sviluppo e ottimizzazione - copia
TRANSCRIPT
Sviluppo e Ottimizzazionetramite “Experimental Design” di un metodo SPME-GC-MS/MS
per la determinazione del la sarcosina in ur ina
Consultando i Registri dei Tumori si evince che attualmente il carcinoma prostatico nei Paesi Occidentali è il secondo tumore maschile più frequente: nei Paesi della Comunità Europea presenta un tasso di incidenza di 55 casi su 100.000 individui e un tasso di mortalità di 22,6 decessi su 100.000 individui; in alcuni Paesi, quali Stati Uniti e nei Paesi Scandinavi rappresenta il tumore addirittura più frequente fra i maschi.
Questi dati epidemiologici spingono quindi ad apportare miglioramenti alle attuali strategie cliniche.
PREMESSA:
sarcosina, nuovo biomarker per la diagnosi del cancro alla prostata.
La diagnosi si effettua mediante:• esame digito-rettale( DRE)• Agobiopsia prostatica• Dosaggio del PSA sierico• Ecografia trans-rettale (TRUS)
Sebbene si tratti di una patologia grave, essa può essere tenuta sottocontrollo se diagnosticata tempestivamente, soprattuttutto prima della comparsa di sintomi.
Attuali strategie diagnostiche
il più adatto come test di screening per considerazioni complessive di costi e facilità di esecuzione. Tuttavia manca di un’adeguata accuratezza diagnostica in assenza di sintomi, poiché è un biomarker organo-specifico, ma non tumore-specifico.
Caratteristiche Marker tumorale in diagnosi precoce•Sensibilità, presente in tutti i pazienti con una determinata patologia •Specificità, tipico del tumore e assente nei tessuti non neoplastici
Come reso noto negli ultimi mesi sulla rivista “Nature”, sono state avviate delle ricerche volte all’individuazione dei metaboliti che distinguono le patologie benigne, il carcinoma alla prostata e le sue metastasi nella forma avanzata. Da campioni di tessuto prostatico, siero e urine, sono stati isolati metaboliti che distinguono il cancro alla prostata rispetto il tessuto prostatico benigno. Di questi metaboliti 6 sono risultati di particolare interesse, perché i loro livelli sono stati superiori nel tessuto metastatico. In particolare la SARCOSINA in urina è stata vista come biomarker per la progressione del cancro.
Introduzione: Per discriminare i tumori dalle altre condizioni è stato speso un grande impegno nella ricerca di nuovi marker specifici in grado di individuare il cancro e discriminare tra le forme aggressive e indolenti.
La sarcosinaE’ un derivato metilato dell’amminoacido glicina.
CAMBIAMENTI dei LIVELLI di SARCOSINA
riflettono
SVILUPPO e PROGRESSIONE del cancro alla
prostata
Biomarker diagnostico
\
NH
COOH
Obiettivo del lavoro di tesi : Sviluppo di un metodo ‘easy’ per la determinazione della sarcosina in urina Punto di partenza: metodo che ha portato all’individuazione della sarcosina
Iniettare nel GC-MS campione di urine da analizzare previa derivatizzazione.
Procedura lunga e laboriosa,Impiego di solventi organici
inquinanti
Sangue
Tessutoprostatico
urine
Benigno
carcinoma
metastatico
Preparazione campione:1. Estrazione sequenziale in fase organica2. Liofilizzazione3. Risolubilizzazione4. Dissecamento5. derivatizzazione in ambiente anidro (N2)
dopo 24 ore dal dissecamento
separazione/ rilevazione GC-MS
Spettri di massa1. Identificazione picco 2. Analisi quantitativa
Necessità di sviluppare un metodo alternativo:
sul campione di urina tal quale,Più rapido ed efficiente,
Ecologico.
Solid-Phase MicroExtraction (SPME)
Sul campione di urina da esaminare previa derivatizzazione.
Scelta del metodo:
Esposizione fibra al campione
In spazio di testa (HS-SPME) analiti volatili matrici problematiche
In immersione direttaanaliti meno volatiliDeterioramento fibra più rapido.
equilibrio tra fasi eterogenee
t ads
Introduzione fibra iniettore GCDesorbimento termico.
Intrododuzione analita in colonna cromatografica
Metodo SPME-GC-MS
Sviluppo del metodo SPME-GC-MS/MS.I -Derivatizzazione amminoacidi in campioni biologici SCOPO: rendere gli amminoacidi volatili, quindi investigabili tramite GC-MS.
Metodo scelto: COOHR
NH2
HN
O
OR2
ROR1
O
Alchil cloroformiatoAlcool/py
Temperatura ambiente(2 min)
amminoacido N-alcossicarbonilestere
• CH3OH/isobutil cloroformiato• isobutanolo / isobutil cloroformiato• etanolo/ etil cloroformiato
N
O
OEt
OEt
O
Etil cloroformiatoEtanolo/py
Temperatura ambiente(2 min)
sarcosina sarcosina derivatizzata
NH
COOH
Estratto con SPME
II-Valutazione del tempo di reazione, treaz Da prove su una soluzione di 1mg/L di sarcosina
treaz 2min5 min 10 min15 min20 min
La resa della reazione non aumenta oltre.
