrome Kleuring 23 4.2.3 Toluidine Bleu 23 4.2.4 Biochemische assays 24 4.3 Experiment 2: Zaaidichtheid in de tijd 26 4.4 Experiment 3: Patiënten studie 26 4.4.1 Trektest 26 4.4.2 Masson Trichrome Kleuring 29 4.4.3 Toluidine Bleu 30 4.4.4 Biochemische assays 32 4.5 Experiment 4: Reproduceerbaarheids studie 34 4.5.1 Trektest 34 4.5.2 Biochemische assays 35 5 Discussie…………………………………………………………………………..37 5.1 Opkweken van de cellen 37 5.2 Zaaidichtheid 37 5.3 Patiënten studie 39 5.4 Reproduceerbaarheid 40 6 Conclusies en aanbevelingen…………………………………………………42 Summary……………………………………………………………………………………43 Literatuur…………………………………………………………………………………..44 Bijlagen…………………………………………………………………………………….45

1

1 Inleiding Op het laboratorium van de TU/e wordt onderzoek gedaan naar het kweken van kleine diameter bloedvaten en hartkleppen. De bloedvaten zouden in de toekomst gebruikt kunnen worden voor Coronary Artery Bypass Grafting (CABG). CABG wordt ook wel een bypass genoemd. Het is een toepassing die gebruikt wordt bij Coronary Artery Disease (CAD). Het betekent dat de bloedvaten die het hart van bloed voorzien, aan het dichtslibben zijn. Dit kan meerdere oorzaken hebben. Wanneer de bloedvaten dicht slibben, zal de toevoer van zuurstofrijk bloed afnemen. Hierdoor kan er pijn op de borst ontstaan of een hartinfarct optreden. Daarom kan er gekozen worden voor een bypass. Hiermee wordt een nieuwe route gemaakt voor het bloed om alsnog voldoende bloed te leveren. Bij de hartkleppen kan het zich voordoen dat één van de hartkleppen niet meer goed functioneert. De oorzaak hiervan kan verkalking zijn. Ook kan het door een ziekte komen of door een aangeboren afwijking. Wanneer deze aandoening zich voordoet kan er niet voldoende zuurstofrijk bloed gecirculeerd worden door het lichaam. Om deze problemen op te kunnen lossen kan Tissue Engineering van pas komen. Het is een vrij nieuwe techniek om op een kunstmatige manier weefsels te kweken. Het uiteindelijke doel is om van eigen cellen een nieuw weefsel te kunnen maken, dat vervolgens een defect weefsel kan vervangen. Op het laboratorium van de Technische Universiteit in Eindhoven wordt gewerkt aan bloedvaten en hartkleppen. Er wordt patiëntenmateriaal gebruikt van verschillende patiënten. Tussen de cellen van dit patiëntenmateriaal zitten natuurlijk verschillen in groeisnelheid en bijvoorbeeld de aanmaak van bepaalde stoffen. Het doel van deze stage is om te bepalen wat de verschillen zijn tussen de cellen van de verschillende patiënten. Om dit doel te bereiken zullen stukjes weefsel gemaakt worden van myofibroblasten uit de humane vena saphena (ader uit het onderbeen) van 5 patiënten. Deze primaire cellen worden op meerdere parameters geanalyseerd. Op deze manier zullen de verschillen tussen de cellen van verschillende patiënten in beeld worden gebracht.

2

2 Achtergrond informatie

2.1 Coronaire arteriën De coronaire arteriën (krans-slagaders) zijn bloedvaten die uit de aorta ontspringen en ervoor zorgen dat het hart van bloed wordt voorzien. Door meerdere redenen kunnen deze arteriën stijver en nauwer worden. Deze aandoening wordt Coronary Artery Disease genoemd. Oorzaken zijn bijvoorbeeld diabetes, roken, hoog cholesterol en hoge bloeddruk. Daar-naast hebben oudere mensen er meer kans op en mensen waarbij het in de familie vaker is voorgekomen. Wanneer de kransslagader meer dan 50 – 70% nauwer is geworden op een bepaalde plek, zal het gebied daarachter zuurstof tekort gaan komen. Ook kan zo’n vernauwing ervoor zorgen, wanneer er een bloedpropje aankomt, dat het bloedvat meteen verstopt raakt. Hierdoor zal een gedeelte van het hart afsterven en zal het hart niet meer kunnen functioneren, zoals te zien is in figuur 2.1. Wanneer het hart te weinig bloedtoevoer krijgt, kan dit zich tot een hartinfarct uitwerken. Een vernauwing zal zich uiten door een pijn in de borst. Het kan zijn dat iemand met CAD hier geen last van heeft. 25% van de CAD patiënten heeft namelijk nergens last van. Desondanks hebben ook zij net zoveel kans op een hartinfarct [1].

2.1.1 Coronary Artery Bypass Grafting De Coronary Artery Bypass Grafting (CABG) wordt ook wel bypassoperatie genoemd. Het principe van deze operatie is een verbindingsweg te maken om de vernauwing heen, zodat het hart weer zuurstofrijk bloed krijgt. Tot op heden worden er voornamelijk twee technieken gebruikt: de

3

veneuze graft en arteriële graft. Bij de veneuze graft wordt er een gedeelte van de ader (geen slagader) uit het onderbeen gehaald en geplaatst om de vernauwing heen. In figuur 2.2 is zo’n bypass te zien. Bij de arteriële graft wordt meestal de linker interne mammary arterie gebruikt, dit is een slagader die aan de binnenzijde van de borstwand zit. Deze graft wordt aangesloten op kransslagader die na de vernauwing komt. Het kan zich voordoen dat mensen met CAD niet één maar meerdere vernauwingen hebben. Wanneer het mogelijk is om goed functionerende bloedvaten te maken, kunnen deze gebruikt worden in plaats van bloedvaten uit het eigen lichaam [2]. 2.2 Hartkleppen Het hart is een pomp die het bloed door het hele lichaam doet stromen. De rechter en linker atrium en ventrikel zijn de vier kamers die het hart bezit. Deze contraheren in een bepaalde volgorde zodat het bloed gaat stromen. Om er voor te zorgen dat het bloed maar één kant op stroomt, zijn er vier verschillende hartkleppen in het hart. Deze laten het bloed maar in één richting door de klep stromen. Hieronder in figuur 2.3 zijn enkele hartkleppen te zien.

De hartklep bestaat uit drie vliezen om voor een volledige sluiting te zorgen. Het kan zich voordoen dat één van de kleppen zich niet meer volledig kan sluiten. Er kunnen hiervoor verschillende oorzaken zijn. Één daarvan is verkalking, waardoor de klep stugger wordt. Ook kan het komen door een bepaalde ziekte of een aangeboren afwijking. Wanneer dit zich voordoet kan het bloed niet meer volledig stromen en is er dus geen goede zuurstof toevoer aan het lichaam. Een dergelijke situatie kan dan een levensbedreigend effect hebben op het lichaam. Binnen de cardiochirurgie is het vervangen van een hartklep dan ook een veel voorkomende ingreep. [3]

2.2.1 Hartklep prothesen Voor een hartklep prothese zijn er tot heden twee opties. De eerste is een mechanische hartklep. De tweede is een donor hartklep. Deze kan van een donorpersoon zijn, maar ook van een donordier. Beide opties hebben hun voor- en nadelen. Bij een mechanische hartklep is er een grote kans op trombo-embolisme. Om hier de kans op te verkleinen zullen er antistollingsmedicijnen geslikt moeten worden. Hiermee worden bloedstolsels tegen gegaan op het oppervlak van de mechanische kleppen. Wanneer er bloedstolsels op de kleppen komen, zal er opnieuw moeten geopereerd worden. Een dergelijke operatie brengt natuurlijk veel risico met zich mee. Wel is de levensduur van de kleppen zeer goed. Naast de

4

problemen met het materiaal is er een probleem dat vooral bij jonge patiënten zich voordoet. Wanneer en kind gaat groeien, zal de hartklep niet meegroeien. Daarom is het voor jonge mensen vaak een groot probleem. De tweede optie is een donorhartklep. Hier moeten ook medicijnen voor geslikt worden. Een donorhartklep heeft een kortere levensduur als die van een mechanische. Omdat het van een donor afkomt, kan het zich dus voordoen dat het niet geaccepteerd wordt door het eigen lichaam. Hierdoor kan een reactie plaatsvinden en de hartklep kan worden ingekapseld, waardoor er dus een risicovolle operatie moet plaatsvinden. [3] Kijkend naar al deze nadelen zou het ideaal zijn om een hartklep te hebben van levende cellen, die niet lichaamsvreemd zijn. Hier zou Tissue Engineering een oplossing kunnen bieden. 2.3 Tissue Engineering (TE) Tissue Engineering is een vrij nieuwe techniek binnen de geneeskunde. De Nederlandse vertaling hiervan is weefselkweek. Het doel van deze techniek is op een kunstmatige manier weefsels te kweken. Hierbij moet gedacht worden aan huid, bloedvaten, hartkleppen, kraakbeen, enz. Het materiaal waar het weefsel van gemaakt wordt zijn cellen uit het eigen lichaam van de patiënt. Hiermee is ook het grootste voordeel genoemd van TE tegenover kunstmatige- en donorimplantaten. Omdat het gemaakt is van eigen cellen, zal het bij implantatie niet snel worden afgestoten door het lichaam. Ondanks de grote variatie binnen deze techniek, is er een duidelijke lijn te volgen door het proces (figuur 2.4). Hiervoor wordt er een stukje weefsel uit het lichaam gehaald van de patiënt. Uit dit weefsel worden cellen geïsoleerd die nodig zijn voor het nieuwe weefsel. Deze worden op een scaffold, dragermateriaal, gezaaid en onder ideale omstandigheden gekweekt. Hierbij wordt gedacht aan voedingsstoffen, O2, CO2, pH, enz. Als het weefsel vervolgens goed gegroeid is, kan het ge-implanteerd worden om de lichaamsfuncties terug te krijgen.

5

3 Methodes

3.1 Inleiding Het doel van de stage is het onderzoeken van verschillende factoren die invloed hebben op cardiovasculaire weefselkweek. Deze factoren zijn; verschillen tussen patiënten, zaaidichtheid en reproduceerbaarheid. Om deze aspecten te onderzoeken worden er eenvoudige stukjes weefsels gekweekt en geanalyseerd. Deze rechthoekige stukjes weefsel worden gekweekt met cellen van verschillende patiënten. Eerst zal er een experiment worden uitgevoerd om te bepalen wat de invloed is van de zaaidichtheid is. Het tweede experiment dat zal worden uitgevoerd, is om te kijken naar de invloed van de kweektijd. Een derde experiment zal worden ingezet, waarbij er cellen van vijf verschillende patiënten worden gebruikt om stukjes weefsel te maken. Deze stukjes weefsel worden vervolgens geanalyseerd en vergeleken met elkaar. Op deze manier moet er een beeld komen van de verschillen tussen de cellen van de verschillende patiënten. Het laatste experiment dat zal worden uitgevoerd is om te kijken of het kweken van weefsel reproduceerbaar is. Hieronder in tabel 3.1 staan de experimenten schematische weergegeven.

Na de kweekperiode worden de onderlinge verschillen tussen deze stukjes weefsel geanalyseerd. Er zal gekeken worden naar hoe sterk elk stukje weefsel is. Daarnaast zal gekeken worden naar de hoeveelheid cellen en concentraties van enkele stoffen in het weefsel. 3.2 Cellen kweken 3.2.1 Cel afkomst Het patiëntmateriaal dat voor deze celkweek gebruikt wordt, is afkomstig van het ziekenhuis. Deze weefsels zijn niet volledig getest op micro-organisme, dus moet er mee omgegaan worden als besmet materiaal. Uit kleine stukjes weefsel van de vena saphena worden myofibroblasten geïsoleerd. Deze myofibroblasten worden in een kweekfles gebracht met een gecoate ondergrond, zoals te

6

zien is op figuur 3.1. Op deze ondergrond kunnen de cellen zich goed hechten. Er wordt een speciaal medium aan toegevoegd, Advanced Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM). Hier wordt vervolgens 10% FBS (Foetal Bovine Serum), 1% Glutamax en 0,1% Gentamicine aan toegevoegd. FBS dient als voedingsstof voor de cellen. Glutamax is een stabiele vorm van L-glutamine. Dit aminozuur is belangrijk voor de cellen maar is ook het meest onstabiele aminozuur. Om bacterie en schimmelgroei tegen te gaan wordt het antibiotica Gentamicine toegevoegd. Het medium zal voor de voeding van de cellen zorgen. Uit het stukje weefsel groeit een laag cellen uit op de bodem van de fles: de eerste passage (P1). De cellen van P1 worden verzameld en gesuspendeerd in medium met 10% Dimethylsulfoxide (DMSO), een “antivriesmiddel”. Daarna worden ze ingevroren in vloeibare stikstof voor onbeperkte houdbaarheid. Vanuit hier begint de uitvoering van het onderzoek. [4] 3.2.2 Eerste celkweek Wanneer de cellen uit de vloeibare stikstof gehaald worden en ontdooid, is het van belang snel te handelen. Dit doordat het DMSO toxisch is voor de cellen. Vlak nadat de celsuspensie volledig ontdooit is wordt het in een grote hoeveelheid medium gesuspendeerd. Hierdoor is de concentratie zo laag dat de cellen niet meer lijden onder de toxische werking van DMSO. Vervolgens moeten de cellen geteld worden om de juiste verdunning te kunnen berekenen. Wanneer de verdunning is bepaald kan die gebruikt worden om de kweekflessen te vullen. De volledige procedure is terug te vinden in bijlage I. Deze kweekflessen gaan vervolgens in de incubator met de gewenste omstandigheden (37ºC en 5% CO2). 3.2.3 Cellen overzetten Wanneer de kweekfles vol gegroeid is, oftewel confluent is, worden de cellen overgezet naar nieuwe flessen. Dit is nodig omdat de cellen naast elkaar groeien en deze mogen niet over elkaar heen groeien. Om de cellen los te krijgen van de bodem worden ze voor een paar minuten in trypsine gezet. Hierdoor komen de cellen los en kunnen ze handmatig worden geteld op een telraam. Hoe dit werkt is te vinden in bijlage II. Er kan ook gebruik gemaakt worden van een telmachine. Op deze manier kan de verdunning bepaald worden zodat er per nieuwe fles (T150 -> 150 cm2 opp.) ongeveer 1 x 106 cellen komen. Het is verstandig om de dag erna te kijken of de cellen goed gehecht zijn, om eventuele fouten op tijd te ontdekken. Naast kweekflessen kunnen ook Roller Bottles (RB’s) gebruikt worden. Deze hebben een veel groter oppervlak en leveren dus meer cellen op. Elke keer als de fles wordt overgezet is dit een passage hoger (bv. P1 -> P2). Daarnaast moet het medium in de flessen worden ververst na 3-4 dagen. De rede hiervan is dat de voedingsstoffen opraken en de concentratie afvalstoffen omhoog gaat. In bijlage I staat het overzetten uitgewerkt. De cellen van passage 5 worden ingevroren zodat ze later gebruikt kunnen worden voor weefselkweek.

7

Experimenten 3.3 Experiment 1: Zaaidichtheid 3.3.1 Strips maken Om een weefsel te kweken is een scaffold nodig waar de cellen in kunnen groeien. Daarnaast moet dit scaffold kunnen worden afgebroken tijdens de kweekperiode, zodat het op later stadium geen invloed meer heeft op het weefsel. Het materiaal dat daarvoor gebruikt gaat worden is Poly Glycolic Acid (PGA). Om het PGA wat sterker te maken wordt Poly-4-hydroxybutyrate (P4HB) gebruikt. Beide materialen worden afgebroken tijdens de kweekperiode. De stukjes scaffold worden op roestvrijstalen ringen bevestigd, zoals op figuur 3.2. Dit gebeurt met behulp van polyurethaan (PU). Wanneer het goed is uitgehard worden ze met 70% alcohol steriel gemaakt en vervolgens gewassen met PBS. Na het wassen worden ze in een 6 wells-plaat gebracht en in medium ondergebracht dat speciaal voor Tissue Engineering (TE) gemaakt is. Het medium is dezelfde als die van het opkweken, alleen is hier L-ascorbic acid 2-phosphate aan toegevoegd. Een andere benaming hiervoor is vitamine C. Deze stof zorgt voor een verbeterde collageenproductie. Hoe het maken van de strips en het medium gaat, is te vinden in bijlage III. 3.3.2 Zaaien Tot heden wordt niet door alle onderzoekers dezelfde zaaidichtheid gebruikt. Uit dit onderzoek zal blijken wat de meest geschikte dichtheid is voor het zaaien. Er worden 6 verschillende dichtheden getest. Van elke zaaidichtheid worden 5 stripjes gezaaid. Alleen van de 50 miljoen groep zal een duplo ingezet worden. In tabel 3.2 is een schematische weergave van de zaaidichtheden. De cellen worden gezaaid met behulp van fibrine-gel. Deze gel zorgt voor een efficiënt zaaiingsproces en bevordert de aanmaak van weefsel. De cellen die voor deze test worden gebruikt zullen worden gekweekt in RB’s, omdat zo snel een grote hoeveelheid kan worden aangemaakt. De cellen worden uit de RB’s gehaald door middel van trypsine. Vervolgens wordt er een grote hoeveelheid medium aan toegevoegd, om de trypsine te

8

deactiveren. Als alle cellen zijn verzameld in een verzamelbuis, wordt het gecentrifugeerd. De celpellet wordt gesuspendeerd in 1 ml trombine-medium. Aan de trom-bineoplossing zal later fibrinogeen worden toegevoegd, zodat het gelleert tot fibrine (bloedstollingseiwit). Op deze manier worden de cellen op hun plek gehouden om zich te kunnen hechten. Met de 1 ml kan een telling gedaan worden. Wanneer de hoeveelheid cellen bekend is kan er een verdunning bepaald worden zodat de bovenstaande concentraties verkregen kunnen worden. Deze worden samen met fibrinogeen op de stripjes gebracht. Na ongeveer 20 minuten is de oplossing volledig gegelleerd op het stripje en kan er TE medium toegevoegd worden (figuur 3.3). Vervolgens kunnen de wells-platen worden geïncubeerd bij 37ºC en bij 5% CO2. Het hele proces is beschreven in bijlage III. Deze wells platen moeten om de 2-3 dagen ververst worden met nieuw TE medium. Iedere week werd er een foto gemaakt om eventuele aparte ontwikkelingen te kunnen verklaren. Het weefsel zal na 4 weken mechanisch getest worden en er zullen kleuringen op gedaan worden. Daarnaast zal het weefsel ook biochemisch geanalyseerd worden. 3.4 Experiment 2: Zaaidichtheidstest in de tijd Naast de invloed van de zaaidichtheid, is het ook interessant om te weten wat de invloed is van de kweektijd; wat gebeurt er bijvoorbeeld tussen de derde en de vierde week. Daarom is er een tweede zaaidichtheidstest opgezet. De dichtheden van dit experiment zijn weergegeven is tabel 3.3. De strips worden hetzelfde gemaakt als de eerste zaaidichtheidstest en worden hetzelfde behandeld. Na drie weken worden de eerste vier strips geanalyseerd en na vier weken de laatste drie. Ook worden de 7 groepen op de-zelfde parameters getest als het eerste experiment. 3.5 Experiment 3: Patiënten studie Op het laboratorium worden cellen gebruikt van 5 verschillende patiënten. Gedurende dit verslag zullen ze worden aangeduid als patiënt I t/m V. Deze cellen moeten eerst ontdooid worden uit de stikstofvriezer voordat ze op opgezet worden naar passage 2. Cellen van patiënt I en V worden als eerste opgekweekt naar P5. De reden hiervoor is om er voor te zorgen dat niet alle patiënten tegelijk worden opgekweekt. Bij P5 aangekomen worden de cellen ingevroren. Wanneer de cellen van de andere patiënten naar P6 gaan worden de cellen pas ontdooid en op P6 gezet. Alle cellen krijgen dezelfde behandeling. Met 0,5 x 106 cellen worden ze op P2 gezet. Alle passages

9

daarna worden ze met 1 miljoen overgezet per fles. Tijdens dit proces worden foto’s gemaakt van de cellen en worden ze geteld. Hiermee wordt de groei bepaald van de cellen van de 5 verschillende patiënten. Wanneer de cellen op passage 6 confluent zijn, kunnen ze worden gezaaid op rechthoekige strips. In tabel 3.4 worden de verschillende zaaidichtheden van elke patiënt weergegeven. Het proces verloopt hetzelfde als voorgaande experimenten. De hoeveelheid strips en de verschillende dichtheden zal afhangen van de hoeveelheid cellen die uit de celkweek komen. Na 4 weken incuberen worden de strips getest op verschillende parameters. Deze parameters zullen worden besproken in de rest van dit hoofdstuk. 3.6 Experiment 4: Reproduceerbaarheids studie Om na te gaan of elk experiment wel betrouwbaar is en niet een toevallige uitkomst zal hebben, wordt er een reproduceerbaarheidtest gedaan. Hierin worden van patiënt I, II, III en V weefsels gemaakt met een zaaidichtheid van 10 miljoen cellen/ml (tabel 3.5). De waardes die hier uit komen worden vergeleken met die van de andere experimenten. Hiermee kan vervolgens gezegd worden of het kweken van weefsel reproduceerbaar is uitgevoerd.

10

Analyses

3.7 Trekproef De trekproef is een belangrijk onderdeel van de analyse, waarbij de stripjes getest worden op hun stevigheid en rekbaarheid. Hiermee wordt bepaald hoeveel kracht en hoeveel rek elk stripje aankan. De stripjes worden op de trekbank bevestigd door middel van een vastgeschroefd blokje met antislib. Tussen de twee bevestigings-punten zit een afstand van 9 mm. Nadat het stripje bevestigd is wordt het kapot getrokken. Naast de trekafstand wordt ook de trekkracht bijgehouden. Wanneer de trekkracht tegenover de trekafstand wordt uitgezet in een grafiek, ontstaat er een stijgende lijn. Op het moment van breken zal de trekkracht sterk afnemen. In de grafiek zal vanaf dat punt de lijn sterk omlaag gaan richting het nulpunt. Van elk stripje wordt het oppervlakte bepaald door de dikte en de breedte te meten. Met een schuifmaat wordt de breedte gemeten. De dikte wordt achteraf bepaald door middel van een histologische coupe van het weefsel. Het weefsel wordt daarvoor met Toluidine Bleu gekleurd. Door de dikte met de breedte te vermenigvuldigen wordt de oppervlakte verkregen. Als de kracht per oppervlakte (spanning) in een grafiek wordt weergegeven tegenover de rek (in %) kunnen verschillende gegevens berekend worden. De Ultimate Tensile Strength (UTS) is de maximale spanning waarbij het stripje breekt. Met de break % wordt bepaald hoeveel het stripje uitrekt voordat het breekt. Daarnaast wordt ook de Youngs’ modulus (E) bepaald. Hiermee wordt de kracht tegenover de rek uitgezet. In grafiek 3.1 is weergegeven hoe deze gegevens verkregen worden.

