techniki laboratoryjne wykorzystywane laboratory methods ... 2011_01 02.pdf · 5. dee s., otake s.,...
TRANSCRIPT
5. DeeS.,OtakeS.,OliveiraS.,DeenJ.:Evidenceoflongdi-stanceairbornetransportofporcinereproductiveandre-spiratorysyndromevirusandMycoplasma hyopneumoniae.Vet. Res.2009,40,39-45.
6. MaesD.,SegalesJ.,MeynsT.,SibilaM.,PietersM.,Ha-esebrouckF.:ControlofMycoplasma hyopneumoniaein-fectionsinpigs.Vet. Microbiol. 2008,126,297-309.
7. MadecF.:Theriskfactorsofrespiratorydiseasesonfat-tenersinintensivebreeding-finishingunits.Proceedings of the 8th IPVSCongress,Ghent,Belgium1984,349.
8. InamotoT.,TakahashiH.,YamamotoK.,NakaiY.,Ogimo-toK.:AntibioticsusceptibilityofMycoplasma hyopneumoniaeisolatedfromswine.J.Vet.Med.Sci.1994,56,393-394.
9. ViccaJ.,StakenborgT.,MaesD.,ButayeP.,PeetersJ.,deKruifA.,HaesebrouckF.:In vitrosusceptibilitiesofMycoplasma hyopneumoniaefieldisolates.Antimicrob. Agents Chemother.2004,48,4470-4472.
10. ViccaJ.:Virulence and antimicrobial susceptibility of Mycoplasma hyopneumoniae isolates from pigs. PhDthesis,FacultyofVeterinaryMedicine,GhentUniversity,ISBN90-5864-086-8,2005,219.
11. MaesD.,DeluykerH.,VerdonckM.,CastryckF.,MiryC.,LeinA.,VrijensB.,deKruifA.:Effectofvaccinationaga-instMycplasma hyopneumoniaeinpigherdswitha conti-nuousproductionsystem. J. Vet. Med.B,1998,45,495-505.
12. MaesD.,DeluykerH.,VerdonckM.,CastryckF.,MiryC.,VrijensB.,VerbekeW.,ViaeneJ.,deKruifA.:EffectofvaccinationagainstMycoplasma hyopneumoniae inpigherdswithanall-in/all-outproductionsystem.Vaccine1999,17,1024-1034.
13. MeynsT.,DewulfJ.,deKruifA.,CalusD.,HaesebrouckF.,MaesD.:ComparisonoftransmissionofMycoplasma hyopneumoniaeinvaccinatedandnon-vaccinatedpopu-lations.Vaccine 2006,24,7081-7086.
14. SibilaM.,NofrariasM.,López-SoriaS.,SegalesJ.,Vale-roO.,EspinalmA.,CalsamigliaM.:Chronologicalstudy
ofMycoplasma hyopneumoniae infection, seroconver-sionandassociatedlunglesionsinvaccinatedandnon-vaccinatedpigs.Vet. Microbiol.2007,122,97-207.
15. JensenD.,ErsbollA.,NielsenJ.:A meta-analysiscompa-ringtheeffectofvaccinesagainstMycoplasma hyopneuumoniaeondailyweightgaininpigs.Prev. Vet. Med.2002,54,265-278.
16. BaccaroM.,HiroseF.,UmeharaO.,GonçalvesL.,DotoD.,PaixãoR.,ShinyaL.,MorenoA.:Comparativeeffica-cyoftwosingle-dosebacterinsinthecontrolofMycoplasma hyopneumoniaeinswineraisedundercommer-cialconditionsinBrazil.Vet. J.2006,172,526-531.
17. BandrickM.,PietersM.,PijanoC.,MonitorT.:Cellularimmuneresponse inpiglets followingsowvaccinationwitMycoplasma hyopneumoniae.Proc. Allen D. Leman Swine Conference,vol.33Supplement.CollegeofVete-rinaryMedicine,UniversityofMinnesota,MinneapolisMN,USA,2006,11.
18. BargenL.:A systemresponsetoanoutbreakofenzooticpneumoniaingrow/finishpigs.Can. Vet. J.2004,45,856-859.
19. MurphyD.,VanAlstineW.,ClarkK.,AlbregtsS.,KnoxK.:AerosolvaccinationofpigsagainstMycoplasma hyopneumoniaeinfection.Am. J. Vet. Res.1993,54,1874-1880.
20. LinJ.,WengC.,LiaoC.,YehK.,PanM.:ProtectiveeffectsoforalmicroencapsulatedMycoplasma hyopneumoniaevaccinepreparedbyco-spraydryingmethod.J. Vet. Med. Sci.2003,65,69-74.
21. KingK.,FauldsD.,RoseyE.,YanceyR.:Characteriza-tionofthegeneencodingMhp1fromMycoplasma hyopneumoniaeandexaminationofMhp1’svaccinepoten-tial.Vaccine 1996,15,25-35.
22. ShimojiY.,OishiE.,MunetaY.,NosakaH.,MoriY.:Vac-cineefficacyoftheattenuatedErysipelothrix rhusiopathiaeYS-19expressinga recombinantproteinofMycoplasma hyopneumoniaeP97adhesinagainstmycopla-smalpneumoniaofswine.Vaccine 2003,21,532-737.
23. OgawaY.,OishiE.,MunetaY.,SanoA.,HikonoH.,Shiba-haraT.,YagiY.,ShimojiY.:Oralvaccinationagainstmy-coplasmalpneumoniaofswineusinga liveErysiplothrix rhusiopathiaevaccinestrainasa vector.Vaccine 2009,27,4543-4550.
24. OkambaF.,MoreauE.,BouhC.,GagnonC.,MassieB.,ArellaM.:Immuneresponsesinducedbyreplication-de-fectiveandenovirusexpressingtheC-terminalportionofMycoplasma hyopneumoniae-P97adhesin.Clin. Vaccine Immunol.2007,14,767-774.
25. ChenA.,FryS.,DaggardG.,MukkurT.:Evaluationofim-muneresponsetorecombinantpotentialprotectiveanti-gensofMycoplasma hyopneumjoniae deliveredascock-tailDNAand/orrecombinantproteinvaccinesinmice.Vaccine2008,26,4372-4378.
26. VillarrealI.,MaesD.,MeynsT.,GebruersF.,CalusD.,Pa-smansF.,HaesebrouckF.:Infectionwitha lowvirulentMycplasma hyopneumoniaeisolatedoesnotprotectpi-gletsagainstsubsequentinfectionwitha highlyvirulentM. hyopneumoniaeisolate.Vaccine 2009,27,1875-1879.
27. MinionF.C.,LefkowitzE.J.,MadsenM.L.,ClearyB.J.,SwartzellS.M.,MahairasG.G.:ThegenomesequenceofMycoplasma hyopneumoniaestrain232,theagentofswi-nemycoplasmosis.J. Bacteriol.2004,186,7123-7133.
28. VasconcelosA.,FerreiraH.,BizarroC.V.:Swineandpo-ultrypathogens:thecompletegenomesequencesoftwostrainsofMycplasma hyopneumoniaeanda strainofMycoplasma synoviae.J. Bacteriol.2005,187,5568-5577.
