structure et fonction de l’hémoglobine : analyse d’un...

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1 Auteur : SENILLE Violette

PHYSICOCHIMIE DES MACROMOLECULES

Structure et fonction de l’hémoglobine : analyse

d’un système complexe

INTRODUCTION 9

I. Pourquoi les hémoglobines ? 9

1 . Les premières structures protéiques élucidées. 9

2 . Des protéines toujours d’actualité. 10

II. Rôles des hémoglobines. 10

1 . Fonctions physiologiques. 10 2 . Fonctions biochimiques : la liaison d’oxygène. 11

III. Structure de l’hémoglobine. 13

1 . L’hème. 13 2 . La protéine autour des hèmes. 14

3 . Les sous-unités. 17

COOPERATIVITE 19

I. Modèle à un site de liaison. 19 1 . Etude de la saturation. 19

2 . Modèle de Hill. 21 3 . Problèmes. 23

II. Modèle avec deux sites de liaison. 24

1 . Constantes d’équilibre. 24 2 . Prédictions suivant la concentration en ligand. 25

3 . Vue moléculaire de ce modèle. 26

4 . Mesure de la coopérativité. 27

III. Le modèle coopératif appliqué à l’hémoglobine. 28



LES MODELES ALLOSTERIQUES 29

I. Le modèle MWC. 29 1 . Les deux conditions du modèle. 29

2 . Les constantes d’équilibre. 30

II. Comment paramétrer le modèle ? 32 1 . Une fonction de partition. 32

2 . Calcul des différents paramètres. 33

III. Les prédictions du modèle. 33

1 . Ajustement des paramètres pour la saturation. 33

2 . Proportion des différentes formes. 34 3 . Proportions suivant la saturation des sites. 34

IV. Ce modèle est-il raisonnable ? 35 1 . Les bases du modèle. 35

2 . Quatre sites identiques et indépendants ? 35

3 . Les formes T et R. 36

STEREOMECANIQUE ET STEREOCHIMIE 38

I. Chimie du Fer. 38

1 . Orbitales et formes. 38 2 . Fixation de ligands. 39

II. Mécanique de l’hémoglobine. 40

1 . Différents petits déplacements. 40 2 . Les extrêmités C-terminales. 42

III. Influence de la liaison d’oxygène. 43 1 . L’oxygène déstabilise la forme T. 43

2 . Passage de la forme T à la forme R. 44

3 . A quoi correspondent les différentes constantes ? 44 4 . Simplement une question d’énergie. 45



EFFET DES MODULATEURS 46

I. Effet du CO2. 46 1 . L’effet Bohr. 46

2 . La liaison avec le CO modifie la capacité de transport. 47

3 . Intégration au modèle MWC. 48 4 . Un système à multiples équilibres liés. 49

II. Effet du pH. 50 1 . L’effet des protons est associé à la présence de CO2. 50

2 . L’effet de pH modifie l’équilibre des formes T-R. 51 3 . Un changement d’ionisation. 51 4 . Mesure des pKa des Histidines. 52

5 . Variations de pKa. 54 6 . Interactions avec l’environnement. 55

III. Le BisPhosphoGlycérate, ou BPG. 56

1 . Effet du BPG. 56 2 . Interaction du BPG avec l’hémoglobine. 57

3 . La liaison du BPG favorise la forme T. 57 4 . Effet général d’un modulateur. 58

IV. L’effet de l’eau. 59

1 . La forme R est plus sensible à l’eau. 59 2 . Un modulateur concentré. 59

AU-DELA DU MODELE MWC 60

I. Un modèle qui n’explique pas tout. 60

II. Modèles QTS versus TTS. 60

1 . Les modèles TTS.. 60

2 . D’autres structures prises en compte. 61 3 . Plusieurs constantes d’équilibre. 62

4 . Des modèles qui se rejoignent quand même. 62

III. Passage à un modèle cinétique plus complexe. 63

1 . Vers un modèle cinétique. 63

2 . Cinétique de la myoglobine. 64



3 . Tentatives d’explication des différentes phases. 65

4 . Etude des intermédiaires. 67 5 . Etude de la dynamique grâce à la cristallographie. 68

IV. Modèle cinétique de l’hémoglobine. 69 1 . Les constantes de vitesse des sites germinates. 69

2 . Un modèle beaucoup plus complexe. 70

3 . Des modèles cinétiques qui sont moins sûrs. 71

V. Conclusions. 71

Evolution de l'hémoglobine : variations inter-

espèces et lien entre séquence, physicochimie et

écologie

RAPPELS SUR L’EVOLUTION ET LA GENETIQUE 73

I. La théorie de Darwin. 73

II. La transmission de la variabilité. 74

III. La variabilité individuelle. 74

MUTATION ET EVOLUTION 75

I. Mutations et protéines. 75 1 . Les taux de mutations. 75

2 . Variabilité des protéines. 76



II. La sélection des individus. 76

1 . Pénétration d’un allèle. 76 2 . La dérive génétique. 77

3 . Lien entre la sélection par pression et les mutations. 78

III. Le paradigme. 78

1 . Evolution moléculaire. 78

2 . L’évolution dirigée. 79

IV. Evolution d’une fucosidase à partir d’une glucosidase. 81 1 . Evaluation du résultat par la cinétique enzymatique. 81 2 . Les mutations introduites. 82

V. Relation entre la séquence et l’écologie. 83

RAPPELS SUR LES HEMOGLOBINES 84

I. Structure. 84

II. Fonctionnement. 85

1 . La coopérativité. 85 2 . Allostérie. 85

III. Mécanique du changement de structure. 86

1 . Une gène stérique. 87 2 . Liaison entre le Fer et la Tyrosine terminale. 87

3 . Les extrêmités C-ter. 88

IV. Transitions T-R : énergétique. 89

1 . Cycle thermodynamqique. 89

2 . Diagramme énergétique. 89

V. Les modulateurs. 90

1 . Rôle des modulateurs. 90 2 . Le BPG. 90

3 . Encore des ponts salins qui se brisent. 91

VI. Conclusion. 91



OIES ET POISSONS 92

I. Deux espèces d’oies apparentées. 92

1 . Des conditions de vie différente. 92

2 . Quatre mutations. 92 3 . Une mutation qui change l’affinité pour l’oxygène. 94

4 . Une oie andienne. 95 5 . Des mutations qui peuvent avoir des effets importants. 96

II. L’effet Root des hémoglobines de poissons. 96

1 . La vessie natatoire des téléosténiens. 96 2 . L’effet de Bohr. 97

3 . L’effet de Root. 99 4 . Mécanisme utilisé chez le poisson. 100

III. Conclusions sur les évolutions des oies et poissons. 103

VARIATIONS INTRA-ESPECES 104

I. Des variations au cours du développement. 104 1 . Différentes proportions au cours du développement. 104

2 . Différences entre deux hémoglobines humaines 105 3 . Interactions avec le BPG. 106

4 . Liaison du monoxyde de Carbone. 108

II. Mutations et maladies. 109 1 . La drépanocytose. 109

2 . Le paludisme. 110 3 . L’hémoglobine S. 111 4 . L’incidence sur le paludisme. 114

5 . D’autres mécanismes de protection différents. 117

III. Conclusions. 117



LES HEMOGLOBINES ANCESTRALES ET MODERNES 118

I. Ascaris suum. 118

1 . Une très forte affinité pour l’oxygène. 118 2 . Origine moléculaire de la différence d’affinité. 119

3 . Les liaisons hydrogènes. 121 4 . Une enzyme de la détoxification. 129

II. Neuroglobines et Cytoglobines. 130

1 . Deux nouvelles globines avec des fonctions inconnues. 130 2 . Alignement de la neuroglobine. 131 3 . Un nouveau pont disulfure : régulation par la cellule. 131 4 . Un autre rôle : la signalisation de l’oxygène. 134

III. Conclusions. 136

LES HEMOGLOBINES : UNE GRANDE FAMILLE 137

I. Une famille de protéines très diverses. 137

II. Construction d’un arbre phylogénétique. 138 1 . Un gabarit nécessaire pour cette construction. 138

2 . L’arbre des hémoglobines. 140

III. Evolution archaïque des hémoglobines. 141 1 . Des origines très anciennes. 141 2 . Beaucoup de rôles différents dans une même famille. 141 3 . Un rôle ancestral différent du rôle actuel. 142

IV. De nouvelles hémoglobines a étudier. 143

1 . Une protéine a deux domaines. 143 2 . Fabrication d’une hémoprotéine. 143

3 . Un rôle dans l’aérotaxie. 144 4 . Une structure incomplète. 145

5 . Comportement avec un ligand. 146

V. Les leghémoglobines, ou hémoglobines végétales. 148 1 . Deux types d’hémoglobine végétales. 148

2 . Différents rôles pour ces hémoglobines. 148 3 . Les leghémoglobines et la fixation de l’azote. 149



Structure et fonction de

l’hémoglobine

Analyse d’un système complexe



INTRODUCTION

I. Pourquoi les hémoglobines ?

1 . Les premières structures protéiques élucidées.

Les hémoglobines (et les myoglobines) sont les premières structures à avoir été résolues, dans les années 50. Perutz et Wyman ont élucidés leur structures par cristallographie aux rayons X . Perutz étudiait les cristaux de glace dans les Alpes, tandis que Wyman étudiait la fonction des protéines et analysait des systèmes complexes.

Les structures de l’hémoglobine et de la myoglobine ont été publiées ensemble. Le modèle de la myoglobine ressemblait à une saucisse entourée autour d’un hème. L’hémoglobine avait le même genre de structure en saucisse, mais elle possédait quatre hèmes et sa structure était en polystyrène. Les deux structures se ressemblaient tellement qu’on croyait alors que toutes les protéines étaient comme elles.



2 . Des protéines toujours d’actualité.

L’hémoglobine a toujours été très étudiée : 2500 articles sont parus en 2004, et 4300 depuis début 2005. Beaucoup de ces articles sont des articles médicaux, qui ne concernent pas le fonctionnement des hémoglobines. Les hémoglobines sont des protéines de référence, car elles sont simples à obtenir et purifier. Leur intérêt médical est évident. Enfin, cette molécule est colorée, donc on peut utiliser plusieurs méthodes basées sur la couleur. Ce sujet d’étude est très ancien, mais il y a toujours de nouvelles choses trouvées.

II. Rôles des hémoglobines.

Une protéine n’a jamais une fonction unique.

1 . Fonctions physiologiques.

La famille des hémoglobines possède plusieurs fonctions physiologiques.

a : Le transport d’oxygène.

La principale fonction est le transport de l’oxygène. Son importance pour l’organisme est facile à comprendre : ces protéines assurent la distribution en oxygène dans tous les tissus. C’est en tout cas le rôle principal de l’hémoglobine A : qui va prendre l’O2 dans les poumons pour le libérer ensuite dans les différents tissus.

b : Le stockage d’oxygène.

Les myoglobines des mammifères servent à stocker l’oxygène dans les muscles. Elles ne le transportent pas dans l’espace , mais dans le temps. En effet elles sont capable de libérer l’oxygène en cas de besoin aigu.



c : La détoxification et encore d’autres fonctions.

Certaines hémoglobines végétales font de la détoxification pour maintenir des régions dépourvues en oxygène. Les carboxyhémoglobines font de la signalisation, ainsi que les neuroglobines chez nous. La famille des hémoglobines possède donc différents rôles , qui sont toujours en relation avec l’oxygène.

2 . Fonctions biochimiques : la liaison d’oxygène.

a : Saturation.

Du point de vue biochimique, la fonction de base des hémoglobine est de lier l’oxygène. Pour décrire cette liaison, on trace des courbes montrant la saturation qui change en fonction de la concentration en oxygène.

Lorsqu’il n’y a pas beaucoup d’oxygène, il y a peu de sites occupés. Lorsqu’il y a beaucoup d’oxygène, tout est saturé (la valeur atteint 1 ou 100%). Par contre entre ces deux situations : la courbe décrit la fonction biochimique. La saturation est fonction de la quantité d’oxygène.



b : Concentration en oxygène.

Les gaz en solution.

L’oxygène est dans l’air, tandis que les protéines sont en solution. Les concentration sont exprimées en mol/L, ce qui n’est pas facile pour les gaz. Or on travaille avec une protéine qui lie un gaz.

Plus la pression augmente, plus la concentration en gaz augmente. Plus la température augmente, plus la concentration en gaz diminue. L’air, constitué de 50% d’azote et 50% d’oxygène, est considéré comme un gaz idéal : l’oxygène représente une fraction de ce gaz.

Mesure de pression.

En pratique, on ajuste la quantité d’oxygène dans le gaz et dans la solution en mesurant la concentration en O2 par rapport à la concentration dans le gaz. C’est une mesure de pression partielle dans l’air, qui se situe normalement à 20%. Par contre, il existe plusieurs unités pour mesurer la pression : l’unité standard mais pas utilisée est le Pascal. On utilise plus couramment : l’atmosphère, les millimètres de Mercure (inventés par M. Trucelli : unité en Tor), les psi et les bar.

La pression partielle est d’environ 0,21 bar : mais cette valeur dépend beaucoup de la température. A haute température, l’oxygène est peu soluble, tandis qu’à basse température il est très soluble. Dans tous les cas, l’oxygène se retrouve toujours à des concentrations relativement faibles.



III. Structure de l’hémoglobine.

1 . L’hème.

a : Le spectre d’absorption.

L’étude des hémoglobines utilise souvent ses couleurs. En effet, il est facile de savoir si l’oxygène est lié ou non à la protéine : - le sang oxygéné (artériel) est rose. - le sang désoxygéné (veineux) est bleu ou pourpre. - le sang oxydé (exposé à l’air) est marron. L’état oxydé correspond à un changement du nombre d’électrons, tandis que l’oxygénation change le nombre de saturations. On peut observer ces différents états sur un spectre d’absorption.

L’oxyhémoglobine chute brutalement à 600nm et laisse passer la lumière après : d’où une couleur rouge. La désoxyhémloglobine a un pic à 450nm : elle absorbe moins le bleu et le rouge, par contre elle bloque la lumière verte, d’où sa couleur plutôt violette.

b : Structure de l’hème.

Ces changements de couleur sont dus à un cofacteur (l’hème) spécifique aux hémoglobines.



L’hème est essentiel pour la chimie de l’hémoglobine . Il a une structure polycyclique : il est composé de quatre motifs identiques liés par des ponts carbonés. De plus, deux types de chaînes sont reliées aux cycles. Au centre , on trouve quatre azotes liés à un atome de fer. La partie organique est appelée protoporphyrine 9. Le chiffre 9 correspond à la 9ème façon d’organiser les différentes chaînes. L’atome de Fer est un métal très réactif, plus que les éléments organiques, qui existe sous deux formes : - une forme réduite : FeII et FeI . On les trouve dans les formes oxygénée et désoxygénée des hémoglobines. - une forme oxydée : FeIII (ou oxyde ferrique) qui possède moins d’électrons. On la trouve dans la forme oxydée de l’hémoglobine .

2 . La protéine autour des hèmes.

a : Rôle des protéines.

Le cofacteur correspond au centre chimique de l’hémoglobine . La protéine joue un rôle important . Elle contient le cofacteur. Elle régule la chimie du cofacteur en évitant les réactions connexes. En effet, les cytochromes utilisent le même cofacteur pour transporter des électrons et non pas de l’oxygène. Elle régule l’accès à l’hème en évitant d’avoir d’autres molécule autour de l’hème. Elle maintient la solubilité de l’hème. Les globules rouges sont des petits sacs pleins d’hèmes. Sans les protéines, tous les hèmes précipiteraient entre eux.



b : Une structure complexe.

Une difficulté des protéines est qu’elles ont une structure compliquée : c’est une masse d’atomes arrangés de façon particulière. Pour comprendre le fonctionnement d’une protéine, il faut d’abord comprendre la place spécifique de chaque atome.

L’hémoglobine A est un tétramère, composé de deux chaînes différentes : a et b . Les chaînes a sont colorées en bleu et les chaînes b en rouge et jaune. Chaque chaîne possède un hème.

Même si il y a deux chaînes différentes, chaque monomère a une structure similaire. Les structures rencontrées se retrouvent aussi dans les myoglobines. Les chaînes se replient de la même façon : les boucles et les hélices se retrouvent aux mêmes endroits.



c : Les hélices a.

Les chaînes ne sont composées que d’hélices a, reliées par des petites boucles. Chaque chaîne est composée de 8 hélices a (notées de A à H), organisées en sandwich 3 sur 3 : 6 hélices se retrouvent sur deux plans . A, E et F constituent le plan supérieur ; B , G et H sont sur le plan inférieur. L’hème se retrouve coincé entre les hélices E et F. On regarde les résidus suivant leur position dans l’espace et non dans la chaîne linéaire. Si on compare des protéines ayant la même structure, on référence les résidus suivant l’endroit où ils se trouvent dans l’espace. Certains résidus sont importants pour la structure : - l’Histidine F8 : c’est le 8ème résidu de l’hélice F. C’est elle qui lie le fer de l’hème.

- l’Histidine E8, appelée aussi Histidine distale : elle est la plus éloignée de l’hème. Elle permet la liaison avec l’Oxygène.



Les autres résidus-clé pour la liaison de l’hème sont : la lysine E10 et l’Histidine CD3 (elle se trouve sur la boucle entre les hélices C et D). Ces aminoacides sont associés aux groupes basiques qui lient les acides pour bloquer l’hème au fond de sa poche.

Les aminoacides verts possèdent des résidus hydrophobes. Les hydrophiles sont en bleu pour les basiques et en rouge pour les acides . La structure des hémoglobines est typique d’une structure de protéine soluble .

3 . Les sous-unités.

a : La surface d’interaction entre les différents monomères.

Les sous-unités sont organisées en tétramère : c’est une organisation particulière. Les deux chaînes a sont en contact l’une à côté de l’autre, tandis que les chaînes b se trouve à côté des a. Les sous-unités b ne sont pas en contact direct : il y a un trou entre elles.



La surface d’interaction protéine-protéine est hétérogène. Les interactions sont de trois types : - des ponts salins entre des groupements positifs et négatifs. Il n’y en a pas beaucoup, mais ils sont importants. - des liaisons hydrogènes. - des liaisons hydrophobes.

Les régions hydrophobes se lient ensemble pour être plus stables : les interactions chargées apportent une grande spécificité aux protéines.

b : Similarité.

Les sous-unités sont similaires par différents aspects : - les séquences ne présentent que 43% d’identité , ce qui n’est pas beaucoup. - la distance moyenne entre deux atomes, lorsqu’on superpose deux structures, est de 2A : ce qui est plutôt correct (le mieux est aux alentours de 0,5A). Au sein d’une même famille, des protéines peuvent avoir seulement 4% d’identité, mais quasiment la même forme.



COOPERATIVITE

I. Modèle à un site de liaison.

1 . Etude de la saturation.

a : Modèle de la myoglobine.

Si on regarde l’affinité d’une protéine pour son ligand, on peut mesurer le taux de saturation de la protéine en fonction de la concentration en ligand. La saturation va de 0 à 1 (sur une échelle normalisée) : on ne peut pas dépasser une saturation totale. Pour la myoglobine (une protéine avec un seul site de liaison) on peut définir un équilibre entre deux molécules et sa constante d’équilibre K : K correspond à la constante du modèle.

Ce modèle nous permet de prédire la saturation (Y) de la protéine, suivant la concentration en oxygène. Le taux de saturation peut aussi être défini par K. Pour des raisons de facilité, on divise K par P50 : ce qui correspond à la concentration en oxygène à 50% de saturation.

On obtient une équation de prédiction pour savoir comment varie la saturation : on doit seulement connaître la valeur de P50.



b : Modèle équivalent pour l’hémoglobine.

Si on applique ce modèle à l’hémoglobine : il ne prédit pas bien le comportement de l’hémoglobine. La courbe expérimentale est différente de celle du modèle.