11

3.8 Biochemische assays Niet alleen is het belangrijk om te weten hoeveel kracht het weefsel aankan, ook is het belangrijk om te weten waaruit het weefsel bestaat. Daarom wordt er gekeken naar de hoeveelheden glycosaminoglycans, DNA en hydroxyproline, de laatste als een maat voor collageen. Om deze biochemische assays te kunnen uitvoeren worden alle stukjes weefsels eerst gevriesdroogd en gedigesteerd (bijlage IV). Alle drie de concentraties (glycosaminoglycan, DNA en hydroxyproline) worden vervolgens bepaald uit hetzelfde sample. Hierdoor is er minder sample nodig en kunnen de resultaten ook makkelijker aan elkaar gerelateerd worden. In bijlage IV van het verslag is een gedetailleerd protocol te vinden van deze drie bepalingen. 3.8.1 Glycosaminoglycan Glycosaminoglycan (GAG) is een lange onvertakte polysaccharide bestaande uit een herhaalde disaccharide. Glycosaminoglycan is te vinden in verbindingsweefsel, zoals collageen, en zorgt voor het aantrekken en vasthouden van water. [5] Om de concentratie te kunnen bepalen van elk stukje weefsel, zal er naast de monsters ook een ijkreeks gemaakt moeten worden. Een ijkreeks is een reeks van bekende concentraties die een ijklijn vormen, waarmee de concentratie van het monster bepaald kan worden. Eerst zal er een test moeten worden uitgevoerd om de juiste verdunning van het monster te bepalen. Deze verdunning is nodig om de waardes van de monsters in het midden van de ijklijn te laten vallen. Vervolgens wordt er DMMB oplossing (bijlage IV) aan de standaarden en monsters toegevoegd, waardoor het een blauw/paarse kleur krijgt. Van deze kleuring wordt de absorptie gemeten bij een golflengte van 540 en 595 nm. Deze waardes worden van elkaar afgetrokken en hieruit ontstaat een nieuwe waarde waarmee gewerkt kan worden. Omdat de ijklijn (die uit de ijkreeks volgt) een rechte lijn is, kan hier vervolgens de concentratie bepaald worden van de monsteroplossingen. Wanneer de concentratie van de monsteroplossingen bepaald is, kan de concentratie berekend worden van het oorspronkelijke monster. 3.8.2 Hydroxyproline Hyp is de afkorting voor hydroxyproline (C5H8O3N). Dit aminozuur is de gehydroxyleerde vorm van proline. Dit aminozuur is een belangrijk component van collageen. Het geeft de draaiing van de helix van collageen. Naast collageen is dit aminozuur in bijna geen ander eiwit te vinden. [6] Net als bij de andere twee assays, wordt er gebruik gemaakt van een assay met ijklijn. Alleen worden er andere chemicaliën gebruikt waardoor er een andere kleur ontstaat. Hierdoor wordt er ook met een andere golflengte gemeten. De handelingen en gebruikte materialen zijn te vinden in bijlage IV. Door de concentratie van Hyp te bepalen kan er een waarde gegeven worden aan de hoeveelheid collageen. In combinatie met het DNA gehalte kan er bepaald worden hoeveel Hyp per DNA aanwezig is. 3.8.3 DNA DNA is de afkorting voor Deoxyribo Nucleic Acid. Het is een macromolecuul dat alle erfelijke informatie bezit. Zonder deze informatie kan een cel niet ontstaan of overleven (op rode bloedcellen na). Om de concentratie te achterhalen wordt ook gebruik gemaakt van een assay met de

12

daarbij horende ijklijn. Het verschil zit hier in de chemicaliën en de gemeten golflengte. Uit de meetwaardes volgt een concentratie en daarmee de concentratie van het oorspronkelijke monster. De concentraties van GAG en Hyp worden berekend per hoeveelheid DNA. Aangezien de hoeveelheid DNA een indicatie geeft voor de hoeveelheid cellen in het weefsel. Hierdoor kan dus bijvoorbeeld een schatting gedaan worden over de hoeveelheid collageen per hoeveelheid DNA. In bijlage IV staat de uitwerking van deze assay. 3.9 Kleuringen 3.9.1 Coupes snijden Wanneer de strips gekweekt zijn, moeten ze worden geanalyseerd. Één van de manieren om dit te doen is door middel van kleuringen. Om de kleuring goed te laten intrekken en ook een duidelijk beeld te krijgen van de weefsels, worden er coupes gesneden. Er worden dunne plakjes van het sample gesneden. Hiervoor wordt het stukje weefsel eerst in paraffine ingekapseld. Vervolgens worden de blokjes met sample tot coupes gesneden en op een preparaat bevestigd. Daarna kan het een Masson Trichrome kleuring krijgen. Bij de kleuring moet eerst de paraffine verwijderd worden met xyleen en alcohol. Hierna kan direct begonnen worden met de kleuring. Ook wordt een stukje weefsel in plastic gekapseld. Met deze coupes kan vervolgens een Toluidine Bleu kleuring gedaan worden. 3.9.2 Masson Trichrome Kleuring Deze kleuring wordt gebruikt in de histologie. Het is een weefselkleuring met drie verschillende kleuren. Eerst wordt Hematoxyline gebruikt om de celkernen te kleuren. Hierdoor krijgen ze een donkerblauw/zwart kleur. Vervolgens wordt Biebrich Scarlet-acid Fuchsin oplossing gebruikt. Dit is een rode kleuroplossing die het cytoplasma en het spierweefsel kleurt. Als laatste komt een blauwe kleuring. Deze bestaat uit twee stappen. Eerst wordt met een werkoplossing ervoor gezorgd dat de tweede oplossing opgenomen kan worden. Deze werkoplossing bestaat uit Phosphotungstic acid en Phosphomolybdic acid. Het tweede deel van deze kleuring komt door Anilline Blue. Het geeft een blauwe kleur aan het collageen. De reden voor deze kleuring is om een beeld te krijgen van wat collageen is en wat spierweefsel of cytoplasma. Collageen is namelijk een belangrijke stof binnen de Tissue Engineering. Het zorgt voor de stevigheid van het weefsel. De kleuring staat beschreven in bijlage V. 3.9.3 Toluidine Bleu Deze kleuring is een algemene cel en weefsel kleuring. Het is ook een zeer makkelijke kleuring. Wanneer de coupes gesneden zijn, worden er een paar druppels Toluidine Blue 0,2% op gedruppeld. Na een paar minuten kan het eraf gespoeld worden en de kleuring is klaar. Door deze kleuring wordt het duidelijk hoeveel cellen er ongeveer zijn er waar ze zitten in het weefsel. In dit onderzoek wordt het voornamelijk gebruikt om de dikte van het weefsel te bepalen. Met deze dikte kunnen de gegevens van de trekproef berekend worden.

13

3.9.4 α-SMA Met deze kleuring wordt gekeken naar alfa Smooth Muscle Actin (SMA). Actines zijn moleculen die voor stevigheid en beweging zorgen van de cel en zijn daarom een zeer belangrijk onderdeel van het cytoskelet. Ook spelen ze een rol bij de celdeling. Alle eukaryote cellen bezitten actine, maar gladde spiercellen bezitten er de meeste. Het eiwit actine is een eiwit dat vrijwel bij alle eukaryote cellen hetzelfde is gebleven tijdens de evolutie. Tussen de mens en de Saccharomyces cerevisiae (een schimmel) zit voor 95% gelijkenis in de bouw van dit eiwit. Spiercellen bevatten veel α-SMA, in tegen stelling tot fibroblasten. Deze type cellen bevatten geen α-SMA. Tussen deze twee type cellen liggen myofibroblasten. Deze fibroblasten maken namelijk wel α-SMA aan. Het α-SMA wordt aange-toond door middel van een antilichaam en een fluorescente label. Mono-clonal mouse anti-human SMA is een antilichaam dat zich hecht aan de NH2-terminaal van het eiwit.

Vervolgens wordt er aan dit antilichaam het fluorescent label Alexa 488 gehecht. Wanneer er licht op valt met de golflengte van 490 nm, zal het Alexa een golflengte van 517 nm uitstralen (licht groen). Dit is vervolgens te detecteren op een fluorescentie microscoop. Met deze beelden kan er semikwantitatief bepaald worden hoeveel cellen er α-SMA aanmaken. Daarnaast wordt er een Dapi-kleuring gedaan, om te zien waar de celkernen liggen. Deze kernen absorberen vervolgens bij 345 nm en stralen 455 nm uit (blauw). De resultaten zien eruit als op figuur 3.4. Als controle wordt een derde kleuring gedaan met Phalloidine TRITC. Hiermee wordt het F-actine gekleurd. Dit actine is de grote bouwsteen van het cytoskelet. Alle cellen bevatten F-actine en hiermee kan het cytoskelet gekleurd worden. Wanneer het bij 587 nm bestraald wordt, zal het bij 602 nm uitstralen, waardoor het een duidelijke rode kleur krijgt. Door deze kleuring uit te voeren op de cellen, wanneer ze bij P2 en P6 zijn, kan gekeken worden wat er gebeurd met het percentage cellen dat α-SMA aanmaken naarmate de passages hoger worden. Ook wordt daarmee duidelijk wat de verhouding tussen fibroblasten en myofibroblasten is. Hoe deze kleuring wordt uitgevoerd is te vinden in bijlage VI. [7] [8]

14

3.10 Real-time PCR 3.10.1 mRNA isoleren Om een indicatie te krijgen van hoeveel er van een bepaald eiwit aangemaakt wordt, kan gekeken worden naar de hoeveelheid mRNA. Alle informatie over de bouw van een eiwit staat op het DNA vastgelegd. Omdat het DNA grote dubbelstrengs moleculen zijn, worden er steeds kleine stukjes overgeschreven die daadwerkelijk nodig zijn voor de aanmaak van eiwitten (transcriptie). Deze kleine copietjes, genaamd mRNA, zijn enkelstrengs. Tijdens dit proces wordt er onderscheid gemaakt tussen intronen en exonen. Intronen zijn stukken RNA die nergens voor coderen. De intronen worden eruit gehaald en de exonen blijven achter. Vanaf dit moment heet het mRNA. Door middel van ribosomen wordt de code omgezet in een ketting van aminozuren, die zo een eiwit vormen (translatie). [5] Om het mRNA te isoleren moet eerst de cel kapot gemaakt worden (lyseren). Vervolgens worden er stoffen aan toegevoegd zodat alleen het mRNA in een kolom achterblijft. Na afloop wordt het mRNA verzameld in RNase water. Van deze RNA oplossing wordt de concentratie mRNA gemeten, om de verdunningen in latere stappen te kunnen berekenen. Al deze materialen en oplossingen zitten in een mRNA-Kit. In deze Kit is ook het protocol te vinden. 3.10.2 cDNA Omdat de PCR alleen maar DNA kan vermenigvuldigen, Moet er van het mRNA eerst DNA gemaakt worden. Omdat tijdens het proces van DNA naar mRNA stukjes DNA niet worden overgenomen, kan er van het mRNA geen volledig DNA gemaakt worden. Omdat het ‘nieuwe’ DNA korter is, krijgt het de naam cDNA. [5] Om van mRNA cDNA te maken, wordt een PCR apparaat gebruikt. Hierdoor kan de temperatuur binnen geringe grenzen geregeld worden. Door enzymen en base toe te voegen, kan er van een enkelstrengs mRNA een dubbelstrengs cDNA gemaakt worden. Voor informatie over de handelingen, zie bijlage VII. 3.10.3 PCR Om te kijken of er wel cDNA in je monster zit dat codeert voor het specifieke eiwit, wordt een PCR uitgevoerd. Door de temperatuur te verhogen gaat het dubbelstrengs DNA uit elkaar en vormen er twee enkelstrengs. Hier hecht vervolgens een primer op die alleen hechten op het specifiek stukje DNA. Door het enzym DNA Polymerase III worden er base geplaatst tegen de primer aan en vervolgens weer tegen die nieuwe base aan. Op deze manier wordt het cDNA verdubbeld. Wanneer deze cyclus is voltooid begint de cyclus weer opnieuw. Op deze manier wordt het cDNA verdubbeld zodat er genoeg cDNA aanwezig is voor een experiment. In figuur 3.4 is overzichtelijk te zien hoe het

15

proces verloopt. Na ongeveer 33 cyclus is er genoeg DNA om een elektroforese uit te voeren. Hiermee wordt zichtbaar gemaakt of het gezochte mRNA in eerste instantie aanwezig was. In bijlage VIII staat het protocol voor de PCR.[5] 3.10.4 Elektroforese Elektroforese is een scheidingstechniek die gebruik maakt van de geladen eigenschappen van een (macro)molecuul. Binnen de elektroforese bestaan talloze technieken die elk op een andere eigenschap scheidt. Voor dit experiment wordt de gel-elektroforese gebruikt. Het idee hierachter is dat het DNA gescheiden worden op verschil in lengte. De gel bestaat uit een oplossing van agarose in TBE-buffer. Wanneer de gel nog vloeibaar is wordt ethidiumbromide (EtBr) toegevoegd. Deze stof hecht aan het DNA en zal ervoor zorgen dat het onder UV licht zichtbaar wordt. Nadat de agarose-gel is gemaakt en gestold, wordt aan de monsters Ficoll-Orange toegevoegd. Deze oranje kleur zal ervoor zorgen dat de snelheid van het snelste molecuul te volgen is. Daarnaast zorgt de Ficoll-Orange ervoor dat het DNA onder in de slotjes komt en niet uit de slotjes gaat. Wanneer de oranje kleur bijna van de gel afloopt, heeft er een maximale scheiding plaatsgevonden. Alle bandjes zullen tussen de slotjes en de oranje kleur zichtbaar zijn. Voor een exacte beschrijving van de handelingen, kan bijlage IX geraadpleegd worden. Het detecteren van de DNA bandjes gebeurt bij een golflengte van 254 nm. Het apparaat dat hiervoor gebruikt wordt is de VersaDoc. [10] 3.10.5 Real-time PCR Het principe van de real-time PCR is vrijwel hetzelfde als die van de normale PCR. Het verschil zit in het feit dat bij real-time PCR het proces gevolgd wordt. Op de base die aan het DNA ‘geplakt’ worden, zitten fluorescente probes. Als een base aan het DNA wordt geplakt, verliest het zijn probe en zal het een fluorescente straling uitzenden. Op deze manier kan een special Real-time PCR apparaat de aanmaak van DNA volgen. Er zal van elke patiënt cellen worden geanalyseerd op mRNA voor Collageen I en Collageen III. Als referentie zal de primer GAPDH gekozen worden, als deze stabiel is over de verschillende patiënten. In bijlage X staat de werkwijze voor deze techniek. 3.11 Statistiek Om alle resultaten statistisch te vergelijken is gebruik gemaakt van een ANOVA test die het mogelijk maakt verschillen tussen meer dan 2 groepen te testen op significantie. Als de ANOVA test een statistisch significant verschil geeft wil dit zeggen dat de parameter die getest wordt, bijvoorbeeld de zaaidichtheid, een significante invloed heeft op de uitkomst, bijvoorbeeld op de UTS. Om de groepen vervolgens onderling te vergelijken wordt gebruik gemaakt van een Bonferroni post-hoc test. Hiermee is het mogelijk om te bepalen welke afzonderlijke groepen van elkaar verschillen. De resultaten van de statistische analyse zijn weergegeven in bijlage XI.

16

4 Resultaten 4.1 Cellen van de vijf patiënten 4.1.1 Groeisnelheid De cellen van de vijf verschillende patiënten zijn geteld gedurende het opkweken naar passage 6 (P6). Bij P2 zijn de cellen opgezet met 0,5 miljoen cellen in een kweekfles van 150 cm2. Verdere passages zijn ze met 1 miljoen overgezet. Alleen de cellen van patiënt I zijn op passage 5 nog eens overgezet met 0,5 miljoen. De reden hiervoor is dat deze cellen als eerste werden gekweekt en er toen nog gezocht werd naar het meest ideale aantal cellen voor het overzetten. Hieronder zijn de grafieken weergegeven van de vermeerdering per dag.

Grafiek 4.1: Vermeerdering per dag per passage

Patiënt V

-0,20

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

P2 P3 P4 P5

Ve

rme

nig

vu

ldig

ing

pe

r d

ag

Patiënt I

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

P2 P3 P4 P5

Verm

en

igvu

ldig

ing

per

dag

Patiënt II

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

P2 P3 P4 P5

Verm

en

igvu

ldig

ing

per

dag

Patiënt III

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

P2 P3 P4 P5

Verm

en

igvu

ldig

ing

per

dag

Patiënt IV

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

P2 P3 P4 P5

Verm

en

igvu

ldig

ing

per

dag

17

Wat meteen opvalt in de grafieken van grafiek 4.1, is dat er geen vast patroon is te herkennen. De cellen van patiënt II en III bezitten over een gelijk patroon. Dit patroon is ook het patroon wat er verwacht zou worden, omdat de cellen zwakker worden naarmate er verder mee gekweekt wordt. Patiënt IV en V hebben een zeer vreemd patroon. Bij patiënt V is er zelfs vermindering van cellen opgetreden. Doordat er bij deze twee patiënten zo weinig cellen waren, is er bij P4 en P5 met een lagere beginconcentratie begonnen, omdat er gewoonweg niet genoeg cellen waren. Verder valt op, dat bij een beginwaarde van 0,5 miljoen de cellen zich beter vermenigvuldigen dan bij 1 miljoen cellen. In bijlage XII zijn de getallen te vinden van de grafieken. Er zijn elke keer bij het overzetten van de cellen foto’s gemaakt (figuur 4.1). Op deze foto’s is te zien dat de tellingen overeen komen met de foto’s. Figuur 4.1: Cellen op P3 van a) patiënt II,

b) patiënt V

De cellen van patiënt II zijn zeer confluent en liggen naast elkaar georiënteerd. Dat in tegenstelling tot de cellen van patiënt V. Deze liggen door elkaar heen en er is nog veel ruimte over tussen de cellen.

18

4.1.2 α-SMA Vervolgens is er een α-SMA kleuring gedaan om te kijken wat de verhouding is tussen fibroblasten en myofibroblasten. Om te kijken of de kleuring gelukt is, is er een negatieve controle meegenomen. De foto’s in figuur 4.2 zijn alle drie met dezelfde filters gemaakt. Op afbeelding 4.2 a, waar alle drie de kleuringen op zijn gedaan, is duidelijk een cel zichtbaar met α-SMA. Bij de andere foto’s is deze kleuring niet gedaan en is met hetzelfde filter geen enkele cel die oplicht. Daardoor kan aangenomen worden dat de kleuring gelukt is. Figuur 4.2: α-SMA kleuring

a) Alexa 488+TRITC+Dapi b) TRITC+Dapi c) Dapi

Omdat een foto maar een klein deel van het totaal kan laten zien, is er onder de microscoop gekeken om een totaalbeeld te krijgen. Er is een schatting gedaan naar het aantal cellen (in %) dat α-SMA bevatten. Deze waardes zijn te vinden in tabel 4.1. De foto’s die gemaakt zijn, zijn te vinden in bijlage XIII.

Figuur 4.3: α-SMA kleuring, a) Alexa 488+TRITC+Dapi,

b) Alexa 488

19

Wat opvalt, is dat er op P6 minder cellen α-SMA produceren dan op P2. Bij de cellen van patiënt II en III is dit percentage hoger dan de rest. 4.1.3 Real-time PCR Van elke patiënt zijn er cellen geanalyseerd met de real-time PCR. Deze run was bedoeld om kennis te maken met de techniek en om te kijken of de primers geschikt waren voor de sample. Omdat deze run niet de volledige analyse was, kunnen er geen conclusies getrokken worden uit de resultaten. Eerst is er een conventionele PCR uitgevoerd, waarmee duidelijk wordt of de primers (collageen I, collageen III en GAPDH) geschikt zijn voor de samples. In figuur 4.4 is een negatief beeld van de elektroforese afgebeeld.

Figuur 4.4: Negatief van elektroforese met drie primers

In de meest linkse en rechte laan van de elektroforese-gel zijn de markers aangebracht. Hiermee zou de lengte van elk bandje berekend kunnen worden. Wat te zien is, is dat er steeds 6 bandjes op dezelfde hoogte zichtbaar zijn. Deze bandjes bevatten dus DNA met dezelfde lengte. Elke van de drie gebruikte primers, heeft een eigen hoogte op de gel.

20

In grafiek 4.2 zijn de curve’s van de real-time PCR afgebeeld.

Grafiek 4.2: Real-time PCR Grafiek 4.3: Smeltcurve’s

met drie verschillende primers

Uit deze gegevens kunnen geen resultaten gehaald worden. Omdat het een ‘test’ run was, zijn er handelingen weggelaten. Zo zijn de primers niet getest op efficiëntie, en is de referentie primer niet getest op stabiliteit. Er zijn ook smeltcurve’s gemaakt gedurende de PCR. Deze curve’s staan in grafiek 4.3. Hieruit is op te maken dat er geen verontreiniging was in de cupjes. Wanneer dit wel zou zijn, waren er onverwachte pieken te zien. Omdat de real-time PCR niet volledig is, worden deze resultaten niet meegenomen in de discussie en conclusies.

21

4.2 Experiment 1: Zaaidichtheid 4.2.1 Trektest Van de verschillende zaaidichtheden zijn trekcurve’s gemaakt. Deze zijn hieronder weergegeven in grafiek 4.4. Grafiek 4.4: Trekcurve’s van de 6 zaaidichtheden

Er is te zien dat de steilheid toeneemt naarmate de zaaidichtheid toeneemt. De groep van 2,5 miljoen cellen/ml is de enige die niet aan die toename voldoet. Daarnaast zijn er twee echte uitschieters: één bij de 2,5 en één bij de 5 miljoen groep. Deze uitschieters zijn ook terug te vinden op de foto’s in bijlage XIV. Omdat deze uitschieters veel effect hebben op alle verdere analyses, worden deze twee stukjes weefsel niet meegenomen bij de verdere berekeningen.

22

De resultaten van de trekproef zijn terug te vinden in bijlage XV. De gemiddeldes met daarbij de standaarddeviaties zijn verwerkt in grafiek 4.5. De Ultimate Tensile Strength (UTS) neemt toe naarmate de zaaidichtheid toeneemt. Bij de groepen van 25 en 50 miljoen is deze stijging aan het afnemen. Ook is te zien dat de 2,5 miljoen groep duidelijk niet op Grafiek 4.5: UTS van zaaidichtheid het patroon ligt zoals de rest. Deze groep is duidelijk minder sterk dan de 1 miljoen groep.

Bij de Young’s modulus (grafiek 4.6) is een gelijk patroon te bekennen als dat van de UTS. Eveneens heeft de 2,5 miljoen groep een waarde die lager ligt.

De waardes in grafiek 4.7van de rekking op moment van het breken liggen bij alle groepen Grafiek 4.6: Young’s modulus van zaaidichtheid

op een gemiddelde van ongeveer 26%. De enige uitschieter is de 2,5 miljoen groep. Deze is een stuk rekbaarder dan de rest

Grafiek 4.7: Strain at break in % van zaaidichtheid

UTS

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

1 miljoencellen/ml

2,5 miljoencellen/ml

5 miljoencellen/ml

10 miljoencellen/ml

25 miljoencellen/ml

50 miljoencellen/ml

Patiënt I

UT

S (

MP

a)

Young's modulus

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

1 miljoencellen/ml

2,5 miljoencellen/ml

5 miljoencellen/ml

10 miljoencellen/ml

25 miljoencellen/ml

50 miljoencellen/ml

Patiënt I

E(M

Pa)

Strain at break %

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

1 miljoencellen/ml

2,5 miljoencellen/ml

5 miljoencellen/ml

10 miljoencellen/ml

25 miljoencellen/ml

50 miljoencellen/ml

Patiënt I

str

ain

at

bre

ak %

23

4.2.2 Masson Trichrome Kleuring Als de foto’s bekeken worden op figuur 4.5 van de Masson Trichrome Kleuring, is te zien dat de kleur toeneemt naarmate de zaaidichtheid toeneemt. De blauwe kleur van in het weefsel van 10 en 25 miljoen cellen/ml correspondeert voor het collageen. De intensiteit van alle kleuren zijn minder, omdat de coupes waarschijnlijk te lang in de azijnzuur hebben gehangen.

Figuur 4.5: Masson Trichrome Kleuring van weefsel, a) 2,5 miljoen, b) 5 miljoen, c) 10 miljoen, d) 25 miljoen

4.2.3 Toluidine Bleu Deze kleuring is voornamelijk gebruikt voor de dikte-bepaling die nodig is voor de berekening van de trektest gegevens. Wanneer naar de coupes wordt gekeken, is er een duidelijk verschil te zien tussen de verschillende zaaidichtheden. In figuur 4.6 zijn drie dichtheden als voorbeeld gegeven.

