89

TẠP CHÍ KHOA H ỌC, Đại học Huế, Số 55, 2009

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN β-GALACTOSIDASE TRONG E. COLI BL21

Trần Văn Giang

Trường Đại học Sư phạm, Đại học Huế TÓM T ẮT β-galactosidase là enzyme xúc tác phản ứng thuỷ phân liên kết β – 1,4-D galactoside

trong phân tử đường lactose thành glucose và galactose. Để biểu hiện được enzyme này trong E.

coli BL21, chúng tôi đã tiến hành chèn gene đích đã tinh sạch vào vector biểu hiện pET, sau đó

chúng tôi đã tinh sạch vector tái tổ hợp, tiến hành biến nạp vào tế bào E. coli BL21 và đã biểu

hiện được protein này ở nhiệt độ và pH thích hợp sau khi cảm ứng với IPTG.

1. Mở đầu

β-galactosidase là enzyme xúc tác phản ứng thủy phân liên kết β-1,4-D galactoside trong phân tử đường lactose thành glucose và galactose, được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp chế biến sữa, trong y học để chế biến thuốc hỗ trợ tiêu hoá. Trên thế giới, đã có một số công trình công bố về tạo dòng và biểu hiện β-galactosidase từ Lactobacillus reuteri 103 [1] và Bacillus megaterium [2]. Ở Việt Nam, Nguyễn Văn Cách (2008) đã tạo dòng β-galactosidase từ Aspergillus oryzae và xác định một số tính chất lý-hóa của nó [3]. Trần Văn Giang, Nguyễn Sỹ Lê Thanh, Quyền Đình Thi (2008) đã tạo dòng và phân tích trình tự gen mã hóa β-galactosidase từ chủng Bacillus subtilis G1 [4].

Nhiều người khi uống sữa có hiện tượng đau bụng và tiêu chảy do bị dị ứng với đường lactose trong sữa, đây là một dạng đường chủ yếu trong thành phần sữa. Sau khi uống sữa nếu bị khó tiêu, đầy hơi, sôi bụng hay tiêu chảy, đau bụng thì chắc chắn họ bị dị ứng với lactose trong sữa. Lactose khi vào đến ruột sẽ được thủy phân thành galactose và glucose nhờ vào enzyme lactase (β-galactosidase ở vi khuẩn) có ở thành ruột non. Trong trường hợp thiếu lactase, lactose không được thủy phân sẽ bị tống ra ngoài dưới dạng tiêu chảy. Những người không tiêu hóa được lactose do họ thiếu lactase bẩm sinh hoặc lactase bị thoái hóa từ thuở thơ ấu.

Trên thế giới và Việt Nam đã có một số nghiên cứu về β-galactosidase có nguồn gốc từ các sinh vật. Tuy nhiên, ở Việt Nam những nghiên cứu về β-galactosidase mới dừng lại ở nghiên cứu cơ bản và chưa đưa vào sản xuất enzyme này [3]. Vì vậy, cần nghiên cứu biểu hiện β-galactosidase để làm cơ sở cho việc sản xuất enzyme này và góp phần giúp các nhà sản xuất sữa Việt Nam có thêm sản phẩm sữa dễ tiêu hóa.

90

2. Nguyên liệu và phương pháp

2.1. Nguyên liệu và hóa chất

Chủng vi sinh vật tái tổ hợp sinh tổng hợp β-galactosidase đã được tuyển chọn Baccillus subtilis G1 [4]. Vector pET22b(+) (Invitrogen) dùng để biểu hiện β-galactosidase trong E. coli BL21. Các thiết bị và hóa chất để biểu hiện được Phòng Công nghệ sinh học enzyme, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công Nghệ Việt Nam cung cấp.

2.2. Khuếch đại gen bằng PCR

Để khuếch đại gen mã hóa β-galactosidase của chủng Bacillus subtilis G1, sử dụng mồi xuôi GalF: 5'-GCG GAT CCG GTG ATG TCA AAG CTT GAA AAA ACG C-3' và mồi ngược GalR: 5'-GCG CGG CCG CAT GTG TGT TTA CGA CAA T-3', được thiết kế dựa vào trình tự nucleotide của gen mã hóa β-galactosidase B. subtilis trên GenBank (mã số NC_000964), có bổ sung điểm cắt hạn chế BamHI và NotI để chèn vào vector biểu hiện pET-22b(+). Hỗn hợp phản ứng PCR bao gồm: 2,5 µl đệm 10x PCR; 2 µl 2,5 mM dNTP; 2 µl 25 mM MgCl2; 1 µl (0,1µg/ml)DNA khuôn mẫu; 0,5 µl (5u/µl )Taq polymerase và 1 µl (10u/µl) mồi mỗi loại bổ sung nước cất đến thể tích 25 µl. Phản ứng được thực hiện trong điều kiện: 94°C/3 phút; 35 chu kỳ: 94°C/1 phút, 54°C/1 phút, 72°C/1 phút; cuối cùng 72°C/10 phút.