La forme de la courbe est : - une hyperbole pour la myoglobine : c’est une forme bien spécifique. - une sigmoïde pour l’hémoglobine. Les courbes ne sont pas ajustées : il faut trouver un nouveau modèle.

c : Effet sur l’hémoglobine.

Cette différence a un effet majeur sur le fonctionnement de l’hémoglobine. Si l’hémoglobine fonctionnait suivant le modèle proposé (en décrivant une hyperbole) alors : - la pression partielle en oxygène dans les poumons, permettrait à l’hémoglobine de charger un maximum d’O2 : 80% de saturation. - arrivée dans les tissus, l’hémoglobine doit libérer un maximum d’oxygène : la saturation diminue alors à 43%. Le transport a permis d’utiliser 40% de l’oxygène disponible.



La forme de sigmoïde permet de charger 100% de l’oxygène dans les poumons et de relarguer jusqu’à 25% de saturation. Cette forme permet d’augmenter la capacité de transport : qui atteint 75% . Ce phénomène est dû à la coopérativité.

La liaison d’un premier ligand a un effet sur la liaison d’un autre ligand : la liaison du premier permet d’augmenter l’affinité pour les autres. Cela se traduit par la forme sigmoïde : au début la protéine a du mal à lier le ligand, puis la saturation augmente très vite.

2 . Modèle de Hill.

a : Tous les oxygènes se lient en même temps.

Pour la myoglobine, on a défini l’équilibre suivant avec une constante d’équilibre K définie ci-dessous :

Le modèle de l’hémoglobine a été défini par Hill, en 1913 : tous les oxygènes se lient en même temps, ce qui modifie K. L’équilibre se traduit par un modèle thermodynamique du comportement : il n’y a plus besoin de décrire le mécanisme.

Ce modèle est légèrement plus compliqué, mais il traduit mieux le fonctionnement de l’hémoglobine.



On peut alors définir une nouvelle écriture pour la saturation :

Le modèle possède deux paramètres ajustables. Ainsi définit, il prédit bien une sigmoïde pour l’hémoglobine. Ce modèle a un bon pouvoir prédictif. La valeur n qui décrit au mieux le comportement est égal à 2,8 .

Problème : n devrait être un entier car il correspond à un nombre de sites.

b : Graphique de Hill.

On utilise aussi le graphique de Hill, qui date de 1910 : on utilise les logarithmes pour obtenir une droite. La pente de la droite correspond à n.

c : Les différentes valeurs de n.

La valeur de n est une mesure de la coopérativité : plus cette valeur est grande, plus la coopérativité est bonne. - si n>1 : la coopérativité est positive. - si n<1 : la coopérativité est négative : la liaison d’un ligand empêche la liaison d’un autre ligand.



Graphique de Hill pour différentes valeurs de n : - si n=1 , on obtient le même modèle que pour la myoglobine. - plus n est grand, plus la courbe de saturation est sigmoïde.

La courbe de titrage représente la saturation en fonction du log de la concentration en oxygène. Plus n est grand, plus la pente de la courbe de titrage est importante. Dans tous les cas, la sigmoïde est plus ou moins bien marquée.

Le modèle qui marche le mieux correspond à n égal à 2,8 :

3 . Problèmes.

Comment peut-on lier 2,8 oxygènes ? Pourquoi 2,8 alors que l’hémoglobine est un tétramère ? Il est difficile de réconcilier la structure avec ce modèle qui traduit un phénomène.



II. Modèle avec deux sites de liaison.

1 . Constantes d’équilibre.

a : K1 et K2.

La liaison d’un premier ligand se fait suivant la constante K1. La liaison du second ligand correspond à K2.

b : β1 et β2.

On peut aussi considérer le même système, mais la protéine peut soit lier un ligand (constante : β1), soit deux à la fois (β2) .

On peut lier les deux types de constantes d’équilibre, tant qu’on inclus toutes les composantes qui entrent en jeu.



2 . Prédictions suivant la concentration en ligand.

On peut toujours calculer la saturation à l’aide des nouveaux paramètres : la saturation est complète lorsque les protéines sont complètement liées. La saturation est fonction de K1, K2 et de la concentration en ligand.

Pour la courbe de Hill : Grande concentration en ligand : Faible concentration en ligand : Demi-saturation :

Graphique de Hill :

Le modèle s’est un peu complexifiée : la courbe croise l’axe des abscisses à 1,4 . De plus, cette courbe est légèrement sigmoïde et se trouve bloquée : elle n’augmente plus, passée une certaine concentration en oxygène. La saturation dépend uniquement des constantes d’équilibre K1 et K2.



3 . Vue moléculaire de ce modèle.

Au niveau moléculaire, il y a deux formes possibles lorsque le ligand se lie. Les sites A et B donnent plusieurs possibilités d’ordre de liaison du ligand.

a : Les deux sites n’interagissent pas.

Si la liaison sur le site A n’affecte pas la liaison avec le site B, alors on peut établir une relation entre les constantes d’équilibre entre les différentes formes :

Nota : si les deux sont équivalents alors on a

b : Les deux sites interagissent : le système coopératif.

La coopérativité sur un système à deux sites peut être appliquée, même si les deux sites sont équivalents. Au niveau macroscopique, on ne sait pas distinguer quel monomère a lié le premier oxygène. On ne peut distinguer le site A du site B qu’en observant le phénomène au niveau microscopique.



La coopérativité correspond à l’influence d’un site sur un autre. Il faut donc que les deux sites interagissent entre eux. Le KA dépend alors de la liaison d’un ligand sur le site B, mais les quatre équilibres doivent être équivalents :

Si la coopérativité est positive, la liaison du premier ligand favorise la liaison d’un autre ligand. Une voie sera préférée à une autre si sa coopérativité est positive.

4 . Mesure de la coopérativité.

L’indication que l’on doit regarder n’est plus le nombre de sites, mais l’influence de la liaison d’un premier ligand sur un second. Une mesure de la coopérativité est la pente à un taux de saturation de 50% de la courbe de Hill. Ce qui donne 2,8 pour l’hémoglobine.



III. Le modèle coopératif appliqué à l’hémoglobine.

Pour expliquer la coopérativité au niveau moléculaire, il faut plusieurs sites de fixation : l’hémoglobine en a 4, c’est un tétramère. Pour que la liaison d’un site change l’affinité d’un autre site, il faut que les différents sites interagissent entre eux : - si 2 sites sont proches : la liaison d’un ligand empêche la liaison d’un second ligand. En effet, il y a eu un recouvrement d’une partie du site. - si 2 sites sont éloignés : la structure doit être modifiée pour qu’il y ait une communication entre les deux sites. Un modèle coopératif pour l’hémoglobine est compliqué : - 4 sites de liaisons. - 16 possibilités différentes suivant si un site est lié ou non. - 32 constantes d’équilibre différentes pour relier toutes les formes.

Lorsqu’un ligand est lié, on a 4 formes possibles. Pour 2 ligands liés, on obtient 6 formes. Pour 3 ligands liés, on a 4 formes. De plus, on a une forme vide et une forme avec 4 ligands. Toutes ces relations n’aident pas à comprendre la fonction de l’hémoglobine. Pour établir un modèle, on part d’un modèle simple et on le complique petit à petit jusqu’à atteindre certaines limites. Au bout d’un moment, un modèle devient trop compliqué pour obtenir des informations intéressantes. On cherche un autre modèle pour simplifier celui-ci tout en restant juste.



LES MODELES ALLOSTERIQUES Le modèle allostérique est plus compliqué que le modèle coopératif. Pauling, en 1935, a établit le premier ce type de modèle. Il l’a fait à partir d’une construction mathématique, qui n’explique pas le comportement fonctionnel de la protéine. Wyman a lui aussi mis en place un modèle, qui sera ensuite spécialisé par Monod et Changeux. Le modèle final est appelé : modèle de MWC (1965).

I. Le modèle MWC.

1 . Les deux conditions du modèle.

a : Formes T et R.

La description minimale d’une hémoglobine, qui a un fonctionnement correct, nécessite deux choses : - quatre sites de liaison. - un système coopératif : donc plusieurs formes différentes permettant une communication inter-sites. Le modèle le plus simple qui lie ces deux propriétés est constitué de : - 4 formes identiques. - 2 conformations possibles appelées : tendue (T) ou relâchée (R).



b : Interactions entre les sites.

Les quatre sites sont identiques et indépendants : il n’y a pas d’interactions entre les sites . Les interactions inter-sites se font à travers des changements conformationnels.

2 . Les constantes d’équilibre.

a : Trois constantes de base.

On a définit trois constantes d’équilibre : - KT permet la liaison d’un oxygène sur un monomère de la forme T. - KR permet la liaison d’un oxygène sur un monomère de la forme R. - L0 représente l’équilibre entre les formes T et R en absence de ligand.

Ces trois constantes permettent de relier toutes les formes différentes que l’on peut rencontrer.

b : Explication par les constantes de vitesse.

On peut diviser le KR en deux constantes de vitesse : kf et kd, pour traduire la formation et la dissociation de la liaison du ligand. KR correspond alors au rapport de ces deux vitesses.



Pour la liaison du premier ligand, il y a quatre sites disponibles. Si il y a 4 sites alors il est quatre fois plus simple de lier le ligand sur un site : nous avons donc 4.Kf . Par contre, la dissociation n’a pas le choix : un seul site peut être dissocié, donc 1.Kd . Or KR = kf/kd , donc le premier équilibre se traduit pas (4/1).KR = 4.KR

c : Un système d’équilibres couplés.

On retrouve alors les différentes proportions entre les formes possibles. Par contre pour passer de la forme T sans O2 à la forme R avec 1 O2, il existe deux voies possibles qui doivent être équivalentes. D’où L0 . 4KR = 4KT . L0 . c

On arrive à un système d’équilibres couplés, qui se base sur un système de trois équilibres de base.



II. Comment paramétrer le modèle ?

1 . Une fonction de partition.

Si on part d’une concentration en oxygène donnée, on peut utiliser le rapport des concentrations en protéines en amont et en aval. Les nouvelles équations permettent de décrire les relations entre les différentes formes de la protéine. La fonction de partition correspond à une transformation qui permet de calculer une description des concentrations relatives des différentes formes de la protéine. KT ne dépend pas de la concentration en ligand ou en protéine : c’est une constante. Par contre α varie en fonction de la concentration en oxygène, sans être influencée par la concentration en protéine. On prend une forme de référence (généralement la première à gauche) qui est égale à 1. Puis on fait le rapport entre la forme voulue et la forme de référence. On obtient alors les proportions des différentes formes.

Cette fonction de répartition permet de relier le modèle aux différentes mesures expérimentales.



2 . Calcul des différents paramètres.

Grâce à cette fonction de partition, on peut prédire quelle forme se trouve en solution. On peut aussi prédire la saturation ou encore les proportions de la forme T.

III. Les prédictions du modèle.

1 . Ajustement des paramètres pour la saturation.

A l’aide des différents paramètres (L0, c et α), on peut prédire le comportement du modèle. Il faut maintenant ajuster les paramètres pour avoir des prédictions qui correspondent aux résultats expérimentaux.

α donne une idée de la dépendance à l’oxygène de la molécule. Plus KT est faible, plus l’affinité avec l’oxygène est faible.



L0 = 0,0001 c = 70 KT = 0,014 Torr

-1 KR = 1 Torr

-1

2 . Proportion des différentes formes.

La forme T est en bleu . La forme R est en rouge. En vert est représentée la courbe de la saturation.

En présence d’oxygène, on passe très rapidement de la forme T à la forme R. Les courbes des fractions dépendent des paramètres L0 et c .

3 . Proportions suivant la saturation des sites.

La forme sans O2 est en bleu . La forme à 4 O2 est en rouge. Les formes à 1, 2 et 3 O2 sont en rose. La saturation est en vert.

Les formes intermédiaires, où il y a peu d’oxygène, sont en très faibles proportions par rapport aux formes extrêmes.



IV. Ce modèle est-il raisonnable ?

1 . Les bases du modèle.

Ce modèle est basé sur deux suppositions : - les 4 sites sont identiques et indépendants. - il existe deux formes différents T et R , sans intermédiaires. Le modèle thermodynamique fonctionne : toutes les formes, présentes en conditions raisonnables, doivent apparaître dans les prédictions. Mais peut-on, par exemple, incorporer les effets de modulateurs, qui changent l’affinité des protéines ?

2 . Quatre sites identiques et indépendants ?

a : Des sites identiques.

La protéine est constituée de deux chaînes α et de deux chaînes β. Ces deux types de chaînes se ressemblent beaucoup.

Lorsqu’on aligne ces deux types de chaînes, on obtient un écart (rmsd) de 2,1A en moyenne entre les positions des atomes. Les différences se trouvent surtout au niveau des boucles. Les cœurs qui entourent les hèmes ont une rmsd proche de 0,8A .



Les deux types de chaînes présentent donc une identité importante : surtout au niveau du site actif. Les quatre sites sont donc considérés comme identiques, malgré une approximation. Les sites α paraissent plus affins que les sites β. Mais cela ne change pas grand-chose : le premier site occupé est normalement un site α.

b : Des sites indépendants.

Les quatre sites de liaison sont éloignés dans l’espace. A part à travers un changement de structure, les sites ne peuvent pas communiquer directement. Ils sont donc considérés comme indépendants.

3 . Les formes T et R.

On sait qu’il existe deux structures (T et R) car ces deux structures ont pu être cristallisées : d’abord l’oxyhémoglobine puis la déoxyhémoglobine.

Lorsqu’on ajoute de l’oxygène à un cristal de déoxyhémoglobine, il explose : ceci confirme le changement de structure de l’hémoglobine face à l’oxygène. L’organisation globale de la protéine est différente, mais l’axe de symétrie entre les paires de sous-unités α-β persiste. La structure des différentes sous-unités est conservée entre les deux formes : il y a donc eu un changement dans l’agencement des sous-unités.



Ce changement d’agencement peut être mesuré : la différence entre les sous-unités a d’une forme à l’autre est de 0,57A . La différence entre les structures b est de 0,88A. Les changements entre les deux structures sont donc de faibles amplitudes et relativement localisés. Les deux sous-unités de chaque forme sont « identiques » : seule la structure globale change. Les deux sous-unités β semblent s’écarter. Le changement de conformation n’est pas un système hiérarchisé.



STEREOMECANIQUE ET STEREOCHIMIE Comment une petite molécule ( MR de l’oxygène = 32 ) peut changer une très grande protéine ( MR = 67 000 ) ? C’est un problème mécanique important car l’oxygène permet de passer de la forme T à la forme R, tout en augmentant l’affinité de l’hémoglobine pour l’oxygène. C’est aussi un problème chimique qui met en jeu des protons et des électrons : certains évènements permettent de changer une structure.

I. Chimie du Fer.

1 . Orbitales et formes.

a : Les orbitales du Fer.

Le Fer a 5 orbitales, donc il peut fixer entre 5 et 6 électrons. Les orbitales dégénérées ont une énergie qui se distribue de façon uniforme. Sans oxygène, on fixe 6 électrons : on a donc 5 orbitales équivalentes. Le sixième électron est apparié avec le premier. On a un système à haut spin. Avec de l’oxygène, on a 6 électrons qui se placent dans les trois orbitales dégénérées de type Tg. Les électrons s’apparient, alors on a un spin égal à 0. (Les spins se retrouvent dans les systèmes de navigation par champ magnétique.)

On a un effet sur l’absorption car l’énergie des orbitales totales est identiques, mais les orbitales Tg ont une énergie plus basse. D’où un changement de couleur de l’hémoglobine.



b : La forme du Fer.

Le Fer ayant 5 orbitales a une forme sphérique, il peut lier le ligand n’importe où : toute sa surface est homogène. Par contre, lorsque les orbitales Tg sont occupées, alors on a une déficience en électrons qui rend l’atome cubique. Le ligand ne peut se lier que sur les faces du cube.

La position du Fer dans l’hème varie suivant son état : - si le Fer est sphérique, alors il se trouve dans le plan de l’hème. Il est légèrement déplacé par rapport au centre de l’hème. - si le Fer est cubique, il est plus difficile de le sortir du plan de l’hème. En effet, les atomes d’azote de l’hème sont contraints à rester dans le plan, d’où une obligation du Fer à rester dans le plan lui aussi.

La position du Fer dépend du type de ligand qu’il lie.

2 . Fixation de ligands.

a : Une orientation qui influe sur la forme des atomes.

Un ligand positif aura une certaine orientation. Une liaison covalente entre le fer et le ligand est une liaison de type S (de centre à centre). Les trois orbitales Tg se dirigent entre les différents ligands. Un ligand très négatif favorise ce type d’orbitale. On a un jeu de positions par rapport au Fer. Il faut faire attention à la direction des différents points.



Les électrons se placent différemment, suivant les interactions avec un ligand certaines orbitales seront favorisées. La forme de l’atome sera alors changée.

b : Les ligands forts et faibles.

Les ligands ont une énergie relative différente : - les ligands axiaux sont plus forts car leur liaison favorise les orbitales Tg. Ils montrent une grande différence entre les orbitales Eg et Tg. Exemples de ligands forts : le cyanure (négatif) et l’oxygène. - les ligands faibles lient mal le fer, car il n’y a pas de différences entre les énergies des différentes orbitales. Exemples de ligands faibles : rien ou l’eau.

II. Mécanique de l’hémoglobine.

1 . Différents petits déplacements.

a : Liaison de l’oxygène sur le Fer.

Lorsque le Fer est hors du plan, il peut avoir 5 ligand autour de lui, qui se distribuent de façon homogène. Le Fer se lie alors à l’Histidine proximale. Lorsque l’oxygène se fixe, il peut normalement se lier de partout. Par contre une fois fixé, le ligand étant de type fort, le fer doit rester dans le plan de l’hème, de façon rigide. La liaison avec l’Histidine est forte. L’hème est coincé dans la protéine, donc si le Fer doit se déplacer c’est lui qui bouge et non l’hème. Du coup, lorsqu’il bouge il tire vers lui l’Histidine proximale.



b : Mouvements d’Histidines.

L’hème contient une autre Histidine (l’Histidine distale) qui bloque l’accès de l’oxygène au fer, car il n’a pas assez de place. Pour permettre la liaison avec l’oxygène, le fer doit se déplacer vers le haut, en même temps que l’hème. L’Histidine proximale est obligée de suivre le Fer, donc elle se déplace aussi : c’est un petit mouvement d’environ 0,5A.

c : Mouvement de l’hélice F.

L’Histidine entraîne avec elle l’hélice F car elle y est fortement liée. L’hélice F bouge de façon similaire au Fer : on a une même échelle de distance qu’une liaison entre deux atomes.

Il existe une liaison hydrogène entre l’hélice F et l’avant-dernier nucléotide de la chaîne (une Tyrosine). La Tyrosine rentre dans la protéine et forme une liaison entre son OH et le CO d’une liaison peptidique de l’hélice F. Pendant le déplacement de l’hélice F, la liaison hydrogène n’est plus dans une position favorable : l’hélice et la tyrosine sont alors trop éloignés : le donneur de liaison hydrogène n’est plus satisfait, la liaison est rompue.



2 . Les extrêmités C-terminales.

a : Modifications à cause des mouvements.

Libérée, la Tyrosine sort de la protéine pour trouver un autre accepteur d’électrons, lui permettant de former une nouvelle liaison.

La Tyrosine est piégée de façon rigide dans la protéine, cela permet de structurer le dernier résidu de la chaîne. Du coup, sans liaison, il y a une déstructuration de dernier résidu aussi : le C-terminal est modifié. Des petits déplacements autour de l’hème ont finit par libérer le C-terminal, qui joue un rôle très important pour toute la protéine.

b : Rôles dans la sous-unité β.

