Állatkísérletek Elmélete és Gyakorlata-B szint

Function specific modules B 11/2

Állatkísérletek helyettesítése 2: Sejt és szövettenyésztés;

Szegedi Tudományegyetem ÁOK

Sebészeti Műtéttani Intézet

2017. december 06-december 15.Referencia szám: AA1.0/2015; AB1.0/2015

SZTE ÁOK Biokémiai Intézet

2017-2018-I. szemeszter

Állatkísérletek helyettesítése 2: Sejt és szövettenyésztés; Ex vivo vizsgálatok (Langendorff szív).

Dr. Csont Tamás és Dr. Csonka Csaba

Meghatározások

Ex vivo:

Izolált szervperfúzió a testen kívül

Perfúzió:

A kiválasztott szerv érrendszerén keresztüli folyadék

2

A kiválasztott szerv érrendszerén keresztüli folyadék áramoltatás (ú.m. szív, máj, tüdő, vese, bél, nagyerek, stb.)

Történelem - ex vivo szívperfúziós modell 1.izolált béka szív

1866, Elias Cyon, Carl Ludwig

készülék: hőmérséklet kontrolláltnyúl szérummal perfundáltrecirculating

3

Béka szív: szivacsszerű állománykoronária erek hiányaegy kamra

Történelem - ex vivo szívperfúziós modell 2.

1880: Sydney RingerRinger oldat, Na+, K+, Ca2+

1895: Otto Frnak„Frank Starling” békán

4

„Frank Starling” békán

1915: Ernest Starling„Frank Starling” kutyán

1921 Otto Loewi2 béka szív, egyik neuro intaktparaszimp lassul, chemical neurotransmission(1936 w Henry Dale)

Történelem - ex vivo szívperfúziós modell 3.„Langendorff” perfúzió

Retrográd perfúzió Oskar Langendorff: Untersuchungen am überlebenden Säugethierherzen. Archiv für die gesammte Physiologie des Menschen und der Thiere, Bonn, 1895, 61: 291–332.

5

Állandó nyomás,

szívcsúcs

1904 Gottlieb & Magnus

ballon (isovolumetric)

1939 Katz és mtsai

konstans flow

Történelem - ex vivo szívperfúziós modell 4.Neely-féle perfúzió

„dolgozó” perfúzió

Neely, J.R.; Liebermeister, H.; Battersby, E.J.; Morgan, H.E. Effect of pressure development on oxygen consumption by isolated rat hearts. Am. J. Physiol. 212: 804-814; 1967.

6

804-814; 1967.

ex vivo szívperfúzió

7

Az ex vivo szívperfúzió előnyei

� Gyors, olcsó, könnyen kivitelezhető� Jól reprodukálható, magas elemszám� Szkrínelésre alkalmas� Biokémiai, élettani, morfológiai és gyógyszertani vizsgálatok széles

spektruma elérhető� Szív specifikus kezelések vizsgálatára alkalmas

8

� Szív specifikus kezelések vizsgálatára alkalmas� Ellenőrzött környezet� Iszkémia/reperfúzió� Olyan kísérletek is végezhetők, amelyek in vivo esetben

kivitelezhetetlenek lennének a kísérleti állat halála miatt (pl. infarktus indukált pumpafunkció csökkenés, szívmegállás, aritmiák)

� perifériás metabolikus hatások (NO, NO spin trapping)

Az ex vivo szívperfúzió hátrányai

� Az in vivo modellnél kevésbé fiziológiás� A preparátum folyamatos és időarányos funkciócsökkenése (~10%/h,

ozmotikus)� Csak akut kísérletekre alkalmas (működése kb 3 óráig fenntartható)

9

Az ex vivo szívperfúzió alapkövetelményei

� Kísérleti állatból szív izolálása (szervdonorság nem engedélyköteles)� Perfúziós rendszer� Perfúziós folyadék� Oxigén (karbogén) és oxigenátor� Hőmérséklet kontroll� Sebészi műszerek

10

� Sebészi műszerek� Adatrögzítő rendszer� Gyakorlott kutató

Az ex vivo szívperfúzióra használt kísérleti állatok

� Bármely emlős állat lakalmas� elsősorban patkány (méret és elterjedség)� egér: transzgenikus állatok� nyúl, tengerimalac, hörcsög, , guinea pig, hamster, futóegér, görény� szintén használt: malac, majom, birka, kutya – méret!