Prof. dr hab. Zygmunt Pejsak, Państwowy Instytut Wete-rynaryjny, al. Partyzantów 57, 24-100 Puławy, e-mail: [email protected]
Chorobytransmisyjnezwierzątstano-wiągrupęgroźnychchoróbzakaźnych
i pasożytniczychprzenoszonychprzezpa-sożytniczestawonogi,z którychtochoróbznacznączęść stanowiązoonozy (1,2).Chorobytransmisyjnedzieląsięna:obli-gatoryjnietransmisyjne,fakultatywnie/ob-ligatoryjnietransmisyjneorazfakultatyw-nietransmisyjne.Chorobyobligatoryjnietransmisyjnetotakie,któreprzenoszonesąwyłączniezapośrednictwemstawono-gów.PrzykłademtakiejchorobymożebyćprzenoszonaprzezkleszczehepatozoonozapowodowanaprzezinwazjępierwotniakówHepatozoon canis.Z koleidochoróbfakul-tatywnie/obligatoryjnie transmisyjnych
zaliczasiętakie,któreprzenoszonesąprzezpasożytniczewektory,jednakżeodnotowa-nopojedynczeprzypadki,w którychdo-chodziłodozakażeńbezudziałuwektora.Przykłademtakiejchorobymożebyćza-każeniewirusemśrodkowoeuropejskiegokleszczowegozapaleniamózgu.Chorobąfakultatywnietransmisyjnąnatomiastjesttaka,któramożebyćprzenoszonazapo-średnictwemwektora,jednakniejestonniezbędnyw zakażeniu i równieczęstodochodzidozarażeńzapośrednictwemwektora,jaki bezniego.PrzykłademmożebyćtutajgorączkaQczyteżtularemia(3).Należyzdawaćsobiesprawę,żepodziałten jest sztuczny, jak równieżzmienny.
Techniki laboratoryjne wykorzystywane w diagnostyce chorób transmisyjnych u zwierząt. Część I. Rozpoznawanie zakażeń i inwazji
Wojciech Zygner1, Olga Gójska-Zygner2, Anna Rodo3, Karol Sobków4
z Zakładu Parazytologii i Inwazjologii Katedry Nauk Przedklinicznych1 i Zakładu Patomorfologii Zwierząt Katedry Patologii i Diagnostyki Weterynaryjnej3 Wydziału Medycyny Weterynaryjnej w Warszawie oraz Centrum Zdrowia Małych Zwierząt – Kliniki Multiwet w Warszawie2 i Weterynaryjnego Laboratorium Diagnostycznego – Lab-Wet w Warszawie4
Laboratory methods in diagnostics of animal transmissible diseases. Part I. Identification of infections and invasions
Zygner W.1, Gójska-Zygner O.2, Rodo A.3, Sobków K.4, Division of Parasitology and Parasitic Diseases, Department of Preclinical Sciences1, Division of Animal Pathomorphology, Department of Pathology and Veterinary Diagnostics3 Faculty of Veterinary Medicine3, Warsaw University of Life Sciences-SGGW and Small Animals Health Center – Multiwet Clinic in Warsaw2 and Veterinary Diagnostic Laboratory – Lab-Wet in Warsaw4
Arthropod-borne diseases of animals are important for veterinary practitioners. Many of them are zoonoses and their course is often severe. Different transmissible dis-eases need different diagnostic methods. Some of them can be recognized with traditional bacteriological and cytological methods whereas others need serological or molecular biology techniques. Also additional tests like biochemical and hematological examinations and urinalysis may be necessary to establish the diagnosis. This review has been divided into 2 parts. In the Part I basic routine laboratory diagnostic methods available for arthropod-borne animal diseases with the examples of their use were presented. Part II has been dedicated to the other complementary laboratory techniques to-gether with examples of their application.
Keywords: arthropod-borne animal diseases, diag-nostic approach.
Prace poglądowe
19Życie Weterynaryjne • 2011 • 86(1)
Przykłademtakichzmianmożebyćbabe-szjozapsówpowodowanaprzezpierwot-niakiz rodzajuBabesiaczyteżhepatozo-onozapsówpowodowanaprzez inwazjęH. americanum.Okazujesię,iżbabeszjo-zapsówmożebyćprzenoszonaz matkinaszczeniętaprzezłożysko,jakrównieżdo-chodzićmożedozarażeniapsówpodczaswalkzwierząt(4,5).W przypadkuinwa-zjiH. americanumdoniedawnauważano,żejedynądrogązarażeniapsa,jestzjedze-nieprzezpsakleszczazawierającegowy-sporulowaneoocysty.Jaksięjednakoka-zuje,istniejerównieżinnadrogazarażeniatympasożytempoprzezzjedzeniezarażo-negogryzonia,w któregomięśniachszkie-letowychobecnesąmerontyzawierająceinwazyjnemerozoity(6).Wartorównieżdodać,iżpodziałtennieuwzględniaza-rażeń,doktórychmożedochodzićw wy-nikutransfuzjikrwiczyteżprzeszczepównarządówu ludzi.
Obecniew diagnostycechoróbtrans-misyjnychwykorzystywanych jestwieleróżnychtechniklaboratoryjnych.Docho-róbtychzaliczasięwywołaneprzezwi-rusy,bakterie,jakrównieżpierwotniaki,a nawetnicienie.W związkuz tymw roz-poznawaniutychchoróbwykorzystujesięzarównotradycyjnetechnikimikrobiolo-giczneczyparazytologiczne,jakrównieżnowszemetodyimmunologicznei meto-dybiologiimolekularnej.Ponadtow dia-gnostycechoróbtransmisyjnychużytecz-nesąrównieżdodatkowebadanialabora-toryjne,takiejakbadaniamorfologicznekrwi,biochemicznesurowicyorazogól-nebadaniemoczu.W tymartykulezo-stanąprzedstawioneróżnetechnikilabo-ratoryjneorazprzykładyichzastosowań
w diagnostyce chorób transmisyjnychu zwierząt.
Badania mikroskopowe
Niektórezarazkiprzenoszoneprzezpaso-żytniczestawonogimogąbyćwykrywanebezpośredniow badaniachmikroskopo-wych.Materiałemdo tychbadań,zależ-nieodposzukiwanegozarazka,mogąbyć:krewpełna,płynmózgowo-rdzeniowy,maźstawowa,wysiękposkaryfikacjiskóry,kałorazaspiraty śledziony,wątroby, szpikukostnego lubwęzłówchłonnychpobra-nedrogąbiopsjiaspiracyjnejcienkoigło-wej.Zarazkówposzukiwaćmożnarównieżw preparatachodciskowychwycinkówna-rządówpobranychdobadańhistopatolo-gicznychorazw preparatachwykonanychz hodowliniektórychbakteriinaspecjal-nychpodłożach.
Mikroskopowe badania krwi
W diagnostycechoróbtransmisyjnychwy-korzystywanadobadańmikroskopowychkrewmożebyćużytadobadaniarozmazukrwibądźteżmożestanowićmateriałwy-korzystywanyw teścieKnotta.