Sur la sous-unité β, le dernier résidu est une Histidine, impliquée dans deux interactions : - une interaction de type ionique : elle forme un pont salin avec un résidu aspartate de la même sous-unité. - une liaison entre le C-terminal d’un poylpeptide et la lysine de la sous-unité α qui se trouve à côté. Les interactions de cette histidine sont interprotéiques et intraprotéiques.



c : Rôles dans la sous-unité α.

Sur la sous-unité α, les interactions du dernier résidu sont similaires, c’est une arginine impliquée dans deux ponts salins : - un avec un aspartate d’une autre sous-unité α. - un avec une histidine d’une sous-unité β.

On obtient un système de liaisons très fortes entre les différents morceaux. Il y a de bonnes interactions entre les chaînes latérales des deux sous-unités.

III. Influence de la liaison d’oxygène.

1 . L’oxygène déstabilise la forme T.

Lorsqu’il y a oxygénation des sous-unités β, on déstabilise sa liaison avec la sous-unité α. De même, lorsqu’un oxygène se fixe sur une sous-unité α, on casse les deux interactions ioniques entre les sous-unités α. Chaque oxygénation permet de briser les liaisons qui maintiennent la structure de l’hémoglobine. La forme T est maintenue sous tension par 6 liaisons ioniques. La forme R résulte de la déstabilisation des 6 ponts salins, responsables du maintient de la structure en forme T. Si on lie un oxygène, il faut casser la liaison avec la Tyrosine. La cassure des ponts salins dépend de la transition entre les formes T et R .

En observant la structure d’une sous-unité α, on peut expliquer la transition entre les deux formes pour une sous-unité. La fixation d’oxygène engendre des petits déplacements qui peuvent amener à la cassure de ponts salins.



2 . Passage de la forme T à la forme R.

On doit maintenant pouvoir faire passer tous les tétramères de la forme T à la forme R, en même temps. Pour passer de T à R sans oxygène, il faut casser les 6 ponts salins qui maintiennent la structure en forme T. Ce qui est défavorable car les différentes structures sont bien imbriquées. Par contre, la forme T oxygénée possède toujours des ponts salins, mais qui peuvent s’ouvrir plus facilement. La transition est donc plus favorable , car il n’y a pas de raisons de retenir la Tyrosine à l’intérieur de la protéine.

Les deux équilibres sont donc reliés : l’oxygénation facilite la transition de T vers R et vice-versa. La destructuration entraîne un gain d’énergie : donc l’oxygénation est favorisée.

3 . A quoi correspondent les différentes constantes ?

Pour passer de T à R sans oxygène, la constante d’équilibre est égale à c4L0. Pour chaque transition qui inclue une déstructuration du C-ter, on fait entre un « facteur c » en jeu. Cela correspond au gain d’énergie venant de la déstructuration de la molécule : KR

4 = KT4 . c4



L0 correspond au changement de structure quaternaire : c’est en fait la cassure des liaisons entre les différentes sous-unités. KT4 entre en jeu lorsqu’on lie l’oxygène : cela correspond à la cassure des

liaisons hydrogène des Tyrosines. KT4.c4 entre aussi en jeu lorsqu’on lie l’oxygène : cela correspond à la

cassure des liaisons hydrogène des tyrosines et à la libération du résidu C-terminal. Du coup, la différence entre KT

4 et KT4.c4 correspond à la libération des

C-terminaux. Le Facteur c correspond donc à ce phénomène. C4.L0 correspond à la cassure des liaisons entre les sous-unités et à la libération des C-terminaux. Ce cycle correspond à une série de changements, associés à différentes constantes. Le facteur c correspond à la différence entre les formes à haute énergie et les formes à basse énergie.

4 . Simplement une question d’énergie.

Si la forme R est plus affine pour l’oxygène que la forme T, c’est que la transition de T à R augmente l’affinité pour l’oxygène. L’énergie libre correspond à :

∆G° = - RT. Ln Keq Sans oxygène, on préfère la forme T à la forme R. Par contre, en présence d’oxygène, on préfère la forme R à la forme T . C’est toujours la forme à plus basse énergie qui est choisie.

On peut comprendre le rôle des différents morceaux de la protéine pour la fonction. Cela explique pourquoi on ne considère que deux structures.



EFFET DES MODULATEURS Différents paramètres de l’environnement peuvent influencer le comportement d’une protéine. Pour l’hémoglobine, il existe plusieurs modulateurs : - le CO2, le pH ou encore de le BisPhosphoGlycérate, qui ont un effet d’environnement. - l’eau, qui a un effet physique. L’importance de ces effets a été intégré à notre modèle.

I. Effet du CO2.

1 . L’effet Bohr.

Le CO2 diminue l’affinité de l’hémoglobine pour l’oxygène. Cela est dû à l’effet de Bohr, décrit en 1904 par M. Christian Bohr. Le rôle physiologique du CO2 est important, car si on diminue l’affinité de l’hémoglobine, alors on augmente la capacité de transport de l’oxygène. On arrive à obtenir 95% de saturation.

Le problème, c’est qu’il y a plus de C02 dans les tissus que dans les poumons. On décharge l’hémoglobine, ce qui provoque l’effet « bleu ». Ceci permet d’augmenter la capacité de transport de l’oxygène : on modifie alors la courbe de saturation. Le CO2 permet donc d’augmenter la capacité de transport de l’oxygène.



2 . La liaison avec le CO modifie la capacité de transport.

a : L’équilibre des formes T et R est modifié.

Ce phénomène est lié à la capacité de l’hémoglobine à lier l’oxygène. En effet, l’hémoglobine peut aussi lier d’autres molécules, comme le CO. C’est la forme T qui lie le mieux le CO2 : donc l’équilibre entre les formes T et R est modifié.

Le CO2 stabilise la forme T, ce qui normalement diminue l’affinité pour l’oxygène. Toutes les protéines sont capables de réagir avec le CO2. La structure se modifie : on passe d’un groupement NH2 (+) à un COOH (-).

b : Des interactions électrostatiques favorisées.

La réaction permet de changer une lysine (+) en lysine-carabamylate (-) : c’est une réaction chimique simple, qui peut être considérée comme une modification post-traductionnelle, ou une réaction parasite. L’hémoglobine peut être carbamylée en plusieurs points sur sa surface. Certaines amines favorisent la forme T à travers des interactions électrostatiques. Environ 14% du CO2 qui se trouve dans le sang veineux est transporté par l’hémoglobine. C’est donc un effet important, sans pour autant être majeur. Un peu plu d’une hémoglobine sur 2 possède en moyenne 1 carbonylate : il y a donc 50% des hémoglobines qui sont modifiées par le CO2.



3 . Intégration au modèle MWC.

Cet effet de CO2 est mal intégré dans le modèle MWC, car ce modèle ne présente que deux états possibles pour le ligand. Comment se comportent les formes T et R en présence de CO2 ? En effet, tous les sites ne sont pas exactement identiques, notamment au niveau de leurs amines.

Si on fait un calcul avec n sites définis, alors on obtient les mêmes constantes qu’avant.

On a aussi les mêmes relations entre les différentes formes, pour la fonction de répartition.



On peut faire une simplification de la formule en faisant la somme des différentes formes T et formes R. Ce qui nous intéresse, c’est l’équilibre des effectifs entre les formes T et R : c’est le facteur Leff.

4 . Un système à multiples équilibres liés.

L’analyse classique d’un système à plusieurs équilibres, correspond à l’analyse de l’effet de n’importe quel ligand sur notre système. L’effecteur (le ligand) permet de changer l’affinité de l’hémoglobine, ce qui modifie le rapport des formes T et R. Si on constate des modifications de comportement en présence de l’effecteur, alors on sait que Leff est différent de L0. Le facteur c doit donc être différent de 1, pour que Leff soit différent de L0. Le ligand a alors une affinité différente pour la forme T et la forme R. Cet effet change donc l’affinité du ligand sur le système. La concentration en ligand, ou en modulateur, modifie l’équilibre entre les formes T et R.



II. Effet du pH.

1 . L’effet des protons est associé à la présence de CO2.

La liaison de l’oxygène dépend du pH : plus le pH augmente, plus l’affinité de l’hémoglobine augmente. Cet effet est important, car il est associé à l’effet du CO2 à travers l’anhydrase carbonique.

L’affinité est diminuée là où se trouve le CO2, c'est-à-dire dans les tissus. Les modulateurs permettent de changer les équilibres associés aux hémoglobines.

A pH acide, il y a peu d’effets : l’hémoglobine reste toujours en basse affinité. Le P50 demeure trop élevé. A pH physiologique, il y a une diminution du P50. A pH alcalin, il y a peu d’effet car on a toujours une très haute affinité.



2 . L’effet de pH modifie l’équilibre des formes T-R.

L’effet du pH se situe entre 20 et 130 Torr : cela correspond à un facteur de 6,5 sur l’affinité. L’effet se trouve principalement au niveau du L0, c'est-à-dire l’équilibre entre les deux formes T et R.

En conditions acides, c’est la forme T qui est favorisée. En conditions basiques, c’est la forme R qui est favorisée. Si on modifie le pH, alors on modifie l’équilibre entre les formes T et R. Tout ce qui touche à l’affinité correspond à un système d’équilibres multiples (équilibre des formes, équilibre des modulateurs, …). La forme T a plus d’affinités pour les protons que la forme R, car les protons favorisent cette forme.

3 . Un changement d’ionisation.

a : Etude des pKa.

Si les protons ont une influence, on pense plus aux pKa : la forme T a un pKa plus grand que celui de la forme R. Mais cela n’affecte pas le comportement de l’hémoglobine : les pKa changent simplement entre les formes T et R. L’ionisation des chaînes latérales à la surface de la protéine n’ont pas d’influence sur l’affinité, mais cela va modifier la transition entre les deux formes. Si les mêmes groupements étaient ionisés dans les deux formes, il n’y aurait pas d’effet provoqué par les protons, donc pas d’effet de pH.



b : Une mesure des pKa par RMN.

Pour mesurer les pKa des groupements ionisables d’une protéine, il faut déterminer quels groupements sont ionisés et ensuite l’effet du pH sur chacun d’eux. Une mesure performante se fait par RMN sur les protons. On voit facilement si des protons sont attachés ou non à certains groupements. Par défaut, le temps de mesure de la RMN est long (de l’ordre des ns). Mais pendant ce laps de temps, un proton peut se dissocier et se réassocier. Le temps de mesure est donc trop long pour étudier l’effet de pH. On recherche des protons proches des groupements ionisables : ces protons ne bougent pas dans la protéine, ils ne se déplacent pas.

c : Spectroscopie Infrarouge.

Ce n’est pas l’unique méthode qui donne de très bons résultats avec l’hémoglobine. La spectroscopie InfraRouge peut aussi être utilisée sur les carboxylates : le temps de mesure est très court. C’est une autre technique qui permet d’observer d’autres groupements, mais c’est très difficile de définir chaque type. On a donc souvent recours à un marquage des différents groupements à étudier.

4 . Mesure des pKa des Histidines.

a : Pourquoi les Histidines ?

La RMN est efficace pour voir les pKa des Histidines (autour de 6), qui jouent souvent un rôle important dans le comportement des molécules. En effet, la résonnance du proton du Cε est très sensible au nombre d’électrons du cycle aromatique.



En conditions acides, le signal montre un grand déplacement chimique suivant la protonation de la protéine. A des pH intermédiaires, le déplacement est lent, ce qui correspond à une protonation rapide. Le déplacement de chaque Histidine est différent, car elles se trouvent toutes dans un environnement différent. On obtient des courbes de titrage différent pour chacune des Histidines. Par contre, il faut pouvoir identifier quel pic correspond à quelle protéine ?

b : Etude de l’Histidine du C-Ter de la sous-unité β.

Ici, nous avons supprimé les Histidines de la sous-unité α. Le pKa de l’Histidine du C-Ter de la sous-unité β varie beaucoup : il passe de 7,1 en forme R, à 8,5 en forme T. Normalement, le pKa en solution de l’Histidine est égal à 6 : le déplacement du pKa montre différentes amplitudes.

Les courbes de titrage montrent un déplacement chimique en fonction du pH. Les positions de départ et d’arrivée sont différentes d’une Histidine à une autre. Il faut donc bien suivre le signal de chaque Histidine.

Les pKa sont éloignées des valeurs normales que l’on peut trouver pour des Histidines.



5 . Variations de pKa.

a : Des pKa qui dépendent de l’environnement.

Le pKa peut être modifié par certaines interactions, car l’Histidine se trouve au milieu d’une protéine et non isolée. Les déplacements de pKa donnent des indications sur les interactions des groupements ionisables avec l’environnement. On connaît le pKa de certains groupements ionisables : - 4,4 pour l’Asp et la Glu. - 6,5 pour l’His. - 10,0 pour la Lys, la Tyr et l’Arg. Ces valeurs peuvent varier de ±0,5 : ces variations dépendent du témoin utilisé pour faire la mesure.

b : Le pKa est caractéristique de l’environnement.

Un groupement ionisable a un pKa caractéristique de son ionisation. Si le groupement AH n’est pas isolé, il aura une interaction avec son environnement. On a alors un équilibre entre le groupement protoné isolé et le groupement dans son environnement naturel. On associe souvent au pKa, une constante d’équilibre et une énergie libre d’interaction entre le groupement et son environnement. On trouve la même chose avec le groupement ionisé A-. On obtient alors un cycle thermodynamique avec trois équilibres définis. On a donc un équilibre entre les formes AH et A- dans leur environnement.



c : Effet de pH sur le pKa.

Durant la protonation, le pKa est lié au ∆G°. On recherche donc dans notre système, à quoi correspond le ∆G° de la dernière réaction. Ce qui nous intéresse, c’est le changement de pKa lorsqu’on passe dans un environnement protéique. Le changement de pKa est un témoin des différentes interactions avec l’environnement des formes protonées et déprotonées. On veut maintenant mesurer la force de ces interactions.

6 . Interactions avec l’environnement.

Il existe différents types d’interactions qui affectent la stabilité d’une forme chargée.

a : Ponts salins et liaisons hydrogène.

Ces interactions existent seulement dans les formes chargées, et non dans les formes neutres. Les interactions stabilisantes vont diminuer le pKa des groupements acides, il est plus difficile de mettre des protons sur un acide. De même, il va augmenter le pKa des bases, qui sont facilement protonables. Dans notre cas, l’Histidine interagit dans ce type de relation. D’autres interactions stabilisent les formes non chargées, comme l’enfouissement dans une région hydrophobe, des interactions hydrophobes, des variations de pKa contraires.



Un déplacement de pKa d’une telle ampleur ne peut marcher qu’en introduisant des interactions très défavorables dans la forme protonée, mais cela peut entraîner l’explosion de la molécule.

b : Une modification importante.

La comparaison entre les structures des formes T et R donne une indication sur l’ampleur des modifications des acides aminés. L’effet de pH est important sur les Histidines : la chaîne latérale interagit avec l’Aspβ94, mais uniquement dans la forme T. Cette interaction étant favorable, le pKa est plus élevé dans cette forme.

On devrait faire le même type de mesure avec l’Asp : si c’est cette interaction qui correspond à l’effet de pH, alors on devrait avoir la même amplitude de déplacement que pour l’Histidine. C’est l’effet principal, mais il y en a d’autres. Les protons interagissent de façon un peu particulière avec les protéines, par rapport à d’autres modulateurs.

III. Le BisPhosphoGlycérate, ou BPG.

1 . Effet du BPG.

D’autres modulateurs sont importants au niveau physiologique, comme le BPG. Il provoque une diminution de l’affinité de l’hémoglobine pour l’oxygène.



L’effet est important pour l’acclimatation d’un organisme en altitude. Ce modulateur permet une variation rapide : c’est une modulation efficace. Les modulateurs sont importants, car ils changent le P50 de l’hémoglobine pure. C’est donc un grand effet naturel important.

2 . Interaction du BPG avec l’hémoglobine.

Le système est simple au niveau fonctionnel : le BPG se lie dans le trou entre les sous-unités b, qui n’existe que dans la forme T. Le BPG est un polyanion possédant 5 charges négatives : il est très acide. Il interagit avec l’amine terminale de la sous-unité β et une glycine.

3 . La liaison du BPG favorise la forme T.

a : Une forme R défavorisée.

Ces deux groupements positifs se trouvent sur les deux sous-unités β : ils forment des interactions ioniques dans la forme T. Il n’y a pas d’affinité avec le BPG dans la forme R, car il n’y a plus de place.



Mais l’équilibre n’est pas totalement interdit : il n’y a pas d’équilibre 0, sinon l’énergie serait infinie. L’espace n’est pas assez grand, donc cela va coûter beaucoup d’énergie pour fixer le BPG dans la forme R, c’est donc un évènement très défavorable.

b : Effet du pH sur le BPG.

A l’aide des pKa, nous avons déterminé que plusieurs phosphates sont impliqués, certains se trouvent dans des zones de pH physiologiques. L’effet additionnel des pH sur le BPG va modifier la charge du ligand. Or les interactions du ligand avec la protéine sont ioniques, d’où un effet de pH sur les liaisons du ligand. Cela induit une complication du modèle si on fait entrer tous les effets en même temps : le système deviendrait ingérable si il y avait beaucoup d’équilibres. Les effets de pH sur l’Histidine et le BPG sont différents, et donc assez facilement dissociables. Pour comprendre ce qu’il se passe, il faut séparer les différents effets.

4 . Effet général d’un modulateur.

Il existe plusieurs modulateurs, qui sont importants ou non. L’affinité de l’hémoglobine et la transition entre les formes T et R est modulée, si les conditions changent pendant la transition. Tout ce qui va se lier différemment entre les formes T et R va influencer l’affinité de la protéine. On peut augmenter le nombre de sites de liaison d’une forme à l’autre, ou encore changer l’affinité des sites. Si un site lie un polyanion, tout ce qui peut interagir avec ce site peut changer l’affinité de l’hémoglobine ou du BPG. Toute molécule importante, est une molécule qui peut moduler l’affinité lorsqu’elle est à des concentrations physiologiques. Il ne faut pas perdre de vue la physiologie, sinon ce n’est pas intéressant pour l’étude du comportement de la cellule.



IV. L’effet de l’eau.

1 . La forme R est plus sensible à l’eau.

Certains ligands peuvent renseigner sur la structure et la fonction, mais en dehors des gammes physiologiques. L’eau se lie différemment sur les formes T et R : elle se lie à la surface pour former la couche d’hydratation. Or cette surface est différente suivant la forme que l’on prend en compte. En forme T, il y a moins de surface exposée au solvant qu’en forme R. Sans le BPG, il y a plus de surface exposée qu’avec celui-ci.

2 . Un modulateur concentré.

Normalement on travaille en conditions diluées, mais il y a beaucoup plus d’eau dans les globules rouges, qu’en conditions physiologiques. Si la forme R est avide en eau, alors la forme T est favorisée dans les globules rouges car il y a moins d’eau. On regarde maintenant les contraintes imposées par une quantité d’eau limitée. Lorsqu’il y a peu d’eau libre, on favorise le relarguage de l’eau de surface. La solution concentrée va défavoriser la transition vers la forme R. C’est un des aspects de la physicochimie cellulaire : on travaille en solutions concentrée (peu d’eau et beaucoup de protéines). Les transitions sont ralenties, ainsi que les réactions. Lorsqu’il y a peu de solvants, la concentration en produits est plus élevée. La concentration en molécules a des effets cinétiques et thermodynamiques : mais ce sont les limites du modèle. L’analyse d’un système à équilibres est facile à paramétrer. Mais le modèle MWC est incapable de prédire le comportement cinétique de l’hémoglobine. Par exemple, comment la vitesse d’oxygénation varie en fonction de la concentration en oxygène ? Il n’y a pas de prédictions cinétiques, mais ce modèle est tout de même utile.



