strategie di difesa con agenti di biocontrollo in pre- e post-harvest … … contro la...

Strategie di difesa con agenti di biocontrollo in pre- e post-harvest …

… contro la «fumaggine» causata da Alternaria spp.

Moruzzi Serena, Martini MartaUniversità degli Studi di Udine, DISA

Presentazione del problema2000:

prime segnalazioni in FVG di alterazioni della buccia delle mele in campo e in ambiente di conservazione

Presenza di fumaggine

Presenza di agenti fungini

Dia

gnos

i di r

outin

e

Osservazione dei sintomi

Indagini fitopatologiche (stereomicroscopio e isolamento)

Presentazione del problema2008:

Università di Udine, DISA (p.a. Borselli S., prof. Osler R., dott. Grisan S., dott. Poggetti L.)

Agenzia Regionale per lo Sviluppo Rurale (dott. Benvenuto L., dott. Malossini G., dott. Frausin C.)

FriulFruct (dott. Zampa C.)

1. Ricerca bibliografica2. Sintomatologia e diffusione della malattia: campo e ambiente di

conservazione 3. Eziologia della malattia (identificazione agente/i patogeno/i): isolamento

microrganismi e loro identificazione, postulati di Koch

4. Individuazione strategia di lotta/controllo: chimico biologico

hanno iniziato progetto di ricerca sulla malattia:

1. Ricerca bibliografica- Problematiche simili (malattie epifitiche) risultavano comuni nelle zone

temperate e umide: diffuse in gran parte degli Stati Uniti, Europa (Olanda, Norvegia, Germania, Slovenia, Serbia, Polonia), Turchia, Giappone, Cina, Brasile

- In Italia segnalazioni in Trentino Alto Adige, Piemonte, Emilia Romagna e Friuli Venezia Giulia (Lindner, 2009; Grosso et al., 2011)

Malattia- Gloeodes pomigena (Schweinitz, 1832)

- Peltaster fructicola (Johnson et al., 1997)

- Leptodontium elatius (Johnson et al., 1997)

- Geastrumia polystigmatis (Johnson et al., 1997)

- 80 nuove presunte specie (anni 2000), tra cui:

Tripospermum spp. (Grabowski, 2007);Microcyclospora spp., Stomiopeltis spp., Microcyclosporella spp. (Gleason et al., 2011)

Classe Dothideomycetes, ordine Capnodiales (95%)

Sooty blotch (maculatura fuligginosa)

Agenti causali

Malattia

- Schizothyrium pomi (Von Arx , 1959)

- Zygophiala jamaicensis (Mason, 1945)

- 10 nuove presunte specie (anni 2000), tra cui:Ramularia spp., Dissoconium spp. (Gleason et al., 2011)

Flyspeck (macchiolina di mosca)

- Tilletiopsis spp. (Boekhout et al., 2006)

White haze (patina bianca)

Agenti causali

1. Ricerca bibliografica

2. SintomatologiaTipica delle malattie epifitiche (fumaggini) che si sviluppano a spese degli strati più superficiali e inerti del frutto:

Striature diffuse sulla maggior parte della superficie del frutto, concentrate soprattutto (colore nero più intenso) nei dintorni della base del peduncolo e della depressione calicina; frequentemente sembrano descrivere il percorso di un percolamento, probabilmente in corrispondenza dei punti in cui si è trovata a scorrere acqua piovana o di condensa e quindi l’organismo si è sviluppato maggiormente in concomitanza di tali zone, più ricche d’acqua

2. Sintomatologia

Iniziale opacizzazione degli strati superficiali, che evolve in un annerimento consistente, causato dalla maturazione e sporulazione del micelio fungino

Odore organico caratteristico Nessuna lesione o distruzione dei tessuti (no rugginosità) Interferenza sul normale sviluppo dei frutti (caratteristiche organolettiche) I sintomi si evidenziano soprattutto su Golden Delicious, ma risultano

sintomatiche anche altre cultivar (Golden Lasa, Gold Rush, Brina, Summerfree)