Rozmazkrwidobadaniamożnawyko-naćz krwiżylnejpobranejdoprobówkiza-wierającejantykoagulantbądźteżz krwiwłośniczkowej(ryc. 1).Rozmazwykonywa-nyjestzapomocądwóchszkiełekpodsta-wowych.Najednymzeszkiełekumieszczasiękroplękrwi,a następniedrugieszkieł-koprzykładadokroplii jednympłynnymruchemciągnie się rozmazposzkiełku(ryc. 2).Następniewysuszonyi zabarwio-nyrozmaz (np.metodąGiemsy)ogląda
siępodmikroskopem,używając,zależnieodposzukiwanegopasożyta,obiektywówo powiększeniuod5do100razy.Badaniepreparatówwykonanychz krwiwłośnicz-kowejwykorzystywanejestw diagnostyceinwazjipierwotniakówz rodzajuBabesia,Theileria,Cytauxzoonorazmykoplazmhe-motropowych,takichjakMycoplasma haemofelis,M. haemocanisorazM. haemominutum(7,8).Inwazjepowodowaneprzezwymienionepierwotniakiprzenoszonesąprzezkleszcze.Prowadząoneu zwie-rzątdorozwojugroźnychchorób,takichjakbabeszjoza,theileriozaczycytaukszo-onozaz towarzyszącą imniedokrwisto-ściąi jejkonsekwencjami(7).Z koleimy-koplazmozyhemotropowesąchorobami,któreujawniają siędopierow przebieguinnychchoróbbądźw przypadkuobniże-niaodporności.Chorobomtymrównieżtowarzyszyniedokrwistość, jednakczę-stoichprzebiegzależnyjestwspółistnie-jącejpierwotnejchoroby.Wartorównieżwspomnieć,iżnegatywnywynikbadaniakrwiw kierunkumykoplazmhemotropo-wychniewykluczazakażenia,gdyżbakte-rietepojawiająsięwekrwicyklicznie(9).
Badaniepreparatówkrwiżylnej jestużytecznew diagnostycepiroplazmoz,se-tarioz,filarioz,trypanosomozczyhepato-zoonoz(7,10,11,12).Niezalecasięna-tomiastbadaniarozmazukrwiżylnejpo-branejdoprobówkiz antykoagulantemw kierunkumykoplazmozhemotropowych.Wynikatoz faktu,iżużywanyw probów-kachmorfologicznychantykoagulant–EDTA(werseniansodu),powodujeodkle-jeniezarazkaodpowierzchnibłonyczer-wonychkrwinek,utrudniającw tensposóbpostawienieprawidłowegorozpoznania(8).Z koleimikroskopowebadanie rozmazukrwiw kierunkuzakażeńriketsjamiz ro-dzajuAnaplasmabądźEhrlichiamabar-dzoniskączułośćzewzględunafaktcy-klicznegopojawianiasięmoruli(klastrówbakterii)w komórkachkrwi(13,14).
TestKnotta jestbadaniemwykorzy-stywanymw diagnostycefilarioz, takichjakinwazjeDirofilaria immitis,D. repensorazDipetalonema reconditum.Dopro-bówkiz 3,8%cytrynianemsodupobie-rasię2mlkrwiżylnej.Następniepróbkajesthemolizowanaprzezdodanie10ml2%Ryc. 1. Pobranie krwi do badań mikroskopowych. A – pobranie krwi włośniczkowej. B – pobranie krwi żylnej
A B
Ryc. 2. Technika wykonania rozmazu krwi
Prace poglądowe
20 Życie Weterynaryjne • 2011 • 86(1)
formaliny.Kolejnymetapemjestwirowa-nieprzez5 minutz prędkością2500ob-rotównaminutę.Następniesupernatantzlewanyjestnaszkiełkoi barwionykroplą0,1%błękitumetylenowego.Takwykona-nypreparatoglądanyjestpodmikrosko-pem,przyużyciuobiektywówo powięk-szeniu5i 10 razy(15).Wartotutajrównieżwspomnieć,iżobecniew Polscestwierdzo-nowystępowanieD. repens,nicienia,któ-rypowodujeinwazjenietylkou psów,alerównieżu ludzi(16,17,18).
Badania cytologiczne
W diagnostycechoróbtransmisyjnychwy-korzystujesięrównieżbadaniacytologicz-ne.Materiałemdobadańmogąbyćaspira-tyśledziony,wątroby,szpikukostnegolubwęzłówchłonnychpobranedrogąbiopsjiaspiracyjnejcienkoigłowej.Ponadtowyko-nujesięrównieżbadaniapreparatówodci-skowychwycinkównarządówpobranychdobadańhistopatologicznych.Utrwalonenaszkiełkupodstawowympreparatybar-wisięnajczęściejmetodamiGiemsy,Wri-ghtabądźDiff-Quick.Tegotypubadaniawykorzystujesięgłówniew diagnostycele-iszmaniozy,groźnejchorobyludzii zwie-rzątpowodowanejprzezprzenoszoneprzezćmiankipierwotniakiz rodzajuLeishmania (19).Ponadtometodycytologicznestosowanesąrównieżw rozpoznawaniucytaukszoonozyu kotów. Istniejemożli-wośćrozpoznania inwazjipowodowanejprzezCytauxzoon felisnapodstawieba-daniamikroskopowegorozmazukrwi,jed-nakżew cyklurozwojowymtegopasożytawystępujestadiumprzederytrocytarnena-zywaneschizontami,a zasiedlającymima-krofagi.W fazietej,nazywanejschizogonią,niewystępujeparazytemia(obecnośćpa-sożytawekrwi),a cozatymidziebadaniakrwidadząwyniknegatywny.Natymeta-pierozwojuchoroby,podobniejakw przy-padku inwazjipierwotniakówz rodzajuLeishmania,użytecznesąbadaniacytolo-giczneaspiratówśledziony,wątroby,szpi-kukostnegolubwęzłówchłonnych(20).
