Predavanja iz kliničke hemijeIspitivanje statusa gvožña

Prof Vesna Spasojević-KalimanovskaProf Violeta Dopsaj

Farmaceutski fakultetUniverziteta u Beogradu

2009/2010

CiljeviCiljevi predavanjapredavanja –– analitikaanalitika gvogvožžñaña

• Parametri u ispitivanju statusa gvoždja• Biohemijski markeri funkcionalnog i

deponovanog Fe• Preanalitički faktori u ispitivanju statusa

gvožña• Analitičke metode

Parametri za ispitivanje statusa gvožña

• Hematološki parametri• Biohemijski parametri

• Parametri za procenu funkcionalnog gvožña• Parametri za procenu rezervi gvožña

Indeksi statusa gvožña

• Hemoglobin• Morfologija eritrocita• Eritrocitni indeksi MCV, MCH, MCHC i RDW• Retikulociti• Gvožñe u serumu• TIBC i saturacija transferina• Slobodni eritrocitni protoporfirini• Cink protoporfirin• Feritin• Solubilni transferinski receptori• Eritropoetin

Hematološki parametri

• Hemoglobin• Morfologija eritrocita• Eritrocitni indeksi MCV, MCH, MCHC i

RDW• Retikulociti

Hemoglobin

• Koncentracija hemoglobina je prvi parametar izbora u proceni anemije

• Nedostatak Fe → snižena sinteza Hb anemija

• utvrdjivanje nedostatka Fe• praćenje terapije preparatima Fe• preklapanje rezultata (anemija i normalni)

Morfologija eritrocita

• nedostatak Fe

hipohromna mikroeritrocitoza• nalaz mikrocita

– kod talasemija– sideroblastna anemija

• koncentracija mikrocita ukazuje na stepen anemije

Razmaz krvi zdrave osobe

Razmaz krvi osobe sa hipohromnom

mikrocitnom anemijom. Uočava se anizocitoza i

poikilocitoza

Hematološki parametriBroj eritrocita ????????????Metode • Brojanje, fotometrijski i na brojačuAnemija - Smanjenje mase eritrocita uperifernoj krvi

M: 4,5-6,3 x 10 12/LŽ: 4,2-5,5 x 10 12/L

Hematokrit: udeo krvnih ćelija u L krviAnemija - Smanjenje hematokritaMetode:• Mikrohematokrit metodom i na brojaču

M: 0,40-0,54 L/LŽ: 0,37-0,47 L/L

Eritrocitni indeksi

MCV

MCH

MCHC

RDW

1. Izračunavaju se iz broja eritrocita, hemoglobina i hematokrita

2. Odreñuju se na brojaču krvnih elemenata

Kriterijumi• izgled eritrocita u razmazu• prosečan volumen eritrocita (MCV)• prosečna konc. Hb u pojedinačnom eritrocitu (MCH)• prosečna konc. Hb u eritrocitima (MCHC)

MORFOLOŠKA KLASIFIKACIJA ANEMIJA

Mikrocitne→ poremećaj sinteze Hb zbog nedostatka gvoždja ili hronične bolesti

Normocitne → hipoproliferativni ilihipoplastični mehanizmi

Makrocitne → nedostatak vit.B12 ili folnekis.

Eritrocitni indeksi

MCV: prosečna zapremina eritrocitaMean cell volume

hematokrit (L/L)MCV (µ m3) =

broj eritrocita (1012 /L)

µm3 = 10-15 L = femtolitar (fL)

Normalan: 80 - 94 fL

MCH prosečna količina hemoglobina u eritrocituMean cell hemoglobin content

Hemoglobin (g/L)MCH (pg) =

Broj eritrocita (1012 /L)Normalno: 25-30 pg

pg (pikogram) = 10-12 g

Eritrocitni indeksi

MCHC prosečna koncentracija hemoglobina u eritrocitima

Mean cell hemoglobin concentration

Koncentracija hemoglobina (g/L)MCHC (g/L) =

Hematokrit (L/L)

Normalno: 300-360 gHb/L Er (g/L)Maksimalno: 370 g/L

Eritrocitni indeksi

Hipohromni eritrocit Normalan eritrocit

Normalno gvožñeDeficijencija gvožña

Megaloblast

Nizak Folat i vit B12 -

Snižen MCV

Snižen MCH

Snižen MCHC

Povećan MCV

Povećan MCH

Normalan MCHC

RDW Red cell distribution widthŠirina distribucije zapremine eritrocitaIndeks varijacije veličine eritrocita

Značaj:• Detekcija anizocitoze• Deficijencija Fe RDW ↑↑↑↑ i MCV ↓↓↓↓

Eritrocitni indeksi

RDW = RBC DISTRIBUTION WIDTH (CV) %

RDWRDW = COEFICIENT OF VARIATION OF RBC VOLUME

RDWRDW

Širina distribucije zapremine eritrocitaIndeks anizocitoze

RDW zavisi od vrste hematološkog brojača (15.8 ± 2.9 %)