AU-DELA DU MODELE MWC

I. Un modèle qui n’explique pas tout.

Il existe deux types de polypeptides, donc deux sites de liaisons différents. Le modèle se base sur quatre sites identiques : ces sites présentent-ils réellement des différences ? Les deux formes R et T possèdent des structures quaternaires différentes. Il est difficile d’accepter un passage aussi facile entre ces deux structures. La cinétique est très mal expliquée par ce modèle : ce sont les changements du taux de saturation, le fait de suivre le ligand, … Les points essentiels et l’approximation sont admis pour un modèle. Pour qu’il fonctionne à l’équilibre, toutes les espèces présentes en solution doivent y être représentées. Le modèle MWC permet de montrer ces différentes formes. Mais il ne montre pas quelle sous-unité est utilisée. Aussi on ne connaît pas les espèces transitoires entre les formes R et T : on ne les voit pas à l’équilibre.

II. Modèles QTS versus TTS.

1 . Les modèles TTS..

Il existe d’autres modèles expliquant le fonctionnement de l’hémoglobine. Le modèle MWC fait partie des modèles QTS : on pense que les structures quaternaires sont très liées.



Il y a deux étapes pour changer de structure. La liaison dépend donc de la structure quaternaire. Il existe d’autres types de modèles : les modèles TTS. On sépare les changements d’états tertiaires et quaternaires : chaque polypeptide peut se modifier indépendamment des autres. Ici, la liaison de l’oxygène dépend de l’état tertiaire de chaque sous-unité. Ce modèle suit peut-être plus finement le fonctionnement de l’hémoglobine, mais il est plus complexe.

2 . D’autres structures prises en compte.

Le modèle MWC ne prend en compte que deux structures possibles : l’état R ou l’état T. Dans le système TTC, toutes les combinaisons pour les deux sites sont possibles. Même si la structure quaternaire est T ou R, les structures tertiaires pour chacun des quatre sites peuvent être T ou R (bleue ou rouge). On obtient alors différentes structures, sans faire la distinction entre les sous-unités α et β.



3 . Plusieurs constantes d’équilibre.

Dans un modèle de style TTS, on peut définir 5 constantes d’équilibres différentes : - une pour le changement de structure quaternaire. - deux pour les changements de structures tertiaire des polypeptides, suivant l’état de la structure quaternaire. - deux pour la liaison d’oxygène, qui dépend de la structure tertiaire de la protéine.

Il y a toujours une constante d’affinité pour les formes R et T, ainsi qu’une constante d’équilibre pour basculer d’une forme à l’autre. Si ces intermédiaires sont présents dans la solution, alors on a un modèle plus compliqué, mais plus juste.

4 . Des modèles qui se rejoignent quand même.

Par contre, si on ajuste ces paramètres, on peut retomber sur le modèle MWC. En effet, tous les carrés auront tendance à être sous forme rouge et tous les ronds à devenir bleus. Les autres intermédiaires sont quasiment inexistants.



A l’équilibre, on peut simplifier la fonction de partage, mais ce n’est pas toujours gérable.

On a une série de valeurs correspondant le mieux à l’hémoglobine. Il y a deux paramètres qui sont importants, et pourtant ils sont absents du modèle MWC. Mais les différentes valeurs permettent de retomber malgré tout sur le modèle MWC. Les prédictions de ces différents modèles sont similaires : les équilibres sont fortement poussés vers une extrêmité. L’intérêt de ce modèle est qu’il peut expliquer la cinétique : les différents intermédiaires sont transitoires, ils n’apparaissent pas à l’équilibre.

III. Passage à un modèle cinétique plus complexe.

1 . Vers un modèle cinétique.

Il est possible de passer d’une constante d’équilibre à une paire de constantes de vitesse, ce qui devrait permettre d’obtenir un modèle cinétique. Mais cela ne marche pas pour l’hémoglobine, ni pour la myoglobine.

Les modèles à équilibre ont oublié des détails, comme les intermédiaires. En effet, à l’équilibre toutes les espèces transitoires sont absentes, or elles sont indispensables pour comprendre la cinétique.



2 . Cinétique de la myoglobine.

a : Etude par la photodissociation.

Pour des facilités expérimentales, on étudie la liaison de monoxyde de carbone. Le CO est très stable dans la forme liée : cette liaison peut être dissociée par une technique utilisant des lasers. On peut observer la cinétique du retour à la normale : on observe la reformation de la liaison avec le CO. La photodissociation est simple et en absence de lumière, le CO ne se détache jamais de l’hémoglobine.

La vitesse observée en cinétique ne dépend pas du sens des réactions, mais elle dépend de tous les équilibres. Les deux constantes de vitesse sont importantes, donc si un sens de l’équilibre est nul alors c’est plus simple.

b : Absorption en fonction du temps.

Cette réaction qui semble très simple, ne l’est pas autant qu’on le croit. Si on observe l’absorption en fonction du temps, le graphique obtenu est plutôt compliqué : il traduit plusieurs évènements. En cinétique, les réactions se font sur une échelle de temps différente. L’échelle logarithmique permet de voir toutes les différentes réactions en même temps. La courbe ressemble alors à une courbe de titrage, mais elle traduit en fait des exponentielles. Au départ, sur un petit temps, rien ne se passe : on verrait alors une simple droite dans une représentation normale.



Cette représentation logarithmique permet d’observer des cinétiques plus compliquées sur de échelles de temps très étendues. La linéarisation permet de calculer la constante de vitesse.

c : Une cinétique qui varie avec la température.

Ici, la cinétique de reformation de la liaison avec le CO est différente : plus on augmente la température, plus la vitesse de la réaction augmente, tout en gardant la forme exponentielle. A de très hautes températures, on commence à observer une seconde phase. Plus on augmente la température, plus les choses deviennent compliquées. A des températures vraiment très hautes, on revient à une seule phase.

Ces expériences permettent de voir une complexité cinétique, qui n’est pas expliquée par une simple réaction : il y a donc forcément des intermédiaires dans la réaction de liaison sur l’hémoglobine.

3 . Tentatives d’explication des différentes phases.

a : Deux modèles possibles.

La première phase de recombinaison s’accélère lorsqu’on augmente la température. Deux modèles sont utilisés pour expliquer ce phénomène. Le modèle d’Arrhénius : la vitesse de réaction d’une exponentielle et liée à l’énergie d’activation.



Le modèle d’Eyring : il existe un état à haute énergie de transition, après lequel on devient un produit, ou on revient aux conditions de départ.

La constante de vitesse est reliée à l’état de transition.

b : Plusieurs points de départ.

Le fait d’obtenir des phases multiples de tailles variables indique que la cinétique que l’on observe possède plusieurs points de départ. Suivant la température, on part de différents états dissociés. Il existe alors plusieurs structures de départ différentes qui permettent une réassociation du ligand avec la myoglobine.

c : Plusieurs formes peuvent exister.

Le modèle final obtenu est très compliqué. « A » correspond au CO lié à la myoglobine : c’est la forme la plus stable. Il existe deux formes présentes à basses températures, qui se trouvent toujours dans la myoglobine. Les sites de liaison se trouvent dans la protéine, mais pas au niveau de l’hème.

Même pour la cinétique à température physiologique, il faut inclure un intermédiaire, où un ligand qui se trouve dans la protéine n’est pas lié à l’hème.



4 . Etude des intermédiaires.

a : Des intermédiaires visibles à basse température.

On peut utiliser la température pour piéger différents états intermédiaires. On peut voir et mesurer la distribution des deux sites de liaison du CO.

A basse température, le ligand ne peut pas partir très loin de son site de liaison.

b : Des intermédiaires pris en photo.

On peut alors choisir la température suivant ce que l’on veut observer : on fait alors une cristallographie cinétique pour essayer de visualiser ces états intermédiaires. L’intermédiaire recherché a pu être stabilisé. On a procédé ensuite à une dissociation par un éclaire de laser, avec un éclair au rayon X en même temps pour faire la mesure cristallographique. Lorsqu’il n’y a plus de CO, le Fer est sorti du plan de la porphyrine. Le CO se trouve à un autre endroit dans la forme germinate. On a voulu observer l’effet de liaison d’un gaz, qui se voie facilement aux rayons X, le Xénon : il se lie à aussi à un autre endroit.



5 . Etude de la dynamique grâce à la cristallographie.

a : Des déplacements importants.

Avec la cristallographie, on peut observer la dynamique de la protéine (voir les changements de structure en fonction du chemin suivi par le ligand). Certains carbones se déplacent lorsque le CO se délie et va en forme germinate. Certains atomes se déplacent loin (environ 1 A), comme la Tyrosine, car le CO se trouvait à côté d’eux dans l’état lié. L’Histidine distale se déplace aussi, ainsi que l’hélice F. Les déplacements des atomes sont plus importants du côté du ligand de l’hème. De l’autre côté, ils sont plus faibles. Mais les mesures se font à très basses températures, donc les déplacements sont minimisés.

L’étude dynamique de la protéine permet de montrer qu’il faut une certaine énergie pour pouvoir modifier toute une structure.

b : Une liaison en deux étapes.

On doit considérer les différents états qui existent lors de la liaison du ligand. Cette division de la liaison en deux étapes est importante pour la protéine. Il existe différents sites de liaison, ayant souvent des propriétés différentes. Les sites peuvent être sensibles à différents paramètres physicochimiques du ligand. Plus il y a de sites, plus il peut y avoir de discrimination pour la liaison du ligand.



IV. Modèle cinétique de l’hémoglobine.

1 . Les constantes de vitesse des sites germinates.

Pour avoir un bon modèle cinétique de la liaison de l’oxygène sur l’hémoglobine, il faut déterminer plusieurs constantes de vitesse sur les sites germinates.

Constantes de vitesse de la liaison sur le site :

Constantes de vitesse de transition de l’état quaternaire:

Toutes les constantes d’équilibre doivent être divisées en deux constantes de vitesse : on obtient donc 22 constantes au final. Le système possède alors beaucoup de paramètres modifiables.



2 . Un modèle beaucoup plus complexe.

Tous ces paramètres permettent de définir différents états. On peut estimer les vitesses de liaison, ou de séparation, de l’oxygène.

a : La forme R est favorisée après la liaison sur le site germinate.

La transition du site germinate à l’hème, dans l’état R où l’hélice F est moins restreinte, est une réaction 1000 fois plus rapide. La forme R facilite donc cette dernière étape de la liaison de l’oxygène. Les vitesses de dissociation de l’oxygène sont identiques dans les deux formes. Les vitesses d’entrée et de sortie de l’oxygène des hémoglobines ne peuvent pas être distinguées dans les formes R et T. Une structure a une plus haute affinité, si la transition de l’état germinate est plus rapide. L’entrée de l’oxygène est plus rapide dans la forme T. La forme R est limitée par la vitesse d’entrée de l’oxygène : mais une fois entré, le processus de liaison sur l’hème est très rapide. Ces constantes de vitesse varient beaucoup.

b : Un sens pourrait être privilégié.

On peut observer les vitesses de transitions de l’état quaternaire, suivant le nombre de sous-unités qui se trouvent dans un état donné. Sans formes bleues, on a une transition vers la forme T qui est très rapide : on préfère donc la forme T. Les vitesses que l’on peut atteindre sont toujours de l’ordre de la microseconde. Sans formes rouges, c’est la transition vers la forme R qui va beaucoup plus vite. Le passage vers la forme T est 400 fois moins rapide que sans formes bleues. Le passage vers R est accéléré 105 fois. Il y a donc une réaction plus sensible aux structures tertiaires, que son inverse : c’est la relaxation qui est plus sensible.



Le changement de structure quaternaire peut être plus rapide que la liaison d’une petite molécule, malgré le fait qu’ils impliquent de grands changements. Les vitesses se trouvent entre les millisecondes et quelques secondes. (0,02 sec-1 = 1 min)

3 . Des modèles cinétiques qui sont moins sûrs.

Les modèles cinétiques sont plus compliqués car il faut inclure toutes les espèces importantes, mêmes les espèces transitoires. Il est nécessaire de trouver les valeurs des constantes de vitesse, ce qui est plus compliqué que de déterminer des valeurs de constantes d’équilibre. Les chiffres obtenus sont beaucoup moins sûrs. Il est difficile de trouver un unique jeu de chiffres, qui mime le fonctionnement réel de la protéine naturelle.

V. Conclusions.

On peut toujours faire des modèles plus compliqués, mais ça n’est utile que si cela permet de mieux comprendre et de déterminer des vitesses de fonctionnement dans le cadre du modèle. Parfois, la complexité de sert à rien : la différence entre les sites α et β ne permet pas d’obtenir des informations utiles. On arrive toujours à des conclusions très similaires. Mais, par exemple, les sites germinates permettent de comprendre la cinétique et donc de prédire des « photos » dans les conditions qui les permettent. Souvent, un modèle a des paramètres à ajuster pour qu’il puisse s’approcher au plus près des résultats expérimentaux. Avant, on passait par la linéarisation, maintenant les ordinateurs se chargent de minimiser les erreurs. Plus il y a de mesures, meilleur sera le modèle. Mais il faut pouvoir déterminer les bons paramètres et connaître leur fiabilité : il n’y a pas encore de recette miracle pour cela …



Evolution de l’hémoglobine

Variations inter-espèces et lien

entre séquence,

physicochimie et écologie



RAPPELS SUR L’EVOLUTION ET LA GENETIQUE Le papillon biston betularia présente deux couleurs : c’est un exemple d’évolution rapide. En effet, les papillons noirs vivent en zone polluée et les blancs dans les zones non polluées. C’est une exemple classique d’une évolution rapide : si il y a trop de contraste, alors le papillon est trop voyant pour ses prédateurs.

I. La théorie de Darwin.

Darwin a construit une théorie qui repose sur trois points : - la variabilité des individus. - la transmission de cette variabilité aux enfants. - la sélection des individus les plus adaptés à l’environnement, à travers la reproduction. Tout ce qui touche à la survie des enfants a plus de poids pour l’évolution.

La théorie de Darwin repose sur des constats biologiques : de nos jours l’évolution s’explique plus facilement par des données moléculaires.



II. La transmission de la variabilité.

La transmission se fait à différents niveaux : les bactéries sont plus simple car elles n’ont qu’une copie du chromosome unique et quelques plasmides. Le matériel répliqué est distribué aux cellules-filles : c’est une transmission par une seule copie complète et quasi-identique du parent. Les eucaryotes sont plus compliqués car chaque cellule possède plusieurs copies de plusieurs chromosomes, qui sont répliqués et réorganisés. Les enfants obtiennent la moitié du matériel génétique de chaque parent. La transmission est donc plus compliquée car seulement une moitié est transmise par parent : la descendance n’est donc pas identique aux parents.

III. La variabilité individuelle.

La variabilité individuelle provient de deux types de changements : - un changement dans la séquence d’ADN : sur les régions codantes ou non codantes. La sélection est moins repérable dans les régions non codantes. - une réorganisation de l’ADN : ce phénomène est assez courant chez Coli, c’est une source de variations importantes. Ces changements ne changent pas les séquences mais l’organisation dans le génome. La variabilité est un peu plus compliquée. Les changements de séquences sont les plus simples à comprendre. Ces petits changements de séquences modifient une protéine et sa fonction : cela modifie la variabilité de l’organisme. Le cadre d’évolution que l’on regarde sera alors simplifié.



MUTATION ET EVOLUTION

I. Mutations et protéines.

1 . Les taux de mutations.

Ce phénomène n’est pas si simple, car on considérait pendant longtemps la probabilité d’erreurs dans la reproduction de l’ADN. Cantor a établit un premier modèle d’évolution : il se base sur la probabilité α que tous les changements de bases sont identiques. Cette probabilité fut changée par Kimura : certains changements sont plus probables que d’autres, notamment entre A/G et C/T.

D’autres systèmes plus complexes mettent en jeu la vitesse de réplication, ainsi que le complexe utilisé et le sens de réplication. Même la variabilité individuelle n’est pas si simple.



2 . Variabilité des protéines.

La variabilité est liée aux protéines : même si tous les changements avaient la même fréquence, certains acides aminés ont plus de codons que d’autres. Certaines mutations sont alors silencieuses. Le tryptophane est codé par un seul codon : toutes mutation le fera disparaître. Sur une longue période, tous les changements peuvent être « essayés ».

II. La sélection des individus.

1 . Pénétration d’un allèle.

La sélection joue un rôle important car il ne suffit pas d’avoir une mutation, il faut aussi que la mutation perdure dans la population. Une mutation peut arriver chez un individu qui meurt avant d’avoir des enfants. Si une mutation se fixe sur une population (c’est la pénétration d’un allèle), on peut mesurer sa distribution dans la population et donc son niveau de pénétration. Le sort de la mutation dépend de deux facteurs : - la pression de sélection. - la dérive génétique : c’est la chance qu’une mutation anodine puisse se fixer ou être perdue.



2 . La dérive génétique.

En absence de sélection, la pénétration d’un allèle varie par hasard d’une génération à une autre. Dans une grande population, ce phénomène est lent et hasardeux. Par contre, dans une petite population ce phénomène est rapide. Certains individus ont plus d’enfants que d’autres : si on garde le même nombre de personnes, la pénétration va changer d’une génération à l’autre. Au bout d’un certain nombre de générations, le résultat est le même : une fois arrivé à 0 ou 1, tous les enfants seront identiques. Ils le resteront tant qu’on introduit pas une nouvelle mutation. La variation est présente jusqu’à une pénétration égale à 0 ou 1. Même en absence de sélection, une mutation a deux possibilités : - soit elle se fixe : 1. - soit elle disparaît : 0. Cela peut prendre de 1 à des millions de générations, pour arriver à ce résultat. La dérive génétique cause une perte de la variabilité génétique, contrairement aux mutations. Même si il y a une perte de variabilité dans une population, la dérive augmente la variabilité entre les différentes populations. Elle joue sur la différenciation des populations. La pression de sélection peut augmenter la vitesse de la dérive car elle enlève une partie de la population. La sélection est indépendante de l’influence des allèles sur la survie.



3 . Lien entre la sélection par pression et les mutations.

On peut aussi considérer les liens génétiques : un petit allèle « mauvais » peut être lié à un grand « bon » et donc être emmené avec lui. Toutes les mutations ne sont pas toutes importantes pour les changements de fonction et de sélection. La sélection et la dérive diminuent la variabilité, tandis que les mutations l’augmentent. Tout cela modifie le patrimoine génétique qui sera accumulé. Après une série de modifications, on obtient deux séquences différentes : mais combien de mutations sont dues à une sélection ou au hasard ?

III. Le paradigme.

1 . Evolution moléculaire.

On ne part pas d’un gène et des protéines, mais on part d’un génome entier pour arriver à une résistance à la sélection. Entre les deux, on trouve une série de menaces qui peuvent affecter la séquence du gène, la fonction des protéines, mais aussi la quantité des différentes molécules qui entrent en jeu.



Il y a des tas d’influences, qui jouent sur la physiologie de l’organisme, qui vont déterminer la résistance à la sélection. Si on essaie de comprendre les différences entre un poulet et un canard, on serait embêté car les liens entre le génome et la résistance sont floues.

Le lien entre la structure, la fonction et la résistance, sont difficiles à établir dans la plupart des cas. Nous n’avons pas les connaissances nécessaires pour établir clairement ces liens. Il existe deux façons de procéder : - manipuler expérimentalement la variabilité et la pression, en contrôlant toutes les étapes. C’est un système maîtrisé où l’on comprend tout ce qu’il se passe. - la variation naturelle : c’est l’observation.

2 . L’évolution dirigée.

a : Systèmes naturel et artificiel.

Un système artificiel est difficile car il n’y a pas beaucoup de résultats. Par contre un système naturel s’observe à une échelle raisonnable. Il existe beaucoup d’espèces, donc beaucoup de résultats : par contre, il est difficile à comprendre car on ne connaît pas la pression de sélection à l’origine de la différenciation entre les deux caractères étudiées. Il est difficile de connaître l’origine d’une mutation. Un système d’évolution dirigé est simple, car il est basé sur un gène (dans un plasmide). Par contre, un protocole de sélection et un criblage est basé sur la fonction de la protéine.

b : Le DNA-shuffling.