Figuur 4.6: Toluidine Bleu

a) 2,5 miljoen b) 5 miljoen c) 10 miljoen

24

4.2.4 Biochemische assays De stripjes die van de trektest afkwamen zijn vervolgens geanalyseerd met biochemische assays. Er werd gekeken naar de DNA, GAG en Hyp concentratie. Voor de berekeningen achter de grafieken kan bijlage XVI geraadpleegd worden. DNA: In grafiek 4.8 is een duidelijke stijgende lijn te trekken. Duidelijk is te zien dat de 2,5 miljoen groep onder die lijn ligt. Dit verschijnsel is ook te zien in de trekgegevens en in de andere assays. De rede van de stijgende lijn is ook te verwachten, omdat er met een steeds hogere concentratie is begonnen. Wanneer deze Grafiek 4.8: DNA per drooggewicht lijn zou afvlakken, zou dit de maximale concentratie zijn.

GAG: Bij de verhoudingen van de GAG concentraties (grafiek 4.9) is hetzelfde patroon te vinden als bij de UTS waardes, namelijk een stijging bij de laagste zaaidichtheden en ver-volgens afvlakking bij de hoogste zaaidichtheden

Grafiek 4.9: GAG per drooggewicht

Vervolgens worden de GAG tegen de DNA afgezet. Hiermee wordt gekeken hoeveel GAG aanwezig is per hoeveel-heid DNA. In grafiek 4.10 is een optimum zichbaar. De groep van 5 miljoen is de piek en het neemt af naarmate de zaaidicht-heid meer of minder wordt. Grafiek 4.10: GAG per DNA

GAG per drooggew icht

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

1 miljoencellen/ml

2,5 miljoencellen/ml

5 miljoencellen/ml

10 miljoencellen/ml

25 miljoencellen/ml

50 miljoencellen/ml

Co

ncen

trati

e

GAG/DNA

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

1 miljoencellen/ml

2,5 miljoencellen/ml

5 miljoencellen/ml

10 miljoencellen/ml

25 miljoencellen/ml

50 miljoencellen/ml

Co

ncen

trati

e (

mg

/mg

)

DNA per drooggewicht

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

1 miljoencellen/ml

2,5 miljoencellen/ml

5 miljoencellen/ml

10 miljoencellen/ml

25 miljoencellen/ml

50 miljoencellen/ml

Co

ncen

trati

e (

mic

rog

ram

/mg

)

25

Hyp: Net zoals bij de UTS, Young’s modulus en de GAG is hier een op-lopende lijn te zien die afvlakt bij de 25 miljoen. Ook de Hyp concentraties worden afgezet tegenover het DNA.

Er is een duidelijk optimum te vinden bij deze gegevens. Bij de 10 Grafiek 4.11: Hyp per drooggewicht

miljoen cellen/ml is de verhouding Hyp/DNA het hoogst. De verhouding neemt af wanneer er minder of meer cellen gezaaid worden per ml. Grafiek 4.12: Hyp per DNA

Hyp per Drooggewicht

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

14,00

16,00

18,00

20,00

1 miljoencellen/ml

2,5 miljoencellen/ml

5 miljoencellen/ml

10 miljoencellen/ml

25 miljoencellen/ml

50 miljoencellen/ml

Concentr

atie (m

icro

gra

m/m

g)

Hyp per DNA

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

1 miljoencellen/ml

2,5 miljoencellen/ml

5 miljoencellen/ml

10 miljoencellen/ml

25 miljoencellen/ml

50 miljoencellen/ml

Verh

oudin

g (m

g/m

g)

26

4.3 Experiment 2: Zaaidichtheid in de tijd Van dit experiment zijn geen resultaten. Door een infectie zijn de weefsels verloren gegaan. Nadat het weefsel drie dagen met een bacterie-infectie heeft geïncubeerd, was de kans om de infectie eruit te krijgen te klein. Mocht het weefsel vrij van infectie gekomen zijn, dan had het waarschijnlijk toch nog gevolgen ondervonden van de bacteriën en de antibiotica. 4.4 Experiment 3: Patiënten studie Doordat er te weinig cellen zijn van patiënt IV en V wordt er van deze twee patiënten maar met één dichtheid gezaaid: 10 miljoen per ml. Van patiënt I waren de cellen over-confuent en hierdoor was het moeilijk de cellen van elkaar los te krijgen. Dit maakte het tellen onbetrouwbaar. Daarnaast was er al een eerder experiment met deze patiënt gedaan, dus is gekozen om alleen met 10 miljoen cellen/ml te zaaien. De dag na het zaaien is een infectie geconstateerd. Deze is met antibiotica verholpen. Wat de gevolgen hiervan zijn is nog onbekend. 4.4.1 Trektest Net zoals bij experiment 1 zijn op deze weefsels trektesten gedaan. Hieronder zijn de trekcurves weergegeven. Patiënt I: Patiënt II:

Grafiek 4.13: Trekcurve’s van de patiëntenstudie

27

Patiënt III: Patiënt IV: Patiënt V: Grafiek 4.13: Trekcurve’s van de patiëntenstudie

28

De gegevens van de trukcurve’s zijn bewerkt in bijlage XV en uitgewerkt in de grafieken hieronder.

UTS

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

1,25

1,50

I: 10miljoen

II: 5miljoen

II: 10miljoen

II: 25miljoen

II: 50miljoen

III: 5miljoen

III: 10miljoen

III: 25miljoen

IV: 10miljoen

V: 10miljoen

UT

S (

MP

a)

Grafiek 4.14: UTS van de patiënten studie

Bij patiënt II is een oplopende UTS die bij de 50 miljoen weer is gedaald. Ook is te zien dat patiënt IV opvallend hoger ligt dan de andere.

Young's modulus

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

I: 10miljoen

II: 5miljoen

II: 10miljoen

II: 25miljoen

II: 50miljoen

III: 5miljoen

III: 10miljoen

III: 25miljoen

IV: 10miljoen

V: 10miljoen

E (

MP

a)

Grafiek 4.15: Young’s modulus van patiënten studie

De verhoudingen tussen de verschillende groep, zijn ongeveer hetzelfde als bij de UTS waardes.

29

Strain at break %

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

I: 10miljoen

II: 5miljoen

II: 10miljoen

II: 25miljoen

II: 50miljoen

III: 5miljoen

III: 10miljoen

III: 25miljoen

IV: 10miljoen

V: 10miljoen

str

ain

at

bre

ak %

Grafiek 4.16: Strain at break in % van patiënten studie

De waardes van de rekbaarheid schommelen rond de 28%. 4.4.2 Masson Trichrome Kleuring Nadat het weefsel is opgeblokt in paraffine, zijn er coupes van gesneden. Op deze coupes is vervolgens een Masson Trichrome Kleuring uitgevoerd. Hieronder in figuur 4.7 zijn deze coupes te zien.

Figuur 4.7: Masson Trichrome Kleuring op elke weefsel groep.

30

Figuur 4.7: Masson Trichrome Kleuring op elke weefsel groep.

Bij de groep van patiënt II is duidelijk een verloop te zien. Van 5 tot 25 miljoen neemt de hoeveelheid blauwe kleur toe, waarna de 50 miljoen een minder dichte kleur heeft. Tussen de 5 en 10 miljoen van patiënt III is ook duidelijk verschil te zien. De 25 miljoen van patiënt III is verloren gegaan tijdens de kleuring. Van patiënt IV is nog maar een klein gedeelte over gebleven. Wel is te zien dat het kleine stukje ongeveer dezelfde kleur heeft als de groep II25. Het weefsel van patiënt V is net zo als II5 weinig gekleurd. 4.4.3 Toluidine Bleu Op alle tien de verschillende groepen zijn foto’s gemaakt. Om goed te kunnen vergelijken volgen hieronder (figuur 4.8) alle patiënten naast elkaar met een zaaidichtheid van 10 miljoen cellen/ml.

31

Figuur 4.8: Toluidine Bleu kleuring op weefsel van patiënt I t/m V van 10 miljoen cellen/ml

Het weefsel van patiënt I en IV zien er vrijwel hetzelfde uit. Van patiënt II iets minder en die van III een stuk minder. Het weefsel van patiënt V ziet er niet goed uit.

32

4.4.4 Biochemische assays Ook bij experiment 3 is gekeken naar de concentraties van DNA, GAG en Hyp van het gekweekte weefsel. In bijlage XVII zijn de waardes te vinden die bij deze assays horen. DNA: Bij de cellen van patiënt II en III is te zien dat er binnen de groep een oplopende lijn is. Deze oplopende lijn is te verwachten, omdat er met een steeds hogere concentratie wordt begonnen. Ook is te zien dat patiënt IV het meeste DNA bevat voor een zaaidichtheid van 10 miljoen cellen/ml. Patiënt I en II hebben een vrij lage concentratie DNA ten opzichte van de rest.

Grafiek 4.17: DNA per drooggewicht

GAG:

Bij patiënt II liggen de waardes rond dezelfde waarde. Patiënt III toont een licht oplopende lijn en verder is te zien dat patiënt I en IV de hoogste waarde hebben.

Grafiek 4.18: GAG per drooggewicht

Patiënt I heeft zeer veel GAG tegenover DNA, o.a. veroorzaakt door een lage DNA-waarde. Bij patiënt II is het minder dan bij patiënt I. De andere groepen zijn veel lager dan patiënt I.

Concentratie GAG op drooggewicht

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

Patient I10

Patient II5

Patient II10

Patient II25

Patient II50

Patient III5

Patient III10

Patient III25

PatientIV 10

Patient V10

Co

ncen

trati

e

Concentratie DNA op drooggewicht

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

3,50

4,00

4,50

Patient I10

Patient II5

Patient II10

Patient II25

Patient II50

Patient III5

Patient III10

Patient III25

Patient IV10

Patient V10

Co

ncen

trati

e

33

Grafiek 4.19: GAG per DNA

Hyp:

Concentratie Hyp in drooggewicht

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

14,00

16,00

Patient I10

Patient II5

Patient II10

Patient II25

Patient II50

Patient III5

Patient III10

Patient III25

Patient IV10

Patient V10

Co

ncen

trati

e

Grafiek 4.20: Hyp per drooggewicht

De hydroxyproline concentraties lopen op naarmate de zaaiconcentratie stijgt, bij patiënt II en III. Van patiënt I en IV liggen de waardes bij 10 miljoen hoger dan bij de andere patiënten. Het weefsel van patiënt III en V heeft een zeer lage concentratie hydroxyproline.

Hyp/DNA

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

Patient I10

Patient II5

Patient II10

Patient II25

Patient II50

Patient III5

Patient III10

Patient III25

Patient IV10

Patient V10

Co

ncen

trati

e (

mg

/mg

)

Grafiek 4.21: Hyp per DNA

De verhoudingen tussen deze kolommen komen vrij veel overeen met die van de UTS waardes.

GAG/DNA

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

35,00

40,00

Patient I10

PatientII 5

PatientII 10

PatientII 25

PatientII 50

PatientIII 5

PatientIII 10

PatientIII 25

PatientIV 10

PatientV 10

Co

ncen

trati

e (

mg

/mg

)

34

4.5 Experiment 4: Reproduceerbaarheids studie Een andere onderzoeker een gelijktijdig onderzoek uitgevoerd. Van de patiënten I, II, III en V zijn cellen opgezet. Van deze cellen is weefsel gemaakt met een zaaidichtheid van 10 miljoen cellen/ml. De uitkomsten van deze test zijn vergeleken met experiment 1 t/m 3 en worden besproken in Hoofdstuk 5. Hieronder volgen de resultaten uit de trektest. 4.5.1 Trektest

UTS

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

1,25

1,50

Patiënt I Patiënt II Patiënt III Patiënt V

UT

S (

MP

a)

Grafiek 4.22: UTS van reproduceerbaarheids studie

Young's modulus

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

Patiënt I Patiënt II Patiënt III Patiënt V

E (

MP

a)

Grafiek 4.23: Young’s modulus van reproduceerbaarheids studie

Strain at break %

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

Patiënt I Patiënt II Patiënt III Patiënt V

str

ain

at

bre

ak (

%)

Grafiek 4.24: Strain at break in % van reproduceerbaarheids studie

35

4.5.2 Biochemische assays Verder zijn er de drie biochemische assays op uitgevoerd.

Concentratie DNA op drooggewicht

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

3,50

4,00

Patient I Patient II Patient III Patient V

co

ncen

trati

e

Grafiek 4.25: DNA per drooggewicht

Concentratie GAG op drooggewicht

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

35,00

40,00

Patient I Patient II Patient III Patient V

GA

G/d

ry

Grafiek 4.26: GAG per drooggewicht

GAG/DNA

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

14,00

16,00

18,00

Patient I Patient II Patient III Patient V

GA

G/D

NA

Grafiek 4.27: GAG per DNA

36

Concentratie Hyp op drooggewicht

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

Patient I Patient II Patient III Patient V

co

ncen

trati

e

Grafiek 4.28: Hyp per drooggewicht

Hyp/DNA

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

Patient I Patient II Patient III Patient V

co

ncen

trati

e

Grafiek 4.28: Hyp per DNA

37

5 Discussie 5.1 Opkweken van de cellen Het opkweken van de cellen is begonnen met alleen de cellen van patiënt I. Tijdens het opkweken werd gezocht naar het ideale protocol. Daarna is er begonnen met het opkweken van de andere cellen. Hierdoor is er een klein verschil geweest in het protocol van patiënt I tegenover de andere vier patiënten. De laatste passage in de kweekflessen is er met 0,5 miljoen cellen begonnen. Dat is waarschijnlijk ook de reden van de grote vermenigvuldiging tijdens de laatste passage. Waarom er bij patiënt I, IV en V zo’n afwijkend patroon is in de groei, is nog onduidelijk. Bij de patiënten IV en V was er tijdens het kweken al te zien, dat de groei niet was zoals het eigenlijk hoorde. De cellen lagen random door elkaar heen en de bodem was niet confluent, in tegenstelling tot de flessen van II en III. Van patiënt IV was het al bekend dat deze slecht groeide, maar patiënt V heeft in eerdere studies nog nooit zo slecht gegroeid. Waarschijnlijk lag het aan het cupje cellen dat ontdooit is, omdat er bij een later experiment de cellen van deze patiënt wel goed groeide. Door deze grote verschillen in groei, was het moeilijk één protocol te volgen. Bij patiënt IV en V groeide de cellen zo langzaam dat er niet genoeg cellen waren om met 1 miljoen over te zetten naar 2 of 3 nieuwe kweekflessen. Daarom werden de nieuwe flessen met minder cellen gevuld. De cellen van de vijf patiënten hebben een α-SMA kleuring ondergaan. De kleuring was op moment van analyseren al 3 weken oud. Hierdoor verliest het zijn fluorescentie. De kleuring was nog wel goed zichtbaar voor een goede analyse. Omdat de glaasje met cellen niet voor elke patiënt even confluent was, kan het zijn dat sommige cellen zich anders gedragen hebben dan cellen van andere patiënten. Daarnaast is het kijken en beschrijven van wat je ziet semi-kwantitatief. Hierdoor kan er niet echt een duidelijke uitspraak gedaan worden over de hoeveelheid α-SMA-positieve cellen. Opvallend was wel dat het percentage α-SMA leek af te nemen bij toenemende passages. Dit is een interessant aspect en verder onderzoek hiernaar wordt aangeraden. De PCR die is uitgevoerd, was niet voldoende om er bruikbare resultaten uit te halen. De run was in eerste instantie bedoeld om te kijken of de gekozen markers gebruikt konden worden voor de PCR. De uitwerking hiervan was goed verlopen en er kwamen goede resultaten uit. Er waren alleen bepaalde aspecten die misten voor een bruikbare PCR waarden. De primers moesten eerst getest worden op hun efficiëntie. Ook moest er een referentie primer worden toegevoegd die niet veranderd over de samples. Er moest eerst een PCR uitgevoerd worden, om te kijken wat de beste referentie is. 5.2 Zaaidichtheid Tijdens de trektest waren er twee duidelijke uitschieters. In de groep van 2,5 en van 5 miljoen cellen/ml zaten beide één uitschieter. Deze twee stripjes waren op de foto’s ook al opgevallen. Ook in de assays bleken ze uitschietende waardes te hebben. Daarom zijn ze gedurende de resultaten niet meeberekend. Het is onduidelijk

38

waarom deze 2 stripjes zo afwijken. Verder heeft al het weefsel van de 2,5 miljoen groep opvallende lage waardes in alle testen, kleuringen en assays. De reden van deze afwijking is nog onduidelijk. Wanneer de 2,5 miljoen groep even buiten beschouwing wordt gelaten, is er duidelijk een lijn te herkennen, zoals in grafiek 5.1. Deze lijn loopt op en vlakt af na de 10 miljoen groep. Hiermee is te zeggen dat als er met meer cellen wordt gezaaid dan 10 miljoen per ml, dan zal de strekte van het weefsel niet meer toenemen. Dit geldt alleen voor de cellen van patiënt I. Bij andere patiënten kan dit namelijk anders liggen.

Grafiek 5.1: UTS met trendlijn

Als de assays vervolgens naast de UTS en Young’s modulus waardes worden gelegd, zijn er veel overeenkomsten te vinden. Zo kan de lijn die door de UTS waarden loopt, ook door de GAG en Hyp concentraties getrokken worden. Dit is zeker logisch voor de Hyp omdat deze stof voor de stevigheid zorgt van het weefsel. Ook op de foto’s van de twee kleuringen is te zien dat het weefsel verloopt zoals de lijn door de UTS waardes. Omdat deze waardes zo vergelijkbaar zijn met elkaar, is te concluderen dat de analyses goed zijn uitgevoerd. Kijkend naar de hydroxyproline per DNA is er optimum te herkennen. Bij de 10 miljoen cellen/ml is er namelijk het meeste Hyp aanwezig tegenover DNA. Deze top is terug te vinden in de UTS waardes, waar vanaf dit punt de sterkte van het weefsel niet meer zoveel toeneemt. Wanneer er gekeken wordt naar patiënt II in grafiek 5.2, dan zijn er andere resultaten te zien. Hier is duidelijk een optimum van 25 miljoen cellen/ml

Grafiek 5.2: UTS van patiënt II

39

cellen/ml. Op de foto’s is dit ook te herkennen. Bij de GAG en Hyp waardes niet. De Hyp blijft toenemen en de GAG blijft stabiel over de verschillende concentraties. De drie verschillende zaaidichtheden van patiënt III hebben geen optimum vertoond. Omdat van deze patiënt geen 50 miljoen groep is gemaakt, is het niet duidelijk of de hoogste waardes bij de 25 miljoen groep liggen. 5.3 Patiënten studie In grafiek 5.3 zijn alle UTS kolomen naast elkaar gezet van alle patiënten met een zaaidichtheid van 10 miljoen cellen/ml. Wat meteen opvalt, is dat patiënt IV er ver bovenuit steekt. Patiënten I en II liggen vrij gelijk en III en V zijn zeer laag. Wanneer gekeken wordt naar het DNA op grafiek 5.4, dan is te zien dat het weefsel van patiënt I en II vrij laag liggen. Dit is niet een resultaat dat verwacht zou worden, omdat de cellen tijdens het opkweken goed groeide. Dit in tegenstelling tot patiënt IV. Grafiek 5.3: UTS van de vijf patiënten

Grafiek 5.4: DNA van alle patiënten Grafiek 5.5: GAG van alle patiënten met 10 miljoen cellen/ml met 10 miljoen cellen/ml Grafiek 5.6: Hyp van alle patiënten met 10 miljoen cellen/ml

40

De lage UTS en de lage concentraties aan DNA, GAG en Hyp van patiënt V waren enigszins wel te verwachten. Tijdens het opkweken van deze cellen traden al problemen op. Zoals in de groeigegevens terug te vinden is, kwam het zelfs voor dat er minder cellen uitkwamen dan dat erin gingen. Dit probleem is bij andere onderzoekers met deze patiënt nog niet voorgekomen. Waarschijnlijk waren de cellen die uit de stikstofvriezer kwamen minder sterk dan normaal. Ook patiënt III gaf lage waardes bij de UTS, GAG en Hyp. Tijdens het opkweken van deze patiënt groeide de cellen zeer goed. Dit is dan ook terug te zien in de concentratie DNA. 5.4 Reproduceerbaarheid Om de reproduceerbaarheid te achterhalen, moeten de gegevens van alle weefsels met dezelfde patiënt en zaaidichtheid naast elkaar gehouden worden. Grafiek 5.7: De 3 experimenten langs elkaar

DNA

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

3,50

Patient I Patient Patient Patient

co

nc

en

trati

es

exp 1

exp 3

exp4

Young's modulus

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

Patient I Patient Patient Patient

E (

MP

a) exp 1

exp 3

exp 4

UTS

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

Patient I Patient Patient Patient

UT

S (

MP

a)

exp 1

exp 3

exp 4

strain at break %

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

35,00

40,00

Patient I Patient Patient Patient

str

ain

at

bre

ak %

exp 1

exp 3

exp 4

Hyp

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

14,00

16,00

18,00

20,00

Patient I Patient Patient Patient

co

ncen

trati

es

exp 1

exp 3

exp 4

GAG

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

35,00

Patient I Patient Patient Patient

co

ncen

trati

es

exp 1

exp 3

exp 4

41

Wat opvalt is, dat de waardes van experiment 3 lager liggen dan die van experiment 4. Wel is te zien dat beide experimenten dezelfde verhoudingen vertonen tussen de patiënten. Wat hier waarschijnlijk de reden voor is, is het feit dat het weefsel van experiment 3 een infectie heeft gehad. Alle weefsel waren geïnfecteerd en hebben dezelfde behandeling gehad. De gevolgen hiervan zouden kunnen zijn dat het weefsel hierdoor minder sterk is. Het vreemde is dat patiënt I van experiment 1 eigenlijk bij de waardes van experiment 4 zouden moeten liggen, maar nu tussen de waardes van experiment 3 en 4 in schommelt. Wat een oorzaak kan zijn voor het feit dat de waardes lager liggen als verwacht, is dat de cellen op een andere manier geteld zijn gedurende de opkweek. Experiment 1 is namelijk met het telraam geteld onder de microscoop. Deze tellingen kwamen altijd lager uit dan die met het telmachine. De ware concentratie cellen, dat gezaaid is bij experiment 1, zal dus hoger zijn als dat er met het telmachine geteld was. Daarnaast zijn er cellen gebruikt uit een ander epje, waardoor de cellen al anders waren voordat het experiment was opgezet. Ook bij patiënt V is een groot verschil te zien. Bij experiment 4 liggen de waardes een stuk hoger. Bij de celkweek van deze patiënt voor experiment 3, was de groei extreem laag. Dit in tegenstelling tot wat andere onderzoekers hadden ervaren met deze patiënt. De celkweek voor experiment 4 verliep zoals verwacht. Omdat bij experiment 4 cellen uit een ander epje waren gebruikt, zal dat de oorzaak zijn van het verschil. Gedurende experiment 3 is er een infectie opgetreden. Wat de gevolgen hiervan zijn is nog niet bekend. In tabel 5.1 zijn alle verschillen schematisch weer-gegeven.

Tabel 5.1: Verschillen tussen weefsels

42

6 Conclusies en aanbevelingen Het opkweken van cellen is een proces met een grote variatie, dat afhankelijk is van het oorspronkelijke patiëntenmateriaal. Door deze verschillen is het onmogelijk één protocol te definiëren dat voor alle cellen hetzelfde is. Er zou onderzoek gedaan kunnen worden, waarmee het verschil al voor de celkweek kan worden aangetoond. Met een real-time PCR kan er gekeken worden naar de collageen en α-SMA productie op mRNA niveau. Deze analyse is namelijk door tijdgebrek niet uitgevoerd. Over de zaaidichtheid is meer duidelijkheid gekomen. Het is duidelijk gebleken dat er een optimale zaaidichtheid is. Deze is voor de cellen van patiënt I bij de 10 miljoen cellen per ml medium. Deze waarde kan iets hoger liggen doordat er met het telraam geteld is. Wat daarom aan te raden is, is dat er consequent geteld moet worden met de telmachine. De reden hiervan is dat met het telraam vaak door iedereen anders geteld wordt. Door van elke patiënt een zaaidichtheids-experiment uit te voeren, kan er van elke patiënt de ideale zaaidicht bepaald worden. Uit het 3e experiment is gebleken dat er veel verschil zit tussen de weefsel van verschillende patiënten. Er zou eenzelfde experiment gestart kunnen worden, maar dan met meerder zaaidichtheden per patiënt. Hierdoor kunnen de weefsel beter met elkaar vergeleken worden. Ook is het verstandig om er meer analyses op uit te voeren, zoals een real-time PCR, zodat er op meerdere vlakken verschillen ontdekt zullen worden. De reproduceerbaarheid is een belangrijk aspect. Doordat elk experiment een enigszins ander protocol heeft doorlopen, is het binnen deze stage niet gelukt om hier een uitspraak over te doen. Wel is gebleken dat cellen die anders zijn opgekweekt, een groot verschil tonen tijdens de weefselkweek.