2.3. Gắn sản phẩm PCR

Phản ứng gắn sản phẩm PCR từ vector tạo dòng với vector biểu hiện gồm: 2 µl đệm gắn dính DNA T4 10x; 3µl DNA tinh sạch; 3 µl (0,5µg/ml) plasmid pET-22b(+) cắt mở vòng; 1,5 µl (5u/µl) DNA T4 ligase; bổ sung nước cất đến thể tích 20 µl. Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 22°C từ 30 phút đến 3 giờ hoặc qua đêm.

2.4. Biến nạp vector biểu hiện vào E. coli BL21

Phân đoạn DNA sau khi gắn vào vector pET-22b(+) được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli BL21 theo phương pháp sốc nhiệt và hóa học. Một khuẩn lạc E. coli BL21 được cấy chuyển vào 3 ml môi trường LB, lắc 200 vòng/phút ở 37°C qua đêm. 15 ml môi trường LB lỏng được tiếp giống với 150 µl dịch tế bào đã nuôi qua đêm. Sau khi tiếp giống, dịch này được nuôi lắc ở 37°C với 200 vòng/phút trong khoảng 2-3 giờ, đến khi OD600nm đạt 0,4 - 0,6. Sau đó dịch nuôi cấy được đặt vào đá lạnh 1 giờ, rồi ly tâm 5 phút ở 4°C với 4000 vòng/phút. Tủa tế bào được hòa đều trong 7,5 ml 0,1 M CaCl2 vô trùng đã để lạnh, ủ đá lạnh 30 phút và ly tâm như trên. Tủa tế bào lại được hòa đều trong 7,5 ml 0,1 M CaCl2 vô trùng đã để lạnh, ủ đá khoảng 1 giờ và ly tâm 5 phút với 4000 vòng/phút. Tủa tế bào được hòa vào 750 µl 0,1 M CaCl2 vô trùng, lạnh. Dịch tế bào được chia nhỏ 50 µl/ống Eppendorf 1,5 ml khử trùng, dùng biến nạp ngay hoặc bổ sung 50 µl 75% glycerol bảo quản ở -80°C để biến nạp sau. Năm µl dung dịch plasmid hoặc hỗn hợp phản ứng gắn dính được hòa với 50 µl dịch tế bào khả biến vừa chuẩn bị

91

xong (hoặc tế bào khả biến ở -80°C đã giải đông), ủ 20-30 phút trong đá. Hỗn hợp được gây sốc nhiệt 45 giây ở 42°C. Sau đó được đặt ngay vào đá lạnh khoảng 2 phút rồi bổ sung 250 µl môi trường SOC lỏng đã khử trùng. Sau khi ủ lắc hỗn hợp khoảng 60 phút ở 37°C với 200 vòng/phút, 50-250 µl dịch tế bào đã biến nạp plasmid được cấy trải trên đĩa thạch chứa ampicillin với nồng độ 0,1% (w/v), ủ qua đêm ở 37°C để cho khuẩn lạc mọc và sàng lọc tiếp.

2.5. Nuôi cấy E. coli và biểu hiện

Khuẩn lạc E. coli BL21 tái tổ hợp được nuôi lắc qua đêm (200 vòng/ phút) trong môi trường LB lỏng có bổ sung 0,1% (w/v) ampicillin trong bình tam giác 25 ml. Tiếp 1% giống vào bình tam giác 250 ml, lắc 200 vòng/phút. Sau 2 giờ, dịch nuôi được cảm ứng bằng 1% (w/v) IPTG (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside), tiếp tục nuôi và tiến hành lấy mẫu sau thời gian 1,5; 3 và 4,5 giờ ở 37°C. Mỗi lần lấy 1 ml mẫu dịch nuôi biểu hiện đã được cảm ứng. Đối chứng là khuẩn lạc E. coli BL21 không biến nạp. Sau đó, các mẫu được ly tâm thu cặn và hòa trong nước khử ion để tiến hành điện di kiểm tra. Protein tổng số đo được sau khi biểu hiện theo phương pháp Bradford. Phương pháp này dựa trên nguyên tắc: các protein khi phản ứng với Coomassie Brilliant Blue sẽ hình thành phức hợp màu có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595 nm, cường độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ protein trong dung dịch. Nồng độ β-galactosidase được xác định dựa vào đồ thị chuẩn protein từ dung dịch albumin huyết thanh bò 1 mg/ml.