11

� szintén használt: malac, majom, birka, kutya – méret!� ember is!

Perfúziós oldat

� Krisztalloid oldat (pl. Krebs-Henseleit oldat, Tyrode’s oldat, stb.)• Tápanyagok az energiatermeléshez (pl. glükóz, pyruvát, szabad

zsírsav, stb.) inzulinnal vagy anélkül• Ca2+ a kontrakcióhoz• Pufferrendszer a pH 7.4±0.05 értéken tartásához (pl. HCO3

-, PO43-)

• Megfelelő extracelluláris ionmiliő (Mg2+, K+, Na+, Cl-), 300 mOsm

12

• Megfelelő extracelluláris ionmiliő (Mg , K , Na , Cl ), 300 mOsm• oxigén (see later)

• Néha szükséges az oldat kiegészítése fehérjével vagy egyéb onkotikusan aktív anyaggal

• Eltarthatóság 2-8 °C max 3 nap

� Vér• Antikoagulánsok, forrás, kimosás (mosogatás), oxigenáció

A perfúziós oldat jellegzetes összetétele

Krebs-Henseleit oldat konc (mM) M (g/mol)

� NaCl 118.5 mM 58.5� NaHCO3 25.0 mM 84� KCl 4.7 mM 74.5� MgSO4 1.2 mM� KH2PO4 1.2 mM

13

� KH2PO4 1.2 mM� glükóz 11.0 mM* 180 � CaCl2 2.5 mM

� EDTA-Na (selecton B2) 0.5 mM 372� piruvát 5.0 mM 110� inzulin 100 mU� albumin (BSA) 0.2 %

� * Szívizom energiaellátása

Oxigén ellátás

Szív állapota MVO2 (ml O2 min-1 100g-1)

Megállított szív 2

Szív nyugalomban 8

Szív terhelés alatt 70

Agy 3

Vese 5

14

Vese 5

Bőr 0.2

Izom nyugalomban 1

Izom terhelés alatt 50

5 ml/l=CF 14 ml/min

http://www.colby.edu/chemistry/CH331/O2%20Solubility.html30-35 salinity (norm see) 35 g/l (600 mM)

Végpontok, paraméterek

� Infarktus méret� Morfológia, szövettan� Miokardium kontraktilis funkciói� Átáramlások: aorta, koronáriák, perctérfogat� Kamrai nyomás és származékai

15

Kamrai nyomás és származékai� Kamrai térfogat és származékai � Elektrofiziológia és aritmiák � Szöveti és perfuzátum minták különféle biokémiai és

egyéb mérésekre

Adatgyűjtő rendszer

� elektromos aktivitás (ECG)� aorta átáramlás AF� koronária átáramlás CF� perctérfogat CO

16

� perctérfogat CO� aorta nyomár AP� kamrai nyomás

Perfúziós rendszer

Tárolóelemek: Neely rezervoárLangendorff rezervoárBuborékcsapda és szélkazán edényeBal pitvari reservoárSzívedény

Összekötő elemek: Flexibilis összekötő elemekMerev összekötő elemek

17

Merev összekötő elemekKanülök

Elvárások anyagokkal szemben: merev és térfogattartóalaktartó, funkciótól függően hajlékony vagy merevátlátszóhőállókönnyen tisztíthatósav és lúgállógyógyszeret, anyagokat ne abszorbáljonviszonylag olcsó, könnyen cserélhető

December 14, 2017 18

December 14, 2017 19

December 14, 2017 20

Sejttenyészet a kardiovaszkuláris Sejttenyészet a kardiovaszkuláris kutatásokbankutatásokban

Gáspár Renáta, Csonka Csaba

Szegedi Tudományegyetem,

Általános Orvostudományi

Bevezetés

• A sejttenyésztés folyamata során prokarióta, eukarióta vagy növényi sejteket növesztünk vagy tartunk fenn kontrollált körülmények közöttkontrollált körülmények között

• A gyakorlatban állati eredetű sejtek tenyésztését értjük a kifejezés alatt

• A sejttenyésztés története több mint 100 évre vezethető vissza

Sejtkultúra típusai

• Primer sejtkultúrák (faj, szerv/sejt típus, neonatális, felnőtt)