In genere si riscontra in cella di conservazione: Durante la conservazione in cella frigo, sia in atmosfera controllata

(ULO) che non, in condizioni di elevata umidità relativa, i sintomi si manifestano in maniera evidente

Le mele sintomatiche nei bins sono disposte in ordine sparso e non come tipicamente avviene per le malattie da conservazione (infezione che inizia in campo)

A volte (sulla base dell’andamento stagionale) è possibile riscontrare i sintomi iniziali già in campo, nel periodo estivo

2. Sintomatologia

Mela sintomatica in campo Mela sintomatica in conservazioneBins con mele sintomatiche

Si è potuto osservare una maggiore diffusione della malattia:

nelle annate con lunghi periodi piovosi in primavera, seguiti da estati calde

in caso di presenza di fitta copertura fogliare

sui frutti sviluppatisi nella parte bassa della pianta

2. Sintomatologia

DOVE CAMPO CELLA FRIGO CELLA ATMOSFERA CONTROLLATA (ULO)

COME POCHI SINTOMI EVIDENTI

AUMENTO PROGRESSIVO SINTOMI SIA COME GRAVITÀ SIA COME INCIDENZA

AUMENTO PROGRESSIVO SINTOMI SIA COME GRAVITÀ SIA COME INCIDENZA

QUANDO DA LUGLIO ALLA RACCOLTA

DALLA RACCOLTA FINO ALLA VENDITA

DALLA RACCOLTA FINO ALLA VENDITA

2. Sintomatologia

Valutazione dei sintomi presenti su mele in campo e in cella di conservazione al fine di stabilire:

l’influenza della tipologia di conservazione (cella frigo o atmosfera controllata, ULO) sulla manifestazione dei sintomi

l’influenza dei trattamenti effettuati sulla manifestazione dei sintomi

l’influenza del regime di coltivazione (biologico o integrato) sulla manifestazione dei sintomi

2. Diffusione della malattia

Individuazione aziende e tesi sperimentali

Integrato

Biologico

tesi trattata fino a termine consentito

tesi non trattata a partire da ingrossamento frutti

TrattamentiRegime Conservazione

Cella frigo

Atmosfera controllata

Cella frigo


tesi trattata in regime convenzionale da inizio ingrossamento frutti

Cella frigo


tesi non trattata fino alla raccolta

Cella frigo


Valutate e catalogate 2101 mele

Azienda 1

Azienda 2


% di superficie colpita dalla malattia in funzione della modalità di conservazione

Azienda 1Integrato

Azienda 2 Integrato

Azienda 2Bio

Atmosfera Controllata (ULO) 16% 21% 37%

Cella Frigo 20% 17% 33%

Significatività n.s n.s n.s

Kruskal-Wallis Test (Nonparametric ANOVA) GraphPad InStat version 3.00

L’ incidenza della malattia non è risultata correlata con la tipologia di conservazione


L’ incidenza della malattia è risultata maggiore: - nelle tesi non trattate rispetto a quelle trattate- nelle tesi biologiche rispetto a quelle integrate

% di superficie colpita dalla malattia in funzione dei trattamenti e del regime di coltivazione

Azienda 1integrato

Azienda 2Integrato

Azienda 2 Bio

Trattato 14% 10% 31%

Non Trattato 23% 30% 38%

Significatività S p <0,001 S p <0,001 S p <0,001

Kruskal-Wallis Test (Nonparametric ANOVA) GraphPad InStat version 3.00


Conclusioni:

L’incidenza della malattia non è risultata correlata alla tipologia di conservazione (cella frigo o ULO)

L’incidenza della malattia è risultata inferiore nelle tesi trattate, rispetto a quelle in cui i trattamenti sono stati sospesi in primavera o che non sono state sottoposte a trattamenti

L’incidenza della malattia è risultata superiore nelle tesi biologiche, rispetto a quelle sottoposte a regime integrato