2.6. Điện di SDS trên polyacrylamide gel

Điện di biến tính protein trên polyacrylamide gel 12,5% theo Laemmli (1970) [5]. Sau khi điện di, gel được nhuộm bằng Coomassie Brilliant Blue trong 3 giờ. Sau đó, gel được rửa bằng dung dịch rửa (30% (v/v) methanol, 10% (v/v) acetic acid) cho đến khi nền gel trở nên trong còn các băng protein xuất hiện màu xanh.

3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận

3.1. Chèn gene β-galactosidase tinh sạch vào vector biểu hiện

Phân đoạn gen gal (β-galactosidase) và vector plasmid pET-22b(+) mở vòng được tinh sạch bằng kit của hãng Invitrogen để sử dụng cho phản ứng gắn (Hình 1).

Dung dịch của phản ứng gắn được biến nạp vào E. coli BL21 bằng phương pháp sốc nhiệt, sau khi biến nạp, dịch tế bào được nuôi lắc phục hồi và trải lên đĩa thạch để nuôi cấy chọn lọc. Plasmid tái tổ hợp được tách chiết, tinh sạch và kiểm tra bằng điện di agarose. Plasmid tái tổ hợp (pEGal) có kích thước lớn hơn plasmid đối chứng pET-22b(+) (Hình 2). Hình ảnh điện cho thấy plasmid đối chứng (ĐC) chạy nhanh hơn các plasmid tái tổ hợp (1 - 4).

92

Hình 1. Điện di phân đoạn gen gal (1) tinh sạch sau khi cắt ra khỏi vector nhân dòng và pET-

22b(+) (2) đã được tinh sạch. M: DNA marker (1kb)

Hình 2. Vector biểu hiện

Hình 3. Điện di đồ plasmid đối chứng pET-22b(+) (ĐC)

và các plasmid tái tổ hợp pEGal (1-4).

3.2. Hệ thống biểu hiện E. coli BL21/pEGal

Để biểu hiện thành công gen ngoại lai cần phải có vector thích hợp. Vector tái tổ hợp pEGal (vector biểu hiện pET-22b(+) mang gen gal) được biến nạp vào chủng E. coli BL21 bằng phương pháp sốc nhiệt và hóa học, tạo ra hệ thống biểu hiện E. coli BL21/pEGal. Dịch tế bào E. coli BL21/pEGal được thu sau 1,5; 3; và 4,5 giờ cảm ứng với IPTG để xác định mức độ biểu hiện của β-galactosidase tái tổ hợp.

Dịch nuôi cấy biểu hiện sau khi thu được đo độ hấp thụ quang (OD). Từ độ hấp

2000

5000

500

10000 M 2

1 M

1 2 ĐC 3 4

93

thụ của protein tổng số (trong đó cóβ-galactosidase) đo được trên máy quang phổ, đối chiếu với đồ thị chuẩn đã được xây dựng dựa trên BSA (Bovine serum albumin) để tính ra nồng độ protein tổng số .Nồng độ protein tổng số của các mẫu biểu hiện được thể hiện qua bảng (1). Dựa vào nồng độ protein tổng số để tính toán hiệu suất thu hồi sau khi tinh sạch β-galactosidase.

Bảng 1 cho thấy khi không cảm ứng IPTG thì hàm lượng protein tổng số ở các chủng tái tổ hợp và đối chứng sai khác không đáng kể. Nhưng sau 1,5; 3; và 4,5 giờ cảm ứng IPTG, hàm lượng protein tổng số ở chủng tái tổ hợp đã tăng lên rất nhiều. Điều đó chứng tỏ promoter của vector biểu hiện đã được cảm ứng và β-galactosidase đã được tổng hợp. Để khẳng định chắc chắn hơn, dịch nuôi cấy biểu hiện đã được điện di trên polyacrylamide gel.