Le protocole de DNA-shuffling a pour objectif de modifier la spécificité d’une enzyme pour qu’elle puisse avoir une autre fonction qu’elle ne pouvait pas faire avant.



Le principe d’un tel système est la sélection, l’introduction de mutations rapides, par mutagenèse et assemblage d’une variété de gènes. On coupe aléatoirement le gène en petits morceaux, puis on réassemble les morceaux par PCR mutagéniques et recombinagéniques. Cela permet la recombinaison des mutations en en introduisant de nouvelles. On sélectionne les gènes reconstruits qui sont différents de ceux du départ. Le criblage permet la sélection des meilleurs. De nouveaux cycles permettent d’obtenir beaucoup de gènes mutés. Il est facile de découper un gène, mais plus difficile de les recombiner différemment. On coupe des morcea ux, puis la PCR allonge un morceau contenant une mutation. Ensuite on fait un cycle de dissociation puis association, pour recoller d’autres morceaux ensemble. Une nouvelle PCR permet d’allonger de nouveau le morceau avec une suite différente.

On obtient à la fin un nouveau gène, constitué d’un mélange avec différentes mutations. On peut introduire en même temps de nouvelles mutations en faisant les cycles de PCR. Mais c’est une étape critique car si il y a trop de mutations alors plus rien ne marche. Lorsqu’il n’y a pas assez de mutations, on obtient les mêmes gènes au début.



Le criblage sur un substrat homogénique est idéal, car on peut visualiser les bonnes bactéries, qui sont bleues. La sélection est basée sur les propriétés des enzymes. Après 8 cycles de mutation/sélection, on ne sélectionne que quelques dizaines de bactéries sur des milliers : la sélection est donc très forte.

IV. Evolution d’une fucosidase à partir d’une glucosidase.

1 . Evaluation du résultat par la cinétique enzymatique.

Au cours de cette expérience, on a pu sélectionner ce qu’on recherchait. Des mesures sur les différents paramètres enzymatiques ont été faites sur deux substrats (glucose ou fucose). On regarde la vitesse et l’affinité pour déterminer l’efficacité de l’enzyme.

La glucosidase marche 1 000 fois mieux avec du glucose qu’avec du fucose. La fucosidase modifiée marche moins bien avec le glucose, qu’avec le fucose. Malgré tout elle préfère le glucose. Les chercheurs ont tout de même réussi : le système de sélection par la couleur a bien marché.



2 . Les mutations introduites.

13 mutations ont été introduites sur la séquence : 5 sont silencieuses sur les 6 changements qui interviennent sur la protéine.

Au niveau de la structure, certaines mutations se trouvent à la surface et d’autres sur le site actif.

Deux modifications pourraient être importantes : l’une est proche du site actif et l’autre se trouve au niveau du site de liaison du substrat. Sur les 13 modifications, une a modifié l’activité et l’autre entre peut-être en jeu : les 11 autres modifications ne servent apparemment pas. Une mutation se trouve avant le gène : elle joue sûrement car elle se trouve sur le promoteur et change donc l’expression du gène. Sur un système simple : seulement 15% des mutations sont importantes pour la fonction de la protéine.



V. Relation entre la séquence et l’écologie.

Actuellement on ne sait pas la relation entre une séquence et la niche écologique de l’individu. L’hémoglobine est un système simple, avec un patron d’expression simple : cette protéine a un rôle physiologique important. Sa fonction est très simple et le lien entre structure, fonction et séquence a été établit. Elle ne joue qu’un seul rôle, simple et important pour notre organisme. Mais attention, ce n’est pas toujours le cas : la lien entre la séquence et la sélection n’est pas encore bien connu.



RAPPELS SUR LES HEMOGLOBINES L’hémoglobine est une protéine qui possède peu de contraintes, en effet c’est une protéine simple à comprendre au niveau physiologique. Elle a un lien clair entre sa fonction et la physiologie de l’organisme. L’hémoglobine lie l’oxygène, ce qui est très important pour beaucoup d’organismes. Son rôle physiologique est plus ou moins unique. Une enzyme quelconque a un lien avec la disponibilité du substrat et le métabolisme de l’organisme. Suivant les variations d’environnement, une pression sera effectuée sur ces protéines. Même si une protéine est simple, elle peut évoluer.

I. Structure.

L’hémoglobine transporte l’oxygène dans le sang. C’est un tétramère composé de 2 chaînes α et 2 chaînes β.

Chaque monomère est constitué de 8 hélices α, notées de A à H. Lorsqu’on change d’espèce, le nombre d’acides aminés varie, mais généralement pas la structure secondaire. Il est donc plus simple d’utiliser la position des acides aminés au sein des différentes structures.



II. Fonctionnement.

Le meilleur modèle qui décrive ce fonctionnement est celui de MWC.

1 . La coopérativité.

La liaison de l’oxygène est un mécanisme coopératif : la saturation monte rapidement lorsque la concentration en oxygène passe un seuil défini.

La coopérativité nécessite plusieurs sites de fixation. Pour qu’ils interagissent : - soit ils communiquent en continu lorsqu’ils sont proches. - soit ils sont éloignés dans la structure et celle-ci doit changer pour permettre une communication.

2 . Allostérie.

Le modèle d’allostérie correspond le mieux à l’hémoglobine. Il y a 4 sites de liaison identiques (avec la même affinité pour l’oxygène). Un site ne peut pas savoir directement si un autre site a lié de l’oxygène ou non. La communication passe par un changement de toute la structure de la protéine : on passe de la forme T à la forme R.



La forme T est la plus stable en absence d’oxygène : son affinité pour l’O2 est basse. La forme R a une plus haute affinité pour l’oxygène. Si l’on bascule de la forme T à la forme R, on augmente l’affinité et la fixation de l’oxygène. La courbe rouge représente la liaison de l’oxygène sur l’hémoglobine. La courbe bleue représente l’évolution de la forme T et la courbe verte celle de la forme R. Lorsqu’on sature l’hémoglobine en oxygène, on passe tout de suite en forme R. Le changement de structure correspond à un changement d’affinité pour l’oxygène.

III. Mécanique du changement de structure.

Lorsqu’on regarde en détail la structure, on voit que l’oxygène est une molécule toute petite par rapport à la taille de l’hémoglobine : l’O2 (2A) entraîne un déplacement de 50A. Comment une si petite molécule arrive à induire un changement de toute la forme d’une molécule beaucoup plus grande ?



1 . Une gène stérique.

Le cofacteur de l’hémoglobine contient un atome de Fer. Lorsque l’oxygène arrive, il se lie au niveau de cet atome de Fer. Cela modifie la forme de l’hémoglobine en oxyhémoglobine. Mais quand on regarde la structure de l’hème, il n’y a pas de place pour l’oxygène entre le Fer et l’Histidine distale. Cette gène stérique entraîne un petit déplacement de 0,5A du Fer et de l’hème, lorsque l’oxygène se fixe. C’est le début d’une cascade de déplacements qui va changer toute la structure de l’hémoglobine.

2 . Liaison entre le Fer et la Tyrosine terminale.

Le déplacement du Fer entraîne un déplacement de l’hélice F. Il existe une forte liaison de l’hème avec l’Histidine proximale, qui se trouve dans l’hélice F.

Il y a ensuite une transmission de proches en proches du déplacement. La Tyrosine HC2, qui se trouve entre l’hélice H et le C-terminal, fait partie de la boucle finale.

La Tyrosine pointe du bout de la protéine en direction de l’hélice. Elle forme une liaison hydrogène avec le carbonyle du résidu précédent , l’Histidine F8. L’oxygène du carbonyle forme 2 liaisons : une avec l’hélice et l’autre avec la Tyrosine HC2. Mais la Tyrosine ne peut pas suivre le mouvement de l’hélice F car sa chaîne latérale est trop courte. La liaison hydrogène qu’elle formait se brise, contrairement à la liaison que formait l’oxygène avec l’hélice.



3 . Les extrêmités C-ter.

La Tyrosine est relâchée de la protéine, elle ressort de l’intérieur de la structure. Or l’extrêmité C-terminale d’une protéine est très importante pour la structure , car elle est impliquée dans plusieurs ponts salins.

a : His146 de la sous-unité β.

L’Histidine 146 permet de retenir la structure de l’hémoglobine humaine. En effet elle forme une liaison avec la sous-unité α qui se trouve à côté d’elle. Il y a un second pont salin avec le résidu D94 de la sous-unité β. Si la Tyrosine se trouve dans la protéine, le dernier résidu forme deux ponts salins : un dans la même sous-unité et l’autre avec la sous-unité d’à côté.

b : Arg141 de la sous-unité α.

Le dernier résidu de la chaîne α est une arginine qui forme deux ponts salins avec l’autre sous-unité a de la protéine.

Il existe une série de liaisons entre les sous-unités qui impliquent les parties C-ter des chaînes qui constituent la protéine. Donc si on modifie la structure du C-ter, on perd les différentes liaisons ioniques. Le groupement COO- du C-ter est très important : on ne peut pas la muter ! Cela démontre bien l’importance des extrémités d’une protéine.



IV. Transitions T-R : énergétique.

1 . Cycle thermodynamqique.

Il existe bien un lien entre la liaison d’un oxygène et le changement de la structure de l’hémoglobine. Cette liaison de l’O2 déstabilise les ponts salins entre les différentes sous-unités. Or ce sont les ponts salins qui maintiennent la forme T. Si la forme T est stable sans oxygène, il y a incompatibilité entre les ponts salins et la présence de l’oxygène.

KR > KT , donc c>1 : on bascule forcément dans la forme R dès qu’un oxygène est fixé. La fonction de l’hémoglobine repose sur les sites de liaison et sur la façon dont on passe de la forme T à la forme R. En empêchant la bascule de la forme T à la forme R, on diminue l’affinité globale de la protéine.

2 . Diagramme énergétique.

Ce diagramme énergétique montre les différents niveaux énergétiques des formes R et T , avec ou sans oxygène. Sans O2, c’est la forme T la plus favorisée, car c’est elle qui a la plus asse énergie. Lorsqu’il y a de l’O2, la forme R est favorisée car son affinité avec l’oxygène est faible donc l’écart d’énergie des deux formes T est faible. Le grand écart entre les deux formes R montre qu’il y a beaucoup d’affinité pour l’oxygène, car il y a beaucoup de variations d’énergie.



V. Les modulateurs.

1 . Rôle des modulateurs.

L’affinité pour l’oxygène est modulée par d’autres composants chimiques comme : les protons, le CO2 ou encore le BPG (2,3-bisphosphoglycérate). Ces petits effecteurs vont change l’équilibre entre les formes T et R. Chaque modulateur modifie l’affinité pour l’oxygène car ils facilitent, ou non, la forme T ou la forme R.

2 . Le BPG.

Le BPG diminue l’affinité de l’hémoglobine pour l’O2. Si la stabilité augmente, alors l’affinité pour l’oxygène diminue : la forme T est maintenue plus facilement.

Le BPG stabilise la forme T en comblant le trou entre les deux sous-unités α : ce trou n’existe pas dans la forme R.



3 . Encore des ponts salins qui se brisent.

La structure est schématisée en montrant les parties importantes pour les transitions.

La forme T est indiquée avec les interactions, entre les différentes sous-unités, qui permettent son maintient. Le COO- participe à deux ponts salins : dans les sous-unités α, les C-ter interagissent entre eux. Le BPG est chargé négativement : il interagit avec les quatre résidus des sous-unités β. Des liaisons hydrogènes sortent les phénylalanines de leurs poches et cassent les ponts salins. La forme R ne possèdent aucune liaison ionique.

VI. Conclusion.

Ce qui est important, ce sont les ponts salins et le terme P50, qui intervient dans l’équation du Km. La saturation suit les changements entre les formes R et T : le P50 mesure la facilité d’échange entre les deux formes.



OIES ET POISSONS

I. Deux espèces d’oies apparentées.

1 . Des conditions de vie différente.

On étudie deux espèces d’oies apparentées : - Anser anser, ou « oie cendrée » : une espèce d’oie habite à basse altitude. - Anser indicus, ou « oie à tête barrée » : une autre oie survole l’Himalaya deux fois par an.

La différence entre ces deux espèces est la capacité de voler à haute altitude (9 000 m) où l’oxygène est raréfié. Le sang des oies « tête barrée » a une très haute affinité pour l’oxygène : cela lui permet de tirer un maximum d’oxygène. De plus elle présente une haute résistance à un stress hypoxique : la diminution d’oxygène dans l’air l’atteint moins que ses cousins.

2 . Quatre mutations.

a : Des mutations de surface.

Les hémoglobines des deux espèces sont très apparentées : il n’existe que 4 différences entre elles. Mais comment chacune de ces différences influence-t-elle l’affinité de l’hémoglobine ?



Toutes les mutations se trouvent à la surface de l’hémoglobine. En effet l’extérieur présente moins de contraintes structurales que l’intérieur de la protéine.

b : Une mutation majeure.

Mais parmi ces mutations seules trois mutations se trouvent réellement à la surface : elles sont considérées comme mineures. Seule la mutation de Pro119α est peu exposée au solvant. Elle se trouve à un contact entre une sous-unité α et une sous-unité β. En conditions normales, elle est en face d’une Leucine.

Au niveau protéique, la modification est mineure : on perd deux groupements méthyles. Cette mutation crée un petit trou entre les deux sous-unités : elle supprime le contact entre la proline et la leucine.



3 . Une mutation qui change l’affinité pour l’oxygène.

a : La mutation chez l’homme.

On introduit cette mutation sur une hémoglobine humaine (HbA), par mutation dirigée. On fait ensuite une mesure du P50 sur de l’hémoglobine pure.

On observe alors une baisse du P50 et donc une augmentation de l’affinité sur notre hémoglobine modifiée. On a besoin de moins d’oxygène pour arriver à 50% de la saturation. Mais dans quelles mesures cette différence est comparable aux espèces d’oies ? On doit mesurer la contribution énergétique de la mutation : pour cela, on utilise les logarithmes. La mutation est plus efficace chez l’humain que chez l’oie : cette mutation est à l’origine des changements d’affinité.

b : Un trou qui augmente l’affinité.

Cette interface entre les deux sous-unités est importante pour le maintient de la forme T. La présence du trou est alors défavorable pour la stabilité de la forme T. Ce manque de stabilité augmente l’énergie de la forme T, qui est très faible. Si la forme T est déstabilisée alors la transition vers la forme R est facilitée. L’énergie dont on a besoin correspond à ¼ de l’énergie d’une liaison hydrogène.



c : Un changement d’affinité est-il suffisant ?

La modification est mineure dans le sang car l’hémoglobine n’est pas pure, comme pour les mesures, mais en présence de modulateurs. Le sang des oies présente une différence d’affinité importante : - oie « cendrée » : 50 mm de Hg. - oie « tête barrée » : 35 mm de Hg. Lorsqu’on calcule l’altitude où on trouve cette pression en oxygène, l’oie « cendrée » pourrai voler à un maximum de 8 000 m , contre 12 000 pour l’oie « tête barrée ». Cette différence d’affinité à un effet sur l’altitude maximum de vol des oies. Malgré le même effet énergétique (150 J/mol) et le même facteur (1,4) entre les valeurs chez les oies et l’être humain. La comparaison entre deux espèces différentes a permis d’expliquer l’effet d’une mutation.

4 . Une oie andienne.

Cette histoire se retrouve chez une oie andienne (Chloephaga melanoptera), qui vit toute l’année à haute altitude, dans la cordillère des Andes. Le sang de ces oies montre 16 mutations par rapport à l’oie « cendrée ».

Parmi ces modifications, une touche la Leu55β, qui était en contact avec la Proline touchée toute à l’heure. On a donc le même effet au même endroit.

La mutation change deux groupements méthyle en hydroxyle : c’est un cas frappant qui touche les mêmes acides aminés et produisent les même effets.



5 . Des mutations qui peuvent avoir des effets importants.

Des petites mutations modifient peu la séquence, mais un petit trou permet de modifier la stabilité d’une forme de la protéine. Elles ont donc un effet sur l’adaptabilité des oies à haute altitude. En étudiant des cousins proches, on peut avoir des informations sur les liens et l’importance d’un site particulier. De petits effets énergétiques, avec des interactions faibles, ont de grands effets sur la physiologie de l’organisme. Il ne faut donc pas toujours de grands effets pour avoir des changements importants. On n’observe que 75 à 90% des mutations n’ont rien à voir avec les changements physiologiques observés. Il y a beaucoup de modifications neutres et issus d’une dérive génétique. Une mutation n’est donc pas forcément importante.

II. L’effet Root des hémoglobines de poissons.

1 . La vessie natatoire des téléosténiens.

Autres exemples de variations de séquences dans différentes espèces : chez le poisson. La particularité des poissons téléosténiens (possèdent des arêtes) est qu’ils ont une vessie natatoire, contrairement aux poissons cartilagineux. Cette vessie natatoire permet de flotter et d’ajuster la flottaison, car elle est remplie d’oxygène. Plus il y a de l’oxygène, plus le poisson monte vers le haut et vice-versa. Il faut donc une régulation de la quantité d’oxygène dans la vessie natatoire. L’oxygène utilisé pour la vessie se trouve dans le sang.



La manière de remplir cette vessie pose un problème, car d’autres poissons vivant à plus de 3 000 m de profondeurs réussisent à la remplir malgré la pression atmosphérique différente : ils sont capable de fournir un effort supplémentaire. On veut donc savoir comment peut-on remplir la vessie natatoire malgré la pression isostatique ? C’est expliqué par l’effet Root, découvert par H. Root, un physiologiste.

2 . L’effet de Bohr.

L’effet de Bohr correspond à un effet de pH qui agit sur l’affinité de l’hémoglobine pour l’oxygène : le pH joue donc un rôle important. En effet une augmentation de pH diminue l’affinité pour l’oxygène pour pouvoir permettre le transfert de l’oxygène dans les tissus, car les tissus sont plus acides que les poumons et donc réduisent l’affinité de l’hémoglobine permettant la libération de l’oxygène. Lorsqu’un organisme a besoin d’oxygène, ses tissus s’acidifient.

a : Effet du pH sur une Histidine.

A pH acide, l’hémoglobine a une faible affinité pour l’oxygène. A pH 7,8 on a un minimum d’affinité, puis au-delà elle augmente.

On a donc bien un effet de Bohr sur l’hémoglobine.



Au niveau moléculaire, cet effet de Bohr est dû à la protonation, en particulier de l’Histidine β146. Si on change le pH, on protone et déprotone ce qui modifie la stabilité de l’hémoglobine. La protonation de l’Hisβ146 (une histidine terminale qui intervient dans un pont salin) se fait à un pKa de 6. Cet acide aminé est parfait pour moduler l’état des protons autour du pH physiologique. Lorsque l’Histidine est chargée positivement, elle forme une liaison hydrogène, ce qui stabilise la forme T de l’hémoglobine, et donc diminue l’affinité pour l’oxygène. Ce changement d’affinité n’est pas très grand, il ne permet pas de pomper l’oxygène lorsque la pression isostatique est trop importante.

b : Variations entre les formes T et R.

Le plus important, c’est comment cela varie entre la forme T et la forme R. A des pH acides, cette histidine est toujours protonée , donc on peut toujours former le pont salin, ce qui diminue l’affinité pour l’oxygène. A pH intermédiaire, l’histidine change sa protonation : elle perd son proton lorsque l’hémoglobine est en conformation R, ce qui l’empêche de revenir en forme T. A pH alcalin, l’histidine n’est plus protonée et revient à une situation où on a déstabilisé la forme T : ce n’est plus couplé à l’oxygénation. Si le changement de protonation est lié à un changement de structure, alors l’effet du pH est plus important.



c : Indication du couplage protonation/oxygénation.