RDW (%) = SD (širina histograma) x 100MCV (fL)

MCV nizak MCV normalan MCV visokRDW α i β talasemija Anemija hroničnih bolesti Aplastična anemijanormalan (heterozigoti)

Anemija zbogRDW deficijencije gvožña Bolesti jetre Deficijencija folatavisok Hemoglobin H HLL, HGL (perniciozna anemija)

S-β talasemija Mjelofibroza Hemolizna anemija

RETIKULOCITI

Prelazni oblik izmeñu eritroblasta sa jedrom i zrelih eritrocita bez jedra sa remnantima ribozomalne RNK

Prisustvo retikulocita u krvi ukazuje na aktivnu kostnu srž

Zadržavaju se 2-3 dana u kostnoj srži i 1 dan u perifernoj krviU stimulisanoj eritropoezi su 2-3 dana u perifernoj krvi, dvostruko je povećan broj retikulocita u cirkulaciji, tzv stresni retikulociti

Normalan hematološki nalaz

Hematološki nalaz kod pacijenata sa anemijom zbog deficijencije gvožña. Zapaža se nizak hemoglobin,

nizak hematokrit, mikrocitoza (nizak MCV), hipohromatoza (nizak MCH) i RDW je povećan

Mikrocitnaanemija

(MCV < 80 fL)

FeritinSaturacija transferina

Snižene vrednosti

Normalne vrednosti

Hronični gubitak krvi Smanjen unos Fe hranom

Normalan broj retikulocita

Povišen broj retikulocita

Hronična inflamacija

Hemoglobinopatija

Alogoritam u ispitivanju mikrocitne anemije

Normocitnaanemija

(MCV 80-94 fL)

Retikulociti

Povišeni Normalni/Sniženi

Akutna hemoragij

a

Hemolizni sindrom

Insuficijencija kostne srži

Anemija hroničnih bolesti

Alogoritam u ispitivanju normocitne anemije

Makrocitnaanemija

(MCV > 94 fL)

Retikulociti

Normalni / Sniženi Povišeni

Nedostatak vitamina B12 ili folata

Nelečeni nedostatak vitamina B12ili folata

Akutna hemoragija u nedostatku vitamina B12 ili folata

Alogoritam u ispitivanju makrocitne anemije

Mikrocitna – hipohromna anemija

MCV < 80 fL, MCH < 25 pg

Deficit gvožña – sideropenijska anemija• gubljenje krvi• nedostatak Fe u hrani• loša apsorpcija Fe

Talasemije i hemoglobinopatije- poremećaj sinteze globinskih lanaca

Anemija kod trovanja olovom – poremećaj sinteze hema

Anemije hroničnih bolesti – anemije kod inflamatornih stanja

Normocitna – normohromna anemija

MCV 80-94 fL, MCH < 30 pg

– Akutno gubljenje krvi– Hemolizne anemije– Izolovana aplazija crvene loze– Anemija u hroničnoj bubrežnoj

insuficijenciji– Anemija u endokrinim bolestima– Anemija hroničnih bolesti

Makrocitna anemija

MCV > 94 fL, MCH >30 pg

– Megaloblastna• perniciozna anemija

– Anemija u bolestima jetre– Anemija u hroničnom alkoholizmu

Indeksi statusa gvožña

• Hemoglobin• Morfologija eritrocita• Eritrocitni indeksi MCV, MCH, MCHC i RDW• Retikulociti• Gvožñe u serumu• TIBC i saturacija transferina• Slobodni eritrocitni protoporfirini• Cink protoporfirin• Feritin• Serumski transferinski receptori• Eritropoetin

Biohemijski parametri statusa Fe

• Gvožñe u serumu• TIBC i saturacija transferina• Slobodni eritrocitni protoporfirini• Cink protoporfirin• Feritin• Serumski transferinski receptori• Eritropoetin

Biohemijski parametri statusa Fe

• Gvožñe u serumu

Odreñivanje Fe bez TIBC ima mali klinički značajFe se uvek odreñuje istovremeno sa TIBC da bi se pravilno interpretirao rezultat

Metode odreñivanja Fe

• Metoda sa deproteinizacijom• Metoda bez deproteinizacije

– Slepa proba (bilirubin, hemoglobin, zamućenost)