Bảng 1. Nồng độ protein của dịch nuôi biểu hiện

Dịch nuôi biểu hiện OD (TB) Nồng độ protein tổng số (µµµµl)

E. coli

BL21/pEGal (0h) 0,425 977,7

E. coli

BL21/pEGal (1.5h) 0,785 1652,7

E. coli

BL21/pEGal (3h) 0,825 1727,7

E. coli

BL21/pEGal (4.5h) 0,885 1840,2

E. coli BL21 (0h) 0,421 970.2

E. coliBL21 (1.5h) 0,485 726,8

E. coli BL21 (3h) 0,501 746,8

E. coliBL21 (4.5h) 0,542 798,2

3.3 Mức độ biểu hiện β-galactosidase

Dịch tế bào thu ở các thời gian khác nhau sau cảm ứng được chạy điện di kiểm tra trên gel polyacrylamide. β-galactosidase tái tổ hợp đã được biểu hiện sau 1,5 giờ cảm ứng bởi IPTG. Sau thời gian 3 và 4,5 giờ, hàm lượng protein tăng lên không đáng kể.

94

Hình 4. Điện di protein hòa tan tổng số của dịch nuôi cấy. Các đường 4-6: chủng

BL21/pEGal sau 1,5; 3; và 4,5 giờ cảm ứng IPTG. Các đường 1-3: chủng BL21/pE-22b(+)

sau 1,5; 3; và 4,5 giờ cảm ứng IPTG. M: protein chuẩn.

Theo lý thuyết thì β-galactosidase có khối lượng phân tử khoảng 66 kDa. Nếu được biểu hiện thì trên điện di đồ protein tổng số của chủng BL21/pEGal sẽ xuất hiện băng có cùng khối lượng phân tử. Kết quả của chúng tôi cho thấy ở các đường 4-6 có băng to và đậm hơn các giếng khác đồng thời so với protein chuẩn thì thấy có khối lượng phân tử của chúng cũng khoảng 66 kD điều đó chứng tỏ β-galactosidase tái tổ hợp đã được biểu hiện trong chủng E. coli tái tổ hợp BL21/pEGal.

4. Kết luận

β-galactosidase (khoảng 66 kD) của vi khuẩn Baccillus subtilis đã được biểu hiện trong chủng E. coli tái tổ hợp BL21/pEGal. Thời gian cảm ứng IPTG thích hợp là 1,5 giờ.

TÀI LI ỆU THAM KH ẢO

1. Nguyen TH, Splechtna B, Yamabhai M, Haltrich D, Peterbauer C., Cloning and

expression of the β-galactosidase genes from Lactobacillus reuteri 103 in Escherichia

coli. J Biotechnol 129, (2007), 581-591.

2. Li JM, Chiou CY, Lee TR, Chen YS, Shaw GC., Identification of a lactose-responsive

element upstream of the promoter of Bacillus megaterium β-galactosidase-encoding gene mbgA. Cur Microbiol 51, (2005), 31-34.

3. Nguyễn Văn Cách, Bùi Thị Hải Hòa, Đặng Thị Thu, Tách, tinh chế và xác định đặc

tính của β-galactosidase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae 3, Hội nghị Khoa học

toàn quốc lần thứ IV . Hà Nội. Nxb Khoa học và Kỹ thuật, (2008), 287-289.

4. Trần Văn Giang, Nguyễn Sỹ Lê Thanh, Quyền Đình Thi, Nhân dòng và phân tích trình

35

66

45

18

25

95

tự gene mã hóa β-galactosidase từ chủng Bacillus subtilis G1, Hội nghị Khoa học toàn

quốc lần thứ IV: Hóa sinh và Sinh học phân tử phục vụ nông, sinh, y học và Công

nghiệp thực phẩm. Hà Nội. Nxb Khoa học và Kỹ thuật, (2008), 691-694.

5. Laemmli UK, Cleavage of structure proteins during the assembly of the head of

bacteriophage T4, Nature 227, (1970), 680-685.

RESEARCH ON THE EXPRESSION OF ββββ-GALACTOSIDASE IN STRAIN

E. COLI BL21

Tran Van Giang

College of Pedagogy, Hue University

SUMMARY

The β-galactosidase coding gene was isolated from Bacillus subtilis G1 and expressed

in E. coli BL21 through pEGal vector (Invitrogen) after 1,5 h of 1% (w/v) IPTG induction. Our

results showed a β-galactosidase band of approximately 66 kDa occurred in 12,5%

polyacrylamide gel.