IDENTIFICAZIONE SINTOMI DELLA

MALATTIA IN CAMPO

IDENTIFICAZIONE SINTOMI DELLA

MALATTIA IN CAMPO

ISOLAMENTO E IDENTIFICAZIONE

DELL’ AGENTE PATOGENO

ISOLAMENTO E IDENTIFICAZIONE

DELL’ AGENTE PATOGENO

IDENTIFICAZIONE DEL MICRORGANISMO AL

MICROSCOPIO OTTICO

IDENTIFICAZIONE DEL MICRORGANISMO AL

MICROSCOPIO OTTICO

INOCULO PATOGENO SU MELE SANE IN LABORATORIO

INOCULO PATOGENO SU MELE SANE IN LABORATORIO

OSSERVAZIONE DEI SINTOMI TIPICI E

REISOLAMENTO DA MELE INOCULATE ARTIFICIALMENTE

OSSERVAZIONE DEI SINTOMI TIPICI E

REISOLAMENTO DA MELE INOCULATE ARTIFICIALMENTE

Applicazione dei POSTULATI

DI KOCH

3. Eziologia

Isolamento da mele sintomatiche da

campo e da cella frigo, su diversi substrati (Potato Dextrose Agar, Potato Carrot Agar, Agar buccia di mela) e diverse

metodiche (da porzione di buccia infetta, da raschiatura, da acqua di lavaggio di buccia infetta; incubazione a T° ambiente o T°

controllata a 25°C) per isolare tutta la flora microbica presente

Sviluppo di un unico microrganismo ricorrente

3. Eziologia

Dictiospore di Alternaria al microscopio ottico

Identificazione dell’agente causale al microscopio ottico, confermata da riconoscimento presso Istituto di Micologia Olandese (CBS):

gruppo Alternaria alternata

3. Eziologia

Reisolamento su piastra da sintomatologia indotta

Inoculo artificiale in laboratorio su mela sana

(immersione intere mele in soluzione di spore di Alternaria 2*105 spore/ml, conservazione in

cella frigo o a T° ambiente fino a comparsa dei sintomi)

3. EziologiaVerifica dei postulati di Koch:

3. EziologiaConclusioni:

l’agente causale della malattia è risultato appartenere al genere Alternaria spp.

l’applicazione dei Postulati di Koch ha confermato un solo microrganismo fungino quale agente della malattia, sia in campo che nelle celle di conservazione

4. Strategia di controllo chimico:agricoltura convenzionale

• Dodina (Syllit)• Penconazolo (Topas)• Pyrimethanil (Scala)• Metiram (Polyram)• Iprodione (Rovral)• Captano (Make-up)

• Cyprodinil (Chorus)• Difenconazolo (Score)• Fluazinam (Ohayo)• Zolfo puro (Thiopron)• Pyraclostrobin (Bellis)• Boscalid (Cantus)

Capacità inibitoria dei principali fungicidi usati in melicoltura:

Inibizione della crescita del micelio di Alternaria

Inibizione della capacità germinativa delle spore di

Alternaria

2 prove parallele:

4 principi attivi sono risultati efficaci:

- Difenconazolo (Score)

- Iprodione (Rovral)

- Penconazolo (Topas)

- Cyprodinil (Chorus)

Inibizione della crescita del micelio di Alternaria:


Inibizione della capacità germinativa delle spore di Alternaria


AgrofarmacoRiduzione

germinazione spore di

Alternaria

Riduzione crescita micelio di Alternaria

Pyrimethanil (Scala) si no

Metiram (Polyram) si no

Captano (Make-up) si no

Penconazolo (Topas) si si

Cyprodinil (Chorus) si si

Difenconazolo (Score) no si

Iprodione (Rovral) no si


Penconazolo(Topas)

2% di spore di Alternaria germinate

Principio attivo

Inoculopatogeno

Inoculo patogeno

Testimone Testimone

Cyprodinil(Chorus)

15% di spore di Alternaria germinate

Principio attivo

Inoculopatogeno

Inoculo patogeno

Testimone Testimone

23 volte la doseconsigliata inetichetta (80 gr/lt)


Colonia a 4 giorni di crescita su PCA



Rame ossicloruro

4. Strategia di controllo chimico:agricoltura biologica

Conclusioni: Sono stati individuati alcuni principi attivi in grado di controllare la

crescita del micelio e la germinazione delle spore di Alternaria spp., in particolare il Penconazolo e il Cyprodinil sono risultati i più efficaci

Il rame ossicloruro, utilizzato nei regimi di agricoltura biologica, non dotato di selettività ed efficace nei confronti di gran parte degli organismi microfungini, non si è dimostrato efficace nei confronti di Alternaria spp.