I -Derivatizzazione amminoacidi in campioni biologici
III-Scelta programmata di temperatura forno GCProve direttamente in urina 50 mg/L di sarcosina .
sarcosinaalanina
T(°C) v (°C/min) Hold(min)
50 0 10210 20 5280 30 2
50 75 100 125 150 175 m/z
0%
25%
50%
75%
100%
44
56
72 88
102
116
130
143
164189
NH
COOH H2N COOH
sarcosina alanina
T(°C) v (°C/min) Hold(min)
70 0 5210 8 2280 60 2
Spettro di massa EI full scan
13.5 14.0 14.5 15.0 15.5 16.0 16.5minutes
0
5
10
15
20
25
30kCounts
0
10
20
30
40
50
60
kCounts
010203040506070
kCounts
0
10
20
30
40
50
kCounts
A
B
C
D
Rs= 0,84
Rs= 1,2
Rs= 1,8
Rs= 1,5
IV-Scelta della fibra e del tempo di adsorbimento analisi SPME in immersione .Scopo: escludere a priori le fibre meno efficienti e inserire nell’Experimental Design solo una fibra.
2 min 5min 10 min 20 min0
50000100000150000200000250000300000350000
tads fibra Polyacrilato
Kcount
2 min 5 min 10 min 20 min0
50000
100000
150000
200000
250000
tads fibra CAR/ DVBKc
ount
2 min 5 min 10 min 20min0
50000100000150000200000250000300000350000400000450000500000
tads fibra DVB/ CAR/ PDMS
Kcou
nt
2 min 5 min 10 min 20 min0
50000100000150000200000250000300000350000400000
tads fibra PDMS/DVB
Kcount
2 min 5 min 10 min
20 min
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
t ads fibra PDMS
Kcou
nt
az-zurra
10 min
bianca 10
min
grigia 2 min
rosa 5 min
rossa 5 min
050000
100000150000200000250000300000350000400000450000500000
Kcount
In immersione, precoce deterioramento della fibra;La piridina è la probabile causa.
Analisi SPME in spazio di testaLe condizioni di estrazione però cambiano ⇒
V-Valutazione fibra in head-space
bianca azzurra grigia rosa rossa
020000400006000080000
100000120000140000160000180000
fibra
Area
tads=20 min
In head-space n° di molecole adsorbite dalla fase stazionaria correlato rapporto volume campione/volume vapore spazio di testa.
VI-Valutazione volume campione
3 ml 4 ml 5 ml0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
Series1
Area
VII-Analisi in spettrometria tandem (MS/MS):Scopo: aumentare sensibilità e selettività del metodoisolamento ione caratteristico dell’analita
Frammentazione
Ioni figli caratteristici
Corrente ionica ioni figli
• si annulla il problema interferenti
• aumenta il rapporto segnale/rumore.
Picco base spettro in EI full scan e CI full scan
picco base EI-full scan
50 75 100 125 150 175 m/z
0%
25%
50%
75%
100%
5771
80
91 105
116144
158167173
190
Spect 1
picco base CI-full scan
Overlaid Chromatogram Plots
12.5 13.0 13.5 14.0 14.5 15.0 15.5 minutes
0
50
100
150
200
250
300
350
Counts
0
50
100
150
200
250
300
350
Counts
preferibileCI-MS/MS E= 0.3 volt
EI-MS/MS E= 0.38 volt
50 75 100 125 150 175 m/z
0%
25%
50%
75%
100%
44
56
72 88
102
116
130
143
164189
VII-Analisi in spettrometria tandem (MS/MS):
VIII - Ottimizzazione parametri HS-SPME tramite “Experimental Design”Le analisi SPME sono sensibili ai seguenti parametri:
• fibra
• tempo di desorbimento
• tempo di adsorbimento
• temperatura di desorbimento
• temperatura di adsorbimento
• presenza di Sali
• pH
Poco importante,analita non sensibile alla temperatura
Già scelta
Non valutato • allungamento tempi di analisi• range di pH della fibra 1-7⇒ variazioni di pH solo verso valori acidi, ma presenza di funzione amminica ⇒ nessun miglioramento analitico
4 parametri da studiare
Scopo: individuazione variabili più significative
20 prove sperimentali CI-MS/MS Fibra poliacrilato Variazione 4 parametri SPME prescelti
Ottimizzazione parametri SPME
2 possibilità:Approccio univariatoApproccio multivariato Experimental Design
variabili sono fatte variare contemporaneamente•Singolo effetto di ogni variabile• Interazioni tra variabili
adeguatamente progettate :
massima infomazione con minimo numero di prove.-Tempo- costi
Ottimizzazione parametri SPME
Valutazione LOD/LOQSulla base del risultato ottenuto in CI-MS/MS
Il calcolo è stato eseguito secondo le indicazioni IUPAC /Commissione American Chemical Society sulla chimica analitica ambientale:
SRB = segnale di un bianco e σRB = deviazione standard segnale bianco.
Ottenuti analizzando 3 volte un bianco.
LOD = 0,9 µg/L e LOQ =1,7 µg/L.
paragonabili ai valori riportati nel lavoro di Nature
Conclusioni:E’ stato sviluppato un metodo per la determinazione quantitativa della sarcosina.
Metodologia: estrazione analita campione di urina tal quale tramite SPME in spazio di testa dopo rapido processo di derivatizzazione ed analisi CI-MS/MS .
Risultati raggiunti:
•Rispetto dell’ambiente (senza solventi organici)• sensibilità e specificità ( MS/MS)• Riduzione tempi preparazione campione rispetto lavoro su Nature.• Analisi conclusa in 45 min.
Metodo adatto per
procedure di
screening non invasivo