Direktne metode• brze, jednostavne• manja zapremina uzorka• manja opasnost od kontaminacije in vitro• na automatima• dodatak deterdjenta Triton X-100 zbog

zamućenja

Metode odreñivanja Fe

• Spektrofotometrijsko– stvaranje kompleksa sa visokim apsorpcionim

koeficijentima1. Odvajanje Fe od proteina

– kisela sredina (HCl, H2SO4, CCl3COOH)2. Redukcija Fe+3

– hidrazin, ditionit, sulfit, tioglikolna kiselina, hidroksilamin, askorbinska kiselina

3. Reakcija Fe+2 sa hromogenom (-N=C-C=N-)Hromogeni

– Batofenantrolin disulfonat– Tripiridil triazin– Ferozin– Terozit

Serumsko gvožñe

Fe ↓↓↓↓• kod anemija• akutne i hronična

inflamatorna stanja• kod terapije anemija

– perniciozne anemije vit B12

• akutno ili skoro krvarenje

• davaoci krvi• menstruacije

Fe ↑↑↑↑• kod nagomilavanja Fe

– hemohromatoza– uzimanje Fe– akutno trovanje Fe

• upotreba kontraceptiva• megaloblastna anemija• talasemija• hipoplazija koštane srži• nekroza ćelija jetre

Kapacitet vezivanja gvožña

• Transferin 1/3 zasićen Fe• TIBC Total iron binding capacity

– Ukupan kapacitet vezivanja gvožñja• UIBC Unsaturated iron binding capacity

– Slobodan (nezasićen) kapacitet vezivanja gvožña

TIBC = UIBC + Fe• Zasićenje transferina

AnemijaFe ↓TIBC ↑UIBC ↑

Zasićenje transferina ↓

Metode odreñivanja kapaciteta vezivanja Fe

1. Dodavanje Fe u višku (feri-amonijum citrata)• višak nevezanog Fe(III) se uklanja (MgCO3)• centrifugiranje• u supernatantu se odredi koncentracija Fe TIBC

UIBC = TIBC - serumsko Fe

2. Dodavanje Fe u višku• redukcija viška Fe(III)• Fe vezano za transferin ne reaguje• Reakcija sa hromogenom

UIBC = Dodato Fe - Fe u višku

Transferin u serumu

Transferin je negativni reaktant akutne faze

• TIBC ↓– trauma, infekcije, nefrotski sindrom (gubitak

proteina)– glukokortikoidi ili ACTH

Zasićenje transferinaSaturacija transferina

• Udeo transferina zasićenog gvožñem u odnosu na njegov ukupan kapacitet vezivanja gvožña

koncentracija Fe u serumu / TIBCReferentne vrednosti:

muškarci………....0,20-0,50žene………………0,15-0,50

Povišena saturacija transferina >>>> 45 %• Hemohromatoza, hemosideroza, talasemija, terapija

kontraceptivima, unos FeSnižena saturacija transferina <<<< 15 %• Anemija zbog deficijencije gvožña

Zasićenje transferina

• Granica merenja TIBC do ~ 180 µmol/L • Fe i TIBC > 180 µmol/L

– visoke koncentracije feritina• hepatocelularna oštećenja- virusni hepatitis

– injekcije gvožñem dekstranom

Izračunavanje koncentracije transferinaTransferin• imunohemijske metode

– RID, nefelometrija, turbidimetrija• Izračunavanje

Tf (g/L) = 0,0405 x TIBC (µµµµmol/L)Mm = 81000 ; 1 mol transferina - 2 atoma Fe

TIBC stvarna količina Fe-transferina:– vezivanje Fe za druge proteine– MgCO3 ne uklanja kvantitativno slobodno Fe

Dobra korelacija izračunatog transferina i odreñenog transferina- imunohemijskommetodom

• Prednost imunohemijske metode mala količina uzorka

Preanalitičke varijacije pri odreñivanju statusa Fe

Fiziološke varijacije

Fe TIBC

• Dnevni ritam– ujutru N N– uveče ↓ N

• Menstruacija ↓ N• Pre-menstrualni period ↑ N• Kontraceptivi ↑ ↑• Trudnoća (uz terapiju Fe) ↑ ↑

Preanalitičke varijacije pri ispitivanju statusa Fe

Interferencije lekovaFe ↓↓↓↓• aspirin (velike doze) • alopurinol i do 40 % posle terapije od 1 meseca• holestiramin zbog otežane apsorpcijeFe ↑↑↑↑↑↑↑↑• davanje gvožña dekstrana intravenozno zbog

spore eliminacije

Preanalitičke varijacije pri odreñivanju Fe• Uzorak

– serum– plazma (heparin) EDTA, oksalat, citrat vezuju Fe– uzimanje ujutru– interferencija jaka hemoliza

• Čistoća – reagensi– sudovi: preko noći u 6 mol/HCl, ispiranje 6 x sa vodom– voda dejonizovana

Preporuke za pravilno uzimanje uzorka– Vakutejner sistemi ili plastične epruvete za jednokratnu upotrebu