4. Strategia di controllo chimico:agricoltura convenzionale e biologica

Inizio progetto: 2011Il progetto di ricerca AGER STAYFRESH “Strategie innovative

rispondenti ai bisogni delle imprese nel comparto degli ortofrutticoli della IV gamma”, si è occupato anche della ricerca di trattamenti

fitoiatrici sostenibili, basati sull’utilizzo di antagonisti naturali contro i patogeni vegetali.

Attività previste (Task/activities):

Progetto Ager StayFresh

1.2.4. Ricerca di antagonisti naturali contro malattie di post-raccolta su mela

1.2.5. Applicazione di antagonisti naturali e monitoraggio su mela

(+) Caratterizzazione dell’agente causale della malattia

Valutazione della possibile variabilità genetica (caratterizzazione molecolare) del patogeno, a causa della difficoltà del

riconoscimento morfologico delle specie di Alternaria «small-spored» (Polizzotto et al., 2012):

Analisi molecolari su 41 ceppi di Alternaria spp. isolati da mele sintomatiche:

Caratterizzazione dell’agente causale

Estrazione del DNA da micelio funginoAmplificazione della regione ITS (Internal

Transcribed Spacer) con tecniche di PCR-RFLPConfronto con i profili di restrizione dei ceppi

di riferimento di A. alternata, A. arborescens e A. tenuissima

A. alternata

A. arborescens

Amplificazione della regione IGS (Intergenic Spacer) con

tecniche PCR-RFLP Confronto con i profili di

restrizione dei ceppi di riferimento di A. alternata,

A. arborescens e A. tenuissima

Caratterizzazione dell’agente causaleAnalisi molecolari su 41 ceppi di Alternaria spp.

isolati da mele sintomatiche:

A. arborescens

A. arborescens

A. alternata

A. alternata

Caratterizzazione morfologica su 41 ceppi di Alternaria spp. isolati da mele sintomatiche:

osservazione delle colonie su terreni Potato Carrot Agar e DRYES

A. arborescens A. alternata


Tot: 17 ceppi A. arborescens, 24 ceppi A. alternata

Ripetizione prova di patogenicità:

inoculo patogeno su mela sana mele sterilizzate in superficie con

esposizione a raggi UV-C (UNIUD-DIAL, 10’ per lato, λ 254 nm)

individuati 6 spot per ciascuna mela, in 3 diverse posizioni (calice, peduncolo, equatore) e inoculati con una soluzione di spore (2*105 spore/ml) di Alternaria arborescens (3 ceppi diversi) e Alternaria alternata (3 ceppi diversi)

valutazione dello sviluppo dei sintomi tipici della malattia (fumaggine nerastra) a T ambiente e a 0°C


0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Mele infettate con A. arborescens 0°C

Mele infettate con A. arborescens T° amb

Mele infettate con A. alternata 0°C

Mele infettate con A. alternata T° amb

Spot sintomatici alla fine della prova(30 dpi a T° amb, 80 dpi a 0°C)

Perc

entu

ale

di s

pot c

on s

into

mi

Spot sintomatico, a occhio nudo e allo stereomicroscopio


Conclusioni: Sono stati isolati diversi ceppi fungini associati alla sintomatologia

descritta e appartenenti al gruppo di Alternaria alternata

In particolare, sono stati identificati 24 ceppi di A. alternata e 17 ceppi di A. arborescens

Le prove di patogenicità effettuate hanno permesso di stabilire che A. arborescens è in grado di provocare sintomi identici a quelli

osservati in campo

A. alternata invece ha manifestato una minor virulenza, con sintomi più lievi e assenza del caratteristico odore organico

La valutazione dei sintomi ad occhio nudo è risultata spesso difficoltosa (necessità di uso dello stereomicroscopio)


Ricerca degli antagonisti:

90 isolamenti da mele asintomatiche in cella frigo

Ricerca di potenziali microrganismi antagonisti

73 isolati tra lieviti e funghi utilizzati per prove di antagonismo preliminari in vitro contro Alternaria spp.