Pozawymienionymimetodamibarwie-niazarazkiw badanychpreparatachcyto-logicznychmogąbyćrównieżwykrywanezapomocątechnikiimmunohistochemii.Metodatapoleganapołączeniubadaniamikroskopowegoz reakcjąimmunoenzy-matycznąbądź immunofluorescencyjną.W tejmetodziewykorzystywanesąpoli-klonalnelubmonoklonalneprzeciwciałaskierowaneprzeciwkokonkretnemuan-tygenowiwyznakowaneodpowiednioflu-oresceinąbądźenzymem,któryz dodanymsubstratemspowoduje reakcjębarwną.Przeciwciałapołączonez poszukiwanymantygenem(np.antygenpierwotniakówz rodzajuLeishmaniaw formiebezwi-ciowej)powodują świeceniewykrytego
antygenuw świetleUVlubteżzabarwie-nieposzukiwanegopatogenuw wynikureakcjibarwnejenzymuz jegosubstra-tem(21,22).Wartorównieżdodać,iżzapomocąmetody immunohistochemicz-nejwykryćmożnaprzenoszoneprzezsta-wonogipatogenyw preparatachhistopa-tologicznych.Przykłademmożebyćtutajpośmiertnewykrywaniewirusachorobyskokowej,wirusaśrodkowoeuropejskiegokleszczowegozapaleniamózgulubteżwi-rusaZachodniegoNiluw mózguzwierząt(2,23,24,25).PonadtowirusaZachodnie-goNiluwykrywanozapomocąbadańim-munohistochemicznychw nerkach,nad-nerczachi mięśniusercowymzakażonychpsów(23).Wartorównieżdodać,żebada-niemetodąimmunohistochemiipodką-temobecnościwirusachorobyskokowejdawaćmożewynikifałszywienegatywne.W tymwypadkustosowanejestzarażeniedomózgowe3-tygodniowychmyszyho-mogenatemuzyskanymz mózgupadłychzwierząt(25).Czułość,a takżespecyficz-nośćtestówimmunohistochemicznychza-leżyodużytychprzeciwciał (poliklonal-nebądźmonoklonalne).Użycieprzeciw-ciałmonoklonalnychpowodujezarównozwiększenieczułości (stosunekwynikówprawdziwiepozytywnychdosumywyni-kówprawdziwiepozytywnychi fałszywienegatywnych), jak i specyficzności testu(stosunekwynikówprawdziwienegatyw-nychdosumywynikówprawdziwienega-tywnychi fałszywiepozytywnych).Wiążesiętojednakrównieżzewzrostemkosz-tówtakichbadań(22).
Badania mikrobiologiczne
Hodowlebakteriinaspecjalnychpodło-żachstosowanesąw tradycyjnychme-todachmikrobiologiidowykrywaniapa-togennychbakterii.W przypadkuzaraz-kówprzenoszonychprzezpasożytniczestawonogihodowlemogąbyćprowadzo-new kierunkukrętkówz rodzajuBorrelia,jakrównieżpałeczek,takichjak:Francisella tularensis,Coxiella burnetii,Yersinia pestisorazRickettsiaspp.(2,26,27,28,29).
W diagnostyceboreliozymateriałemdobadań,zależnieodobjawów i lokali-zacjizmianpatologicznych,są:płynmó-zgowo-rdzeniowy,maźstawowa,wycinkiskóryorazpobieranepośmiertniewycinkinarządówwewnętrznychoraztorebkista-wowej(26,30).Uzyskanymateriałposie-wasięnapodłożeKellegolubjegomody-fikację,podłożeBSK-H(podłożeBarbour-Stoenner-Kellegoz dodatkiemneomycyny,amfoteromycynyi krwikońskiej).Bakterieinkubowanesąw warunkachmikroaero-filnych,w temperaturze28–33°Cprzez7 dni.Wzrostbakteriiocenianyjestmakro-i mikroskopowoprzyużyciumikroskopuz ciemnympolem.Charakterystycznyjest
braktypowychkoloniibakteryjnych.Kręt-kinapodłożutworzątzw.nalotpełzający(26).Identyfikacjabakteriiprowadzonajestw oparciuo ichwłaściwościbiochemicz-neorazewentualnąreplikację i sekwen-cjonowanieuzyskanegoz bakteriiDNA(30).W przypadkupałeczekF. tularensis,czynnikaetiologicznegotularemii,mate-riałemdobadańsąaspiratybądźwycin-kiwątroby,śledzionyi węzłówchłonnych.Uzyskanymateriałposiewanyjestnapod-łożeagarz krwiąorazpodłożei inkubowa-nyw warunkachtlenowych,w temperatu-rze37°Cprzez7dni.HodowlanapodłożuMacConkeyadajewyniknegatywny,gdyżpałeczkitularemiinierosnąnatympod-łożu,natomiastnaagarzez krwiątworządrobnekolonie,którez czasemzlewająsięzesobą.Podobniejakw przypadkuiden-tyfikacjikrętkówchorobyz Lymeidenty-fikacjabakteriiprowadzonajestw oparciuo ichwłaściwościbiochemiczneorazwynikłańcuchowejreakcjipolimerazy(27).Ho-dowlapałeczekC. burnetii(czynniketio-logicznygorączkiQ)orazw szczególno-ściY. pestis(pałeczkadżumy)prowadzo-na jestwyłączniew wyspecjalizowanychlaboratoriachzewzględunaznacznysto-pieńpatogennościi zakaźnościtychzaraz-kówdlaludzii zwierząt(27,29).Przypo-dejrzeniuzakażeniajednąz tychpałeczekmateriałemwysyłanymdo laboratoriumsąw przypadkuC. burnetiifragmentyło-żyska,wydzielinapochwyorazzawartośćżołądkaporonionychpłodów,natomiastw przypadkupałeczkidżumy–krew,ropa,plwocina,płynmózgowo-rdzeniowyorazaspiratywęzłówchłonnychw przypadkudymieniczejpostacichoroby(27,29,31).W przypadkuriketsjiz rodzajówRickettsia,Ehrlichia,Anaplasmai Cowdria,po-dobniejakw przypadkuczynnikówetiolo-gicznychgorączkiQoraztularemii,w prak-tycediagnostycznejw ogólenieprowadzisięhodowli.Hodowleprowadzonesąnazarodkachkurzychbądźhodowlachtkan-kowychwyłączniew specjalistycznychla-boratoriach.W rozpoznawaniuzakażeńriketsjami stosowanesąmetodyserolo-giczneorazmetodybiologiimolekularnej(28).Obecnie,zewzględunaczasochłon-nośćoraztrudnościw izolacjibakterii,jakrównieżzwiązanez tymniebezpieczeństwozakażeń,hodowlebakteryjnewypieranesąprzeznowetechnikibiologiimolekularnejorazmetodyimmunologiczne.
Badania parazytologiczne
W diagnostyceniektórychpasożytówprze-noszonychprzezstawonogizastosowanieznajdująrównieżtradycyjnemikroskopo-wemetodyparazytologiczne.W przypadkuinwazjiu konii bydłapowodowanychprzezprzenoszoneprzezmeszkilubkuczmanynicieniez rodzajuOnchocerca,dobadań
Prace poglądowe
21Życie Weterynaryjne • 2011 • 86(1)
pobierasięwysiękuzyskanyprzezskary-fikacjęskóryw miejscachpredylekcyjnych(wzdłużkresybiałej).Kroplęwysiękuob-serwujesiępodmikroskopem,używającobiektywówo powiększeniu5 i 10razy,bezpośredniopopobraniu.W prepara-ciemożnazaobserwowaćporuszającesiępoliniisinusoidymikrofilarie(12).Z koleiinwazjau konispowodowanaprzezprze-noszoneprzezmuchynicieniez rodza-jówDraschia lubHabronemamożebyćzdiagnozowananapodstawiemikrosko-powegobadaniakałumetodąflotacjilubjednąz metodlarwoskopowych.Jednak-żew przypadkutychinwazjimetodyko-proskopowemająbardzoniskączułość
i częstodająwynikifałszywienegatywne.Alternatywądlatychbadańw przypadkuskórnejpostacihabronemozyspowodo-wanej inwazjąH. microstomamożebyćbezpośredniepobraniedobadańmikro-skopowychwysiękuz wrzodówpojawia-jącychsięw miejscuziarniniakówzawie-rającegolarwypasożyta(12).