On obtient aussi cet effet lorsqu’on ajoute de l’oxygène sur l’hémoglobine. Si l’Histidine est toujours protonée, il n’y a pas de couplage entre la protonation et l’oxygénation. Quand on va vers un pH intermédiaire, il y a un couplage entre l’état de protonation et l’état d’oxygénation. L’ajout d’oxygène entraîne le relarguage des protons.

3 . L’effet de Root.

L’effet de Root donne sensiblement la même chose mais en beaucoup plus important. Pour l’histidine, on obtient une courbe qui montre qu’un ou deux protons sont libérés lors de l’oxygénation. Pour l’hémoglobine des poissons, ici chez le thon, il y a entre 3 et 6 protons de libérés, c’est trois fois plus que la normale. Il y a plus de sang dans le thon que dans les poissons rouges : toujours à pH physiologique.

Il y a aussi un couplage avec un autre effet, qui entraîne également une perte de la coopérativité. On effectue des mesures sur l’hémoglobine de thon, à 3 pH différents. Le pH a un effet sur l’affinité et sur la coopérativité : le premier oxygène lié empêche la liaison d’un oxygène suivant.



4 . Mécanisme utilisé chez le poisson.

Cette équation marche dans les deux sens, donc on pousser l’équilibre dans l’autre sens en ajoutant de l’acide lactique : cela permettra de relarguer l’oxygène. Cet équilibre-là est utilisé par les poissons. L’accumulation d’une quantité suffisante d’acide lactique permet d’avoir une régulation correcte.

a : 50% d’identité entre le poisson et l’homme.

Ce mécanisme est différente de celui observé chez les oies : il y a beaucoup de différences entre l’hémoglobine des hommes et celle des poissons. Sur les 387 résidus, il y en a 140 qui changent. Malgré tout on peut observer plusieurs résidus conservés : environ 50%.

Il y a tout de même 50% de différences donc c’est dur de voir quels sont les résidus responsables des changements : 90% des modifications ne sont pas importantes, seules 10% ont un effet.



b : Mutation sur la sous-unité β.

La première idée est qu’une substitution particulière chez les poissons, qui leur serait spécifique, permet d’obtenir ces résultats. Une Cystéine de la sous-unité b se trouve mutée en Sérine. Il est peu commun de trouver une Cystéine qui n’est pas engagée dans un pont disulfure à l’intérieur d’une protéine.

Au niveau chimique, la modification est toute petite : le groupement carbonyle CO devient un groupement SH. Ces deux atomes sont très semblables chimiquement : cette modification paraît donc mineure.

Est-ce suffisant pour engendrer une si grande modification de la protéine ? Le changement entre une Cystéine et une Sérine correspond à une toute petite modification dans la géométrie et l’acidité des atomes : - l’angle de la liaison est modifié : l’angle COH est de 104° , celui de CSH est de 180°. La Sérine présente une organisation linéaire. - l’atome de Souffre est un peu plus gros que l’atome d’Oxygène. - l’atome d’Oxygène est un peu plus acide.



- l’Oxygène est plus électronégatif que le Souffre, donc il attire plus de protons. L’oxygène est donc un meilleur accepteur de liaisons Hydrogène que le Souffre.

La Cystéine est impliquée dans une liaison hydrogène vers la chaîne b en C-terminal, et non avec une autre chaîne latérale. En modifiant le résidu Cystéine en Sérine, ils ont prédit qu’il y a une possibilité de faire une autre liaison entre le C-terminal et l’intérieur de la protéine. Donc cette modification va stabiliser la protéine dans sa forme T , en augmentant le nombre et la force des liaisons Hydrogène. Mais ceci n’est pas suffisant pour donne un effet de Root : cela ne marche qu’à moitié.

c : Une 2nde mutation.

On a donc cherché une autre source de protons. Pour libérer 4 protons, il faut un autre résidu qui libère un proton, comme un pont salin additionel dans la forme T.



III. Conclusions sur les évolutions des oies et poissons.

L’effet de Root est moins clair que chez les oies : la distance évolutionnaire entre l’homme et le poisson est plus grande que celle entre l’homme et les oies. Il y a donc un certain nombre de modifications relativement mineures, qui peuvent être importantes. Pour tester les différentes hypothèses, il est impératif de faire une mutagenèse dirigée, qui va modifier des acides aminés afin d’observer les changements induits. C’est en 1970 qu’est née l’hypothèse d’une mutation de la Cystéine en Sérine. A l’époque, il était impossible de faire de la mutagenèse dirigée. Aujourd’hui on peut voir que cette hypothèse n’est pas suffisante.



VARIATIONS INTRA-ESPECES

I. Des variations au cours du développement.

1 . Différentes proportions au cours du développement.

Il y a différentes hémoglobines qui sont exprimées lors du développement du fœtus.

A quelques semaines, le fœtus a une hémoglobine composée de 2 chaînes ζ et de 2 chaînes ε. Durant le premier trimestre, les chaînes ζ sont remplacées par des chaînes α, et les chaînes epsilon sont remplacées par des γ. C’est aussi le début de la production des polypeptides β. Pendant les 6 prochains mois, la quantité de chaînes β augmente. Juste après la naissance, les chaînes β apparaissent tandis que les chaînes γ disparaissent. Enfin chez l’adulte, on va trouver essentiellement des chaînes α et β. On aura quelques traces de chaînes ζ.



2 . Différences entre deux hémoglobines humaines

a : 40 mutations entre beta et gamma.

Si on regarde les chaînes β et γ, les changements introduits sont les mieux compris. Lorsqu’on observe les différences entre l’hémoglobine fœtale et l’hémoglobine adulte, il y a une quarantaine de différentes dans les séquences. Il y a notamment un changement d’un glutamate en aspartate.

Quelles modifications sont importantes ? Quelles sont les différences importantes entre les chaînes β et γ ?

b : Une différence d’affinité pour l’oxygène.

La plus grande différence entre ces hémoglobines sont leur affinité pour l’oxygène. Au cours du développement du fœtus, il faut qu’il y ait beaucoup d’oxygène : le fœtus est approvisionné en oxygène par le sang de sa mère. L’hémoglobine fœtale a une meilleure affinité : laquelle de ces multiples variations entre les chaînes β et γ va modifier l’affinité pour l’hémoglobine ?



c : Les mutations qui ont une incidence.

La plupart des modifications sont des modifications de surface de la protéine. De plus ce sont des modifications mineures. Beaucoup de ces résidus peuvent subir des modifications de séquences.

A priori on a tendance à penser que les modifications de surface sont mineures.

3 . Interactions avec le BPG.

Mais un certain nombre de modifications se trouvent dans des régions importantes, comme la surface d’interaction avec le BPG (2,3-bisphosphoglyérate).

a : Des mutations dans la surface d’interaction.

4 résidus avec des charges positives interagissent avec des charges négatives qui se trouvent sur le BPG.



Il y a deux possibilités de résidus en N-terminal de la protéine : - une Valine, qui peut devenir une Glycine. - une Histidine et une glycine, qui ne changent pas. - l’Histidine 143, qui peut devenir une Sérine. Il y a deux modifications parmi les quatre résidus qui sont impliqués dans la liaison.

Normalement, dans les globules rouges, la concentration en BPG sert à diminuer l’affinité de l’hémoglobine pour l’oxygène. Il se lie entre les deux sous-unités β dans la forme T, mais pas dans la forme R. On peut alors voir un lien entre un changement de séquence et un changement de l’affinité. Une de ces modifications concerne le N-terminal.



b : Une mutation du N-terminal importante.

Si on fait une modification du dernier résidu (H en S), on n’a pas autant d’effet. Il y a très longtemps, en 1971, on a remarqué que dans l’hémoglobine il y a une bonne partie de la chaîne γ qui était acétylée (CH3COO) sur le N-ter de la protéine. Les chercheurs ont pu faire cette observation par chromatographie. L’acétylation du N-ter va changer l’affinité du BPG.

4 . Liaison du monoxyde de Carbone.

Le rôle de l’hémoglobine fœtale n’est pas uniquement géré par son affinité pour l’oxygène. En effet, le monoxyde de carbone joue aussi un rôle. Chaque organisme rejette du CO. Le rapport entre le CO2 et l’O2 correspond à l’affinité. Il est égal à 250. Pour l’hème, cette spécificité pour le CO est d’environ 10 000. Un des rôles majeur de la protéine est de changer cette spécificité : c'est-à-dire d’augmenter l’affinité de l’oxygène et de diminuer l’affinité pour le CO. La spécificité préfère toujours le CO mais diminue vers 80. C’est pour cela que l’on conseille aux femmes enceintes de ne pas fumer. En effet, dans l’hème le monoxyde de carbone est beaucoup plus polaire que l’oxygène. La polarité de la poche de liaison change : plus c’est plaire, plus ça va favoriser le CO sur l’oxygène. Il y a alors possibilité de faire une liaison hydrogène. Il y a 2-3 modifications dans la poche de liaison et une modification dans la liaison avec le BPG. Une autre mutation est associée à une acétylation. On tourne alors autour de 10% des mutations, qui agissent sur la fonction de la protéine.



II. Mutations et maladies.

On connaît environ 400 mutations ponctuelles qui ont des conséquences plus ou moins graves.

1 . La drépanocytose.

a : Des hémoglobines falciformes.

L’hémoglobine S possède une mutation qui est associée à une maladie endémique (qui se retrouve dans toutes les populations). La drépanocytose est endémique car elle a un avantage sur le paludisme. Les globules rouges sont falciformes, c'est-à-dire qu’ils prennent une forme de faucille. Cette maladie a été décrite pour la première fois en 1904 par James Herrick. C’est la première maladie à avoir été associée à une protéine mutante.

b : Différents symptômes pour différents génomes.

C’est une maladie qui existe à différents niveaux. Les individus homozygotes ont 50% de leurs globules rouges « malades ». Mais les hétérozygotes ont une forme beaucoup moins grave de la maladie, car ils n’ont que 1% de leurs cellules malades. Ce qui est étonnant, c’est la pénétration d’un gène. Dans certaines régions, 11% des populations possèdent ce gène, dont 10% d’hétérozygotes pour 1% d’homozygotes. Cette maladie est donc très répandue.



2 . Le paludisme.

Si cette maladie persiste autant, c’est qu’il y a forcément des avantages à être malade.

Cette maladie est associée au paludisme. D’autres mutations ponctuelles y sont aussi associées. Cette maladie touche essentiellement les enfants, c’est celle qui a tué le plus d’hommes. Les individus atteints de paludisme sont infestés par des parasites qui se trouvent dans les globules rouges. Ils sont largués dans le sang et leur maturation se fait dans les tissus.



3 . L’hémoglobine S.

a : Nature de la mutation.

On observe une différence entre les hémoglobines de type A et de type S. Cette différence se trouve au niveau du point isoélectrique des hémoglobines. On n’a pas de protéine qui possède deux allèles mélangés.

Une modification d’un glutamate en Valine se fait en position cis de la chaîne β. Le glutamate se trouve à la surface de la protéine, il est impliqué dans deux autres modifications ayant une mécanique totalement différente.

Le dépistage de ces mutations se fait par PCR et traitement pas une endonucléase. Le site de restriction est détruit par une mutation : - un gros fragment : c’est qu’il n’y a pas eu de coupure. - deux fragments représentent un allèle muté et un allèle non muté.



b : Un problème de solubilité.

L’hémoglobine est très concentrée dans les globules rouges : 5 mM , soit 320 mg/ml. Elle peut être à une si haute concentration car il n’y a qu’un seul type de protéine dans les globules. A de telles concentrations, l’hémoglobine doit être soluble pour éviter une agrégation , sous forme de cristaux ou de corps d’inclusion. Ce paramètre se trouve très modifié dans l’hémoglobine S : la solution dans les globules rouges devient très visqueuse. On a fait une série de mesures sur la solubilité de mutants, pour connaître les acides aminés en cause dans la viscosité.

L’hémoglobine A est soluble jusqu’à 150 mg/ml. Par contre l’hémoglobine S dans les mêmes conditions à une solubilité de 30 mg/ml. Ceci a un effet dramatique sur le comportement de l’hémoglobine S car elle n’est plus soluble dans les conditions cellulaires. Cette protéine va alors précipiter ce qui empêche son bon fonctionnement. Si on ajoute d’autres mutations sur l’hémoglobine S, on peut réussir à réaugmenter sa solubilité. Une Lysine chargée, qui se trouve à la surface, changée en résidu hydrophobe permet d’augmenter la solubilité, contrairement à ce qu’on aurait pu prévoir. La solubilité ne dépend donc pas de la charge des résidus de surface. L’aspect le plus important de l’insolubilité de l’hémoglobine S est qu’elle est soluble sous forme d’oxyhémoglobine, par contre elle devient insoluble lorsqu’elle est sous forme de déoxyhémoglobine. La solubilité dépend donc de la structure de la protéine. Dans le sang artériel, l’hémoglobine S est très soluble. Mais dès qu’elle arrive au niveau des tissus, elle devient insoluble.



c : Des fibres à l’origine du précipité.

Des fibres.

La structure formée contrôle les propriétés physiques du précipité. Suivant la forme oxygénée ou non, cela ne forme pas de cristaux, mais une sorte de gel. La forme de gel est liée à la structure du précipité : ce sont des fibres de protéines polymériques, légèrement torsadés. Ce fibres précipitées déforment la cellule : lorsqu’elles rencontrent la membrane, elles exercent une activité mécanique qui déforme la cellule. C’est pour cela que les globules rouges ont cette forme particulière de faucille, dans le sang veineux.

Lorsque ces cellules déformées arrivent aux poumons, elles se réoxygènent au niveau des hémoglobines, qui dissout les fibres : les globules rouges retrouvent leur forme normale. Le processus est donc réversible. La plupart des globules rouges modifiés arrivent à passer : ils passent difficilement, mais ils passent quand même. L’interaction très spécifique à l’origine des fibres n’est possible qu’en présence de la mutation. Les fibres ont une organisation hélicoïdale des molécules d’hémoglobine : l’hélice peut se voir dans deux sens, de longues fibres ou des fibres courtes qui « tournent » plus vite autour de l’axe de la fibre.



Un dimère d’hémoglobine.

La Valine de la sous-unité β se trouve à côté d’un trou, uniquement dans la forme désoxyhémoglobine. Un morceau d’une autre hémoglobine peut s’imbriquer parfaitement dans ce trou : on a alors formation d’un dimère très stable. Ceci uniquement dans la forme désoxyhémoglobine, car l’imbrication se fait près de l’hème.

Une série d’autres mutations vont empêcher (en vert) ou augmenter (en rouge) la tendance à précipiter : - suivant l’accessibilité du trou. - ce qui se trouve à la surface du trou. - la Valine qui s’imbrique dans le trou. L’arrimage moléculaire ne peut se faire que si deux hémoglobines sont compatibles.

4 . L’incidence sur le paludisme.

Pourquoi l’insolubilité à un effet sur le paludisme ? Pourquoi un avantage pour les hétérozygotes ?



a : Un avantage pour les hétérozygotes.

La drépanocytose est une maladie relativement grave : ceux qui bénéficient des avantages sont simplement les hétérozygotes. Les hétérozygotes possède les deux types d’hémoglobines A et S. Les homozygotes n’ont que des hémoglobines de type S, donc elles vont toutes précipiter. Par contre, chez les hétérozygotes, seules 50% d’entre elles ont tendance à précipiter et pas l’autre moitié. Or pour former les fibres il faut que l’hémoglobine S se lie à une autre de même type : donc il n’y a qu’une faible tendance à former les fibres.

b : Un lien révélateur d’une protection.

On cultive des plasmodium dans des globules rouges, suivant des conditions différentes : - dans un sang oxygéné à 17% : les parasites survivent sans problème pendant 4 jours, pour tous les types d’individus. Les hémoglobines sont sous forme oxygénées, donc ne présentent aucune anomalies. - dans un sang pauvre en oxygène, 3% : . individus sains : le parasite vit normalement. . homozygotes pour Hb S : les parasites meurent rapidement. . hétérozygotes : on observe un effet cinétique important. Les parasites sont stationnaires pendant 1 jour, puis ils meurent.



c : Infection par un parasite de type falciparum.

Deux types d’infection, qui réagissent différemment.

Il existe deux formes de paludisme suivant l’espèce de parasite impliqué : - falciparum : la fièvre dure 4 jours, cette maladie est plus longue donc plus mortelle. - vivex : une fièvre de 3 jours.

Le paludisme de falciparum est le plus sensible aux effets induits pas l’hémoglobine S.

Une maturation dans les tissus faiblement oxygénés.

La maturation des parasites se fait dans les tissus, et non dans les globules rouges circulants. Les globules rouges infectés passent dans les tissus : ils se trouvent à la surface des cellules. Des spicules poussent à la surface des globules : du coup ils s’accrochent dans les tissus où ils ne peuvent pas être repérés. Ils s’installent là où la pression en oxygène est la plus basse. Lorsque les globules rouges sont accrochés, l’hémoglobine passe en forme désoxygénée. Chez les individus non malades, les cellules finissent pas se détacher. Par contre, ici ils restent accrochés pendant quelques jours. Du coup, les hémoglobines ont le temps de cristalliser : il y a de plus en plus d’agrégats de désoxyhémoglobines. Les parasites ont donc plus de mal à utiliser l’hémoglobine. La cellule déformée par les agrégats, finit par éclater. Il y a alors une perte de potassium cellulaire, ce qui tue les parasites. La cinétique d’un hétérozygote est très bien organisée : il n’y a pas d’effet de la mutation dans la circulation sanguine. L’effet majeur porte sur les parasites : ce qui confère une protection contre le paludisme.



5 . D’autres mécanismes de protection différents.

C’est un endroit clé sur la surface de la molécule. D’autres mutations confèrent aussi une protection contre le paludisme, avec des mécanismes totalement différent. Une mutation ne change pas la solubilité, mais la stabilité de la protéine. Si elle est moins stable alors la durée de vie d’un globule rouge sera réduite. La mutation permet à l’hème de s’accrocher sur les membranes. Les globules rouges abîmés sont détruits dans le foie, car ils sont dangereux. La durée de vie de ces globules rouges passe de 4 jours au lieu de 10 normalement. Le plasmodium n’a pas le temps de pousser avant d’être détruit en même temps que le globule rouge.

III. Conclusions.

Il existe beaucoup de changements inter-espèce qui ne sont pas importants ! Par contre des changements dans les modifications post-traductionnelles peuvent aussi influencer la protéine. Il ne faut donc pas regarder uniquement les changements de séquence. Le séquençage des gènes ne montre que les changements de séquences : il faut donc aussi observer la structure de la protéine. Les modifications de surface ne sont pas toujours anodins : ils peuvent modifier la solubilité, la stabilité, … Pour l’hémoglobine S, l’établissement de ce lien a demandé beaucoup de techniques différentes. La cristallographie a permis de voir la structure des fibres. Des mutagenèses dirigées ont servi à la fabrication de mutants. L’analyse fonctionnelle a permis d’observer l’incidence des modifications. Il faut toujours utiliser plusieurs techniques pour analyser le lien entre la structure et la fonction d’une protéine.



LES HEMOGLOBINES ANCESTRALES ET MODERNES Les hémoglobines sont des protéines anciennes, mais on trouve toujours de nouveaux types de globines. Ces différentes hémoglobines ont toujours la même structure de base : un sandwich d’hélices α entourant un hème.

I. Ascaris suum.

1 . Une très forte affinité pour l’oxygène.

a : Une affinité spécifique.

Par exemple, chez Ascaris scuum (une espèce de ver), l’hémoglobine a une énorme affinité pour l’oxygène. Cette meilleure affinité correspond à un P50 plus faible. L’hémoglobine du ver est donc beaucoup plus affine que les hémoglobines précédemment étudiées.

Normalement une hémoglobine peut lier de l’oxygène ou du monoxyde de Carbone. Or l’affinité de cette hémoglobine pour le CO est comparable à celle de la myoglobine. Par contre, son affinité pour l’oxygène est largement supérieure.