ORGANISMI EFFICACI

ORGANISMI NON EFFICACI

Alternaria

antagonista


57 microrganismi sono risultati in grado di ostacolare la crescita del patogeno


Identificazione degli antagonisti:

Suddivisione morfologica

Estrazione rapida del DNA genomico fungino

PCR-RFLP

Sequenziamento e confronto in GenBank


Identificazione degli antagonisti:

Series10

5

10

15

20

25

30

Aureobasidium

Cryptosporiopsis

Epicoccum

Acremonium

Funghi diversi

Lieviti diversi

N°d

i col

onie

ott

enut

e da

gli i

sola

men

ti


Azione degli antagonisti:

Prove di antagonismo in vitro a T° ambiente

per : Aureobasidium Cryptosporiopsis Acremonium

Alternaria (controllo)


7 giorni 14 giorni 21 giorni 28 giorni0

102030405060708090

100

AureobasidiumAcremoniumCryptosporiopsisAlternaria (controllo)

Crescita della colonia di Alternaria (in mm) in presenza degli antagonisti(temperatura ambiente)

Dia

met

ro d

ella

col

onia

in m

mRicerca di potenziali microrganismi

antagonisti

Azione degli antagonisti:

Prove di antagonismo in vitro in cella frigorifera (≈ 0°C)

per : Aureobasidium Cryptosporiopsis Acremonium



4 sett 5 sett 6 sett 7 sett 8 sett 9 sett0

5

10

15

20

25

Aureobasidium

Acremonium

Cryptosporiopsis


Crescita della colonia di Alternaria (in mm) in presenza degli antagonisti(0°C)

Dia

met

ro d

ella

col

onia

in m

mRicerca di potenziali microrganismi

antagonisti

Analisi della porzione ITS

nessuna differenza evidenziabile

Analisi molecolari su 27 ceppi isolati di Aureobasidium spp.:

Le sequenze ottenute dalla porzione ITS di 2 ceppi rappresentativi hanno mostrato una similarità di sequenza del 100% con la sequenza di A. pullulans var. pullulans strain CBS 584.75 (accession

number FJ150906) presenti in banca dati


Analisi con tecniche di rep-PCR

suddivisione in circa 10 gruppi molecolari

Verifica dell’azione antagonistica in vitro di ciascun gruppo nei confronti di diversi ceppi di Alternaria spp.

(3 A. arborescens + 3 A. alternata)

Azione antagonista di A. pullulans (A)nei confronti di A. arborescens (B)

Azione antagonista di A. pullulans (A)nei confronti di A. alternata (B)

A. pullulans è risultato svolgere una valida azione antagonista nei confronti di A. arborescens, mentre non è risultato molto efficace nei confronti di A. alternata

A A

B B

A A

BB


Scelta di 4 ceppi rappresentativi di A. pullulans da usare nelle prove di antagonismo in vivo su mele frigoconservate: 1-4-6-10

Conclusioni: Sono stati isolati diversi organismi con azione antagonistica nei confronti di

Alternaria spp. Gli organismi rivelatisi maggiormente efficaci (appartenenti a 3 diversi

generi) sono stati utilizzati per prove di antagonismo a temperatura ambiente e a circa 0°C (t delle celle di conservazione) e hanno mostrato di ostacolare in maniera significativa la crescita del patogeno in entrambe le

condizioni di temperatura Gli organismi isolati appartenevano principalmente (27 su 57) alla specie

Aureobasidium pullulans, appartenenti a 10 gruppi molecolari L’azione antagonistica è risultata più efficace nei confronti di A. arborescens

che nei confronti di A. alternata 4 ceppi di A. pullulans più efficaci in vitro sono stati scelti per prove in vivo