43

Summary The heart is one of the most important organs. When this muscle can not perform his normal function, the results may become lethal. A major part of people with heart disorders, suffer from coronary artery disease or a non functioning leaflet. For these problems a recently new technology has developed: Tissue Engineering. With this technology it is possible to make tissue, which can regain a body function. The advantage of tissue engineering is that the tissue is made from cells of the patient himself. This advantage will give much less complications after the operation. During this internship the main goal was to engineer tissue and analyze it. Cells from different patients were grown to passage 6. After that, the cells were transferred to a scaffold with a fibrin gel. The scaffold is degraded during culture and the cells produce matrix. During this internship all tissues were grown on rectangular scaffold strips. After an incubation time of four weeks, all tissue were tested on there stretch and maximum tension. They were also analyzed on DNA, glycosaminoglycan and hydroxyproline content. A total number of four experiments was started. The first one was to investigate the influence of the seeding density. An interesting discovery was that there was an clear optimum for this seeding density. It also appeared this optimum was not the same for all patients. The second experiment was to discover how profitable the last week of incubation was for making tissue. Because of an infection this experiment failed. With the third experiment the differences between five patients were clarified. The results of this experiment indicated large differences between different patients. The last experiment tested whether this tissue engineering is reproducible or not. Because there where a few chances during the process, no statement can be made out of these results. What is worrisome is that little changes appear to have a large effect on the outcome of the experiment. .

44

Literatuur [1] Stekelenburg M, (2006), Strain-based optimization of human tissue-

engineered small diameter blood vessels, Eindhoven: Universiteitsdrukkerij TU Eindhoven.

[2] Wikipedia, (2007), Coronary Artery Bypass Graft, geraadpleegd op 12 september 2007 via http://nl.wikipedia.org/wiki/Coronary_Artery_Bypass_Graft

[3] Mol A. (2005), Functional tissue engineering of human heart leaflets, Eindhoven: Universiteitsdrukkerij TU Eindhoven.

[4] Bijlage III [5] Campbell & Reece, (2005), Biology, Pearson-Benjamin Cummings [6] Wikipedia, (2007), Hydroxyproline, geraadpleegd op 10 oktober 2007 via

http://en.wikipedia.org/wiki/Hydroxyproline [7] Wikipedia, (2007), Actin, geraadpleegd op 20 november 2007 via

http://en.wikipedia.org/wiki/Actin [8] Sigma, Monoclonal Anti-a Smooth Muscle Actin Clone 1A4, geraadpleegd op

20 november 2007 via http://www.sigmaaldrich.com/sigma/datasheet/a2547dat.pdf

[9] Braam W.G.M. (2000), Elektroforese, Houten: Educatieve Partners Nederland Figuren: [1] http://www.medicinenet.com/coronary_artery_bypass_graft/article.htm [2] http://yourtotalhealth.ivillage.com/coronary-artery-bypass-

surgery.html?pageNum=7 [3] http://roy.schrijft.nl/vb-hartkleppen.html [4] Zelf gemaakt [5] Zelf gemaakt [6] http://members.aol.com/BearFlag45/Biology1A/LectureNotes/lec24.html

45

Bijlage I

Culturing Human Vena Saphena Cells (HVSC)

Date: 23-1-2003 / 20-3-2007

Introduction These cells are harvested from left-over patient material used in cardiac by-pass operations.

Patients are not explicitly tested for micro-organisms, but are generally in good health apart

from heart problems. Nevertheless the possibility of micro-organisms places handling of these

cells in risk level 2. During the harvesting protocols cells are divided in different batches

corresponding to the harvesting series (in total 4 batches can be harvested from one piece of

saphenous vein). Be aware that the cells can only be used until passage number 8-9, after that

the cells display a changed morphology and a different growth speed.

Precautions

- Perform operations and materials handling according to safe microbiological

procedures. Bear in mind that these are primary human cells and are therefore

categorized at risk level 2.

- Several hazardous chemicals are being used in this protocol. Use the appropriate

personal protection (gloves, fume-hood, etc) and read the concomitant MSDS’s.

(Hazardous) Chemicals

- DMSO is irritant; R36,37,38/S2,23,36

- Isopropanol (2-propanol; isopropyl alcohol) is highly flammable; R11,36,37 /

S7,16,24,25,26

Requirements

- Growth medium

- PBS

- Trypsin

- T150 culture flasks

Preparation of reagents

Growth Medium

- DMEM Advanced (500 ml)

- 10% FBS (50 ml)

- 1% Glutamax (5 ml)

- 0.1% Gentamycin (0.5 ml)

46

Procedures

Thawing the cells

Normally the cells are frozen in an amount of ~1 x 106 cells per vial. This is a good

amount to start with in a T150 flask. The passage that is on the vial is the passage at which

they were frozen, so add a passage when you set up the cells.

1) Take a vial out of the liquid nitrogen

2) Warm up between your hands

3) Carefully open the vial to let N2 escape

4) Put 10 ml PBS in a 50 ml centrifuge tube

5) Transfer the contents of the vial (1 x 106 cells) to the centrifuge tube with the PBS

6) Rinse the vial with PBS and add to the centrifuge tube

7) Centrifuge 7 min at 1000 rpm (or 5 min at 1500 rpm)

8) Discard the supernatant and resuspend the cells in 10 ml medium

9) Transfer the cells to a T150 flask

10) Rinse the centrifuge tube with another 15 ml of medium and add this to the T150 flask

11) Mix the cells with the medium gently and place the flask in the incubator (always

check the water level in the incubator!)

Medium Change

The medium should be changed every three to four days. Most convenient is to do this

every Tuesday and Friday or every Monday and Thursday.

1) Discard the medium

2) Rinse the cells once with PBS

3) Add new medium up to 25 ml per flask

Subculturing the cells

First subculturing after thawing:

It will take about 7-10 days to grow confluent. Subculture the cells (you will have about 5-

6 X 106 cells) at a seeding density of 1.0 X 10

6 cells per new flask.

Further subculturing:

It will take them about 10 days before they grow 80-90% confluent. Subculture them (you

will then have about 5 X 106 cells per flask) at a seeding density of 1.0 X 10

6 cells per new

flask.

1) Discard the medium

2) Rinse the cells twice with 2x 10 ml PBS

3) Add trypsin (2.5 ml per T150 flask) and distribute evenly over the bottom of the flask

4) Place the vial in the incubator for 7 minutes

5) Check whether all the cells are rounded up and de-attached. If not place the flask back

into the incubator for a few more minutes.

6) Add 10 ml of medium to the flask and mix the medium with the cells and the trypsin

7) Transfer the medium to a centrifuge tube

8) Add 10 ml of PBS to the flask and pipette up and down to the walls of the flask to get

all the leftover cells transferred into the centrifuge tube

9) Check the flask microscopically for leftover cells. If there are still many cells in there

rinse the flask again with PBS and add this to the centrifuge tube

47

10) Centrifuge 7 minutes at 1000 rpm

11) Discard the supernatant and resuspend the cells in 1 ml medium for counting

(described separately)

12) Count the cells

13) Calculate the amount of new flasks needed to get a seeding density of 1 x 106 cells per

new flask

14) Add medium to the cells and resuspend

15) Divide the cells over the desired amount of new flasks

16) Fill each flask up to 25 ml with medium and place the flasks in the incubator

!!!!! You can continu the subculturing procedure up to passage 8-9, after that passage they

will not be the same cells anymore as you can notice in a changed morphology and a

different growth speed.

!!!!! Best is to count the cells every time you transfer them to keep track of their growing

speed. Prepare a growth curve and check whether the speed does not change over the

culture period.

Counting the cells

Important for the counting procedure is to think of the amount of cells you expect to have

in your flasks to calculate the right dilution factor and to prevent that you will have too

less or too many cells in your counting window. Always try to have 100-150 cells in your

counting window for a reliable counting.

1) Prepare the counting window: clean, put the cover glass on top and check for dust

2) After resuspending the cells in 1 ml of medium, take out 50 µl of the suspension and

transfer this to a small centrifuge tube, which will be your counting tube

3) Calculte the dilution factor for counting:

4) For example if you would expect 15 X 106 cells, you should dilute the cell suspension

10 times to get 150 cells in your counting window: 15 X 106 (expected amount) /

10.000 (factor of the Neubauer counting window) / 150 (desired amount of cells to

count)

5) Add PBS to the counting tube to obtain the desired dilution and resususpend the cells

in the PBS

6) Put 11µl of the counting solution at each side of the counting window

7) Count the cells and check viability (living cells appear as round cells with a white edge,

dead cells are dark and have irregular edges

8) Calculate the amount of cells in your suspension:

9) Counted cells X dilution factor X 10.000

10) Discard the counting solution

Freezing the cells

What you need for freezing:

- Normal Human Vena Saphena Cells culture medium

- DMSO (toxic!)

- Nalgene Cryovials

- Cryocontainer filled with isopropanol

- Ice

48

How to freeze Human Vena Saphena Cells:

1) Prepare freezing medium: a solution of 10:1 medium:DMSO. For example 10 ml

HVS medium + 1 ml DMSO, resulting in a ∼10 % DMSO/medium solution

2) Discard the medium from the cells

3) Rinse the cells twice with PBS

4) Add trypsin (2.5 ml per T150 flask) and distribute evenly over the bottom of the flask

5) Place the vial in the incubator for 7 minutes

6) Check whether all the cell are rounded up and de-attached. If not place the flask back

into the incubator for a few more minutes.

7) Add 5 ml of medium to the flask and mix the medium with the cells and the trypsin

8) Transfer the medium to a centrifuge tube

9) Add 10 ml of PBS to the flask and pipet up and down to the walls of the flask to get all

the leftover cells transferred into the centrifuge tube

10) Check the flask microscopically for leftover cells. If there are still many cells in there

rinse the flask again with PBS and add this to the centrifuge tube

11) Centrifuge 7 minutes at 1000 rpm (or 5 min at 1500 rpm)

12) Discard the supernatant and resuspend the cells in 1 ml freezing medium

13) Count the cells, in the mean time keep the rests of the cells on ice as DMSO is toxic to

the cells

14) Dilute the cell supsension up to a concentration of 2 X 106 cells per ml in freezing

medium

15) Fill out 1 ml per Nalgene cryovial (equals 2 X 106 cells per vial), label the vials and

place the vials in the cryocontainer

16) Place the cryocontainer in -80°C for about 24 hours and then transfer the vials to the

liquid nitrogen container

17) Fill out a freezing form and note in the database at what spots you have placed the

cells in the liquid nitrogen

49

alcohol 70% coverglass

Chamber

Bijlage II

Counting cells

Date: original date unknown; revised: 6 August 2007;

Introduction To determine the amount of cells in your sample a Hemacytometer is used. The Hemacytometer is an object glass with two “counting chambers”. On top a coverglass is placed such that the chamber height is 0.1 mm. The counting chambers are composed of a grid. There are several types available, in the cellab we use the Neubauer Hemacytometer. In this type the grid is composed as the picture below. The smallest squares, lined with single lines, are (0.25*0.25=) 0.0625 mm2. Triple lines group clusters of 16 smaller squares (A,B,C,D). The total surface of such a cluster correlates to ((4*0.25)*(4*25)=) 1 mm2, resulting in a corresponding volume of 10-4 ml. The cells in such a cluster have to be counted. To determine the viability of your sample, you can stain your cells with Trypan Blue. Trypan Blue only penetrates diseased cells, colouring them blue, while viable cells remain colourless. By determining the ratio between blue and colourless cells, you can determine the viability. Don’t forget to correct for the dilution when you are using Trypane Blue. � Note: See also information about counting chambers in category “equipment”

Precautions

- Perform operations and materials handling according to safe microbiological

procedures.

- Several hazardous chemicals are being used in this protocol. Use the appropriate

personal protection (gloves, fume-hood, etc) and read the concomitant MSDS’s.

(Hazardous) Chemicals

- Trypan Blue is harmful; R20,21,22,36,37,38,40,45,47/S45

-

50

Requirements

- Haemocytometer

- Coverglass

- 70% alcohol

- Trypane blue

- Medium

- Eppendorf tubes

- Pipettes and pipette tips

- Centrifuge

- Inverse microscope

- Cell suspension

Procedures

1) Moisten the sides of the counting chambers with 70 % alcohol and place the coverglass on

top of it. Press down the coverglass gently and/or secure the coverglass with the locks.

2) Add 50 µl of Trypan Blue to an eppendorf tube (optional) and add 50 µl of cell suspension

(use a sterile pipette tip).

3) Mix and transfer the suspension to the hematocytometer. Gently pipet ~10 µl next to the

coverglass, the area under the coverglass will fill automatically by capillary suction.

4) Place the hematocytometer on the inverse microscope table and use the 20x objective and

start counting.

5) Count 16 smaller squares (or 1 cluster)

6) Decide which cells to include and which to exclude. Example: include all cells on the

upper and right lines; exclude the cells on the lower and left lines.

7) Count at least 2 clusters, and take the average of both countings.

Calculations

Average of both countings * dilution factor * 104 = amount of cells per ml

Viability = average colourless cells / average all cells * 100%

51

Bijlage III

Tissue Engineering of tissue strips in 6-wells plate

Date: 19 Sep. 07

Introduction The protocol that is described here is a general

protocol for tissue engineering using Human Vena

Saphena Cells. As a scaffold material PGA/P4HB is

used in this protocol. Fibrin gel is used as a cell

carrier for seeding. Rectangular tissue strips are

cultured which are attached to RVS rings. This

protocol is based on the ‘old’ general tissue

engineering protocol, written by A. Mol.

Precautions

- Perform operations and materials handling according to safe microbiological

procedures.

- Several hazardous chemicals are being used in this protocol. Use the appropriate

personal protection (gloves, fume-hood, etc) and read the concomitant MSDS’s.

(Hazardous) Chemicals

- Tetrahydrofuran is highly flammable and irritant; R11-19-36/37, S(2-)16-29-33

Requirements

Scaffold preparation:

- PGA

- P4HB solution dissolved in THF

- Polyurethane (PU) dissolved in THF (Chemical lab)

- RVS rings

- 70% alcohol

- PBS

- HSV medium

Seeding

- HSV medium

- TE medium

- Human saphenous vein myofibroblasts

- Trypsin

- PBS

- sterile tweezers

- (low attachment) 6-wells plate

52

- Fibrinogen

- Thrombin

- 2.5ml syringes

- 0.2µm filters

- Ice

- Counting window

Preparation of reagents

The medium used for tissue engineering differs from the medium used for cell culture. The

amount of antibiotics used is a bit larger to prevent infections and L-ascorbic acid 2-

phosphate is added to stimulate matrix formation.

HSV medium:

DMEM Advanced (500ml)

10% FBS (50ml)

1% glutamax (5ml)

0.1% gentamycin (0.5ml)

TE medium:

DMEM Advanced (500ml)

10% FBS (50ml)

1% glutamax (5ml)

0.3% gentamycin (1.5ml)

L-ascorbic acid 2-phosphate, Sigma (130mg): non sterile!

L-ascorbic acid 2-phospate has to be solved in DMEM Advanced and sterile filtered:

Therefore, add 15ml of DMEM Advanced to a 50ml tube, warm this for several minutes in

the warm water bath (in warm medium the ascorbic acid will more easily dissolve), add

130mg L-ascorbic acid 2-phosphate, put it back in the warm water bath. After about 10

minutes it will be dissolved, sterile filter it into the rest of DMEM. Then add the rest of the

components to the medium

- P4HB solution

Dissolve 0.3 gram P4HB in 30 ml THF to obtain a 1% w/v solution.

Procedures

Day 1-2: Preparation of scaffold

12) Cut rectangular strips of approx. 30*6mm out of the PGA sheet

13) Coat the PGA strips with P4HB by dipping the scaffold into the P4HB solution

14) Leave the scaffold to dry on a glass plate in the cabinet

15) Let the scaffolds further dry in the vacuum stove in a centrifuge tube with holes in the

lid overnight.

53

16) The scaffold strips can then be mounted on the RVS rings. Put some PU solution

(which can be found in the chemical lab, or make it yourself) in a glass beaker. Put a

droplet of the viscous PU solution on either sides of the ring, by using a small spoon

(or syringe). Make sure that there’s not only PU on top but also on the side and bottom.

This will ensure firm attachment of the scaffold to the ring. This procedure is

necessary as the PU does not adhear to RVS. Press the scaffold strips firmly into the

PU droplets and put some additional PU on the scaffold ends.

17) Let the scaffold rings dry overnight (no vacuum).

18) Put the rings in a 6-wells plate.

19) Fill the wells with 70% alcohol at leave it for at least 3h (work in the LAF cabinet)

20) Remove the alcohol and rinse thoroughly with PBS.

21) Fill the wells with medium and place in an incubator overnight.

Day 3: Seeding of the scaffold

22) Prepare the thrombin solution: weight about 1-1.5mg of thrombin and transfer to a

centrifuge tube.

23) Add an amount of TE medium to obtain a concentration of 10 IU/ml. Look at the

thrombin pot to see how much IU go into 1mg. If, for example, it says 1mg contains

34.7 IU, you will need a concentration of 0.288mg thrombin per ml medium.

24) Shake the solution and put on ice for about 10 minutes

25) Sterile filter the solution with the syringe and the sterile filter.

26) Store the sterile solution on ice until use

27) Prepare the fibrinogen solution: weight about 50mg of fibrinogen and transfer to a

centrifuge tube.

28) Add an amount of TE medium to obtain a concentration of 10mg actual protein per ml

medium. If, for example, the amount of actual protein is 80% you will need 12.5mg/ml

medium to obtain a concentration of 10mg actual protein/ml medium.

29) Mix (gently shake) the solution for a couple of minutes until (almost all) the

fibrinogen is dissolved and sterile filter this. Sometimes you will need multiple sterile

filters for this.

30) Store the sterile solution on ice until use.

31) Before you start, calculate the amount of cells you need:

Per strip you will need about 150µl of cell suspension, equalling the volume of

your strip. The seeding density can be varied but 10.000 cells/mm3 = 10*10

6

cells/ml normally gives good results. In this case you will need 1.5*106

cells/strip.

32) Rinse the desired amount of flasks or rollerbottles (RB) with cells twice with PBS

33) Add 2.5ml (150 flask) or 10ml (RB) of trypsin and distribute evenly over the

bottom/surface.

34) Place the flasks/RB for 5-10 minutes in the incubator.

35) Check whether all the cells are rounded up and de-attached. If not place the flasks/RB

back into the incubator for a few more minutes.

36) Add medium to the flasks/RB and mix the medium with the cells and trypsin

37) Transfer the medium with cells to the centrifuge tube

38) Rinse the flasks/RB with PBS and add to the centrifuge tube

54

39) Centrifuge 7 minutes at 1000rpm

40) Discard the supernatant and resuspend the cells in 1ml medium for counting

41) Count the cells (as described in the protocol culturing human vena saphena cells)

42) Resuspend the cells in 10ml PBS

43) Centrifuge them again at 7 minutes at 1000 rpm

44) Discard the supernatant and resuspend the cells in the sterile thrombin solution so that

you obtain a concentration of 20*106 cells/ ml thrombin (this will result in a

concentration of 10*106 cell / ml fibrin)

45) To seed 2 strips, add 150µl of the thrombin-cell solution to a 5ml tube, take 150µl of

sterile fibrinogen in the pipet tip and put the pipet to 400µl

When fibrinogen is added to the thrombin, the solution starts to gel very

quickly. Therefore you need to adjust the volume of the pipet before you start

mixing. The total volume of fibrinogen and thrombin in this case is 300µl, but

the cells have a volume as well. To not loose any of the cells, take a larger

volume

46) Mix the cell/thrombin solution gently with the fibrinogen for several times and then

immediately pipet the mixture at several spots of the 2 strips.

47) After seeding all of the strips in the 6-wells plate, place the scaffold with cells in the

incubator for about 30 minutes to let the fibrin gel further polymerize.

48) Carefully add medium to the constructs and place them back into the incubator.

49) Culturing of the construct: change the medium every 2-3 days. Do not rinse with

PBS. Preferably, put your 6-wells plates in the incubator on a shaking table to allow

mixing of the medium

50) Sacrificing the construct: after the desired amount of culture weeks, the scaffolds

need to be sacrificed to determine the tissue development and mechanical properties.

To optimally use your tissue for analyses, you can first do mechanical testing and

subsequently prepare the tissue for biochemical assays.

51) When sacrificing your construct it is important to keep the tissue on ice as much as

possible after cutting. Proteases are being secreted by the cells when the tissue is

damaged and these will degrade the matrix. If you keep the tissue on ice, this process

is slowed down.

52) If you perform mechanical testing make sure the tensile tester is ready for use.

53) For histology you can cut off a small piece of each strip and test the rest of the strip

mechanically. Or, you can sacrifice one strip for histology and perform the mechanical

testing on the other whole strips. The pieces for histology should be transferred to a

vial or well containing formalin. These can be stored in the fridge until use.

54) After mechanical testing, the tissue can be freeze-dried for biochemical assays.

55

Bijlage IV Protocol GAG/DNA/Hyp assay from one sample

Date: Revised 19-10-2006

Introduction GAG/DNA DNA and GAG can be determined from different samples according to the Sigma kit for

DNA isolation and an individual GAG assay. By adapting the original GAG protocol, it is

now suitable for determination of GAG and DNA (Hoechst dye method) from the same

sample. This saves tissue and gives you correlated data.

Introduction Hydroxyproline Hydroxyproline, or hydroxyproline (C5H9O3N), is an uncommon amino acid, abbreviated as

Hyp, e.g., in Protein Data Bank. Its IUPAC name is 4-hydroxypyrrolidine-2-carboxylic acid.

Hydroxyproline differs from proline by the presence of a hydroxyl (OH) group attached to the

C (gamma) atom. Other hydroxyprolines also exist in nature, notably 2,3-cis 3,4-trans-

dihydroxyproline, which occurs in diatom cell walls, and is postulated to have a role in silica

deposition.

Hydroxyproline is produced by hydroxylation of the amino acid proline. It is not coded for by

DNA, however, and is hydroxylated after protein synthesis. Along with proline, it is one of

two cyclic amino acids found in proteins.

Hydroxyproline is a major component of the protein collagen. It helps provide stability to the

triple-helical structure of collagen by forming hydrogen bonds. Hydroxyproline is found in

few proteins other than collagen.

Proline hydroxylation requires ascorbic acid. Most effects of absence of ascorbic acid in

humans come from the resulting defect in hydroxylation of proline residues of collagen, with

reduced stability of the collagen molecule causing scurvy.

(http://en.wikipedia.org/wiki/Hydroxyproline)

The assay consists of four steps:

1) Sample digestion � Day 1

2) GAG assay �

3) DNA assay �

4) Hyp assay � Day 3

Precautions GAG/DNA:

- Perform operations and materials handling according to safe microbiological

procedures.

- Several hazardous chemicals are being used in this protocol. Use the appropriate

personal protection (gloves, fume-hood, etc) and read the concomitant MSDS’s.

Precautions Hyp:

- Perform operations and materials handling according to safe microbiological

procedures.

- Several hazardous chemicals are being used in this protocol. Use the appropriate

personal protection (gloves, fume-hood, etc) and read the concomitant MSDS’s.

- Handle flammable chemicals in the fume hood or under the suction cap

Day 2

56

(Hazardous) Chemicals GAG/DNA:

- EDTA after chronic exposure is mutagenic

- L-cystein is irritant and after chronic exposure mutagenic; R36,37,38/S26,36

- Papain is harmful and after chronic exposure teratogenic and reprotoxic;

R36,37,38,42/S22,24,26,36,37

- Chondroitin sulfate from shark cartilage is not fully tested yet.