On a donc une augmentation de l’affinité qui est spécifique à l’oxygène.



b : Origine de cette affinité.

Au niveau cinétique, l’affinité (représentée par le P50) dépend de la vitesse de dissociation et d’association de l’hémoglobine. La constante d’affinité augmente, si la constante d’association augmente et la constante de dissociation diminue.

Pour l’oxygène, l’association de l’hémoglobine d’Ascaris est plus lente que pour la myoglobine. Mais sa vitesse de dissociation est extrêmement ralentie : la moitié des molécules va mettre quelques minutes pour se dissocier. L’association de deux molécules éloignées se fait suivant leurs possibilités d’interactions. Par contre, la dissociation dépend des interactions de l’environnement sur la liaison des deux molécules. La vitesse de dissociation dépend donc des interactions locales de la forme associée. Si le site de liaison est mieux adapté, alors la dissociation sera plus difficile.

2 . Origine moléculaire de la différence d’affinité.

a : Un alignement peu concluant.

L’origine moléculaire de cette différence ne s’explique pas par la séquence. Il n’y a que 8% d’identité avec la myoglobine : cela correspond au résultat obtenu pour deux séquences aléatoires. La structure secondaire de ces protéines est proche, c’est pour cela qu’on a pu les relier. On peut comparer des séquences très différentes et pourtant semblables dans leur structure et leur fonction. Les alignements ne peuvent pas donner de renseignements pour élucider les différences d’Ascaris.



b : Comparaison des spectres d’absorption.

On fait donc des mesures spectroscopiques pour essayer de voir les différences avec d’autres hémoglobines. Le spectre d’absorption d’une hémoglobine d’Ascaris est comparé à une hémoglobine de cheval. Lorsque l’hémoglobine est oxydée (l’atome de Fer est oxydé) alors les spectres sont totalement différents. L’hémoglobine du ver possède deux pics rapprochés dans le rouge et un pic indépendant dans le violet.

Cette différence de spectre est caractéristique de l’organisation de l’hème et du spin du Fer. C’est un témoin de la force du ligand : plus le ligand est fort, plus on est dans un système à bas spin. Les ligands autour du Fer de chez Ascaris sont particulièrement forts.

c : Un modèle.

Pas d’Histidine distale chez Ascaris.

L’hémoglobine possède 5 ligands constants : 4 azotes de la porphyrine et 1 azote venant de l’Histidine proximale. Ceci change lorsque le ligand vient se fixer sur l’hème. Normalement, dans cette forme d’hémoglobine, il ne devrait pas y avoir de 6ème ligand.



Pour la myoglobine, quelque chose peut interagir avec l’Histidine distale. Or cette Histidine distale est absente chez Ascaris, par contre on trouve dans cette région une glutamine, qui peut jouer un rôle similaire. Il y a aussi une Tyrosine qui se trouve à côté. La liaison avec l’oxygène est très forte, car il est bloqué et maintenu par le Fer et deux liaisons fortes avec la Glutamine et la Tyrosine.

Rôle de la Tyrosine.

Si on introduit des mutations dans l’hémoglobine d’Ascaris, on peut montrer l’importance de la Tyrosine. Si elle n’existe plus alors il n’y a plus de spécificité pour l’oxygène. On a pu faire deux mutations de la Tyrosine : - soit en Lysine : on passe d’un acide aminé aromatique à un aliphatique. - soit en Phénylalanine : on garde l’aromaticité, mais on change le groupement hydroxyle. Ces deux mutations ont des effets majeurs sur l’affinité : la Leucine change d’un facteur 1000.

Il y a beaucoup de changements sur la cinétique, le comportement de l’hémoglobine d’Ascaris mutée se rapproche de celui de la myoglobine. Les mutations ont beaucoup d’effets sur la dissociation. Il existe donc une interaction entre la Tyrosine et l’oxygène.

3 . Les liaisons hydrogènes.

Les liaisons hydrogène sont importantes pour la structure secondaire d’une protéine. La difficulté pour les observer, c’est que les hydrogènes sont petits.



a : Plusieurs techniques disponibles.

Cristallographie et diffractions.

La cristallographie n’est pas une technique adaptée pour les étudier. En effet, il y a peu d’électrons donc cette technique marche mal. Pour voir les hydrogènes, il faut avoir une très grande résolution, autour de 1A. On utilise donc une diffraction par les neutrons, et non par les rayons X. Les neutrons vont interagir particulièrement bien avec les hydrogènes : mais cette solution ne montre que la position des hydrogènes. Mais cette méthode est plus coûteuse et tous les laboratoires ne sont pas capables de la pratiquer. De plus, elle donne peu de renseignements sur la force des liaisons hydrogènes : cela ne nous informe pas sur la force et donc l’importance des liaisons.

Spectroscopie vibrationnelle.

La spectroscopie vibrationnelle est une spectroscopie un peu compliquée, mais qui possède des avantages pour notre étude. Une molécule est faite d’atomes reliés par des ressorts : la molécule va donc vibrer et la fréquence de vibration est caractéristique de chaque type de liaison. On peut définir une molécule par son orientation globale et la position de son centre de masse. Les vibrations sont symétriques par rapport au centre de masse, sinon la molécule se déplacerait. Pour définir la structure d’une molécule, il faut trois fois le nombre d’atomes de mesures, pour avoir une structure en 3 dimensions. Pour une protéine comme l’hémoglobine, il y aurait 6700 fréquences de vibrations sur le spectre obtenu.



Sélectivités possibles d’une spectroscopie.

On peut aussi faire une spectroscopie différentielle, pour cela on fait deux spectres avec une condition qui change : on espère alors qu’un seul atome aura bougé avec le changement de condition. Des modifications mineures, comme enlever un électron, peuvent avoir une incidence. On peut faire un marquage isotopique : si on change un proton par un deutéron, qui est plus lourd. La vibration de la liaison va changer, elle sera plus lente. La spectroscopie de Raman de résonance utilise l’effet de diffusion inélastique de lumière. Le faisceau lumineux qui arrive sur une molécule va entrer en collision et provoquer un petit transfert d’énergie qui correspond à la fréquence de la liaison. Elle permet d’observer le spectre vibrationnel autour d’un chromophore, comme un hème par exemple. La vitesse d’une vibration dépend de la masse des atomes impliqués et de la tension du ressort. Le proton qui arrive va polariser la liaison et ainsi la modifier. Il existe un lien linéaire entre le changement de fréquence d’une vibration et la force de la liaison hydrogène.

La RMN.

La RMN est très utile pour observer les hydrogènes. Cette technique est un peu moins utilisée, car on regarde plus souvent les liaisons pour déterminer une structure secondaire. Les chaînes latérales sont moins utilisées. Toutes les liaisons hydrogène réduisent la vitesse d’échange des protons. Cette technique donne des informations sur la force des liaisons hydrogène : mais elle n’est pas encore assez bien adaptée.



b : Spectroscopie Raman de résonnance différentielle avec marquage isotopique.

Une combinaison de plusieurs techniques.

Spectroscopie de Raman : pour regarder la fréquence des vibrations d’une molécule. La résonnance : on a un signal plus important si il y a résonnance entre les photons et la molécule : ils doivent avoir la même longueur d’onde. Cette technique n’observe que des protéines colorées par des chromophores (tyrosine, hème, …). Spectroscopie différentielle : on compare des spectres obtenus en présence ou en absence d’un ligand (02, CO, …). On observe les changements résultants de la modification du système. Le marquage isotopique : on regarde une molécule marquée avec un isotope stable qui a une masse différente, donc une vibration différente. Cela permet d’observer seulement certaines vibrations.

Interactions avec la Tyrosine.

La bande du haut correspond au spectre de Raman : on observe la résonnance des tyrosines et des tryptophanes, contenus dans la protéine. Chaque pic correspond à la vibration d’une molécule. Les deux autres spectres correspondent aux formes oxygénées et désoxygénées de l’hémoglobine. Il y a peu de différences entre ces deux spectres : on peut alors sélectionner les résidus qui interagissent avec l’oxygène. On obtient la fréquence caractéristique d’une Tyrosine.

L’oxygène interagit avec une Tyrosine, ce qui change son spectre de vibration. On se situe dans la région Y8a-8b : le 8 correspond à la 8ème proposition.



On observe maintenant la différence entre l’oxyhémoglobine et la monoxyhémoglobine, ce qui change lorsqu’on lie un CO. En effet, l’hémoglobine d’Ascaris a un comportement différent entre l’oxygène et le CO : le site actif est spécifique de l’oxygène. Certains pics sont caractéristiques des formes oxygénées et désoxygénées. En jouant avec des variants, on peut voir des interactions spécifiques qui se font avec des ligands différents. L’oxygène induit une modification très spécifique du spectre. La spectroscopie sur différents modèles permet de définir les interactions qui entrent en jeu, en modifiant le solvant. L’exaltation de l’intensité d’un pic est typique d’une liaison hydrogène, lorsque l’oxygène se trouve dans le site.

c : Spécificité de la liaison du CO.

Les fréquences de vibration observées sont caractéristiques d’une liaison d’un monoxyde de carbone sur le Fer. On veut maintenant comprendre la spécificité de la liaison d’un CO sur l’hémoglobine.

Vibrations à basse fréquences, pour étudier la liaison Fer-C.

On obtient beaucoup de vibrations à basses fréquences car le Fer est lourd et la liaison du CO partielle (pas covalente). C’est compliqué d’interpréter cette partie du spectre, où beaucoup de liaisons se chevauchent, car il est difficile de distinguer les pics individuellement. On va utiliser des isotopes du CO, qui ont une variation d’environ 10% de la masse d’un CO normale : un CO léger (C12O16) et un CO lourd (C13O18). Les spectres obtenus sont différents suivant la masse du CO : les régions impliquées changent. Pour pouvoir analyser les pics, on fait la différence entre les deux spectres. Les creux et les pics obtenus démontrent un déplacement de spectre.



Mais un atout facilite cette analyse : en diminuant la masse, on augmente les vibrations. On connaît alors le sens de déplacement des pics. Pour chaque liaison entre le Fer et le carbone, on observe des différences pour leurs deux fréquences. Une liaison qui vibre ne doit donner qu’une seule fréquence, or ce n’est pas le cas ici : c’est l’indication d’une hétérogénéité dans l’échantillon. Certaines molécules ont des fréquences différentes, donc toutes les molécules qu’on regarde ne sont pas toutes identiques : soit l’échantillon a été mal préparé, soit les molécules ont des orientations différentes.

Un mutant sans Tyrosine.

Des mutants ont été préparés : la Tyrosine a été remplacée par une Phénylalanine. On observe alors beaucoup moins de pics dans la région qui nous intéresse : le spectre différentiel donne seulement un creux et un pic. Le mutant est moins hétérogène que le sauvage. L’hétérogénéité du sauvage venait de la Tyrosine, qui a en fait deux possibilités d’interactions.

Les résultats sont proches des basses fréquences. Chez le sauvage, on a un doublement des séquences qui vient d’une interaction plus ou moins forte du CO avec la Tyrosine. Une modification de la séquence protéique et de la masse du CO donne une solution.

Fréquences hautes vibrations pour la liaison C-O.

L’autre région du spectre correspond à la fréquence de vibration entre le C et O. Les hautes fréquences dépendent de ce qui va changer la masse effective. Le déplacement est ralentit si il y a une liaison sur le C ou le O.



Une liaison hydrogène utilise les électrons de la liaison CO. Si le CO est lié sur le Fer, on utilise des électrons entre le C et le O pour les mettre entre le C et le Fer : la fréquence va alors diminuer. Le CO est lié sur le Fer, donc sa fréquence de vibration va diminuer.

d : Une liaison en deux temps.

Deux liaisons hétérogènes, avec des forces différentes.

L’hétérogénéité apparaît dans le dédoublement de la fréquence. C’est effectivement le cas pour le type sauvage, mais pas chez le mutant. On se retrouve loin des fréquences normalement attendues. La fréquence du mutant est intermédiaire entre les deux fréquences du type sauvage. La différence observée vient des interactions de l’oxygène avec son environnement. Le sauvage présente deux types d’interactions : une plus forte et une plus faible, que chez le mutant. La mesure est plus sensible qu’avec le Fer, car les fréquences de vibrations sont plus hautes et présentent donc plus de possibilités de vibration. Aussi, on se trouve plus près des liaisons hydrogène formées, donc la sensibilité est augmentée. C’est lié à la force des liaisons hydrogènes : on a une corrélation entre les vibrations avec le Fer ou l’oxygène. On a toutes les possibilités de liaisons hydrogènes. Il existe un lien énergétique direct avec la force de la liaison. Plus il y a de déplacements de fréquence, plus il y a de force avec la liaison hydrogène.

Deux types de liaisons suivant le ligand.

Dans l’organisme sauvage, il existe deux formes de liaisons : - soit on 1 ou 2 liaisons très fortes. - soit il y a des liaisons faibles. Le mutant n’a qu’une seule conformation possible.



Cela affine l’idée d’un site de liaison et le rôle de la Tyrosine. On peut expliquer la sélectivité de l’oxygène par rapport au CO. La tyrosine a des interactions spécifiques avec l’O2, mais pas du tout avec le CO. Il y a tout de même quelques interactions avec le CO. On peut suggérer qu’il y a une séquence d’évènements différents, suivant si on lie de l’oxygène ou du CO.

Une liaison en deux étapes.

Si le site de liaison est vide, il peut accepter de l’O2 ou du CO. Le ligand se lie avec le glutamate.

Ensuite, on forme une seconde liaison hydrogène avec la Tyrosine. Cette étape est différente suivant si le type de ligand : - pour l’O2 : tout se passe très bien, l’oxygène forme une liaison hydrogène forte avec la tyrosine. L’O2 forme donc deux liaisons fortes. - pour le CO : cette étape ne marche pas, une fraction du CO formera une seconde liaison hydrogène, mais de type faible. C’est pour cela qu’il n’y a pas de modifications dans le spectre de la Tyrosine. C’est l’illustration d’un cas typique du mode de liaison forte en deux étapes d’une protéine avec un ligand. La liaison est forte, car le ligand est très lié au final. Les deux étapes correspondent à deux liaisons qui se forment successivement. L’hémoglobine présente deux aspects chimiques, synonyme d’une plus grande sélectivité du substrat. La sélectivité se joue lors de la seconde étape de liaison, lorsqu’il y a une interaction avec l’autre extrémité de la molécule : un C ou un O.



4 . Une enzyme de la détoxification.

Cette protéine n’est pas là pour transporter l’oxygène : elle le détruit, dans le cadre d’un phénomène de détoxification. Cette hémoglobine a un rôle de désoxygénase, activée par le nitroxide (NO). La présence de NO est déterminée par l’intermédiaire d’une Cystéine. L’hémoglobine doit être activée pour pouvoir lier fortement l’oxygène. Elle extrait ainsi des électrons du Fer vers l’oxygène : on a alors formation d’un super oxyde très réactif. Cette espèce d’oxyde interagit avec tout : c’est un ion radicalaire qui interagit avec le NO pour former du nitrate.

Cette réaction est une amorce qui permet de fabriquer une hémoglobine oxydée (pas oxygénée), qui peut interagir avec d’autres NO. Cette nouvelle forme va ensuite interagir avec un anion de la Cystéine. La Cystéine a un pKa de 8, c’est donc une espèce facilement déprotonable : on arrive alors à un Fer ferreux et une Cystéine nitrosylée. De nouveau, l’hémoglobine va interagir avec l’oxygène et la cystéine nitrocylée pour obtenir du nitrate et une Cystéine radicalaire, qui revient à son état de départ en captant un électron. Ce système permet à l’hémoglobine d’être une enzyme qui consomme de l’oxygène pour fabriquer du Nitrate. Cette hémoglobine a la même structure que d’autres hémoglobines, mais elle joue un rôle différent qui n’est pas évident à trouver. En tout cas, il n’y a pas d’intérêt biologique normal à trop lier l’oxygène.



II. Neuroglobines et Cytoglobines.

1 . Deux nouvelles globines avec des fonctions inconnues.

La neuroglobine se trouve dans les neurones et la cytoglobine se trouve un peu partout dans les tissus. La neuroglobine se trouve dans des tissus particuliers : les neurones et les islets β du pancréas, qui s’apparentent beaucoup au tissu neuronal.

Il y a cinq possibilités de fonctions pour une globine se trouvant dans les neurones : - elle aide à la diffusion de l’oxygène dans les tissus. - elle est impliquée dans la régénération du NADH : si les neurones sont trop réducteurs on doit diminuer la quantité de NADH et augmenter celle de NAD+. - elle serait comme un enzyme qui désactive les espèces d’oxygène réactives, qui peuvent faire des dégâts dans cellules (ROS) : les neurones sont très sensibles aux dégâts. - elle permet de se débarasser des nitroxides, comme chez Ascaris. - elle sert de senseur de la concentration en oxygène dans les cellules.



2 . Alignement de la neuroglobine.

Pour essayer de déterminer la véritable fonction de la neuroglobine : on aligne les séquences avec la cytoglobine, la myoglobine et d’autres types d’hémoglobines. On a aussi ajouté la structure de l’hémoglobine pour voir à quoi correspondent les résidus conservés.

On remarque alors une chose frappante : on peut faire un nouveau pont disulfure dans la neuroglobine. On retrouve aussi les histidines distales et proximales à côté de l’hème.

3 . Un nouveau pont disulfure : régulation par la cellule.

a : Rôle des Cystéines.

On fait aussi des mesures pour vérifier les idées qui sont vraisemblables. La Cystéine, avec la possibilité de former un pont disulfure, peut suggérer une liaison hydroxide, comme chez Ascaris. On remarque des résidus de lysines dans des régions importantes de la structure, ce qui suggère que cette protéine pourrait agir sur l’état redox de la cellule, ou une activité enzymatique régulée par cet état redox.



b : Position et réactivité des cystéines.

On observe ensuite l’accessibilité des Cystéines, car elles peuvent être réactives quand elles sont exposées à l’environnement. Si elles sont complètement enfouies, il est peu probable qu’elles jouent un rôle. La réactivité des Cystéines devant le DTNT permet de voir sous quelles formes sont les Cystéines.

Certaines Cystéines de la neuroglobine sont réactives : si on mute ces Cystéines on modifie leur réactivité. On peut alors démontrer quelles Cystéines forment des ponts et celles qui sont réactives ou non.

On regarde aussi comment on peut réduire les différents ponts (par spectroscopie de masse) en ajoutant un agent réducteur. On augmente alors de deux unités de masse, ce qui peut être résolue avec les techniques actuelles. Les ponts disulfures peuvent être réduits : il y a possibilité d’un lien avec l’état redox de la cellule.



c : Comportement en présence de CO.

On observe maintenant la réactivité des neuroglobines en présence de CO, tout en modifiant l’état redox de la cellule. Si un pont s’ouvre, il peut former des liaisons avec le ligand. L’état redox de la cellule peut alors réguler cette activité. La cinétique de liaison du CO correspond à une mesure classique pour les hémoglobines. On peut voir que dans des temps très courts, on a une cinétique exponentielle caractéristique d’un système à 2 temps pour la liaison du CO. Lorsqu’on observe la liaison, une partie se relie très vite contrairement à l’autre. Ce qui est intéressant, c’est la phase lente : le graphique obtenu est typique d’une neuroglobine réduite qui lie moins vite l’oxygène, que la forme oxydée.

d : Modèle de régulation par l’état redox de la cellule et conclusions.

On a mis en place un modèle de régulation de l’état de la neuroglobine par l’état redox de la cellule. L’état oxydé lie facilement l’oxygène, tandis que l’état réduit a une affinité plus faible pour l’oxygène et donc le lie moins facilement. Il existe un couplage entre l’oxygénation de l’hème et l’oxydation des groupements sulfydriles des ponts disulfures, se trouvant à la surface de l’hémoglobine.