Badania serologiczne
Zewzględunaczasochłonność,czasemniskączułośći swoistośćbądźkosztyorazw niektórychprzypadkachryzykozaka-żeń,tradycyjnemetodymikroskopoweco-razczęściejzastępowanesąprzezbadania
serologiczne.Donajczęściejwykonywa-nychbadańw diagnostycechoróbtrans-misyjnychu zwierzątnależą:testagluty-nacjilateksowej,testyimmunofluorecen-cji,ELISAorazWesternblot.
Test aglutynacji lateksowej
Testyaglutynacji są jednymiz najprost-szych testówserologicznych.Wykorzy-stywanew nichjestzlepianieantygenówpodwpływemswoistychprzeciwciał.W te-ścieaglutynacji lateksowejcząstki latek-suopłaszczoneantygenemzlepiająsięzesobą,tworząckłaczki,jeżeliw badanejsu-rowicyobecnesąprzeciwciałaskierowaneprzeciwkowykorzystanemuw teścieanty-genowi.Test lateksowejaglutynacjizna-lazłzastosowaniew diagnostyceleiszma-niozyu ludzi.W teścietymcząstkilatek-suopłaszczonebyłyprzeciwciałami IgGskierowanymiprzeciwkopierwotniakomz rodzajuLeishmania.Testtenwykorzy-stanybyłdobadańprzesiewowychw dia-gnostyceleiszmaniozyu ludziw Sudaniei wykazałwysokączułośći specyficzność.W teścietymwykrywanoantygenpasoży-taw moczubadanychludzi(32).Zewzglę-dunafakt,iżtesttenwykrywałw moczuantygen,możnaspodziewaćsię, iżznaj-dzieonrównieżzastosowaniew diagno-styceleiszmaniozyu zwierząt.
Testy immunofluorescencji
W testach immunofluorescencjiwyko-rzystywanesąprzeciwciałaznakowanebarwnikamifluorescencyjnymi,np. izo-tiocyjanianemfluoresceiny(FITC),którypowzbudzeniuemitujekolorzielonyczyizotiocyjanianemtetrametylorodaminy(TRITC),którypowzbudzeniuemitujeko-lorczerwony.Rozróżniasię2typytestówimmunofluorescencji:bezpośredni i po-średni(32).Testyteznajdująwykorzysta-niew diagnostycewieluchoróbtransmi-syjnychm.in.leiszmaniozy,anaplazmozygranulocytarnej,ehrlichiozymonocytar-nejczybartonelozy(14,32,33,34).W te-ście immunofluorescencjibezpośredniejpopołączeniusięantygenuz przeciwcia-łem,podwpływempromieniultrafiole-towychdochodzidoświeceniabarwni-kafluorescencyjnego(ryc. 3).Wyniktakiejreakcjiobserwowanyjestprzyużyciumi-kroskopuzeświatłemUVjakoświecenieposzukiwanegoantygenu.Z koleitestim-munofluorescencjipośredniejjesttestemo wyższejczułości.Przeprowadzanyjestonw 2 etapach.W etapiepierwszymdochodzidopołączeniaantygenuz poszukiwanymprzeciwciałem,natomiastw etapiedru-gimpowstałekompleksyimmunologicz-newykrywanesązapośrednictwemprze-ciwciałdrugorzędowychwyznakowanychbarwnikiemfluorescencyjnym(ryc. 4;32).
Ag
FITC
FITC
FITC
FITC
FITC
FITC
FITC
FITC
Ab Ag
UV
Ab
FITC
FITC
FITC
FITC
FITC
FITC
FITC
FITC
AntyAb
AntyAb
AbAgAbAg
AbAgAb
Etap I
Etap II
Ag
UV
Ryc. 3. Zasada testu immunofluorescencji bezpośredniej (Ag – antygen, Ab – przeciwciało, FITC – izotiocyja-nian fluoresceiny, UV – światło ultrafioletowe)
Ryc. 4. Zasada testu immunofluorescencji pośredniej (Ag – antygen, Ab – przeciwciało, Anty Ab – przeciwciało drugorzędowe, FITC – izotiocyjanian fluoresceiny, UV – światło ultrafioletowe)
Prace poglądowe
22 Życie Weterynaryjne • 2011 • 86(1)
ELISA
Kolejnymtestemwykorzystywanymw dia-gnostyceserologicznejchorób transmi-syjnych jestELISA(enzyme-linked im-munoabsorbentassay). Jest to test im-munoenzymatyczny,w którymobecnew badanejsurowicyprzeciwciała,popołą-czeniuz ufiksowanymnaplastikowejpłytceantygenem,wykrywanesąprzezprzeciw-ciaładrugorzędowewyznakowaneenzy-mem(najczęściejperoksydaząchrzano-wą),którypopołączeniuz dodanymsub-stratempowodujereakcjęw postacizmianyzabarwienia(ryc. 5).Natężeniezabarwieniajestproporcjonalnedostężeniawykrytychimmunoglobulin,jednakżedokładnywy-nikjestodczytywanyzapomocąspecjal-nychczytnikówdoELISA.Najczęściejko-mercyjnezestawydoELISAmająpostaćplastikowychpłytek,naktórychobecnychjest96dołków.W każdymz tychdołkówprzeprowadzanajestoddzielnareakcja.Takdużaliczbadołkównajednejpłytcewyni-kaz faktu,iżELISAjesttestemczęstowy-korzystywanymw badaniachprzesiewo-wych.Testimmunoenzymatycznyznalazłzastosowaniew rozpoznawanium.in.ehr-lichiozymonocytarnej(chorobypowodo-wanejprzezEhrlichia canis)czyteżinwa-zjipowodowanychprzeznicienieDirofilaria immitis(32).
Western blot
Innymznajdującymszerokiezastosowa-nietestemw diagnostyce,w tymrównieżw diagnostyce chorób transmisyjnych,jestWesternblot.Test tenprzeprowa-dzanyjestw dwóchetapach.Etappierw-szyokreślany jest terminemSDS-PAGE(sodiumdodecylsulfate–poliacrylamidegelelectrophoresis).Jesttotypelektrofo-rezyw żelupoliakrylamidowymprzepro-wadzanejw warunkachdenaturujących,służącejrozdzieleniuwieluróżnychczą-steczekbiałkowych.Białkaposiadającałągamękształtów i rozmiarówdetermino-wanychstrukturą II-, III- i IV-rzędową.Zapomocąanionowegodetergentudo-decylosiarczanusodu (SDS),wiążącegosięz białkaminiekowalencyjnie,białkasądenaturowanei oddzielaneodsiebie.Po-nadtozapomocąmerkaptoetanoluzo-stająprzerwanewiązaniadwusiarczkowebiałek.ZastosowanieSDSi merkaptoeta-noluumożliwiauzyskanieliniowejstruk-turybiałeko ładunkuujemnym,coumoż-liwiaichrozdziałwzględemwielkościzapomocąelektroforezyw żelupoliakryla-midowym.Wędrującew żelupolipepty-dyprzemieszczająsięw kierunkuujem-nejelektrody.Dłuższepolipeptydyprze-mieszczająsięwolniej,natomiastkrótszeszybciej.W tensposóbuzyskujesięroz-dzielonewzględemmasymolekularnej
białkanażelupoliakrylamidowymw po-staciprążków(32,35).