- 1-9-dimethylmethylene blue is harmful; R36/S26,37-39

- Glycin after chronic exposure is mutagenic; S22,24,25

- HCl (for titrating pH) is toxic, corrosive and dangerous to the environment

R23,24,25,34,36,37,38/S26,36,37,39,45

- TRIS is irritant, R36,37,38/S26,36

- Hoechst dye 33528 bis-benzimid is harmful and after chronic exposure mutagenic;

R22,36-38/S26,36

- Calf thymus DNA is not fully tested yet; S22-24,25

(Hazardous) Chemicals Hyp:

- Hydroxyproline is after chronic exposure mutagenic

- NaOH is corrosive; R35/S(1,2),26,37,39,45

- Citric acid is irritant; R36/S26

- Sodium Acetate (NaAc) is after chronic exposure mutagenic

- Glacial acetic acid is corrosive; R10,35/S(1,2),23,26,45

- Chloramin-T is corrosive; R22,31,34,42/S7,22,26,36-39,45

- n-Propanol is flammable and irritant; R11,41,67/S(2),7,16,24,26,39

- Perchloric acid is oxidizing and corrosive; R5,8,35/S(1,2)23,26,36,45

Requirements/ Preparation of reagents

1. Sample digestion (Day 1)

Stock solutions phosphate buffer (500 ml, 500 mM) for digestion buffer:

- Solution 1 – acidic: dissolve 30 gram of Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4 –

MW 119.98) in 500 ml MQ and autoclave.

- Solution 2 – basic: dissolve 35.5 gram of Di-Sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4 –

MW 141.96) in 500 ml MQ and autoclave.

From these stock solutions you can prepare phosphate buffers with various pH’s. For the

digestion buffer you will need a pH of 6.5. For this pH you use about 5 parts of solution 1

and 4 parts of solution 2. Always titrate the pH exactly at the desired pH!! Autoclave after

preparation.

Stock solution EDTA (100 ml, 500 mM, pH 8.0) for digestion buffer:

- Add 18.6 gram EDTA (MW 372.2) to 80 ml of MQ and titrate the pH at 8.0 with

NaOH. Dissolve the EDTA and add MQ up to a volume of 100 ml. Autoclave after

preparation.

57

Digestion buffer (100 ml) according to Kim et al. (1988), Analytical Biochem 174, 168-176:

- 20 ml phospate buffer (500 mM, pH 6.5, as described above) � end conc. 100 mM

- 78.8 mg L-cystein (C3H7NO2S•HCl; MW 157.6) � end conc. 5 mM

- 1 ml stock solution EDTA (500 mM) � end conc. 5 mM

Add MQ up to a total volume of 100 ml

Store the solution at 4°°°°C.

GAG standard (10X, 10 mg/ml):

- Dissolve 30 mg chondroitin sulfate from shark cartilage (Sigma C4348, stored at 4 °C)

in 3 ml MQ. Freeze in aliquots at -20°°°°C.

Papain

2. GAG Assay (Day 2)

DMMB solution (1 liter, pH 3.0) according to Farndale et al. (1986), Biochim Biophys Acta

883, 173-177:

- 16 mg 1-9-dimethylmethylene blue (MW 347.91) � end concentration 46 µM

- 3.04 gram Glycin (MW 75.07) � end concentration 40.5 mM

- 2.37 gram NaCl (MW 58.44) � end concentration 40.5 mM

Add MQ up to a volume of 800 ml.

Titrate the pH to 3.0 with 0.1 M HCl (you will need about 95 ml).

Add MQ up to a total volume of 1 liter.

3. DNA Assay (Day 2)

TNE (1000 ml, pH 7.4) for preparation of the Hoechst working solution:

Add the following components to 800 ml of MQ:

- 1.21 gram Tris (hydroxymethyl)-aminomethan (MW 121.14)

� end concentration 10 mM

- 2 ml 0.5 M EDTA � end concentration 1 mM

- 117 gram NaCl (MW 58.44) � end concentration 2 M

Titrate the pH to 7.4 with concentrated HCl. Add MQ up to a total volume of 1000 ml and

autoclave.

TE buffer (1000 ml, pH 8.0) for preparation of the standards and the samples:

- 1.21 gram Tris (hydroxymethyl)-aminomethan (MW 121.14)

� end concentration 10 mM

- 2 ml 0.5 M EDTA � end concentration 1 mM

Dissolve in 800 ml MQ and titrate the pH at 8.0. Add MQ up to 1000 ml.

DNA stock solution for DNA standard:

Dissolve 5 mg calf thymus DNA (Sigma) in 100 ml of TE buffer (=50 µg/ml). Dissolve

thoroughly by using a vortex and syringing the solution up and down through a narrow needle.

Warming up the solution to 37 °C might help. Make sure the DNA is completely dissolved.

Store the solution protected from light at 4°C.

58

Hoechst dye stock solution (1 mg/ml):

Dissolve 10 mg Hoechst dye 33528 bis-benzimid (Fluka 14530) in 10 ml MQ.

Divide the solutions over eppendorf vials and store the solution protected from

light at 4 °C. More aliquoted eppendorf vials can be found at -20 °C.

4. Hydroxyproline assay (Day 3)

Hydroxyproline standard stock (10 mg/ml):

100 mg Hydroxyproline (Sigma H5534) in MQ up to a volume of 10 ml

Freeze in aliquots at -20°C

NaOH-solution:

4 M solution (40 gr/mol): 16 gram NaOH in 100 ml MQ

Citric acid:

1.4 M solution (192 gr/mol): 29.4 gram Citric acid X H2O in 100 ml MQ

Acetate-citrate buffer (pH 6,5):

Sodium Acetate X 3 H2O (Sigma S7670) 60 gram

Citric acid X H2O (Merck 1.00244.1000) 25 gram

Glacial acetic acid (Merck 1.00056.1000) 6 ml

NaOH 17 gram

Add MQ up to a volume of 500 ml and titrate pH at 6.0 using glacial acetic acid

Chloramin-T solution:

1.41 gram Chloramin-T (Sigma C9887) 10 ml MQ 10 ml N-Propanol (1-propanol, Sigma P6334). Add 80 ml acetate-citrate buffer to this solution (total volume of 100 ml).

If you are using Chloramin •••• 3 H2O, use 1.74 grams instead of 1.41 grams!

Store at 4°C up to 1 month Handle under the suction cap!

Aldehyde/perchloric acid solution:

7.5 gram p-Dimethylaminobenzaldehyde (Sigma D8904)

31 ml N-Propanol.

Slowly add 11.2 ml 70% perchloric acid and 1.9 ml MQ; or 13 ml 60% perchloric acid

(total volume about 50 ml).

Prepare this solution fresh before each assay in the fume hood.

59

Procedures

1. Sample digestion (day 1)

1) Lyophilise the samples for at least 4 hours.

2) Weight the samples; make sure that you have at least 2-3 mg per sample and that you have

3 or more samples per test group to be able to perform statistics on your data.

3) Prepare the digestion buffer: add 125-140 µg papain (Sigma P-5306, stored in -20°C) per

ml digestion buffer that you will use.

4) Dilute the GAG standard 1: 10 in MQ to obtain a solution of 1 mg/ml.

5) Prepare the GAG standards in duplo:

Standard stock solution 1 (50 µg/ml):

25 µl diluted GAG standard (1 mg/ml) + 475 µl papain digestion

buffer.

Standard 2 (25 µg/ml): 250 µl of standard stock solution 1 + 250 µl papain digestion

buffer

Standard 3 (12.5 µg/ml): 250 µl of standard 2 + 250 µl papain digestion buffer

Standard 4 (6.25 µg/ml): 250 µl of standard 3 + 250 µl papain digestion buffer

Standard 5 (3.125 µg/ml):250 µl of standard 4 + 250 µl papain digestion buffer

Standard 6 (1.56 µg/ml): 250 µl of standard 5 + 250 µl papain digestion buffer

Standard 7 (0.78 µg/ml): 250 µl of standard 6 + 250 µl papain digestion buffer � vortex

and discard 250 µl.

Standard 8 (0 µg/ml): 250 µl papain digestion buffer

6) Add 500 µl papain digestion buffer to the samples, not to the standards. The volume you

use to digest is referred to later on as [digestion volume]. (The minimal amount of papain

digestion buffer must be 300 µl)

7) Incubate the vials with the samples and the standards at 60 °C overnight (16 hours). This

can be done in the large water bath, although ensure that the openings in the lid are

secured with autoclave tape to prevent evaporation of the water.

After incubation let them cool down and go ahead with the DNA, GAG and Hyp analyses.

You can also store the samples at 4 °C to analyze them later.

2. GAG Assay (Day 2)

1) Centrifuge the digested samples for 10 minutes at 12000 rpm.

2) There is a big chance that if you use the pure samples, they will exceed the values of the

standard curve. If you have to prepare dilutions, dilute the samples in digestion buffer

(without papain).

3) Centrifuge your diluted samples and standards for 5 minutes at 12000 rpm to prevent that

small particles (not always visible by eye) will interfere with the absorbance measurement

(filtration does not work).

4) Pipet 40 µl of the supernatant and standard in duplo into a 96-wells plate (flat bottom).

5) Add 150 µl DMMB solution per well, preferably with a ‘multi-channel pipet’ as this has

to be done relatively quick as you can only measure within the first 5 to 10 minutes, after

that time it will start to precipitate…

60

6) Measure the absorbance at 540 and 595 nm and extract the values form one another (540-

595). Always make sure that the values of your samples are somewhere between

standard 2 and 4.

Calculations

Prepare the standard curve in Excel and determine the equation of the trend line. Convert the

absorbance values of the samples into concentrations using the equation from the standard

curve. Calculate the amount of GAG in your samples:

GAG [µg] = digestion volume [ml] X calculated concentration from the standard curve [µg/ml].

Divide the calculated amount of GAG by the dry weight of the sample to obtain a GAG

amount per mg dry tissue.

3. DNA Assay (Day 2)

1) Determine the actual DNA concentration in the DNA stock solution on the basis of the

absorbance at 260 nm in a 1-cm path quartz cuvette (A260=1 for 50 µg/ml). For the

standard prepared by WL, the absorbance was 0.852, indicating a concentration of 42.6

µg/ml.

2) Prepare the standards in TE buffer by serial dilution, at least 800 µl per standard:

Standard 1 (2 µg/ml) (if C= 42.6 µl/ml � 71 µl stock + 1429 µl TE-buffer pH 8.0)

Standard 2 (1 µg/ml)

Standard 3 (0.5 µg/ml)

Standard 4 (0.25 µg/ml)

Standard 5 (0.125 µg/ml)

Standard 6 (0.063 µg/ml)

Standard 7 (0.0313 µg/ml)

Standard 8 (0 µg/ml)

3) Always centrifuge the digested samples before you use them in the DNA assay (10

minutes at 12000 rpm)

4) When you have no idea how much you have to dilute your samples to obtain values within

the standard curve, it is best to run a test plate first to determine the optimal dilution.

Always dilute the samples in TE buffer. A guideline for the dilutions when a digestion

volume of 500 µl was used, is 1:30 for tissue engineered samples. Dilute one sample of

each group in various dilutions (e.g. 1:20, 1:40 and 1:80). Don’t go below 1:16 as this has

resulted previously in non-linearity of the assay!

5) Centrifuge your diluted samples and standards for 5 minutes at 12000 rpm to prevent that

small particles (not always visible by eye) interfere with the fluorescence measurement

(filtration does not work).

61

6) Pipette 100 µl of the samples and the standards in a black costar flat bottom 96 wells plate

in duplo according to the following order:

A1 and A2: standard of 0 µg/ml (blank)

B1 and B2: standard of 1 µg/ml

C1 and C2: standard of 0.5 µg/ml

D1 and D2: standard of 0.25 µg/ml

Etc. to H1 and H2: standard of 0 µg/ml

A3 and A4: sample 1

B3 and B4: sample 2

C3 and C4: sample 3

etc…

7) Prepare a Hoechst dye working solution (2.5 µg/ml): 25 µl of Hoechst dye stock solution

(1 mg/ml) in 10 ml TNE buffer. Before adding the Hoechst dye, centrifuge the TNE

buffer. If not in use store at 4 °°°°C protected from light. Discard after the assay.

8) Add 100 µl of Hoechst dye working solution to the wells with the standards and the

samples, preferably with the multi pipet. The stepper pipet is not accurate enough for this

amount!!

9) Directly after addition of the Hoechst dye, pack the wells plate in aluminum foil to protect

against light.

10) Incubate for 10 minutes at room temperature and shake gently (150 rpm on plate shaker).

11) Measure fluorescence using the DNA Hoechst protocol of the platereader (355/460 nm)

12) Determine the optimal dilution factor of the samples from each group and prepare the

dilutions from all samples.

13) Prepare again a black 96 wells plate with all samples and standards in duplo as described

above and repeat the assay as described above as well.

14) Check whether all the sample values are within the range of the standard curve, if not

repeat the assay.

Calculations

The platereader automatically calculates the concentrations of the samples from the standard

curve. To calculate the amount of DNA in your samples:

DNA [µg] = concentration from the platereader [µg/ml] X digestion volume [ml] X dilution factor [-]

Divide the amount of DNA by the dry weight of the sample to obtain the amount of DNA per

mg dry tissue.

62

4. Hydroxyproline assay (Day 3)

4.1. Hydrolyzation:

1. Make sure the solutions are present: - hydroxyproline standard solution

- 4 M NaOH

- 16 M NaOH

- 1.4 M citric acid

- Chloramin-T solution

2. Prepare the standards for the standard curve in duplo:

Solution A (40 µg/50 µl): 20 µl hydroxyproline stock (10 mg/ml) + 230 µl NaOH

(4M)

Standard 1 (20 µg/50 µl): 50 µl solution A + 50 µl NaOH (4M)

Standard 2 (10 µg/50 µl): 50 µl of standard 1 + 50 µl NaOH (4M)

Standard 3 (5 µg/50 µl): 50 µl of standard 2 + 50 µl NaOH (4M)

Standard 4 (2.5 µg/50 µl): 50 µl of standard 3 + 50 µl NaOH (4M)

Standard 5 (1.25 µg/50 µl): 50 µl of standard 4 + 50 µl NaOH (4M)

Standard 6 (0.63 µg/50 µl): 50 µl of standard 5 + 50 µl NaOH (4M) � Vortex and discard 50

µl

Standard 7 (blank): 50 µl NaOH (4M)

3. Pipet 25 µl 16 M NaOH solution into a new eppendorf vial with screw lid! Do not add

anything to the standards!

4. Take 75 µl of the samples and mix these thoroughly with the 16 M NaOH. The total

amount (100 µl) is referred as [hydrolysation volume].

5. To prevent opening of the vials during autoclaving close vials really tight.

6. Fill a large beaker glass with paper tissues and place the vials (samples as well as

standards) in upright position in the tissues.

7. Autoclave this for 10 minutes at 120 °C (Use the small autoclave. Choose optional

cycle and program the autoclave yourself). This process takes about 50-55 minutes.

4.2. Forming and measuring the chromophore:

8. Add 50 µl of 1.4 M citric acid to the standards and 100 µl to the hydrolysed tissue

engineered samples and vortex.

9. Centrifuge the samples at 12000 rpm for 5 minutes.

10. Pipet 250 µl Chloramin-T solution into a new eppendorf vial. (Use the suction cap!)

11. Take 25 µl of the samples and the standards (store the rest at 4 °C, if necessary the

assay can be repeated with those). Mix these into the Chloramin-T solution. (Use the

suction cap!)

12. Incubate for 20 minutes at room temperature (not shaking).

13. Prepare aldehyde/perchloric acid solution.(In the fume hood!)

14. Add 250 µl aldehyde/perchloric acid solution and vortex. (Use the suction cap!)

15. Incubate for 15 minutes at 65 °C (in the heated shaker (eppendorf)).

16. Transfer 400 µl of the content of the tubes into plastic disposable cuvettes. (You can

also transfer 100 µl of the content of the tubes into a 96-wells plate)

17. Measure the absorbance at 550 nm in the spectrophotometer. (or in the plate reader if

you transferred the contents in a 96-wells plate)

63

18. If the value exceeds the standard curve, you can dilute your sample with a 1:1 dilution

of

4 M NaOH and 1.4 M Citric acid. Start again at point 9.

Calculations

Prepare the standard curve, calculate the formulas of the curve and the correlation

coefficient.

Determine the concentration hydroxyproline in the samples using the standard curves,

correct for the differences in initial hydrolysation volumes!! Initial hydrolysation volume

is the amount of NaOH you have added to your samples

(read out from the standard curve / 50) * initial hydrolysation volume in µl * digestion dilution

factor

dry weight of the tisse in mg

Digestion dilution factor = amount of digestion volume (Day1) / amount used for Hyp assay (=75

µl)

Excel tips:

Standard curve preparation:

Prepare the standard curve as follows: 20 µg/µl OD 550

20 µg/µl OD 550

10 µg/µl OD 550

10 µg/µl OD 550 etc

Plot the standard curve with the concentrations on the y-axis and the ODs on the x-axis.

Calculate the slope of the curve and the intercept.

Calculation of the final values per mg dry weight:

1) Determine the amount of hydroxyproline according to the standard curve by multiplying

the OD with the calculated slope and subsequently add the intercept (which has a minus sign

in front of it in most cases!).

2) Divide the calculated amount of hydroxyproline by 50 and multiply this with the

hydrolysation volume you have used to correct for differences in hydrolysation volumes of

the samples compared to the standard. You don’t have to do this when the initial

hydrolysation volume of the samples and the standards are equal.

3) Divide the calculated amount of hydroxyproline by the dry weight of the sample.

Reference values:

Native tissues: pig heart valves (aortic as well as pulmonary): ~ 35 µg/mg

human vena saphena: ~ 44-50 µg/mg

Tissue engineered tissues: bioreactor cultured constructs after 3-4 weeks: ~ 10-20 µg/mg

64

Bijlage V

Masson Trichrome Staining (MTS)

Date:

- February 2005; revised July 2006

Introduction Masson Trichrome Stains are intended for use in the study of connective tissue, muscle and

collagen fibers. In general, they consist of nuclear, collagenous and cytoplasmic dyes in

mordants such as phosphotungstic or phosphomolybdic acid.

The procedure described here is based on a kit from Sigma-Aldrich (Trichrome stain

(Masson), catnr. HT15).

Tissue sections are treated with Bouin’s solution to intensify the final coloration. Nuclei are

stained with Weigert’s iron hematoxylin, and cytoplasm and muscle are then stained with

Beibrich scarlet-acid fuchsin. After treatment with phosphotungstic and phosphomolybdic

acid, collagen is demonstrated by staining with aniline blue. Rinsing in acetic acid after

staining renders the shades of color more delicate and transparent.

Precautions

- Perform operations and materials handling according to safe microbiological

procedures.

- Several hazardous chemicals are being used in this protocol. Use the appropriate

personal protection (gloves, fume-hood, etc) and read the concomitant MSDS’s.

(Hazardous) Chemicals

- Xylol/Xylene is harmful and highly flammable; R10,20,22,36,37,38

- Bouin’s solution contains Picric acid, Formalin and Acetic Acid

o Picric acid is explosive when water content is less than 10%; R1,10,36,37,38

o Formalin (formaldehyde) is toxic and corrosive; R10,26,27,28,34,40,41,43/safety

glasses, nitrile gloves in the fume hood

o Acetic Acid is harmful and corrosive; R10,35/S23,26,45

- Ethanol is highly flammable and harmful;

R11,20,21,22,36,37,38,40/S7,16,24,25,36,37,39,45

- Entallan contains Toluene which is highly flammable, toxic and teratogenic;

R11,23,24,25/S16,25,29,33

- You are working with (very) toxic, harmful, flammable and possible explosive

solutions; So wear gloves and labcoat and work as much as possible in the fumehood!

Requirements

* Reagents and solutions:

- Xylol (Xylene, see chemical list)

- 100% Ethanol (EtOH, see chemical list)

- Diluted EtOH, 96% and 70%

65

- Sigma Accustain Trichrome Stain Kit (cat# HT15), contains:

o Biebrich scarlet-acid fuchsin solution (Cat# HT15-1 Biebrich scarlet, 0.9%,

o acid fuchsin 0.1%, in acetic acid, 1.0%)

o Phosphotungstic acid solution (Cat#HT15-2 Phosphotungstic acid, 10%)

o Phosphomolybdic acid solution (Cat#HT15-3 Phosphomolybdic Acid, 10%)

o Aniline blue solution (Cat#HT15-4 Aniline blue, 2.4% and acetic acid, 2%)

- Bouin’s Solution (Sigma Cat#HT10132), can be re-used several times

- Weigert’s Iron Hematoxylin Set A+B (Sigma cat#HT10-79), make Working Solution

fresh before use by adding equal volumes of Solution A (1% Hematoxylin in 95%

EtOH) and Solution B (1.2% Ferric Chloride and 1% Acetic Acid in distilled water).

The working solution is good for approximately 10 days.

- Tapwater, distilled water, deionized water

- Entellan (see chemical list)

Procedures

1) Deparaffinize slides to deionized water:

a) 2x 5 minutes Xylol

b) 3x 2 minutes 100% EtOH

c) 1x 2 minutes 96% EtOH

d) 1x 2 minutes 70% EtOH

e) 1x 2 minutes MilliQ water

2) Preheat the Bouin’s solution at 56°C for about 20 min in a closed slideholder. Place the

slides in the preheated Bouin’s Solution for 15 minutes.

i) (Note: Important step, intensifies the final coloration of the tissue!)

3) Wash the slides in running tap water for 5 minutes to remove yellow color. Rinse briefly

in deionized water.

4) Stain in freshly prepared Working Weigert’s Iron Hematoxylin Solution for 5 minutes.

5) (Note: staining with Mayer’s hematoxylin, used for H&E staining, is also possible, but

gives a more red nucleus, differentiation with the other red-staining Biebrich scarlet-acid

fuchsin is less clear)

6) Wash in running tap water for 5 minutes. Rinse in deionized water.

7) The rest of the staining is performed using the Trichrome Stain kit. For an optimal use of

the solution, drip the solution onto the slides (about 500 µl per slide) and incubate in a

closed cassette, which contains wetted tissues to provide humidity. After incubation,

discard the dripped solutions:

8) Stain with Biebrich Scarlet-Acid Fuchsin for 5 minutes.

9) Rinse in deionized/ distilled water.

10) Prepare Working Phosphotungstic/Phosphomolybdic Acid Solution by mixing 1 volume

of phophotungstic acid + 1 volume of phosphomolybdic acid + 2 volumes of deionized

water. Incubate the slides with this solution for 5-10 minutes.

11) (Note: allows for uptake of the aniline blue stain)

12) Discard solution but do not rinse!

13) Stain with Aniline Blue Solution for 5 minutes.

14) (Note: Another option is Fast Green for 5 minutes)

15) Place slides in 1% Acetic Acid for 3-5 minutes. Discard solution.

16) (Notes: > renders the shades of colors more delicate and transparent

a) fading of the staining indicates overdifferentiation in acetic acid)

17) Dehydrate, mount and cover the sections:

66

a) 10 dips in 70% EtOH

b) 10 dips in 96% EtOH

c) 3x 10 dips in 100% EtOH

d) 2x 3 minutes Xylol

e) Entellan and coverslip

Expected results

Nuclei: Purple, Purple/ Black (by Hematoxylin)

Cytoplasm, muscle: Red (by Biebrich Scarlet-Acid Fuchsin)

Collagen: Blue (by Analine Blue) or green (by Fast Green)

References

- Product information Sigma-Aldrich: “Accustain Trichrome stains (Masson)”

- Administratieroom: Book “Theory and practice of histological techniques”

- Internet: www.Histosearch.com/histonet

67

Bijlage VI

Immunofluorescence for cells grown on coverslips

Date:

- July 12th

2006

Introduction Staining of cells grown on coverslips using (immuno)fluorescent dyes. Examples are given

for backstaining with phalloidin and DAPI, but any fluorescent dye can be used.