• Immortalizált sejtvonalak (pl. H9C2, HL-1, AC16)• Immortalizált sejtvonalak (pl. H9C2, HL-1, AC16)

• Embrionális őssejtek

• Indukált pluripotens sejtek

Sejtkultúra típusai

2D sejtkultúra 3D sejtkultúra

Mérföldkövek a sejttenyésztés technológiai fejlődésében

• Az antibiotiantibiotiantibiotiantibiotikumokkumokkumokkumok használata (gátolja a

kontamináló baktériumok növekedését)

• A trtrtrtriiiipspspspszzzzinininin használata lehetővé tette az • A trtrtrtriiiipspspspszzzzinininin használata lehetővé tette az

adherens sejtek szétválasztását (primer kultúrák létrehozása, sejtvonalak passzálása)

• Kémiailag jól definiált összetételű tenyésztő Kémiailag jól definiált összetételű tenyésztő Kémiailag jól definiált összetételű tenyésztő Kémiailag jól definiált összetételű tenyésztő médium médium médium médium kialakítása

• Modell rendszer:Sejt biológia alapkutatások, betegséget okozó anyagok és sejtek

kölcsönhatásának vizsgálata, gyógyszerek és gyógyszerjelöltek sejthatásainak vizsgálata (farmakológiai screening),

• Toxicitás vizsgálataÚj gyógyszerjelöltek potenciális toxikus vagy mellék-hatásainak vizsgálata

Sejttenyészetek főbb felhasználási területei

Új gyógyszerjelöltek potenciális toxikus vagy mellék-hatásainak vizsgálata• Rák kutatás

Különböző vegyi anyagok, vírusok sugárzások hatásainak vizsgálata a rákos elfajulásra

• VirológiaVírusok szaporítása, vakcina termelés, vírusok hatásainak vizsgálata

• Genetic EngineeringFehérjék és egyéb biotechnológiai termékek előállítása

• Génterápia & szövet regenerációNem funkcionáló génekkel rendelkező sejtek helyettesítése funkcionáló

géneket kifejező sejtekkel

Primer sejtkultúra készítése

Primer sejttenyészet:egy élő szervezetből sejteket izolálunk (enzimatikusan vagy sebészi úton), s azokat megfelelő úton), s azokat megfelelő tenyésztő közegbe helyezve növesztjük őket.

Primer neonatális szívizomsejt kultúra előállítása

1-3 napos Wistar

patkányokszívek izolálása emésztés

Primer neonatális szívizomsejt kultúra előállítása

24 óra

előkiültetés növesztő médium differenciáló

médium

NEONATÁLIS FELNŐTT

állat Újszülött - olcsó (limitált sejtszám érhető el)

Felnőtt – drága (több sejt)

elkészítés egyszerű komplikáltabb

szenzitivitás Relatíve könnyen előállítható Nagyon érzékeny

élettartam Néhány nap, max 2 hét (hosszabb időtartamú kísérletek is)

max 2-3 nap (csak rövid időtartamú kísérletek)időtartamú kísérletek is) időtartamú kísérletek)

kontamináció igen, pl. fibroblaszt Nem jellemző

Felszíni bevonat Nem szükséges kizárólag laminin-nal bevont felszínre tapadnak

médium DMEM Médium 199 + további komponensek

azonosítás Immunhisztokémia Mikroszkópos morfológia

kitapadó igen igen

Sejtvonalak

• a tenyészet sejtjei vég nélkül képesek proliferálni

• mivel ezek a sejtek folymatosan osztódnak, benővik a rendelkezésre álló felületet, s ezért időről időre új tenyésztő edénybe kell őket átvinni (Passzálás)

• A sejteket le lehet fagyasztani, és később tovább tenyészteni őket

• Ha túlságosan hosszú ideig tartjuk fenn a tenyészetet, a spontán mutációk kialakulásának esélye növekszik

• Nem igényel állatokat

• A sejtek biológiája eltérhet azoktól a sejtekétől amelyeket modelleznek (pl. H9C2 kardiomiociták nem kontrahálnak)

2 napos neonatális szívizom kultúra

1 napos felnőtt szívizom kultúra

Tenyésztő médium

• A megfelelő médium kiválasztása függ a tenyésztett sejt típusától

• Általánosan használt médiumok: DMEMDMEMDMEMDMEM, , , , GMEM, EMEM, stb.