Kolejnymetapemtestu jestprzenie-sieniew tensposóbrozdzielonychw poluelektrycznymbiałeknamembranę,np.nitrocelulozową.Dziękitemuuzyskujesięreplikęcząsteczekobecnychw żelupolia-krylamidowymnabłonienitrocelulozowej.
Kolejnymetapemjestinkubacjaw 5%roz-tworzePBS(phosphatebufferedsaline–roztwórchlorkusodubuforowanyfosfo-ranami)z dodatkiemmlekaw proszku,któregobiałkazwiążąwszystkiemiejscaniezwiązane przez rozdzielone w żelubiałka. Po zablokowaniu przez białkamlekaniezwiązanychmiejscnabłonie
1
Ag Ag Ag
2
Ag Ag Ag
Y Y Y
Y
Y Y
3
Ag
Y Y
Ag
Y Y
Ag
Y Y
4
Ag
Yo YoY Y
Ag
Yo YoY Y
Ag
Yo YoY Y
5
Ag
Yo YoY Y
Ag
Yo YoY Y
Ag
Yo YoY Y
Ryc. 5. Zasada ELISA. 1 – plastikowa płytka opłaszczona antygenem, 2 – zakroplenie na płytkę badanej surowicy, 3 – połączenie swoistych przeciwciał z antygenem, 4 – dodanie koniugatu białka wiążącego się z przeciwciałem połączonego z enzymem, 5 – dodanie substratu dla enzymu – reakcja barwna
Prace poglądowe
23Życie Weterynaryjne • 2011 • 86(1)
nitrocelulozowej,domieszaniny,w któ-rejzanurzonajestbłona,dodajesiębada-nąsurowicę,którejprzeciwciała,w przy-padkuwynikupozytywnego,zwiążąsię
z odpowiednimprążkiembiałkanatejbło-nie.Następniepowypłukaniumembranyw czystymroztworzePBSdodawanesąprzeciwciaładrugorzędowewyznakowane
enzymem(bądźradioizotopem)wiążącesięz powstającyminabłoniekompleksamiimmunologicznymi.Dodaniesubstratudlaenzymuzwiązanegoz przeciwciałempo-woduje,iżzachodzireakcjabarwnai uwi-docznionezostajeumiejscowieniebiałekbadanejsurowicynamembranie(32,36).
MetodaWestern-blotznalazłazastoso-waniew diagnostycewieluchoróbtransmi-syjnych.Szczególnieprzydatnajestw wy-krywaniuprzeciwciałprzeciwkokrętkomchorobyz Lyme,gdyżwykorzystywanydobadańprzesiewowychtestELISAdajeczę-stowynikifałszywiedodatnie,jakrównieżnieodróżniaprzeciwciałposzczepiennychodprzeciwciałpojawiającychsięw su-rowicyw wynikuzakażenia (32).War-torównieżdodać,iżwykrycieu ludziczyzwierzątprzeciwciałprzeciwkokrętkomboreliozyniejestrównoznacznez rozpo-znaniemchoroby.Opisaniejednakżeca-łejdiagnostykitejchorobyi kryteriówjejrozpoznawaniajestdosyćobszernymte-matemnaoddzielnąpublikację.Diagno-stykętejchorobyorazproblemyzwiąza-nez jejrozpoznawaniemopisaliwcześniejAdaszeki wsp.(30)orazTylewska-Wierz-banowskai Chmielewski(37).
Techniki biologii molekularnej
Używane w diagnostyce chorób trans-misyjnych techniki biologii molekular-nej wykorzystywane są do wykrywaniaDNAzarazkówlubw przypadkuniektó-rych wirusów ich RNA. Najpowszech-niejsząi coraztańsząmetodąjestłańcu-chowareakcjapolimerazy.Drugąz me-todmającychzastosowaniew diagnostycechoróbtransmisyjnychjesthybrydyzacjaDNA.Metodatajednakniejestjeszczestosowana komercyjnie w diagnostyceweterynaryjnej.
Łańcuchowa reakcja polimerazy
Łańcuchowareakcjapolimerazy,nazywanapowszechniePCR(polymerasechainreac-tion)poleganawielokrotnympowielaniuokreślonegoodcinkaDNA(wybranejse-kwencjiDNA).Badanew tejreakcjiDNAuzyskiwaniejestprzezizolacjętegokwasuzapomocąkomercyjniedostępnychzesta-wówopartychnazdolnościDNAdowią-zaniazezłożamikrzemionkowymiw wy-sokichstężeniachsolichaotropowych.Ma-teriałemdoizolacjiDNAmożebyćkrewpełna,innepłynyustrojowebądźtkanki.PCRskładasięz 3wielokrotnie(najczę-ściejokoło30razy)powtarzanychetapów.EtapempierwszymjestdenaturacjaDNAprowadzonaw temperaturze94°Cpolega-jącanarozdzieleniupodwójnejniciDNAnadwiepojedynczenici.Kolejnymeta-pemjestprzyłączaniestarterów(krótkichodcinkówDNAkomplementarnychdo
A
B
C
A’
B’
C’
Kier
unek
ele
ktro
fore
zy
100 bp+
500 pz
1
13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
K (+) K (-)2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Ryc. 6. Schemat reakcji PCR. A – podwójna nić wyjściowego DNA; B – denaturacja DNA; C – przyłączanie a następnie wydłużanie starterów; A’ – uzyskane po pierwszym cyklu dwie kopie podwójnej nici DNA, w których jedna nić ograniczona jest na jednym końcu sekwencją startera; B’ – denaturacja nowo powstałych podwójnych nici DNA oraz przyłączanie i wydłużanie starterów; C’ – uzyskane po drugim cyklu cztery kopie podwójnych nici DNA, z których dwie mają po jednej nici DNA ograniczonej na obu końcach sekwencjami starterów ( produkt PCR)
Ryc. 7. Wizualizacja produktów PCR w żelu agarozowym. Wynik reakcji łańcuchowej polimerazy w kierunku frag-mentu genu małej podjednostki rybosomu Babesia canis; DNA wyizolowano z krwi psów; 100 bp+ – marker masy molekularnej, K (+) – kontrola pozytywna, K (-) – kontrola negatywna, 500 pz – odcinek DNA długości 500 par zasad, 1–22 – badane próbki; wynik pozytywny w próbce nr 10 i 14
Prace poglądowe
24 Życie Weterynaryjne • 2011 • 86(1)
poszukiwanegofragmentuDNA).Tempe-raturaprzyłączaniastarterówzależnajestodichtemperaturytopnieniawynikającejz koleiz ichsekwencjinukleotydoweji naj-częściejmieścisięw przedziale45–70°C.