Precautions

- Perform operations and materials handling according to safe microbiological

procedures.

- Several hazardous chemicals are being used in this protocol. Use the appropriate

personal protection (gloves, fume-hood, etc) and read the concomitant MSDS’s.

(Hazardous) Chemicals

- Fixatives and permeabilising agents are often harmful or toxic.

- Formalin (formaldehyde) is toxic, corrosive, R10,26,27,28,34,40,41,43/safety glasses,

nitrile gloves in the fume hood

- Triton-x-100 is harmful, R22,41/S26,36,39

- Phalloidin is very toxic; R26,27,28/S22,28,36,37,45

- DAPI is eye irritant, mutagenic and reprotoxic; R36/S26

Requirements

- Coverslips and slides

- 0.1% gelatin (sterile)

- Parafilm

- 1x PBS

- Fixative (e.g. formalin)

- Permeabilizing solution (e.g. 0.5% Triton X-100)

- Blocking solution (e.g. 1% HS in 1x PBS)

- Wash buffer (e.g. NET-gel)

- Serum (e.g. Horse Serum)

- Primary antibody (e.g. MF20)

- Secondary antibody (e.g. Alexa 488)

- Optional direct staining (DAPI, Phalloidin)

- Mowiol

68

Preparation of reagents

- Wash buffer

e.g. NET-gel 50 mM Tris pH 7.4

150 mM NaCl

5 mM EDTA

0.05% NP40

0.25% Igepal (severe eye irritant!)

Procedures

1) coat coverslips in 0.1% gelatin in 24-wells plate in the incubator for a few hours

2) seed cells and grow until desired confluence

3) fix 1 day in formalin at 4 degrees

4) wash 1x with PBS

5) store at 4 degrees

6) permeabilize 10 min. with 0.5% Triton X-100 in PBS (100 µl per sample)

7) block 2x 10 min. with 1% HS in PBS (100 µl per sample)

8) wash 2x 10 min. with NET-gel (wash buffer) (100 µl per sample)

9) incubate overnight 1st antibody in NET-gel + 10% HS (40 µl per sample)

i) 1:100 Monoclonal Mouse anti-Human SMA � …… µl anti-Human SMA + ……

µl HS + …… µl NET-gel

10) wash 6x 5 min. with NET-gel (100 µl per sample)

11) incubate 1 hour 2nd

antibody in NET-gel (40 µl per sample)

i) 1:1000 Alexa 488

ii) 1:200 rhodamin-conjugated Phalloidin

b) …… µl Alexa 488 + …… µl Phalloidin TRITC + …… µl wash buffer

12) wash 2x 5 min. with NET-gel (100 µl per sample)

13) incubate 5 min. with 1:1000 DAPI in NET-gel (40 µl per sample)

i) 100 ng/ml DAPI --> DAPI stock = 1 mg/ml. 100 µl stock +

ii) 900 µl PBS = 0.1 mg/ml (stock 2). 1 µl stock 2 in 1 ml PBS contains 100 ng DAPI

14) wash 4x 5 min. with PBS (100 µl per sample)

15) Mount coverslips on slides with Mowiol (7 µl)

69

Bijlage VII

cDNA synthesis

Date: 1-2-2007

Introduction Active genes of a cell’s chromosomal DNA are transcribed into mRNA. By investigating the

mRNA it can be seen which genes are active and to which extent. mRNA is rather fragile and

is usually converted into copy DNA (cDNA) on which conventional PCR or real-time PCR

can be done. Converting mRNA in cDNA entails the usage of a special enzyme: reverse

transcriptase (RT) which can translate RNA into DNA. Furthermore primers are needed to

give the RT-enzyme a place to start, these can be either oligo-dT primers, which fit the poly-

A tail of mRNA or random primers, which are hexamers of nucleotides in a random fashion

made (commercially). Other than chromosomal DNA, cDNA does not contain introns or

exons as it is made of mRNA which has already spliced out all introns.

Precautions

- Several hazardous chemicals are being used in this protocol. Use the appropriate

personal protection (gloves, fume-hood, etc) and read the concomitant MSDS’s.

(Hazardous) Chemicals

- Dithiothreitol (DTT) is irritant; R22,36,38/S36,37,38

Requirements

- Random primers; 0.5 µg/µl (Promega C1181) stored at -20oC

- dNTPs (4x 100 mM) (Fermentase R0181) stored at -20oC

- M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) Reverse Transcriptase, 200 U/µl

(Invitrogen 28025-013) stored at -20oC

- DTT, 0.1 M (included with RT)

- 5x First-Strand buffer (included with RT)

- RNasin (Ribonuclease inhibitor) 40 U/µl (Promega N2115) stored at -20oC

- Small table spin centrifuge

- Vortex

- Gilson pipettes + filtertips

- Eppendorf tubes

- PCR-tubes

- 2 thermoblocks

- Total RNA

Preparation of reagents

• ddH2O, double autoclaved MilliQ

70

• 5 mM dNTPs.

dNTP set consists of 100 mM aqueous solutions of dATP, dCTP, dGTP and

dTTP each in a separate vial. Prepare a mix of 5 mM by adding same amounts

of each dNTP, dilute 20x with ddH2O and store aliquots in the freezer.

Working solution can be stored at 4oC.

e.g. 50 µl of each dNTP + 800 µl ddH2O

• Diluted Random primers (20 ng/µl)

Dilute the stock of random primers (0.5 µg/µl) to 20 ng/µl: 40 ul of Random

Primer stock + 960 µl milliQ.

Procedures Using thermoblocks: Before starting the procedure switch on the first thermoblock at 72ºC,

not shaking and the second one at 37ºC, not shaking

1) Prepare Buffer/ Primer mix according to the number of samples+ blanco+ 1 extra and

mix well, per reaction:

2,5 µl Diluted Random Primers (20 ng/µl)

2,5 µl dNTP’s 5mM

5,0 µl 5xFirst-Strand Buffer

Total 10 µl mix per reaction

Aliquot mix in 1.5 ml eppendorf tubes and add 11 µl (RNA + ddH2O ) corresponding with

500 ng RNA or 11 µl only ddH2O for the blanco.

Carefully add a drop of mineral oil on the surface of the mixture to prevent evaporation

during the program.

2) Total program :

• 72 °C, 6 min, first thermoblock

• 37 °C, 5 min, second thermoblock

then add 4 µl of Enzyme Mix (see step 3)

• 37 °C, 1 hr, second thermoblock

• 95 °C, 5 min, first thermoblock

• 4 °C, cooling down on ice

3) During step a. and b. the Enzyme Mix is prepared according to the number of samples

+ blanco + 1 extra.

Per reaction:

0.5 µl ddH2O

2.5 µl DTT

0.5 µl RNasin

0.5 µl M-MLV enzym

Total 4 µl mix

After step 2b. add Enzyme Mix

Then go further with the rest of the program

Store cDNA samples at 4 °C

71

Bijlage VIII

PCR

Procedure:

1. Different primer sets (forward en reverse primer) are present. Each set has specific

PCR conditions (see tables)

2. In general prepare a mix according to the number of samples+ blanc+ 1 extra.

Standard mix per reaction:

18,2 µl ddH2O

0,5 µl forward primer 20 uM

0,5 µl reverse primer 20 uM

2,5 µl 10xPCR buffer II

1,5 µl MgCl2 25 mM

0,5 ul dNTP’s 5 mM

0,3 µl AmpliTaq DNA polymerase 5 U/ul

Total 24 µl mix per reaction

Prepare mix, aliquot and add 1 µl cDNA (sample) or 1 µl ddH2O (blanc).

3. PCR program:

1. pre-denaturation: 94° C, 1 min

2. denaturation: 94 °C, 1 min

3. annealing: 55-66 °C, 1 min (temperature depends on used primer set)

4. elongation: 72 °C, 1 min

repeat step 2- 4 in number of cycles

5. 72 °C, 5 min

6. 4 °C for ever

- Results:

PCR-products can be visualized on a 2% agarosegel+EtBr in 0,5x TBE buffer (see protocol

“Gelelectrophoresis”). Load 5 µl monster + 2 µl 10x ficoll orange on gel. Load in another

well 10 µl 100 bp ladder. Run the gel at 100-120 V and make an image with the Biorad

Versadoc software.

72

Bijlage IX

Gel-elektroforese Van DNA

Inleiding:

Met deze techniek worden deeltjes gescheiden op basis van grootte. In dit geval wil dat dus

zeggen de lengte van het DNA. Om voldoende DNA in het monster te hebben zal eerste een

PCR moeten worden uitgevoerd.

Benodigdheden:

• 0,5x TBE-buffer

• Agarose (voor elektroforese)

• EtBr (zeer giftig)

• Marker (1 Kb Plus DNA Ladder)

• Ficoll-Orange

Werkwijzen:

1. Maak 2% agarose gel in 0,5x TBE-buffer.(200ml).

2. Verwarm in magnetron tot het begint te koken. Haal het uit de magnetron en zwenk. Ga

zo door tot de oplossing helder is en belletjes bevat. Let op: laat het niet over de rand

schuimen.

3. Laat afkoelen en ongeveer 50 oC .

4. Voeg EtBr toe 1:20000 (10 µl).

5. Zwenk tot het opgelost is.

6. Schut de agarose in de mal (met kammetje aan de minpool) en wacht tot de gel hard is

geworden.

7. Verwijder kammetje voorzichtig.

8. Voeg aan de monsters Ficoll-Orange 1:5 toe dit geeft een zicht op de snelheid van de

elektroforese.

9. Pipetteer 10 µl van de monsters en marker in de slotjes.

10. Voeg 0,5x TBE-buffer toe zodat de gel net onder water is.

11. Sluit de elektrode aan op het systeem en plaatst de spanning (100 V)

12. Wacht tot het oranje front bijna van de gel loopt. Dit betekent dat de elektroforese een

maximale scheiding heeft gemaakt.

13. Haal de gel eruit (met handschoenen) en bekijk het onder de VersaDoc.

Gemaakt door:

Lalieu R.L.J.

Op:

07-12-2007

73

Bijlage X qPCR voor dummies Opgesteld: 4-10-2007

� Let op: � Pipetteer platen in de aangegeven ruimte naast het PCR-apparaat (ivm mogelijke

DNA contaminatie) � Werk met filtertips � Raak de onderkant, sticker of ander afdekmateriaal van de PCR-plaat niet aan

� Theorie

Algemeen

Polymerase Chain Reaction (PCR) is een methode om een kleine hoeveelheid DNA te vermeerderen. DNA is opgebouwd uit 4 verschillende bouwstenen, de nucleotiden: Adenosine (A), Cytosine (C), Guanidine (G) en Thymidine (T). Deze 4 bouwstenen zorgen met hun unieke volgorde voor de diversiteit aan genen aanwezig in ons DNA. DNA, zoals aanwezig in onze chromosomen, bestaat uit twee strengen die aan elkaar binden en om elkaar heen draaien: de zogenaamde double helix. Elke streng DNA bestaat uit de unieke nucleotide volgorde. Ten opzichte van elkaar zijn de strengen elkaars complement. De 4 letters van het DNA alfabet kunnen slechts op één manier aan elkaar binden: A met T en G met C. De verbindingen worden gevormd met waterstofbruggen.

Een PCR reactie maakt gebruik van het enzym DNA polymerase. Dit enzym heeft de capaciteit om een enkelstrengs stukje DNA dubbelstrengs te maken, zolang er maar een beginnetje zit.

74

Op het moment dat deze reactie meerdere keren wordt gedaan, ontstaat er een kettingreactie (chain reaction). Er wordt een stukje vermeerderd en in de volgende ronde kan ook dat stukje vermeerderd worden en ontstaat er een exponentiële reactie. De beginnetjes, die we primers noemen, kunnen we zelf definieren en hiermee kunnen we dus selectief een deel van het DNA aanwezig vermenigvuldigen. Gebruikelijk is om 2 primers te kiezen rondom het DNA stuk van interesse, elk van de primers is voor de andere DNA streng. In het figuur hieronder staat dan hoe dit ervoor zorgt dat alleen het stukje DNA van interesse wordt vermenigvuldigd.

In elke cyclus zitten 3 temperaturen. (1) Denatureren: deze stap is op 96oC en hiermee smelten de twee strengen DNA los van elkaar, de waterstofbruggen worden verbroken. (2) Annealing: in deze stap zullen de primers binden aan het nu enkelstrengs DNA. De temperatuur van deze stap moet zo worden gekozen dat er maximale specificiteit is. Dit betekent dat de temperatuur rond de smelttemperatuur van de primer moet zitten (als deze dubbelstrengs zou zijn). (3) Elongation: deze stap is op de optimale temperatuur voor het gebruikte DNA polymerase (meestal Taq) om actief te zijn. Vaak is dit 72oC. In de annealingsstap wordt het DNA al iets verlengd (het polymerase is ook dan al wel wat actief), waardoor de primer niet meteen weer van het DNA afsmelten. Vanwege zijn exponentiële karakter is het met behulp van de PCR techniek in theorie mogelijk om vanuit een eindpuntshoeveelheid DNA de begin hoeveelheid te schatten. In de praktijk blijkt dat de reactie zelden zuiver exponentieel is en al snel gaat afbuigen omdat er tekorten ontstaan in vrije nucleotiden of primers. Real Time PCR of de betere benaming qPCR (quantitiviteits PCR) registreert het vormen van dubbelstrengs DNA tijdens de reactie (in real time dus). Hierdoor kan je op elk gewenst moment samples met elkaar vergelijken en dat punt kiezen in de curve dat de reactie nog wél exponentieel verloopt. Om de vorming van PCR product te registreren wordt gebruikt gemaakt van de fluorescente probe SYBR Green. Het SYBR Green dat bij de reactie gebruikt wordt, gaat alleen tussen het DNA zitten wanneer het dubbelstrengs (ds) is en geeft dan pas een fluorescent signaal af dat gemeten kan worden. De mate van fluorescentie zegt dus iets over de hoeveelheid dsDNA.

75

In Figuur 1 is een qPCR-resultaat te zien. Bovenin zijn de CT-curves weergegeven. De horizontale zwarte lijn is de threshold. Wanneer de software voor het eerst een signaal begint te detecteren die is gerelateerd aan de exponentiële groei van het PCR product, wordt de threshold-level ingesteld. Wanneer een sample voorbij dit threshold-level komt, wordt zijn CT-waarde (threshold waarde; die cyclus waarbij het signaal boven de threshold komt) vastgesteld. Hoe lager de CT-waarde, hoe hoger de beginconcentratie van je target gen. Onderin Figuur 1 zijn de smeltcurves weergegeven. Aan het einde van de reactie worden de samples van 65 tot 95 graden verwarmd. Wanneer je dsDNA ssDNA (= enkelstrengs) wordt, is er een piek te zien bij die temperatuur, welke gerelateerd is aan de lengte van het PCR product en in veel gevallen voor ieder target gen uniek zal zijn. Belangrijk is dat hiermee ook vervuiling van additionele PCR producten zichtbaar wordt (zoals primer-dimer producten die ontstaan doordat primers op elkaar annealen) die een andere, extra piek geven in de smeltcurve.

Figure 1: Resultaat qPCR. CT-curves (boven) en smeltcurve (onder).

76

Referentiegenen

Het is van groot belang om referentiegenen te testen op de samples. Referentiegenen zijn genen die altijd tot expressie komen, waarvan je verwacht dat de expressie constant is, onafhankelijk van de behandeling die je cellen ondergaan. Met behulp van deze genen kan je je samples normaliseren voor kleine artefacten die o.a. ontstaan door pipetteerfouten of een iets andere hoeveelheid startDNA. Nu zijn er geen genen bekend die áltijd een constante expressie hebben, omdat er altijd omstandigheden kunnen optreden waardoor juist die genen toch worden opgereguleerd of juist downgereguleerd. Voorheen werden slechts GAPDH en β-actine gebruikt die juist daarom soms een metingsartefact opleverden. Op dit moment is het gebruikelijk om eerst 6 tot 12 referentiegenen op alle samples te testen, waaruit de meest stabiele kunnen worden bepaald. Deze referentiegenen worden altijd meegenomen op de PCR-plaat, zodat de targetgenen naar de referentiegenen genormaliseerd kunnen worden. De GeNorm software (http://medgen.ugent.be/~jvdesomp/genorm/) wordt gebruikt voor het bepalen van de meest stabiele referentiegenen. De software maakt gebruik van de CT-waarden van alle samples per referentiegen. � Zie GeNorm Housekeeping Gene SelectionKit Handbook (PrimerDesign) voor invoer data in de software.

� Protocol

Verdunningsreeks

cDNA voor qPCR wordt vaak 5 tot 10x verdund. De belangrijkste reden hiervoor is dat er op deze manier langer gedaan kan worden met een cDNA sample en er dus meer target genen gemeten kunnen worden. Ook is het goed om een optimale CT-waarde te krijgen. Met een gen dat hoog tot expressie komt is het niet wensen om met onverdund cDNA al na een paar cycli over de threshold te komen. Ook in het begin van de PCR curve is de reactie nog niet strikt lineair. Om er zeker van te zijn dat je gekozen verdunning niet te veel of te weinig is, kan een verdunningsreeks van het cDNA gemaakt worden van 10x tot 100.000x om te kijken of er nog steeds betrouwbare CT-waarden resulteren. Hoe groter de verdunning, des te meer cDNA wordt er gespaard. Wanneer er tussen de 10x en 100x verdunning een verschil van 3.3 zit in de CT-waarde, dan zijn dit betrouwbare CT-waarden.

Plate set-up

Op de plaat moet aanwezig zijn: - Standaardcurve (optioneel) - Referentiegenen - Targetgenen - Waterblanco’s Standaardcurve (optioneel) Wanneer als resultaat van de qPCR een beginconcentratie in het cDNA gewenst is, moet er gebruik gemaakt worden van een standaardcurve. De standaardcurve is een curve met een bekende hoeveelheid cDNA. Hij wordt gebruikt om de bekende concentraties te koppelen aan de samples waarvan je de beginconcentratie van een specifiek gen wil weten. Deze curve bestaat meestal uit een reeks van 8 concentraties cDNA die kunnen variëren van 10 ng/µl tot 1 ag/µl (=10-18 g/µl!!). Maak deze curve in een behoorlijke hoeveelheid, zodat deze meerdere keren mee te nemen is op de PCR-plaat. De concentraties van de standaardcurve worden ingevuld in de software voor qPCR. Voor elke primer dient een standaardcurve meegenomen te worden.

77

De curve wordt afhankelijk van de verwachting van de concentratie targetgenen gemaakt. In hoeverre wordt verwacht dat de toegepaste behandeling op de cellen het gezochte gen up- of downreguleert? Dit wordt meegenomen in de keuze van de standaardcurve. Een betrouwbare standaardcurve moet altijd de concentratie-range van je targetgen overlappen. Wanneer je slechts geïnteresseerd bent in de relatieve verandering van een targetgen, wordt alleen een standaardcurve getest voor alle primers om de efficiëntie te bekijken. Referentiegenen Referentiegenen kunnen in duplo ingezet worden. Houd er rekening mee dat de “normale” situatie (zonder behandeling) ook op de plaat aanwezig is, zodat hier naar genormaliseerd kan worden. In principe is de CT-waarde van een sample op iedere plaat hetzelfde, maar er kunnen kleine verschillen optreden. Bekijk dus wat je bij elkaar op een plaat wilt hebben! Targetgenen De samples worden getest met behulp van de ontworpen primers voor de targetgenen. Dit wordt genormaliseerd met behulp van de referentiegenen. De beginconcentratie kan bepaald worden met behulp van de standaardcurve (optioneel). Waterblanco’s Voor elke primer die getest gaat worden, wordt een waterblanco meegenomen (gebruik hier ddH2O i.p.v. cDNA). Dit ter controle voor mogelijke DNA vervuilingen. Alternatief of extra kan ook nog een –RT sample uit je cDNA synthese (dus cDNA synthese zonder reverse transcriptase) worden meegenomen, waarbij gecontroleerd kan worden of er eventueel genomisch DNA vervuiling in je RNA sample heeft gezeten.

Inzetten

� De primers hebben een eindconcentratie van 20 µM. � De SYBR Green mix bevat hot-start iTaq DNA polymerase, dNTP’s, buffer en SYBR

Green I. � Wenselijk is om voor alle primers dezelfde annealing temperatuur te hebben.

Vaak is deze rond de 60ºC (lagere temperaturen resulteren vaker in primer dimers).

Bench-protocol 1) Verdun het cDNA en maak de PCR-mix (in RNAse vrije epjes; is handig met

uitvullen). Maak een zo groot mogelijke voormix per primer paar of per cDNA. Per sample: 7.50 µl SYBR Green Supermix 6.50 µl ddH2O 0.75 µl primer mix (of 0.375 forward en 0.375 reverse) 1.00 µl cDNA

2) PCR-protocol: a. 3 min 95ºC b. 20 s 95ºC

20 s 60ºC 30 s 72ºC

c. 1 min 95ºC d. 1 min 65ºC e. 65ºC � 95ºC, ∆T = 0.5ºC (smeltcurve)

Berekeningen

78

Wanneer je slechts een relatieve verandering wilt weten t.o.v. de controle situatie, kun je gebruik maken van de CT-waarden. Die relatieve verandering wordt de “fold change” (fc) genoemd. Per groep worden de gemiddelde CT-waarden genomen.

De fc van de controle behoort 1 te zijn. Wanneer de fc van de samples onder de 0.5 of boven de 2 ligt, zijn er significante veranderingen t.o.v. de controle situatie en referentiegen expressie.

Bio-Rad Software Aan de hand van schermafdrukken van de Bio-Rad software, zal stap voor stap uitgelegd worden hoe een protocol ingesteld kan worden.

In Figuur 2 is het beginscherm van de software te zien. De buttons in de linkerkolom (“Workshop” en “Data Analysis”) zullen met name veel gebruikt worden. “Workshop” wordt gebruikt om protocollen en plaat set-ups in te stellen. Bovenin het scherm staat ‘Setup’ en ‘Plate Summary’, daaronder ‘Protocol’ etc. Nadat de plaat set-up gemaakt is, kunnen bij “Plate Summary” de waarden voor de standaardcurve ingevuld worden. De tweede rij buttons (onder “Setup” en “Plate Summary”) wordt gebruikt om iets te openen. Voor het openen van bijvoorbeeld plaat set-ups, protocollen en data files, dien je op deze buttons te klikken om ze te kunnen openen. De plaat set-up kan aangepast worden via “Selected Plate Setup” en “Edit” rechts onderaan in Figuur 2 (zie verder Figuur 4 en tekst eronder).

∆CTn(target) = CTn(target) – CTn(referentiegen) ∆CT(controle) = CT(normale situatie targetgen) – CT(normale situatie referentiegen) ∆∆CT = ∆CTn(target) – ∆CT(controle) Fc = 2-∆∆CT

Figure 2: Beginscherm Bio-Rad software

79

Gebruik de “Create New” button bij “Selected Protocol” op een nieuw protocol aan te maken. Ook kan het oude protocol hier ge-edit worden.

In Figuur 3 is het scherm voor een nieuw protocol te zien. Onderaan zijn twee cycli te zien. Voor een nieuwe cyclus, klik je op + bij het begin van de voorgaande cyclus. Voor een nieuwe stap binnen een cyclus, klik je op + bij de laatste stap van deze cyclus. Het uiteindelijke protocol kan opgeslagen worden.

Figure 3: Nieuw protocol in Bio-Rad software

80

In Figuur 4 is het scherm voor een nieuwe plaat set-up weergegeven. Links van de plaat kan aangegeven worden of de replica’s horizontaal of verticaal op de plaat zitten; het aantal replica’s wordt aangegeven bij “Size:”. De rij buttons boven de plaat set-up bestaat uit: - S = sample - x = onbekende - NTC = no template control - + = positieve controle - - = negatieve controle - X = verwijderen van items De software bepaalt van de replica’s de gemiddelde CT-waarde en standaarddeviatie (een goede plaat set-up bespaart je dus een hoop rekenwerk!). Het apparaat moet gekalibreerd zijn om juiste metingen uit te voeren. Het sample volume dat in dit protocol gehanteerd wordt is 15 µl. Let er dus op dat het apparaat op dit sample volume gekalibreerd is! Vul het “Sample Volume”, “Seal Type” (bv sticker) en “Vessel Type” (bv plaat) in bij de plaat set-up. Wanneer alles goed ingevuld is, ga je weer naar het beginscherm (zie figuur 2) en klik op “Run”. In het scherm hierna, klik je op “Begin Run”, na nog eens het protocol nagekeken te hebben. De data worden meteen opgeslagen, daarom wordt eerst gevraagd een bestandsnaam in te voeren. Hierna begint de PCR.