Referentne vrednostiUticaj pola i godina

• Fe– novorodjenčad……………...17,9 - 44,7 µmol/L– deca do 1 god……………......7,2 - 17,9 µmol/L– deca > 1 god………………........9,0 - 21,5 µmol/L– muškarci……………………......11,6 - 30,4 µmol/L– žene………………………...........9,0 - 30,4 µmol/L

• UIBC……………………….......32 - 45 µmol/L• TIBC………………………….....45 -80 µmol/L

Feritin• Koncentracija u krvi niska

– svega 1 % Fe u plazmi• Feritin zavisi od količine rezervnog Fe• 1µg/L feritina u serumu ≅ 140 µg rezervnog Fe/kg t.t.• Indikator veličine rezervnog dela Fe

Odreñivanje feritina• IRMA, RIA, EIA (ELISA), FIA

Referentne vrednosti – uticaj pola i godina• odrasli muškarci…………………20-300 µg/L• odrasle žene……………………..15-120 µg/L• novorodjenčad……………………25-200 µg/L• deca 1 m………………………… 200-600 µg/L• deca 2-5 m………………………..50-200 µg/L• deca 6 m - 15 g…………………….7-142 µg/L

Feritin

Feritin je osetljiv pokazatelj nedostatka Fe• rani pad feritina (latentna anemija)• Feritin ↑ protein akutne faze pozitivan

– hronične bolesti: infekcije, zapaljenja, bolesti bubrega– maligne bolesti: limfomi, leukemije, karcinom dojke, neuroblastomi– virusni hepatit, toksično oštećenje jetre, alkohol– hemosideroza, hemohromatoza

•Ukoliko pored deficijencije Fe postoji i infekcija rezultatferitina mora se veoma oprezno tumačiti

•Feritin <10 µg/L uvek ukazuje na hipohromnu anemiju•Feritin > 80 µg/L sigurno isključuje deficit gvožña i anemiju

•Koncentraciju feritina ne treba odreñivati neposredno posle terapije

•Feritin je neophodan u diferencijalnoj dijagnozi

Tumačenje rezultata feritina

Odreñivanje solubilnih transferinskih receptora u serumu

• za procenu funkcionalnog dela Fe• cirkulirajući transferinski receptori• imunohemijske metode• Deficijencija Fe:

– porast transferinskih receptora u serumu– Vrlo visok porast 2-3 x kod anemije u odnosu na

zdrave osobe– Visoka specifičnost i osetljivost u otkrivanju

subkliničkih i kliničkih deficijencija gvožña kod pacijenata kod kojih je indikovana suplementacija Fe

HemoglobinFeritinFeTIBC

% saturacijeMorfologijaEritrocitasTfR

NormalanSniženNormalnoNormalan/blago sniženNormalanNormocitnaNormohromnaNormalan

NormalanSniženSniženoPovišen

SniženNormocitnaNormohromnaPovišen

SniženSniženSniženoPovišen

SniženMikrocitnaHipohromnaVisok

Slobodni eritrocitni porfirini FEP• Protoporfirin IX• Porast FEP kod anemije i trovanja olovom

Cink protoporfirin (ZPP)Kod anemije i kongenitalne eritropoetske porfirije

Eritropoetin• utvrdjivanje uzroka hronične anemije• kod renalnih bolesti izvor eritropoetina je

uništen

Zaključci

Parametri za ispitivanje anemije• Fe• Feritin• Transferin• TIBC• Saturacija transferina• Cink protoporfirina• Transferinski receptori

Parametri za ispitivanje anemije

• Hemoglobin snižen• Sideropenična anemija• Kompletna krvna slika• Makrocitna, normocitna i hipohromna• Sniženi MCV i MCH

Parametri za ispitivanje anemije

Feritin• Manji od 12 ug/L• Protein akutne faze • Uticaj inflamacije

Parametri za ispitivanje anemije

Serumski transferin i TIBC• Inverzni feritinu kod anemije• Saturacija transferina < 15 %

Ispitivanje anemije

Glavni problem kod dijagnoze anemije u hospitalizovanim bolesnicima je razlikovanje kod hroničnih oboljenja anemije nevezano od deficita Fe

Serumski transferinski receptorinajbolji diskriminator prave deficijencije gvožña

ZaključciIspitivanje viška gvožña

Parametri za ispitivanje opterećenja gvožñem:• Feritin• Saturacija transferina > 45 %Dijagnostika hemohromatoze• Histohemijska ili hemijska analiza Fe pri

biopsiji jetre– Praćenje izlučivanja Fe urinom – Kod terapije deforksaminom

• Metode molekularne biologije • HFE protein• Mutacija Cys282Tyr

Alogoritam u dijagnozi hemohromatoze