Applicazione di potenziali microrganismi antagonisti

in pre-harvest Prova di antagonismo in vivo contro A. arborescens:

individuazione a Maggio di un meleto da condurre senza trattamenti fungicidi preparazione di una soluzione di cellule di Aureobasidium pullulans ceppi 1-4-

6-10 ad una concentrazione finale di 2* 108 CFU/ml 10 piante trattate ciascuna con 500 ml della soluzione ottenuta, distribuita con

atomizzatore sull’intera chioma 4 trattamenti durante la stagione: 28.06.13; 27.08.13; 03.09.13; 16.09.13

raccolta mele da 10 piante trattate (circa 1000 frutti) e da 10 non trattate (circa 800

frutti) (controllo negativo) il 26.09.13 individuati 6 spot per ciascuna mela in 3 diverse posizioni con le stesse

modalità utilizzate per la prova di patogenicità, inoculati con una soluzione di spore di Alternaria arborescens (2*105 spore/ml)

valutazione dello sviluppo dei sintomi tipici della malattia (fumaggine nerastra) in presenza o assenza dell’antagonista, su mele conservate in ambiente con bassa umidità relativa a T° ambiente e a 0°C

Prova di antagonismo in vivo contro A. arborescens:

mele non trattate inoculate per immersione in una soluzione di cellule di Aureobasidium pullulans (5*108 cfu/ml)

individuati 6 spot per ciascuna mela, in 3 diverse posizioni e con le stesse modalità utilizzate per la prova di patogenicità, e inoculati con una soluzione di spore di Alternaria arborescens (2*105 spore/ml)

valutazione dello sviluppo dei sintomi tipici della malattia (fumaggine nerastra) in presenza o assenza dell’antagonista, su mele conservate in ambiente con elevata umidità relativa a T° ambiente e a 0°C


in post-harvest

Prova di antagonismo in vivo contro A. arborescens a T° ambiente

Comparsa dei primi sintomi (15 dpi) Fine prova (40 dpi)

Perc

entu

ale

di s

pot c

on s

into

mi

Mele non trattate con elevata u.r.

Mele trattate in post-harvest

Mele non trattate con bassa u.r.

Mele trattate in pre-harvest

B

B

AA


in pre- e post-harvest

Fisher’s exact test: P < 0.0001, estremamente significativo

Prova di antagonismo in vivo contro A. arborescens in cella frigorifera

Comparsa dei primi sintomi (120 dpi) Fine prova (200 dpi)

Perc

entu

ale

di s

pot c

on s

into

mi

Mele non trattate con elevata u.r.

Mele trattate in post-harvest

Mele non trattate con bassa u.r.

Mele trattate in pre-harvest

AA

B B


in pre- e post-harvest

Fisher’s exact test: P < 0.0001, estremamente significativo

Applicazione di potenziali microrganismi antagonisti in pre- e

post-harvestConclusioni:

Sono stati effettuati trattamenti per verificare la capacità dell’antagonista di contenere la malattia, in pre-raccolta, con buoni risultati ma con alcune

criticità:

si sono manifestati leggeri sintomi a carico delle foglie (piccole necrosi fogliari), dovuti probabilmente alla eccessiva quantità di cellule di A. pullulans utilizzate ed alla modalità di trattamento

si sono osservati dei sintomi di fumaggine (provocata da A. pullulans e diversa da quella causata da A. arborescens) durante la conservazione, nelle porzioni maggiormente umide

Sarà necessario mettere a punto i trattamenti, con una minore quantità di spore per ottimizzare l’azione dell’antagonista, e trovando il momento

ideale per l’applicazione

Applicazione di potenziali microrganismi antagonisti in pre- e

post-harvestConclusioni:

Sono stati effettuati trattamenti per verificare la capacità dell’antagonista di contenere la malattia quando utilizzato in post-

raccolta, con ottimi risultati

Aureobasidium pullulans si è dimostrato un organismo di biocontrollo efficace anche nei confronti della fumaggine del melo

strategie di difesa con agenti di biocontrollo in pre- e post-harvest … … contro la...

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