Wanneer de PCR run klaar is, ga je in het scherm van figuur 2 in de linker kolom naar “Data Analysis”. Allereerst worden de smeltcurves bekeken. Voor elke primer is er 1 piek in de smeltcurve.

Figure 4: Plaat set-up in Bio-Rad software

81

Rechtsboven in Figuur 5 is voor ieder sample 1 piek te zien bij 85°C. Dit betekent dat het target DNA van een bepaalde primer combinatie bij 85°C enkelstrengs is geworden. Om de CT-waarden te bekijken, ga je naar “PCR Quant” (bij de buttons bovenaan in het scherm). Het resulterende scherm is te zien in Figuur 6.

Figure 5: Smeltcurve in Bio-Rad software

82

Het voorbeeld in figuur 6 is van 1 primer combinatie (voor 1 target gen). De gekleurde curves rechts in de figuur zijn de standaardcurves. In dit voorbeeld zijn de concentraties in de standaardcurve te laag, om dat de curves in de figuur niet overlappen met de data, zodat er geen betrouwbare conclusies getrokken kunnen worden uit deze PCR. Rechtsboven in het scherm is de betrouwbaarheid van de PCR en standaardcurve af te lezen. De efficiency (E), R2 en de helling worden bepaald. Ideaal is, wanneer de E tussen 90% en 110% ligt (100% betekent dat het amplicon perfect verdubbeld is in elke cyclus; de helling is dan -3.32). De standaardcurve moet lineair zijn (R2 moet zo dicht mogelijk bij 1 liggen). ���� Uit: Introduction to Quantitative PCR, Stratagene

Figure 6: CT-waarden

83

Om alles duidelijker zichtbaar te maken, kan gekozen worden welke samples getoond worden. Dit kan door op “Display Wells” (midden in het scherm, rechts) te klikken. Het scherm van Figuur 7 wordt dan getoond. Selecteer de gewenste samples en klik op “OK”. Nu worden de curves van de geselecteerde samples getoond.

Wanneer in het scherm van figuur 6 op “Results” geklikt wordt (midden in het scherm, links), wordt het scherm van Figuur 8 getoond. Hier zijn alle waarden te zien die nodig zijn voor het verwerken van de resultaten. De waarden kunnen in een Word-file opgeslagen worden.

Figure 7: Kiezen van samples in alayse

Figure 8: Results

84

In de bovenste balk van Figuur 6 kan bij “Reports” gekozen worden welke data opgeslagen worden (plots, data, etc.). Wanneer de smeltcurves opgeslagen moeten worden, ga je naar “Melt Curve/Peak” en maak er een report van.

Kalibreren

Per well moet er door de Bio-Rad software gecorrigeerd worden voor de inhomogene belichting door de lamp. Per plaatsoort en sample volume moet gekalibreerd worden. Allereerst wordt er voor de achtergrond gecorrigeerd door een lege plaat (met seal) te meten. Hierna wordt een plaat vol gepipetteerd met zogenaamde “well factor” kalibratie-vloeistof (bewaard bij -20°C) en doorgemeten met behulp van de software. Bench-protocol � Er worden 2 platen voorbereid: de external well factor-plaat en de achtergrond kalibratie-plaat

- Verdun de 10x External Well Factor Solution tot 1x met water - Pipetteer het gewenste volume in de wells (bv 15µl/25µl) - Seal de plaat met de gewenste methode (bv sticker) - Als achtergrond kalibratie-plaat wordt een lege, gesealde plaat gebruikt - Volg verder de Bio-Rad Calibration software (klik op button “calibration” in

linkermenu) Referenties

Introduction to Quantitative PCR, Stratagene http://medgen.ugent.be/~jvdesomp/genorm/ Manual Bio-Rad MyiQ software

85

Bijlage XI Hieronder staan de resultaten die uit de ANOVA test komen.

Experim

ent 3

pa

tien

t II

se

ed

ing

den

sitie

sE

UT

Sbreak

DN

AG

AG

dryG

AG

DN

Ahyp dry

hyp DN

A

an

ov

a*

****

ns

ns

***n

s

5 _

10

**5

_ 2

5*

****

***5

_ 5

0*

*****

10 _

25

***10 _

50

****

25 _

50

Experim

ent 3

patie

nt III

se

ed

ing

den

sitie

sE

UT

Sbreak

DN

AG

AG

dryG

AG

DN

Ahyp dry

hyp DN

A

an

ov

a***

*****

******

ns

******

5 _

10

***

****

**5

_ 2

5***

*****

******

******

10 _

25

******

****

*

Experim

ent 44 p

atie

nte

n

10 m

iljoen

/ml

EU

TS

breakD

NA

GA

Gdry

GA

GD

NA

hyp dryhyp D

NA

******

NS

******

******

***

I - II**

****

******

***I - III

******

******

******

***I - V

******

******

******

II - III***

*****

*****

***II - V

***

III - V***

*****

******

*p

<0.0

5

Sta

tistie

k**

p<

0.0

1

***p

<0.0

1o

ne-A

NO

VA

met b

on

ferro

ni p

ost-h

oc te

stin

g

Experim

ent 1p

atie

nt I

se

ed

ing

den

sitie

sE

UT

Sbreak

DN

AG

AG

dryG

AG

DN

Ahyp dry

hyp DN

A

AN

OV

A***

******

******

ns

******

1 _ 2.5***

1 _ 5***

*1 _ 10

*****

*****

**1 _ 25

*****

*****

***1 _ 50

***

****

***

2.5 _ 5*

**

****

**2.5 _ 10

******

*****

*****

***2.5 _ 25

******

*****

******

*2.5 - 50

******

****

****

5 _ 10**

5 _ 25*

****

***5 _ 50

****

10 _ 25*

10 _ 50**

25 _ 50

Experim

ent 3

5 p

atie

nte

n

10

miljo

en

/ml

EU

TS

breakD

NA

GA

Gdry

GA

GD

NA

hyp dryhyp D

NA

AN

OV

A***

*****

******

******

***

I - II*

*****

I - III***

*****

******

**I - IV

****

******

I - V***

**

******

**

II - III**

****

***II - IV

*****

****

***II - V

*****

III - IV***

******

*****

*III - V

IV - V

******

****

****

86

Bijlage XII

VB

eginE

ind av

era

ge ±

Tijd

Verm

eerderingV

ermeerdering

Gem

iddelde(m

iljoen)(m

iljoen)std

(dagen)van cellen

per dagverm

eerderingP

10,975

per dagP

20,5

1,8901,7

15

102,78

0,280,2

4

0,51,540

0,24710

2,080,21

0,05P

31,0

1,1760,9

59

70,18

0,03-0

,01

1,00,800

0,7347

-0,20-0,03

0,031,0

0,9007

-0,10-0,01

P4

0,960,969

0,8

90

70,01

0,00-0

,01

0,960,888

0,0787

-0,08-0,01

0,010,96

0,8137

-0,15-0,02

P5

0,530,708

0,6

632

70,34

0,050,0

4

0,530,663

0,0857

0,250,04

0,020,53

0,6667

0,260,04

0,530,753

70,42

0,060,53

0,5267

-0,010,00

IVB

eginE

ind a

vera

ge

±T

ijdV

ermeerdering

Verm

eerderingG

emiddelde

(miljoen)

(miljoen)

std

(dagen)van cellen

per dagverm

eerderingP

10,765

per dagP

20,5

2,2302

,23

010

3,460,35

0,4

5

P3

1,01,260

1,0

90

70,26

0,040

,01

1,00,920

0,2407

-0,08-0,01

0,03P

40,726

1,0051

,02

67

0,380,05

0,0

6

0,7261,029

0,0207

0,420,06

0,000,726

1,0447

0,440,06

P5

0,61,100

1,0

54

70,83

0,120

,11

0,61,200

0,1287

1,000,14

0,030,6

0,9207

0,530,08

0,61,130

70,88

0,130,6

0,9207

0,530,08

IIIB

eginE

ind a

vera

ge

±T

ijdV

ermeerdering

Verm

eerderingG

emiddelde

(miljoen)

(miljoen)

std

(dagen)van cellen

per dagverm

eerderingP

11,345

per dagP

20,5

4,7004

,20

010

8,400,84

0,7

4

0,53,700

0,70710

6,400,64

0,14P

31,0

2,1602

,07

57

1,160,17

0,1

5

1,01,880

0,1747

0,880,13

0,021,0

1,9907

0,990,14

1,02,270

71,27

0,18P

41,0

1,6711

,77

17

0,670,10

0,1

1

1,01,794

0,0917

0,790,11

0,011,0

1,8487

0,850,12

P5

1,01,784

1,6

25

70,78

0,110

,09

1,01,695

0,1167

0,700,10

0,021,0

1,4977

0,500,07

1,01,608

70,61

0,091,0

1,5427

0,540,08

IIB

eginE

ind a

ve

rag

e ±

Tijd

Verm

eerderingV

ermeerdering

Gem

iddelde(m

iljoen)(m

iljoen)std

(dagen)van cellen

per dagverm

eerderingP

11,240

per dagP

20,5

4,3005,0

50

107,60

0,760,9

1

0,55,800

1,06110

10,601,06

0,21P

31,0

2,7802,6

68

71,78

0,250,2

5

1,02,560

0,2957

1,560,22

0,041,0

3,1307

2,130,30

1,02,460

71,46

0,211,0

2,417

1,410,20

P4

1,01,842

1,6

49

70,84

0,120,0

9

1,01,680

0,2107

0,680,10

0,031,0

1,4257

0,430,06

P5

1,01,893

1,7

87

70,89

0,130,1

1

1,01,869

0,1817

0,870,12

0,031,0

1,9837

0,980,14

1,01,587

70,59

0,081,0

1,6027

0,600,09

IB

eginE

ind a

vera

ge

±T

ijdV

ermeerdering

Verm

eerderingG

emiddelde

(miljoen)

(miljoen)

std

(dagen)van cellen

per dagverm

eerderingP

10,825

per dagP

20,5

1,4901

,62

010

1,980,20

0,2

2

0,51,750

0,18410

2,500,25

0,04P

31,0

1,6601

,52

07

0,660,09

0,0

7

1,01,500

0,1317

0,500,07

0,021,0

1,4007

0,400,06

P4

1,02,250

2,3

90

71,25

0,180

,20

1,02,230

0,1747

1,230,18

0,021,0

2,5507

1,550,22

1,02,530

71,53

0,22P

50,5

3,934

,36

87

6,860,98

1,1

1

0,54,82

0,3817

8,641,23

0,110,5

4,227

7,441,06

0,54,50

78,00

1,14

87

Bijlage XIII

Foto’s van de alfa-SMA kleuring

Passage 2

Alexa 488+TRITC+Dapi alleen Alexa 488

88

89

Passage 6

Alexa 488+TRITC+Dapi alleen Alexa 488

90

91

Bijlage XIV Zaaidichtheid: 2,5 x 10

6 cellen/ml

Normaal Uitschieter

Zaaidichtheid: 5 x 106 cellen/ml

Normaal Uitschieter

92

Bijlage XV Hieronder de trekgegevens van experiment 1 en 3.

Experiment 1:

Experiment 3:

Gemiddelde Gemiddelde Gemiddelde

Patiënt I Lengte (mm) Breedte (mm) Dikte (mm) E (MPa) STDEV UTS (MPa) STDEV Break STDEV1 1 9 4,0 0,58 1,70 1,53 0,29 0,23 28 23,25

2 9 4,7 0,58 1,24 0,26 0,17 0,06 24 3,63 9 5,5 0,58 1,40 0,2 204 9 4,0 0,58 1,79 0,27 21

2,5 1 9 6,4 0,46 0,32 0,47 0,11 0,14 35 38,33

2 9 6,0 0,46 0,55 0,13 0,19 0,04 43 4,23 9 5,8 0,46 0,54 1,18 0,13 0,21 37 33,25

4 9 4,7 0,46 3,31 1,42 0,4 0,13 18 10,75 1 9 5,2 0,55 2,02 1,89 0,29 0,33 23 27,33

2 9 5,2 0,55 1,56 0,28 0,3 0,06 31 4,043 9 4,3 0,55 4,60 2,57 0,65 0,41 33 28,75

4 9 5,4 0,55 2,08 1,38 0,4 0,17 28 4,310 1 9 5,5 0,65 2,28 2,63 0,46 0,49 27 26,50

2 9 5,5 0,65 2,63 0,60 0,47 0,09 27 1,73 9 5,7 0,65 3,48 0,62 284 9 5,2 0,65 2,13 0,41 24

25 1 9 5,8 0,70 3,84 3,14 0,58 0,53 26 27,25

2 9 5,8 0,70 2,45 0,63 0,48 0,04 29 2,13 9 5,7 0,70 2,79 0,51 294 9 6,1 0,70 3,46 0,54 25

50 1 9 5,7 0,70 3,34 3,04 0,49 0,51 23 25,50

2 9 5,7 0,70 2,73 0,43 0,52 0,02 28 3,5

Gemiddelde Gemiddelde Gemiddelde

Lengte (mm) Breedte (mm) Dikte (mm) E STDEV UTS STDEV break STDEVI: 10miljoen 1 9,00 4,95 0,73 3,54 3,11 0,60 0,46 27,00 25,40

2 9,00 4,09 0,73 3,21 0,54 0,64 0,17 34,00 5,813 9,00 4,35 0,73 3,68 0,48 24,004 9,00 4,25 0,73 2,73 0,23 18,005 9,00 4,27 0,73 2,41 0,34 24,00

II: 5 miljoen 1 9,00 3,69 0,63 1,81 1,74 0,24 0,23 22,00 21,80

2 9,00 4,13 0,63 1,56 0,12 0,20 0,04 20,00 1,793 9,00 3,80 0,63 1,68 0,21 24,004 9,00 4,49 0,63 1,83 0,29 23,005 9,00 3,65 0,63 1,81 0,19 20,00

II: 10 miljoen 1 9,00 4,02 0,65 1,64 2,74 0,21 0,39 25,00 25,00

2 9,00 3,50 0,65 3,36 0,82 0,43 0,14 23,00 2,353 9,00 3,51 0,65 2,07 0,28 24,004 9,00 3,04 0,65 3,37 0,50 29,005 9,00 3,09 0,65 3,27 0,52 24,00

II: 25 miljoen 1 9,00 3,99 0,70 4,60 3,92 0,79 0,65 27,00 28,00

2 9,00 4,41 0,70 3,00 0,99 0,59 0,15 31,00 2,243 9,00 3,55 0,70 2,80 0,41 29,004 9,00 3,76 0,70 4,14 0,71 28,005 9,00 3,78 0,70 5,05 0,73 25,00

II: 50 miljoen 1 8,00 3,85 0,68 1,90 2,96 0,37 0,48 28,00 28,67

2 8,00 3,90 0,68 2,17 1,61 0,28 0,27 25,00 4,043 8,00 3,51 0,68 4,81 0,78 33,00

III: 5 miljoen 1 9,00 3,62 0,40 0,55 0,47 0,19 0,14 45,00 41,20

2 9,00 4,40 0,40 0,43 0,08 0,11 0,04 38,00 3,563 9,00 3,84 0,40 0,51 0,14 40,004 9,00 4,36 0,40 0,49 0,14 45,005 9,00 4,41 0,40 0,35 0,10 38,00

III: 10 miljoen 1 9,00 4,13 0,57 0,64 0,67 0,20 0,19 36,00 33,00

2 9,00 4,43 0,57 0,61 0,05 0,19 0,02 35,00 3,163 9,00 3,20 0,57 0,68 0,16 28,004 9,00 3,98 0,57 0,73 0,20 34,005 9,00 3,44 0,57 0,67 0,18 32,00

III: 25 miljoen 1 9,00 3,14 0,70 1,23 1,24 0,24 0,24 30,00 29,20

2 9,00 3,24 0,70 1,19 0,17 0,22 0,05 27,00 1,923 9,00 3,10 0,70 1,38 0,26 28,004 9,00 3,37 0,70 1,41 0,30 32,005 9,00 3,66 0,70 0,99 0,17 29,00

IV: 10 miljoen 1 9,00 2,38 0,60 6,50 4,62 0,99 0,98 30,00 34,00

2 9,00 4,49 0,60 3,42 1,15 0,64 0,23 27,00 5,873 9,00 3,37 0,60 4,68 1,23 42,004 9,00 3,84 0,60 4,24 0,92 34,005 9,00 3,46 0,60 4,25 1,14 37,00

V: 10 miljoen 1 8,00 4,90 0,50 0,60 0,50 0,15 0,13 38,00 34,67

2 8,00 5,08 0,50 0,44 0,09 0,14 0,03 36,00 4,163 8,00 4,34 0,50 0,46 0,10 30,00

93

Bijlage XVI DNA:

Conc 1 Conc 2 Mean DNA conc Dig. Volume Ditution factor DNA Weight DNA Gemiddeld

(µg/ml) (µg/ml) (µg/ml) (ml) (µg) (mg) (µg/mg) STDEVSample 1/1 0,512 0,546 0,529 0,4 20 4,232 4,30 0,98 0,86

Sample 1/2 0,512 0,382 0,447 0,4 20 3,576 5,91 0,61 0,17Sample 1/3 0,535 0,421 0,478 0,4 20 3,824 4,18 0,91Sample 1/4 0,494 0,408 0,451 0,4 20 3,608 3,80 0,95

Sample 2,5/1 0,279 0,246 0,263 0,4 20 2,100 3,13 0,67 0,61

Sample 2,5/2 0,293 0,286 0,290 0,4 20 2,316 3,80 0,61 0,07Sample 2,5/3 0,238 0,269 0,254 0,4 20 2,028 3,77 0,54Sample 2,5/4 0,430 0,469 0,450 0,4 20 3,596 4,04 0,89Sample 5/1 0,579 0,458 0,519 0,4 20 4,148 3,88 1,07 1,11

Sample 5/2 0,595 0,545 0,570 0,4 20 4,560 3,56 1,28 0,16Sample 5/3 0,837 0,768 0,803 0,4 20 6,420 4,75 1,35Sample 5/4 0,373 0,448 0,411 0,4 20 3,284 3,38 0,97Sample 10/1 0,291 1,402 0,847 0,4 40 13,544 3,93 3,45 1,56

Sample 10/2 0,304 0,446 0,375 0,4 40 6,000 4,25 1,41 0,13Sample 10/3 0,515 0,509 0,512 0,4 40 8,192 5,05 1,62Sample 10/4 0,304 0,463 0,384 0,4 40 6,136 3,75 1,64Sample 25/1 0,716 0,631 0,674 0,4 40 10,776 5,65 1,91 2,13

Sample 25/2 0,690 0,673 0,682 0,4 40 10,904 4,90 2,23 0,21Sample 25/3 0,618 0,565 0,592 0,4 40 9,464 4,72 2,01Sample 25/4 0,769 0,693 0,731 0,4 40 11,696 4,92 2,38Sample 50/1 0,672 0,667 0,670 0,4 40 10,712 4,04 2,65 2,44

Sample 50/2 0,583 0,524 0,554 0,4 40 8,856 3,99 2,22 0,31 GAG: y = 0,0153x - 0,3263

540-595 540-595 540-595 Mean GAG conc Dig. Volume Ditution factor GAG Weight GAG Gemiddeld DNA GAG/DNA Gemiddeld

1 2 Mean (µg/ml) (ml) (µg) (mg) (µg/mg) STDEV (µg/mg) (µg/mg) STDEVSample 1/1 -0,177 -0,172 -0,175 10,643 0,4 20 85,143 4,30 19,80 3,64 0,98 20,12 4,18

Sample 1/2 -0,298 -0,292 -0,295 1,079 0,4 20 8,635 5,91 1,46 1,93 0,61 2,41 1,56Sample 1/3 -0,276 -0,284 -0,280 2,270 0,4 20 18,159 4,18 4,34 0,91 4,75Sample 1/4 -0,282 -0,274 -0,278 2,429 0,4 20 19,429 3,80 5,11 0,95 5,38

Sample 2,5/1 -0,175 -0,164 -0,170 11,040 0,4 2 8,832 3,13 2,82 2,89 0,67 4,21 4,82

Sample 2,5/2 -0,143 -0,130 -0,137 13,659 0,4 2 10,927 3,80 2,88 1,92 0,61 4,72 0,67Sample 2,5/3 -0,135 -0,129 -0,132 14,016 0,4 2 11,213 3,77 2,97 0,54 5,53Sample 2,5/4 0,116 0,124 0,120 34,016 0,4 2 27,213 4,04 6,74 0,89 7,57Sample 5/1 -0,164 -0,161 -0,163 11,595 0,4 5 23,190 3,88 5,98 6,64 1,07 5,59 6,07

Sample 5/2 -0,159 -0,145 -0,152 12,429 0,4 5 24,857 3,56 6,98 0,57 1,28 5,45 0,95Sample 5/3 0,199 0,189 0,194 39,889 0,4 5 79,778 4,75 16,80 1,35 12,43Sample 5/4 -0,164 -0,157 -0,161 11,754 0,4 5 23,508 3,38 6,96 0,97 7,16Sample 10/1 -0,212 -0,201 -0,207 8,103 0,4 10 32,413 3,93 8,25 8,26 3,45 2,39 5,33

Sample 10/2 -0,198 -0,195 -0,197 8,897 0,4 10 35,587 4,25 8,37 0,27 1,41 5,93 0,54Sample 10/3 -0,187 -0,179 -0,183 9,968 0,4 10 39,873 5,05 7,90 1,62 4,87Sample 10/4 -0,209 -0,207 -0,208 7,984 0,4 10 31,937 3,75 8,52 1,64 5,20Sample 25/1 -0,158 -0,148 -0,153 12,349 0,4 10 49,397 5,65 8,74 8,81 1,91 4,58 4,16

Sample 25/2 -0,161 -0,172 -0,167 11,278 0,4 10 45,111 4,90 9,21 0,30 2,23 4,14 0,36Sample 25/3 -0,183 -0,182 -0,183 10,008 0,4 10 40,032 4,72 8,48 2,01 4,23Sample 25/4 -0,175 -0,169 -0,172 10,841 0,4 10 43,365 4,92 8,81 2,38 3,71Sample 50/1 -0,194 -0,180 -0,187 9,651 0,4 10 38,603 4,04 9,56 8,50 2,65 3,60 3,48

Sample 50/2 -0,221 -0,209 -0,215 7,429 0,4 10 29,714 3,99 7,45 1,49 2,22 3,36 0,18 Hyp: y = 0,0413x + 0,0603

OD 550 OD 550 OD 550HYP conc. Dig.Vol. Begin conc. Hydrolyse Hyp conc Weight Hyp Gemiddeld DNA Hyp/DNA Gemiddeld

1 2 Mean (µg/µl) verdunning (µg/µl) volume (µl) (µg) (mg) (µg/mg) STDEV (µg/mg) (mg/mg) STDEVSample 1/1 0,147 0,148 0,148 0,041 5,33 0,218 100 21,78 4,30 5,07 4,51 0,98 5,1 5,14

Sample 1/2 0,124 0,124 0,124 0,029 5,33 0,156 100 15,58 5,91 2,64 1,30 0,61 4,4 0,63Sample 1/3 0,140 0,140 0,140 0,037 5,33 0,198 100 19,80 4,18 4,74 0,91 5,2Sample 1/4 0,140 0,151 0,146 0,040 5,33 0,213 100 21,25 3,80 5,59 0,95 5,9

Sample 2,5/1 0,077 0,081 0,079 0,007 5,33 0,037 100 3,70 3,13 1,18 1,80 0,67 1,8 3,05