Les mesures cellulaires sur des souris knock-out ont montré que les cellules neuronales survivent mieux en anoxie si ils possèdent une neuroglobine. On sait que la protéine lie l’oxygène, ce qui pourrait intervenir sur les trois premières fonctions proposées. Par contre, pour montrer si la fonction de la neuroglobine est la même que l’hémoglobine d’Ascaris, toutes les manipulations ont échouées.

4 . Un autre rôle : la signalisation de l’oxygène.

A partir des mesures sur l’oxydation et l’oxygénation, on a pensé à un rôle de signalisation. On a alors aligné la neuroglobine avec des domaines RGS : ce sont des domaines de régulations de protéines régulatrices.

a : Alignement avec les domaines RGS.

Dans une partie de la neuroglobine, il y a eu conservation d’une petite partie de la séquence des protéines régulatrices : il y a bien un lien structural entre les domaines RGS et la neuroglobine. Les deux molécules sont formées de faisceaux d’hélices α.

C’est quelque chose de faible, mais qui peut être intéressant : il faut maintenant montrer une interaction entre la neuroglobine et les protéines G, qui interviennent dans la signalisation de l’oxygène.



b : Interaction de la neuroglobine avec les protéines G.

Pour observer l’interaction entre la neuroglobine et les protéines G inhibitrices, on utilise un appareil qui donne un signal de résonnance de surface. Il permet de mesurer la quantité de neuroglobine qui se lie à un support où sont accrochées des protéines G.

On obtient un cinétique de liaison de la neuroglobine : elle peut donc interagir avec les protéines G. Les neuroglobines pourraient donc être impliquées dans la signalisation. La seule chose qui peut influencer cette liaison c’est l’état d’oxydation du Fer.

c : Rôle dans l’hypoxie cellulaire.

Ce modèle montre l’importance de la neuroglobine : elle permet de répondre à l’hypoxie neuronale. Normalement l’hémoglobine se trouve dans un état oxygéné. Mais en cas d’hypoxie, on a formation d’une hémoglobine oxydée, capable de lier une protéine Gα. Cela désactive le Gα, ce qui l’empêche d’inhiber les protéines Gβ. Il y a ensuite une activation d’effecteurs qui peuvent aider à la survie de la cellule.

Deux séries de manipulations différentes, ont permis de suggérer un rôle pour la neuroglobine, qui est peut-être un rôle de signalisation.



III. Conclusions.

On peut voir à travers cet exemple combien il est difficile de trouver une fonction pour une protéine à partir de sa séquence. Les alignements sont peu informatifs et corrects lorsqu’on compare des séquences ayant une faible identité. On pense actuellement, vu les différents rôles que l’hémoglobine peut avoir, que son rôle ancestral n’est pas le transport de l’oxygène. Pour pouvoir observer en détail les sites de liaison on utilise surtout la spectroscopie. Plusieurs facteurs peuvent influencer la sélectivité d’une protéine : l’affinité, la sélectivité, les liaisons fortes à multiples étapes, … Il est très dur de trouver une fonction, par contre il est plus simple de trouver une protéine qui correspond à une fonction connue. L’objectif est de prouver qu’une fonction est possible mais pas les autres.



LES HEMOGLOBINES : UNE GRANDE FAMILLE

I. Une famille de protéines très diverses.

Les hémoglobines se retrouvent dans tous les domaines du vivant, parmi toutes les espèces : - chez les bactéries et les archées : les flavohémoglobines, les hémoglobines et les hémoglobines tronquées. - chez les algues et les protozoaires. - chez les végétaux : les leghémoglobines et les hémoglobines. - chez les animaux.

Toutes ces hémoglobines se trouvent sous différentes formes : - un simple domaine hémoglobine, ou deux domaines, ou encore des protéines à domaines multiples. - des protéines chimères. - des protéines monomériques ou dimériques. Attention, une protéine a deux domaines et différentes d’un dimère. Une protéine à deux domaines possède des liaisons covalentes entre ses domaines, tandis qu’un dimère est composé de deux protéines disctinctes qui s’assemblent.



II. Construction d’un arbre phylogénétique.

La comparaison de toutes les hémoglobines est difficile, car elles sont très variées. Entre l’hémoglobine d’Ascaris et l’hémoglobine humaine, le taux d’identité est très faible, quasiment le même que deux séquences aléatoires. Lorsqu’on a une série de séquences ne présentant pas de similitudes, il est difficile de construire un arbre phylogénétique.

1 . Un gabarit nécessaire pour cette construction.

a : Un alignement de protéines.

Pour faciliter l’étude des hémoglobines, qui est une grande famille, on a besoin d’un gabarit : c’est le patron de la séquence des hémoglobines, avec les possibilités de séquences à chaque position. Pour le construire, on se base sur un alignement structural, plutôt que sur un alignement de séquences : on aligne les hélices ensemble. Ce type d’alignement apporte plus d’informations car on y incluse le codage du repliement de la protéine. Par contre, on doit se méfier des biais dû au nombre de séquences de mammifères par rapport à d’autres espèces : en effet, les positions les plus fréquentes en apparence, ne sont pas forcément les plus essentielles.

b : Gabarit de l’hémoglobine.

La structure de l’hémoglobine peut résulter de plusieurs séquences bien différentes. Seulement deux résidus sont essentiels à la forme de l’hémoglobine : une Phénylalanine dans la boucle CD et une Histidine proximale qui se lie au Fer de l’hème.



Le gabarit indique les positions des acides aminés possibles dans l’espace. On y trouve les acides aminés trouvés les plus fréquemment, mais aussi d’autres possibilités moins fréquentes.

c : Des possibilités d’acides aminés inattendues.

Par contre, parmi les différentes possibilités pour une position donnée, on ne retrouve pas forcément des acides aminés similaires au niveau de leurs propriétés. Par exemple, le résidu E7 peut-être : - une Histidine (c’est l’Histidine distale) qui joue un rôle très important. - une Glutamine, ce qui n’a pas grand chose à voir avec une Histidine. - sinon une Valine ou une Leucine, qui ne sont pas considérés comme des acides aminés similaires à l’Histidine ou la Glutamine. Ici, soit l’acide aminé lie un ligand, soit il est hydrophobe car il se trouve à l’intérieur de la protéine. Le résidu C2 peut-être : - une Proline, qui est un acide aminé bien particulier : c’est le plus rigide des acides aminés. - une Glycine, qui est l’acide aminé le plus flexible et le plus petit. - S ou T. - A ou G, ce qui peut-être plus grave, car ils sont totalement différents de la Proline. Une modification vers un acides aminé similaire ne veut pas dire grand-chose : ce qui est similaire pour une protéine, n’est pas forcément similaire pour nous. Chaque possibilité, ou impossibilité, renseigne sur ce qui est important pour la protéine. Cette importance est basée sur l’étude des hémoglobines.



2 . L’arbre des hémoglobines.

Le gabarit permet d’aligner les séquence : les score et pénalités sont indiqués pour toutes les positions. Le gabarit correspond à une matrice qui permet alors de construire un arbre.

a : Un arbre avec quelques places mélangées.

On retrouve plusieurs groupes différents : - les ciliates, les chalmydomonas et le Nostoc (une espèces d’algues). - les levures et les bactéries. - les plantes et les métazoaires.

Cet arbre phylogénétique est typique d’un arbre de protéines très anciennes. Il permet de donner un âge très ancien pour la famille des hémoglobines. On peut aussi dire qu’il y a eu des transferts horizontaux chez les bactéries et les eucaryotes.

b : Comparaison avec l’arbre des ribosomes.

On peut comparer cet arbre à l’arbre des ARN 16S et 18S, ce qui correspond aux ribosomes. Il est impossible d’avoir des transferts horizontaux des gènes ribosomiques : l’arbre obtenu serait typique d’un arbre sans transferts.

Les différences avec d’autres arbres renseignent sur les différents transferts qui ont eu lieu. Ici, le Nostoc devrait être avec E. Coli, et les levures devraient être avec les eucaryotes. Chez les hémoglobines, on a eu deux transferts : des ciliates vers les algues, et des levures aux bactéries (la direction de ce transfert n’a pas bien été déterminée).



III. Evolution archaïque des hémoglobines.

1 . Des origines très anciennes.

La famille des hémoglobines a des origines archaïques, environ 2 milliards d’années. Cette origine pourrait encore être repoussée à 4 milliards d’années, aux origines de la vie. Cette protéine est très ancienne : c’est une des premières à exister. Elle est donc forcément très importante. A l’époque de l’émergence des hémoglobines, il n’y avait pas d’oxygène : le rôle initial de cette protéine ne serait donc pas de lier l’oxygène. Elle pourrait être une protéine redox, mais ce n’est qu’une hypothèse !

2 . Beaucoup de rôles différents dans une même famille.

D’autres protéines sont très semblables aux hémoglobines mais on ne sait pas si elles ont un ancêtre commun avec les hémoglobines. Ces protéines sont aussi uniquement composées d’hélices α. - les phycocyanines sont des protéines collectrices de lumière. - les colicines sont des protéines tueuses de bactéries. - la toxine diphtérique est une toxine. - l’hémocyanine permet de transporter l’oxygène en le fixant sur un atome de Cuivre, et non un hème comme les cytochromes de type β.

La famille des hémoglobines rassemble donc plus que des hémoglobines.



3 . Un rôle ancestral différent du rôle actuel.

a : La liaison de l’O2 est une fonction moderne.

Avec une augmentation de l’oxygène dans l’atmosphère, le rôle de l’hémoglobine pour la liaison de l’oxygène devient alors important. Mais ce lien est secondaire. La liaison plus ou moins bonne de l’oxygène ne suit pas l’arbre : l’acquisition de cette fonction est différente, plus moderne. Les autres protéines ont aussi un lien à trouver.

b : Des similitudes de structure plus ou moins frappantes.

Pour trouver ce lien, on aligne un cytochrome avec une phycocianine. La phycocianine contient un cofacteur qui ressemble à l’hème, composé de 4 pyrroles linéaires. Ce cofacteur se lie à la protéine dans une crevasse formée par un sandwich d’hélices α. On a bien une similitude de structure avec les hémoglobines. Le cytochrome possède un hème, mais pas une organisation en sandwich : on a tout de même des hélices dans deux plans différents. L’interaction de l’hème avec la protéine n’est pas du tout la même. Il existe des signatures subtiles et donc plusieurs possibilités de conclusions.

c : Une autre évolution, vers une très forte affinité pour l’O2.

Un autre aspect intéressant, c’est que les différentes hémoglobines qui ont évoluées pour avoir une très haute affinité pour l’oxygène, présentent deux types d’évolution : - soit l’étape de dissociation est lente, et l’étape d’association se fait à vitesse normale. - soit l’étape d’association est rapide et la dissociation normale. C’est le cas des léghémoglobines des légumes, de candida chez la levure et de lucida. On peut acquérir une haute affinité par différents moyens : l’évolution s’est faite en plusieurs fois et indépendamment, pour arriver au même résultat.



IV. De nouvelles hémoglobines a étudier.

Chaque année, on trouve de nouvelles hémoglobines. Le Docteur Hou a trouvé une hémoglobine chez les bactéries et les archées. La découverte initiale s’est faite dans une archée, étudiée à l’origine pour la bactériorhodopsine, et dans une bactérie. On veut connaître la fonction de ces nouvelles hémoglobines : cette protéine sert à l’aérotoxie, la détection de l’oxygène dans le milieu.

1 . Une protéine a deux domaines.

Ces protéines sont différentes des hémoglobines classiques : elles sont plus grande, 400 résidus. Elles sont constituées de deux domaines : - un domaine hémoglobine, présentant 16% d’identité avec la myoglobine. On trouve une bonne identité malgré un éloignement évolutionnaire. - un domaine de 200 résidus, 30% identique aux sites de signalisation des protéines chémotaxiques. Ces protéines acceptent un groupement méthyl.

La fabrication d’une protéine chimère permet de trouver la fonction de cette protéine. L’hémoglobine va interagir avec l’oxygène, tandis que la partie chemotaxie intègre l’oxygène. Il reste maintenant à démontrer le rôle physiologique de la chemotaxie.

2 . Fabrication d’une hémoprotéine.

Une expérience a été faite, suivant une démarche actuelle : cette technique utilise des bactéries, ce qui est mieux que des eucaryotes. La protéine, affublée d’un Tag-Histidine, est insérée dans Coli, pour permettre une production en masse de cette protéine. On obtient alors une protéine pure de fonction inconnue.



Les protéines purifiées, sont correctement repliées et colorée : - à 400nm elles ont une grande absorption. - entre 550 et 600nm, on a des informations sur les hémoprotéines. On fait une comparaison de la myoglobine, avec notre protéine purifiée venant d’archées ou de bactéries. En présence d’oxygène, les spectres obtenus sont identiques au niveau des positions : la protéine lie bien l’O2. Les spectres montrent aussi que si on supprime l’oxygène, ils sont modifiés de façon semblable. De plus, lorsqu’on ajoute du CO, on récupère les deux pics obtenus précédemment. L’étude se fait sur une petite quantité de cette protéine, il est alors impossible de travailler in vivo. La molécule est capable de lier ou relarguer l’oxygène ou ne CO. Cette protéine se comporte comme une hémoprotéine.

3 . Un rôle dans l’aérotaxie.

Cette protéine pourrait jouer un rôle dans l’aérotaxie. On utilise la génétique moléculaire pour modifier cette protéine, afin de déterminer le rôle de la protéine. Les images représentent des tubes horizontaux, avec un ménisque sur la droite, qui contient les bactéries. Lorsqu’on éclaire l’échantillon d’un côté, on peut regarder par diffusion : les bactéries apparaissent en blanc sur un fond noir.



Dans la souche sauvage, les bactéries migrent vers la surface : on a une accumulation des bactéries au niveau du ménisque. C’est une réaction d’aérotaxie normale.

L’aérotaxie est normale chez Coli, si on supprime le signal on perd la fonction d’aérotaxie : les bactéries ne s’accumulent plus sur le ménisque. On peut retrouver l’aérotaxie en rajoutant notre protéine d’intérêt. Il faut plusieurs dizaines de millisecondes pour obtenir des changements. Ce résultat est compatible avec un rôle de signalisation.

4 . Une structure incomplète.

Il existe une communication entre les deux domaines de la protéine. La structure de la protéine qui a pu être déterminée ne correspond pas à toutes la protéine. On a une structure en dimère qui possède une partie protéine : c’est un dimère bien assemblé.

Est-ce qu’on a obtenu un dimère à cause d’une forte concentration en protéines : il peut y avoir une précipitation, ce qui favorise la formation de dimères non physiologiques.



Le domaine de l’hémoglobine est plus grand que la taille habituelle d’une globine. Ceci vient de la présence d’une hélice supplémentaire : l’hélice Z supplémentaire se trouve au début de la protéine, avant l’hélice A. Il existe une bonne similitude avec d’autres hémoglobines, malgré l’hélice supplémentaire.

5 . Comportement avec un ligand.

Pour regarder l’effet de la liaison d’un ligand sur l’hème, on utilise du cyanure. On obtient alors deux structures différents, suivant la présence ou non de cyanure. Un changement structural est associé à la liaison du ligand. Le domaine de l’hème est changé de façon différente par rapport aux changements observés sur l’hémoglobine. L’Histidine proximale se trouve de biais : le changement de structure de l’Histidine en présence de cyanure, est dû à un glissement de l’hème hors du plan. L’Histidine change de direction pour pointer le groupement hydroxyle vers le ligand : son rôle est similaire à l’Histidine distale.

Il existe des similitudes de fonctionnement dû à des petits déplacements de l’hème et de la liaison de l’hydrogène de l’autre côté du ligand. Seulement ce sont des résidus différents qui sont impliqués dans ces déplacements.



Le diagramme est perturbé à cause de la forme du dimère. Est-ce que le ligand empêche la formation du dimère ? La protéine est-elle toujours symétrique ? Le résultat se trouve sous forme de matrice, composée de petits carrés. Lorsqu’on compare deux protéines, on regarde, pou chaque paire de position, la différence de distance entre les deux résidus comparés. Le code couleur utilisé correspond à ces changements : - pas de changement : blanc. - une augmentation de la distance : rouge. - une diminution de la distance : bleu.

Si il y a une symétrie, alors on obtient un signal sur la diagonale (de haut en bas). Si il n’y a pas de symétrie, alors on a des couleurs sur l’autre diagonale (de bas en haut). On obtient quatre blocs correspondant aux deux sous-unités dans les deux protéines comparées. Si tout était symétrique, on aurait une répétition horizontale. Seulement, on a une symétrie par rapport à la diagonale. Lorsqu’on ajoute le ligand dans le cristal, on obtient une indication sur une modification de l’imbrication en présence du ligand. L’ajout de ligand joue sur le dimère : on aurait alors une dissolution du dimère si il se trouvait en solution. Les protéines impliquées dans la signalisation sont souvent dimériques. Une partie de l’information passe par l’association ou la dissociation du dimère, suivant les conditions environnementales.



V. Les leghémoglobines, ou hémoglobines végétales.

1 . Deux types d’hémoglobine végétales.

Les hémoglobines végétales regroupent deux types de protéines ayant des rôles différents (on ne comprend pas encore tous ces rôles) : - les hémoglobines tronquées sont des petites hémoglobines qui n’ont pas assez de protéines pour faire un véritable sandwich. - les hémoglobines impliquées dans la symbiose des racines, leurs structures sont proches de celles d’autres hémoglobines.

2 . Différents rôles pour ces hémoglobines.

Le rôle est différent suivant la physiologie des plantes . Les hémoglobines tronquées sont associées à la photosynthèse : on le trouve dans les chloroplastes. Elles ont un rôle de photoprotection : l’oxygène est très réactif, surtout en présence de lumière, et il est produit par les plantes. Les leghémoglobines sont associées à des bactéries, qui vivent dans les racines des plantes. Elles sont essentielles à la bonne fixation de l’azote. Elles sont capables de réduire la pression partielle en oxygène, dans les racines où vivent ces bactéries. Cela permet de maintenir la plante en vie ) basse pression en oxygène. Il y a bien un lien avec la symbiose, mais on a beaucoup d’hypothèses.



Si le rôle n’est pas symbiotique, alors c’est peut-être : - un rôle de signalisation, - de transport de l’O2 vers les racines, - d’oxydase terminale activée par le NO, - de protéines redox utilisée dans la réduction d’ions métalliques. C’est la liste des rôles typiques des hémoglobines ayant une fonction inconnue.

3 . Les leghémoglobines et la fixation de l’azote.

Les leghémoglobines ont un rôle dans la fixation de l’Azote. On sait comment fonctionne le système, mais on ne connaît pas le rôle exact de l’hémoglobine dans le système. La coupe de cellules végétales présente une rougeur au milieu des nodules : cela correspond aux leghémoglobines. Les bactéries sont nourries par la plante à travers un le système d’apport d’eau et de sucre. Les cellules qui contiennent les bactéries vont fabriquer de l’ammoniac.



On trouve des sacs à bactéries dans la cellule. Ces bactéries peuvent fixer l’Azote à l’aide d’une nitrogénase, qui fait une réaction compliquée. Mais cela implique des cofacteurs multimétalliques : sous la forme d’une cage de métaux.

Ces structures métalliques sont très réactives, mais elles sont aussi détruites par l’oxygène. Il est donc nécessaire de protéger ce système de l’oxygène. Par contre, il existe une autre contrainte : les bactéries qui sont dans les cellules de plantes on besoin d’oxygène pour survivre. Cette contradiction est possible grâce à la présence des hémoglobines. Cette protéine est un bon exemple de la complexité physiologique associée à l’hémoglobine. Mais on ne connaît toujours pas le rôle primordiale de l’hémoglobine : détruire l’oxygène, ou le transporter vers les cellules.

structure et fonction de l’hémoglobine : analyse d’un...

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