• Általában bikarbonát alapú puffer • Általában bikarbonát alapú puffer • A médiumot antibiotikummal (penicillin, sztreptomicin,

stb) egészítjük ki

• pH, nutriensek, ionok, indikátor

Sejt toxicitás

• A citotoxikus hatások gátolják a sejtek növekedését

• Toxikus hatásokra a sejtréteg valamint az egyes sejtek morfológiája is megváltozhat (pl. óriás sejtek, többmagvú sejtek, szemcsés, egyenetlen megjelenés, többmagvú sejtek, szemcsés, egyenetlen megjelenés, vakuolumok a citoplazmában vagy a sejtmagban)

• A sejt toxicitás az életfunkciók elvesztését okozhatja

• A citotoxicitás mértékét különféle viabilitás mérési módszerekkel lehet meghatározni

ViabilitásViabilitásViabilitásViabilitás mérés mérés mérés mérés –––– ELHALT SEJTEKELHALT SEJTEKELHALT SEJTEKELHALT SEJTEK

Tripán-kékkizárás

Propidium jodid(PI)

Biológiai indikátor

Membrán integritás

Membrán integritásindikátor integritás integritás

Detektálás módszere

Kolorimetria

mikroszkóp

Fluoreszcencia

FACS

Idő 2 h 30 min

limitáció 24 lyuk max 106 sejt/lyuk szükséges +

Imre

ViabilitásViabilitásViabilitásViabilitás mérés mérés mérés mérés –––– ÉLŐ SEJTEKÉLŐ SEJTEKÉLŐ SEJTEKÉLŐ SEJTEKCell-Titer Glo

(ATP)

Cell Titer Blue

resazurin

Cell Titer 96

(MTS)

MTT

Biológiai

indikátor

ATP tartalom Redukáló

képesség

Redukáló

képesség

Redukáló

képesség

Detektálás Biolumi- Fluorimetria Kolorimetria KolorimetriaDetektálás

módszere

Biolumi-

neszcencia

Fluorimetria

vagy

kolorimetria

Kolorimetria Kolorimetria

Idő 10 min 1-4 h 1-4 h 4 h

Szenzitivitás

(96 plate)

50 sejt 390 sejt 800 sejt 800 sejt

limitáció Lumi

olvasó

Fluoro

olvasó

Sejt viabilitás

• tripán-kék festés

• bejut a nem-életképes vagy elhalt sejtekbe, míg az „egészséges” sejtekbe nem tud bejutni

• - életképes sejtek %-a = nem festődő sejtek száma x 100• - életképes sejtek %-a = nem festődő sejtek száma x 100

össz sejtszám

calceinMagas

Sejt viabilitás – calcein festés

calcein

Kardiomiocit

a kultúra

Alacsony viabilitá

asviabilitá

s

háttér

Szimulált iszkémia kivitelezése

Szimulált iszkémia kivitelezése

Sejttenyészet kontamináció

A sejttenyészet kontaminációja eredetét

tekintve lehet:

• Kémiai - nehéz kimutatni, okozhatja pl. endotoxin, fémionok vagy fertőtlenítőszer nyomai, amelyek nem láthatóakláthatóak

Sejttenyészet kontamináció

• Biológiai – látható jelei vannak a sejttenyészeten; ilyenek a mycoplasma, élesztő, baktériumok vagygombák, de más sejtekkel történő kontaminálódás is ide sorolható

• Sejtenyésztő fülke & CO2 inkubátor!• Sejtenyésztő fülke & CO2 inkubátor!

Laminar box

• Segít megelőzni a kultúra kontaminációját amikor a sejtekkel dolgozunk (termék védelem)

• A kísérletező személyt és a környezetet is véd(het)i

• HEPA-szűrt levegőt keringtet

CO2 inkubátor

• Fenntartja a CO2 szintet (5-10%),

• Biztosítja páratartalmat és • hőmérsékletet (37o C)• Izolálja a plateket a

környezettől• Tri-gáz inkubátor (CO2, O2, N2

szintje szabályozott)