Sample 2,5/2 0,093 0,096 0,095 0,015 5,33 0,078 100 7,79 3,80 2,05 0,54 0,61 3,4 1,17Sample 2,5/3 0,094 0,098 0,096 0,015 5,33 0,082 100 8,18 3,77 2,17 0,54 4,0Sample 2,5/4 0,165 0,173 0,169 0,051 5,33 0,275 100 27,46 4,04 6,80 0,89 7,6Sample 5/1 0,196 0,203 0,200 0,067 5,33 0,355 100 35,51 3,88 9,15 10,31 1,07 8,6 8,78

Sample 5/2 0,205 0,217 0,211 0,072 5,33 0,385 100 38,55 3,56 10,83 1,00 1,28 8,5 0,47Sample 5/3 0,285 0,298 0,292 0,112 5,33 0,598 100 59,80 4,75 12,59 1,35 9,3Sample 5/4 0,204 0,206 0,205 0,069 5,33 0,370 100 36,96 3,38 10,94 0,97 11,3

Sample 10/1 0,284 0,288 0,286 0,109 5,33 0,583 100 58,35 3,93 14,85 15,51 3,45 4,3 10,14

Sample 10/2 0,307 0,318 0,313 0,123 5,33 0,653 100 65,35 4,25 15,38 0,56 1,41 10,9 0,69Sample 10/3 0,37 0,38 0,375 0,153 5,33 0,818 100 81,85 5,05 16,21 1,62 10,0Sample 10/4 0,282 0,291 0,287 0,110 5,33 0,585 100 58,48 3,75 15,60 1,64 9,5Sample 25/1 0,422 0,439 0,431 0,181 5,33 0,965 100 96,50 5,65 17,08 17,89 1,91 9,0 8,47

Sample 25/2 0,393 0,401 0,397 0,164 5,33 0,877 100 87,66 4,90 17,89 0,89 2,23 8,0 0,97Sample 25/3 0,403 0,411 0,407 0,169 5,33 0,903 100 90,30 4,72 19,13 2,01 9,5Sample 25/4 0,391 0,39 0,391 0,161 5,33 0,859 100 85,94 4,92 17,47 2,38 7,3Sample 50/1 0,282 0,292 0,287 0,110 5,33 0,586 100 58,61 4,04 14,51 15,69 2,65 5,5 6,54

Sample 50/2 0,318 0,322 0,320 0,126 5,33 0,673 100 67,33 3,99 16,87 1,67 2,22 7,6 1,51

94

Bijlage XVII

DNA: Conc 1 Conc 2 Mean DNA conc Dig. Volume Dilution factor DNA Weight DNA Gemiddeld

(µg/ml) (µg/ml) (µg/ml) (ml) (µg) (mg) (µg/mg) STDEVSample I/1 0,118 0,130 0,124 0,4 80 3,97 8,05 0,49 0,76

Sample I/2 0,132 0,115 0,124 0,4 80 3,95 6,23 0,63 0,31Sample I/3 0,129 0,124 0,127 0,4 80 4,05 7,22 0,56Sample I/4 0,098 0,297 0,198 0,4 80 6,32 6,16 1,03Sample I/5 0,098 0,103 0,101 0,4 80 3,22 5,57 0,58Sample I/6 0,345 0,359 0,352 0,4 16 2,25 1,80 1,25Sample II5/1 0,098 0,096 0,097 0,4 80 3,10 4,10 0,76 0,75

Sample II5/2 0,067 0,091 0,079 0,4 80 2,53 4,31 0,59 0,26Sample II5/3 0,097 0,092 0,095 0,4 80 3,02 4,15 0,73Sample II5/4 0,087 0,082 0,085 0,4 80 2,70 4,81 0,56Sample II5/5 0,083 0,081 0,082 0,4 80 2,62 4,41 0,60Sample II5/6 0,215 0,230 0,223 0,4 16 1,42 1,13 1,26Sample II10/1 0,129 0,108 0,119 0,4 80 3,79 5,77 0,66 1,01

Sample II10/2 0,097 0,106 0,102 0,4 80 3,25 5,05 0,64 0,47Sample II10/3 0,210 0,183 0,197 0,4 80 6,29 5,25 1,20Sample II10/4 0,111 0,104 0,108 0,4 80 3,44 4,44 0,77Sample II10/5 0,133 0,157 0,145 0,4 80 4,64 5,10 0,91Sample II10/6 0,355 0,387 0,371 0,4 16 2,37 1,26 1,88Sample II25/1 0,117 0,133 0,125 0,4 80 4,00 6,17 0,65 1,16

Sample II25/2 0,258 0,295 0,277 0,4 80 8,85 7,21 1,23 0,60Sample II25/3 0,108 0,143 0,126 0,4 80 4,02 5,91 0,68Sample II25/4 0,136 0,148 0,142 0,4 80 4,54 6,91 0,66Sample II25/5 0,365 0,383 0,374 0,4 80 11,97 6,71 1,78Sample II25/6 0,599 0,608 0,604 0,4 16 3,86 1,94 1,99Sample II50/1 0,333 0,338 0,336 0,4 80 10,74 4,63 2,32 2,13

Sample II50/2 0,242 0,259 0,251 0,4 80 8,02 5,59 1,43 0,63Sample II50/3 0,483 0,478 0,481 0,4 80 15,38 5,82 2,64

Conc 1 Conc 2 Mean DNA conc Dig. Volume Dilution factor DNA Weight DNA Gemiddeld

(µg/ml) (µg/ml) (µg/ml) (ml) (µg) (mg) (µg/mg) STDEVSample III5/1 0,218 0,221 0,220 0,4 80 7,02 3,70 1,90 1,77

Sample III5/2 0,194 0,208 0,201 0,4 80 6,43 3,86 1,67 0,12Sample III5/3 0,185 0,191 0,188 0,4 80 6,02 3,24 1,86Sample III5/4 0,197 0,215 0,206 0,4 80 6,59 3,56 1,85Sample III5/5 0,166 0,178 0,172 0,4 80 5,50 3,20 1,72Sample III5/6 0,254 0,260 0,257 0,4 16 1,64 1,02 1,61Sample III10/1 0,335 0,343 0,339 0,4 80 10,85 4,43 2,45 2,49

Sample III10/2 0,322 0,304 0,313 0,4 80 10,02 4,37 2,29 0,50Sample III10/3 0,347 0,319 0,333 0,4 80 10,66 3,26 3,27Sample III10/4 0,340 0,344 0,342 0,4 80 10,94 4,37 2,50Sample III10/5 0,307 0,290 0,299 0,4 80 9,55 3,57 2,68Sample III10/6 0,372 0,380 0,376 0,4 16 2,41 1,38 1,74Sample III25/1 0,532 0,532 0,532 0,4 80 17,02 4,39 3,88 3,81

Sample III25/2 0,557 0,531 0,544 0,4 80 17,41 4,55 3,83 0,33Sample III25/3 0,494 0,490 0,492 0,4 80 15,74 3,78 4,17Sample III25/4 0,525 0,522 0,524 0,4 80 16,75 4,06 4,13Sample III25/5 0,509 0,517 0,513 0,4 80 16,42 4,61 3,56Sample III25/6 0,706 0,709 0,708 0,4 16 4,53 1,37 3,31Sample IV/1 0,625 0,612 0,619 0,4 80 19,79 4,29 4,61 3,73

Sample IV/2 0,585 0,595 0,590 0,4 80 18,88 5,08 3,72 0,46Sample IV/3 0,621 0,656 0,639 0,4 80 20,43 5,94 3,44Sample IV/4 0,688 0,690 0,689 0,4 80 22,05 6,23 3,54Sample IV/5 0,637 0,639 0,638 0,4 80 20,42 6,14 3,33Sample IV/6 0,886 0,883 0,885 0,4 16 5,66 1,50 3,77Sample V/1 0,207 0,209 0,208 0,4 80 6,66 3,92 1,70 1,73

Sample V/2 0,174 0,183 0,179 0,4 80 5,71 3,47 1,65 0,11Sample V/3 0,172 0,174 0,173 0,4 80 5,54 2,98 1,86

95

GAG:

y = 0,0162x - 0,3386540-595 540-595 540-595 Mean GAG conc Dig. Volume Ditution factor GAG Weight GAG Gemiddeld DNA GAG/DNA Gemiddeld

1 2 Mean (µg/ml) (ml) (µg) (mg) (µg/mg) STDEV (µg/mg) (mg/mg) STDEVSample I/1 -0,217 -0,250 -0,234 6,49 0,4 40 103,80 8,05 12,89 18,71 0,49 26,16 27,04

Sample I/2 -0,168 -0,199 -0,184 9,57 0,4 40 153,19 6,23 24,59 4,58 0,63 38,76 9,33Sample I/3 -0,213 -0,235 -0,224 7,07 0,4 40 113,19 7,22 15,68 0,56 27,96Sample I/4 -0,237 -0,243 -0,240 6,09 0,4 40 97,38 6,16 15,81 1,03 15,41Sample I/5 -0,225 -0,218 -0,222 7,23 0,4 40 115,65 5,57 20,76 0,58 35,96Sample I/6 -0,170 -0,142 -0,156 11,27 0,4 9 40,58 1,80 22,54 1,25 18,01Sample II5/1 -0,246 -0,244 -0,245 5,78 0,4 20 46,22 4,10 11,27 11,08 0,76 14,89 16,22

Sample II5/2 -0,246 -0,246 -0,246 5,72 0,4 20 45,73 4,31 10,61 1,36 0,59 18,09 5,36Sample II5/3 -0,274 -0,242 -0,258 4,98 0,4 20 39,80 4,15 9,59 0,73 13,16Sample II5/4 -0,228 -0,221 -0,225 7,04 0,4 20 56,35 4,81 11,71 0,56 20,84Sample II5/5 -0,204 -0,235 -0,220 7,35 0,4 20 58,81 4,41 13,34 0,60 22,41Sample II5/6 -0,285 -0,291 -0,288 3,12 0,4 9 11,24 1,13 9,95 1,26 7,90Sample II10/1 -0,253 -0,206 -0,230 6,73 0,4 20 53,88 5,77 9,34 12,77 0,66 14,21 14,29

Sample II10/2 -0,212 -0,214 -0,213 7,75 0,4 20 62,02 5,05 12,28 2,28 0,64 19,10 5,00Sample II10/3 -0,213 -0,229 -0,221 7,26 0,4 20 58,07 5,25 11,06 1,20 9,24Sample II10/4 -0,210 -0,198 -0,204 8,31 0,4 20 66,47 4,44 14,97 0,77 19,32Sample II10/5 -0,173 -0,196 -0,185 9,51 0,4 20 76,10 5,10 14,92 0,91 16,40Sample II10/6 -0,262 -0,256 -0,259 4,91 0,4 9 17,69 1,26 14,04 1,88 7,45Sample II25/1 -0,256 -0,255 -0,256 5,13 0,4 40 82,07 6,17 13,30 12,68 0,65 20,52 13,23

Sample II25/2 -0,231 -0,249 -0,240 6,09 0,4 40 97,38 7,21 13,51 1,98 1,23 11,01 5,75Sample II25/3 -0,265 -0,269 -0,267 4,42 0,4 40 70,72 5,91 11,97 0,68 17,61Sample II25/4 -0,244 -0,284 -0,264 4,60 0,4 40 73,68 6,91 10,66 0,66 16,21Sample II25/5 -0,261 -0,270 -0,266 4,51 0,4 40 72,20 6,71 10,76 1,78 6,03Sample II25/6 -0,194 -0,206 -0,200 8,56 0,4 9 30,80 1,94 15,88 1,99 7,97Sample II50/1 -0,256 -0,262 -0,259 4,91 0,4 40 78,62 4,63 16,98 12,71 2,32 7,32 6,91

Sample II50/2 -0,242 -0,243 -0,243 5,93 0,4 40 94,91 5,59 16,98 7,40 1,43 11,84 5,14Sample II50/3 -0,224 -0,235 -0,230 6,73 0,4 9 24,24 5,82 4,17 2,64 1,58

y = 0,0149x - 0,3367540-595 540-595 540-595 Mean GAG conc Dig. Volume Ditution factor GAG Weight GAG Gemiddeld DNA GAG/DNA Gemiddeld

1 2 Mean (µg/ml) (ml) (µg) (mg) (µg/mg) STDEV (µg/mg) (mg/mg) STDEVSample III5/1 -0,278 -0,276 -0,277 4,01 0,4 20 32,054 3,70 8,66 7,73 1,90 4,56 4,35

Sample III5/2 -0,285 -0,284 -0,285 3,50 0,4 20 28,027 3,86 7,26 1,38 1,67 4,36 0,54Sample III5/3 -0,289 -0,279 -0,284 3,54 0,4 20 28,295 3,24 8,73 1,86 4,70Sample III5/4 -0,282 -0,27 -0,276 4,07 0,4 20 32,591 3,56 9,15 1,85 4,94Sample III5/5 -0,293 -0,296 -0,295 2,83 0,4 20 22,658 3,20 7,08 1,72 4,12Sample III5/6 -0,273 -0,261 -0,267 4,68 0,4 3 5,613 1,02 5,50 1,61 3,41Sample III10/1 -0,29 -0,296 -0,293 2,93 0,4 40 46,926 4,43 10,59 9,93 2,45 4,33 3,98

Sample III10/2 -0,297 -0,297 -0,297 2,66 0,4 40 42,631 4,37 9,76 2,39 2,29 4,26 0,67Sample III10/3 -0,303 -0,305 -0,304 2,19 0,4 40 35,114 3,26 10,77 3,27 3,30Sample III10/4 -0,288 -0,289 -0,289 3,23 0,4 40 51,758 4,37 11,84 2,50 4,73Sample III10/5 -0,301 -0,297 -0,299 2,53 0,4 40 40,483 3,57 11,34 2,68 4,24Sample III10/6 -0,24 -0,253 -0,247 6,05 0,4 3 7,264 1,38 5,26 1,74 3,02Sample III25/1 -0,276 -0,275 -0,276 4,11 0,4 40 65,718 4,39 14,97 14,28 3,88 3,86 3,73

Sample III25/2 -0,282 -0,279 -0,281 3,77 0,4 40 60,349 4,55 13,26 2,72 3,83 3,47 0,53Sample III25/3 -0,286 -0,278 -0,282 3,67 0,4 40 58,738 3,78 15,54 4,17 3,73Sample III25/4 -0,273 -0,27 -0,272 4,38 0,4 40 70,013 4,06 17,24 4,13 4,18Sample III25/5 -0,274 -0,268 -0,271 4,41 0,4 40 70,550 4,61 15,30 3,56 4,30Sample III25/6 -0,179 -0,175 -0,177 10,72 0,4 3 12,862 1,37 9,39 3,31 2,84Sample IV/1 -0,238 -0,25 -0,244 6,22 0,4 40 99,544 4,29 23,20 18,49 4,61 5,03 4,98

Sample IV/2 -0,254 -0,253 -0,254 5,58 0,4 40 89,342 5,08 17,59 3,78 3,72 4,73 1,00Sample IV/3 -0,225 -0,227 -0,226 7,43 0,4 40 118,872 5,94 20,01 3,44 5,82Sample IV/4 -0,22 -0,227 -0,224 7,60 0,4 40 121,557 6,23 19,51 3,54 5,51Sample IV/5 -0,228 -0,23 -0,229 7,23 0,4 40 115,651 6,14 18,84 3,33 5,66Sample IV/6 -0,122 -0,112 -0,117 14,74 0,4 3 17,694 1,50 11,80 3,77 3,13Sample V/1 -0,242 -0,259 -0,251 5,79 0,4 20 46,282 3,92 11,81 10,66 1,70 6,95 6,15

Sample V/2 -0,278 -0,275 -0,277 4,04 0,4 20 32,322 3,47 9,31 1,26 1,65 5,66 0,70Sample V/3 -0,274 -0,279 -0,277 4,04 0,4 20 32,322 2,98 10,85 1,86 5,84

96

Hyp: y = 0,0415x + 0,0674

OD 550 OD 550 OD 550 HYP conc. Dig.Vol. Begin conc. Hydrolyse Hyp conc Weight Hyp Gemiddeld DNA Hyp/DNA Gemiddeld

1 2 Mean (µg/µl) verdunning (µg/µl) volume (µl) (µg) (mg) (µg/mg) STDEV (µg/mg) (mg/mg) STDEVSample I/1 0,448 0,472 0,460 0,189 5,33 1,01 100 100,90924 8,05 12,535 10,51 0,49 25,4 16,14

Sample I/2 0,346 0,371 0,359 0,140 5,33 0,75 100 74,820884 6,23 12,01 1,78 0,63 18,9 7,00Sample I/3 0,360 0,381 0,371 0,146 5,33 0,78 100 77,905221 7,22 10,79 0,56 19,2Sample I/4 0,304 0,323 0,314 0,119 5,33 0,63 100 63,254618 6,16 10,269 1,03 10,0Sample I/5 0,276 0,290 0,283 0,104 5,33 0,55 100 55,415261 5,57 9,9489 0,58 17,2Sample I/6 0,118 0,122 0,120 0,025 5,33 0,14 100 13,519679 1,80 7,5109 1,25 6,0Sample II5/1 0,134 0,140 0,137 0,034 5,33 0,18 100 17,889157 4,10 4,3632 4,17 0,76 5,8 6,05

Sample II5/2 0,122 0,128 0,125 0,028 5,33 0,15 100 14,804819 4,31 3,435 0,55 0,59 5,9 1,93Sample II5/3 0,126 0,133 0,130 0,030 5,33 0,16 100 15,961446 4,15 3,8461 0,73 5,3Sample II5/4 0,145 0,157 0,151 0,040 5,33 0,21 100 21,48755 4,81 4,4673 0,56 7,9Sample II5/5 0,149 0,157 0,153 0,041 5,33 0,22 100 22,001606 4,41 4,989 0,60 8,4Sample II5/6 0,082 0,087 0,085 0,008 5,33 0,04 100 4,3951807 1,13 3,8895 1,26 3,1Sample II10/1 0,182 0,190 0,186 0,057 5,33 0,30 100 30,483534 5,77 5,2831 6,68 0,66 8,0 7,60

Sample II10/2 0,193 0,202 0,198 0,063 5,33 0,33 100 33,439357 5,05 6,6217 1,32 0,64 10,3 3,02Sample II10/3 0,166 0,177 0,172 0,050 5,33 0,27 100 26,756627 5,25 5,0965 1,20 4,3Sample II10/4 0,210 0,220 0,215 0,071 5,33 0,38 100 37,937349 4,44 8,5444 0,77 11,0Sample II10/5 0,210 0,222 0,216 0,072 5,33 0,38 100 38,194378 5,10 7,4891 0,91 8,2Sample II10/6 0,101 0,103 0,102 0,017 5,33 0,09 100 8,8931727 1,26 7,0581 1,88 3,7Sample II25/1 0,336 0,351 0,344 0,133 5,33 0,71 100 70,965462 6,17 11,502 9,91 0,65 17,7 10,61

Sample II25/2 0,337 0,360 0,349 0,135 5,33 0,72 100 72,250602 7,21 10,021 1,34 1,23 8,2 5,38Sample II25/3 0,237 0,244 0,241 0,083 5,33 0,44 100 44,491566 5,91 7,5282 0,68 11,1Sample II25/4 0,344 0,360 0,352 0,137 5,33 0,73 100 73,150201 6,91 10,586 0,66 16,1Sample II25/5 0,332 0,342 0,337 0,130 5,33 0,69 100 69,294779 6,71 10,327 1,78 5,8Sample II25/6 0,139 0,139 0,139 0,035 5,33 0,18 100 18,403213 1,94 9,4862 1,99 4,8Sample II50/1 0,271 0,282 0,277 0,101 5,33 0,54 100 53,744578 4,63 11,608 11,43 2,32 5,0 5,69

Sample II50/2 0,299 0,312 0,306 0,115 5,33 0,61 100 61,198394 5,59 10,948 0,42 1,43 7,6 1,70Sample II50/3 0,328 0,338 0,333 0,128 5,33 0,68 100 68,266667 5,82 11,73 2,64 4,4

y = 0,0365x + 0,0747OD 550 OD 550 OD 550 HYP conc. Dig.Vol. Begin conc. Hydrolyse Hyp conc Weight Hyp Gemiddeld DNA Hyp/DNA Gemiddeld

1 2 Mean (µg/µl) verdunning (µg/µl) volume (µl) (µg) (mg) (µg/mg) STDEV (µg/mg) (mg/mg) STDEVSample III5/1 0,51 1,90 0,0 0,10

Sample III5/2 0,079 0,081 0,080 0,003 5,33 0,02 100 1,55 3,86 0,40 0,37 1,67 0,2 0,45Sample III5/3 0,080 0,081 0,081 0,003 5,33 0,02 100 1,69 3,24 0,52 1,86 0,3Sample III5/4 0,086 0,088 0,087 0,007 5,33 0,04 100 3,59 3,56 1,01 1,85 0,5Sample III5/5 0,075 0,077 0,076 0,001 5,33 0,00 100 0,38 3,20 0,12 1,72 0,1Sample III5/6 0,069 0,073 0,071 -0,002 5,33 -0,01 100 -1,08 1,02 -1,06 1,61 -0,7Sample III10/1 0,105 0,107 0,106 0,017 5,33 0,09 100 9,15 4,43 2,06 2,01 2,45 0,8 0,64

Sample III10/2 0,102 0,107 0,105 0,016 5,33 0,09 100 8,71 4,37 1,99 0,10 2,29 0,9 0,34Sample III10/3 0,098 0,099 0,099 0,013 5,33 0,07 100 6,96 3,26 2,13 3,27 0,7Sample III10/4 0,102 0,104 0,103 0,016 5,33 0,08 100 8,27 4,37 1,89 2,50 0,8Sample III10/5 0,098 0,101 0,100 0,014 5,33 0,07 100 7,25 3,57 2,03 2,68 0,8Sample III10/6 0,073 0,076 0,075 0,000 5,33 0,00 100 -0,06 1,38 -0,04 1,74 0,0Sample III25/1 0,141 0,144 0,143 0,037 5,33 0,20 100 19,81 4,39 4,51 4,39 3,88 1,2 1,15

Sample III25/2 0,141 0,146 0,144 0,038 5,33 0,20 100 20,11 4,55 4,42 0,78 3,83 1,2 0,12Sample III25/3 0,135 0,14 0,138 0,034 5,33 0,18 100 18,35 3,78 4,86 4,17 1,2Sample III25/4 0,146 0,153 0,150 0,041 5,33 0,22 100 21,86 4,06 5,38 4,13 1,3Sample III25/5 0,139 0,141 0,140 0,036 5,33 0,19 100 19,08 4,61 4,14 3,56 1,2Sample III25/6 0,088 0,09 0,089 0,008 5,33 0,04 100 4,18 1,37 3,05 3,31 0,9Sample IV/1 0,269 0,28 0,275 0,109 5,33 0,58 100 58,39 4,29 13,61 12,30 4,61 3,0 3,32

Sample IV/2 0,261 0,27 0,266 0,105 5,33 0,56 100 55,76 5,08 10,98 1,28 3,72 3,0 0,47Sample IV/3 0,312 0,292 0,302 0,125 5,33 0,66 100 66,43 5,94 11,18 3,44 3,3Sample IV/4 0,356 0,359 0,358 0,155 5,33 0,83 100 82,64 6,23 13,27 3,54 3,7Sample IV/5 0,354 0,362 0,358 0,155 5,33 0,83 100 82,79 6,14 13,48 3,33 4,1Sample IV/6 0,131 0,134 0,133 0,032 5,33 0,17 100 16,89 1,50 11,26 3,77 3,0Sample V/1 0,094 0,095 0,095 0,011 5,33 0,06 100 5,79 3,92 1,48 1,12 1,70 0,9 0,64

Sample V/2 0,085 0,079 0,082 0,004 5,33 0,02 100 2,13 3,47 0,61 0,45 1,65 0,4 0,25Sample V/3 0,087 0,088 0,088 0,007 5,33 0,04 100 3,74 2,98 1,26 1,86 0,7