TrzecimetapemPCRjestwydłużaniestarterów.Etap ten jestprzeprowadzanyw temperaturze72°C.W tymetapieen-zympolimerazaDNA(pierwotnieuzyska-nyz termofilnychbakteriiThermus aquaticus)dobudowujedowolnychniciDNAkomplementarnenukleotydy.Wielokrotnenaprzemienneuzyskiwanieróżnychtem-peraturposzczególnychetapówodbywasięw urządzeniunazywanymtermocyklerem(32,38).SchematPCRprzedstawiononaryc. 6.CelemPCRjestreplikacjaokreślo-negoodcinkaDNAdotakdużejilości,iżbędziemożliweuwidocznieniegopood-powiednimwyznakowaniu.Wizualiza-cjaproduktuPCRodbywasięzapomocąelektroforezyDNAw żeluagarozowym.
PoprzeprowadzeniuPCRmieszaninęreakcyjnąz probówkiprzenosisiędospe-cjalnychdołkóww żeluagarozowymz do-datkiembromkuetydyny.Umieszczonew żeluDNAwędrujew poluelektrycznym.Podobnie jakw przypadkuelektroforezybiałekw żelupoliakrylamidowymkrótszeodcinkiDNAprzemieszczająsięszybciej,w związkuz czymprzemieszcząsiędalejw żelu,natomiastdłuższeodcinkiDNAwędrująwolniej,a cozatymidziepoko-nająznaczniemniejsząodległośćw żelu.Równocześniez badanymDNAw sąsied-nimdołkuumieszczanyjestwzorzecmasymolekularnej. Jest tomieszaninaróżnejdługościodcinkówDNA,przyczymdłu-gośćposzczególnychodcinkówjestznana.W związkuz tym,gdyposkończonejelek-troforezienapewnejwysokościw żeluwi-daćprążekDNA,możnaoszacowaćjegodługośćnapodstawiejegopołożeniawzglę-demwzorcamasymolekularnej,którypoelektroforezieprzybierawygląddrabiny,w którejkażdyszczebelodpowiadaod-cinkowiDNAo innej,znanejdługości.Je-żeliw badanymDNAobecnybędzieprą-żekodpowiadającydługościposzukiwa-negofragmentuDNA,totakiwynikPCRuznaćmożnazapozytywny(ryc. 7).DNAuwidacznianyjestw żeluzapomocąświa-tłaUV.Możliwetojestdziękidodanemudożelubromkowietydyny,którywiążesięz DNA,a w świetleultrafioletowymświe-cinapomarańczowo(32,38).
Zewzględunafakt,iżmożliwejestuzy-skanieodcinkanieswoistegoDNAo ocze-kiwanejdługościwynikPCRpowinienzo-staćzweryfikowany.Weryfikacjęproduk-tuPCRmożnaprzeprowadzić, stosującanalizę restrykcyjnąbądźsekwencjono-wanieproduktu.
Analizarestrykcyjnajesttocięcieuzy-skanegoproduktuPCRzapomocąenzy-muendonukleazy restrykcyjnej.Z kolei
endonukleazyrestrykcyjnesąenzymamirozpoznającymiokreślonesekwencje(np.enzymyrestrykcyjneklasy II rozpoznająsekwencjepalindromowe).RozcinająonenićDNAw miejscurozpoznanejsekwen-cjilubw pewnejokreślonejodległościodtej sekwencji.Przykłademmożebyćen-donukleazarestrykcyjnaEcoRIuzyskanaz bakteriiEscherichia coli,którarozcinase-kwencjępalindromowąpomiędzyguaninąa adeniną(ryc. 8).UwidocznionyzapomocąelektroforezyproduktPCRwycinanyjestz żelu.NastępniepowyizolowaniuDNAz żelu,zapomocądostępnychkomercyj-niezestawówprzeznaczonychspecjalnie
dotegocelu,inkubujesięgow probówcerazemz enzymemrestrykcyjnym.ZnającsekwencjęposzukiwanegofragmentuDNAwiadomo,w którymmiejscu(i w ilumiej-scach)enzymrestrykcyjnyprzetniepro-duktPCR.W związkuz tymwiadomo,ja-kiejdługościi ileodcinkówDNApowstaniepotrawieniurestrykcyjnym.Przykładana-lizypokazanonarycinie 9.Jeżelienzymprze-tniefragmentDNAw oczekiwanymmiej-scu,uznajesię,żejesttowynikpozytywny.Wynikanalizyrestrykcyjnejjestsprawdza-nyzapomocąelektroforezyw żeluaga-rozowymz dodatkiembromkuetydyny,a jegouwidocznienienastępujew świetle
Eco RI
Eco RI
3’
3’
G A A T T C
A A T T CC T T A A GG
C T T A A G 5’
3’3’ 5’
3’5’ 5’
5’
3’
5’
AB
C
Kier
unek
ele
ktro
fore
zy
750 pz
500 pz
250 pz
D
Kier
unek
ele
ktro
fore
zyRyc. 8. Miejsce cięcia sekwencji palindromowej w podwójnej nici DNA przez endonukleazę restrykcyjną EcoRI
Ryc. 9. Schemat analizy restrykcyjnej. A – uwidocznienie produktu PCR w żelu agarozowym, B – izolacja DNA z żelu, C – trawienie enzymem restrykcyjnym wyizolowanego DNA, D – uwidocznienie produktów analizy restrykcyjnej, 750 pz – odcinek DNA długości 750 par zasad, 500 pz – odcinek DNA o długości 500 par zasad, 250 pz – odcinek DNA o długości 250 par zasad
Prace poglądowe
25Życie Weterynaryjne • 2011 • 86(1)
ultrafioletowym.Istniejeznikomeprawdo-podobieństwo,żeproduktnieswoistyzo-staniepociętynaodcinkio tychsamychdługościachcowłaściwyprodukt(39,40).
InnąmetodąweryfikacjiproduktuPCRjestsekwencjonowanie.W reakcjisekwen-cjonowaniazapomocą jednegostarterapolimerazaDNAprzyłączaznakowanenukleotydy,powielając jednąnićDNA.Następnie sekwencjaodczytywana jestprzezkomputerpodłączonydoaparatudosekwencjonowaniaDNA(sekwenato-ra).Obecnie sekwencjonowaniemDNAzajmująsięwyspecjalizowanekomercyj-nelaboratoria,a kosztsekwencjonowania,podobniejakw przypadkuPCRznaczniesięobniżył(40).
NukleotydowąsekwencjęDNAuzy-skujesięjakowynikw wersjielektronicz-nej.W celuocenieniaczyjesttosekwen-cjaDNApodejrzewanegopatogenu,uzy-skanasekwencjękopiujesię,a następniewklejaw odpowiednieoknow dostępnymzadarmow InternecieprogramieBLAST(http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).Programtenporównujeprzedstawionąse-kwencjęz sekwencjamidostępnymiw ba-ziedanychGenBank®,a następniewyświe-tlaodpowiedźw postaciokreśleniastop-niapodobieństwapomiędzyprzedstawionąsekwencjąa sekwencjamiw baziedanych.W przypadkugdypodobieństwojestwy-sokie,dopodejrzewanegoo zakażeniepa-togenu,w przypadkutejpracypatogenuprzenoszonegoprzezstawonogi,wynikse-kwencjonowaniauznajesięzapozytywny,a więcpotwierdzonyzostajew tensposóbwynikPCR(41,42).ObecniemetodaPCRznajdujezastosowaniew diagnostycewięk-szościchoróbzakaźnych.Stosowanajestm.inw rozpoznawaniuzakażeńpowodo-wanychprzezA. phagocytophilum,Babesiaspp.czyHepatozoonspp.Ograniczo-nemanatomiastzastosowaniew diagno-styceboreliozyzewzględunaprzejściowąspirochetemię(obecnośćkrętkówwekrwi)i potrzebęuzyskaniadoizolacjiDNAwy-cinkówzmienionychchorobowotkaneklubnarządów(7,10,14,43).
Hybrydyzacja DNA
HybrydyzacjaDNApolegana łączeniudwóchobcychniciDNAnapodstawiekomplementarnościzasad.W metodzietejużywanesąsondyDNA,czyliwyznako-wanefragmentyDNA,coumożliwiauwi-docznienieposzukiwanegoDNAzarazka.SondyDNAznakowanemogąbyćbioty-nąlubradioizotopem.Rozdzielonew żelufragmentyDNAsądenaturowane,a na-stępnieprzenoszonesąbłonęnitrocelulo-zową.Kolejnymetapemtestujestpołącze-niejednoniciowejsondyDNAz poszuki-wanymfragmentemDNA.ZdenaturowaneodcinkibadanegoDNAłącząsięz sondąna
zasadziekomplementarnościzasad(adeni-nałączysięz tyminą,natomiastcytozynaz guaniną).Powypłukaniumembranęni-trocelulozowąnakładasięnabłonęfotogra-ficznąbądźteż,w przypadkuwyznakowa-niasondybiotyną,dodajesięprzeciwciałaprzeciwkobiotyniewyznakowaneenzy-mem.Pododaniusubstratudlaenzymureakcjabarwnaw odpowiednimmiejscunanitrocelulozie(lubteżpojawieniesięza-ciemnienianabłoniefotograficznej)świad-czyo pozytywnymwynikutestu.W ostat-nich latachcorazczęściej stosowana jestmodyfikacja tejmetody, tzw.hybrydyza-cjain situ.W metodzietejskrawkitkaneklubrozmazycytologicznezawierająDNAzdolnedohybrydyzacji.W tymprzypad-kusondyDNAnajczęściejznakowanesąbarwnikiemfluorescencyjnym,a wynikre-akcjiobserwowanyjestpodmikroskopemfluorescencyjnym.W przypadkustosowa-niasondznakowanychbarwnikiemfluore-scencyjnymmetodahybrydyzacjiuzyskałanowąnazwę,a mianowicieFISH(fluore-scence insituhybrydization).Metodatajestbardzoczuła,aleniestetykosztownai pracochłonna,coograniczajejwykorzy-staniew komercyjnejdiagnostycewetery-naryjnej(32,39).Obecniew diagnostycechoróbtransmisyjnychhybrydyzacjaDNAwykorzystywanajestdowykrywaniainwa-zjipowodowanychprzezzarodźcemalariiu ludzi(44,45).HybrydyzacjaDNAjestjed-nąz bardzoobiecującychmetoddiagno-stycznych.Obecniew dobieminiaturyza-cjipojawiająsięnowetechnikibadawcze,takiejakmikromacierzeDNA.Mikroma-cierzeDNAsąodmianąhybrydyzacjiDNAużywanądookreślaniarównocześnieeks-presjiwielugenóww danychtkankach.NaszkiełkopodstawowenaniesionesątysiącesondDNA,naktórenastępnienakładasiębadaneDNA.Wyniktegobadaniaodczy-tywanyjestprzyużyciumikroskopukon-fokalnego i analizowanyprzezprogramkomputerowy(46,47).Możliwejestrów-nieżprzygotowanietakichmikromacierzy,w którychkażdasonda(bądźgrupasond)odpowiadaćbędzie innemuczynnikowizakaźnemu,i dziękitemuw jednymteściemożnabywykonaćrównocześniewieleba-dańw kierunkuzakażeniabądźzarażeniawielomazarazkami,określającrównocze-śnieichszczep,zjadliwośćczylekoopor-ność.Niestetyobecniezastosowaniemi-kromacierzyDNAw praktyceweterynaryj-nejograniczonejestprzezbardzowysokiekosztytychbadań.
Podsumowanie
Znajomośćwykonywanychprzez labo-ratoria testów jest istotnadlapraktyku-jącychw lecznicach lekarzyweterynarii,gdyżtoonizlecająbadaniai decydująjakimateriałnależypobraćdobadań(a jestto
częstozależneodwykonywanegotestu).Praktykującylekarzweterynarii,zlecającbadaniedecyduje,którątechnikąmaonozostaćwykonane,mającświadomośćwadi zaletdanegobadaniaorazjegokosztów.Ponadtobadaniawykonywanew kierunkudiagnostykichoróbtransmisyjnychnajczę-ściejwykonywanesąw dalszejkolejności,gdynajczęstszeprzyczynychorobyzosta-nąjużwykluczone.Wiążesiętoz koszta-mi,którewłaścicielzwierzęciajużponiósłnawcześniejszebadaniai w takiejsytuacjinależyprzekonaćgodowykonaniakolej-nychbadań,w czymmożepomócrzeczowewytłumaczenienaczymtobadaniepolega.Ponadtow opiniiautorówwartorównieżpoznawaćnowoczesne technikidiagno-styczneniemające jeszczezastosowaniaw diagnostycekomercyjnejzewzględunawysokiekoszty (np.FISHczymikroma-cierzeDNA),gdyżmożnaprzypuszczać,iżw przyszłości techniki tepotaniejąnatyle,żezostanąrównieżwprowadzonedodiagnostykikomercyjnej,podobniejaktosięstałoz niedostępnąjeszczeniedawnow praktyceweterynaryjnejmetodąPCR.
Pozatestamiukierunkowanyminawy-krywaniezarazków,w diagnostycelabora-toryjnejchoróbtransmisyjnychzastosowa-nieznajdująrównieżbadaniadodatkowenieprowadzącebezpośredniodowykryciapatogenu,jednakżewskazującenauszko-dzeniaróżnychnarządóworazułatwiającepostawieniepodejrzeniachorobytransmi-syjnej.Dobadańtychzaliczyćmożnaba-daniemorfologicznekrwi,badaniabio-chemicznesurowicyorazbadanieogólnemoczu.Technikitychbadańzostanąopi-sanew drugiejczęściartykułupoświęco-nej laboratoryjnymbadaniomdodatko-wymstosowanymw diagnostycechoróbtransmisyjnych.
Piśmiennictwo
1. ShawS.,DayM.:Introduction.W:ShawS.E.,DayM.J.:Arthropodborne Infectious Diseases of the Dog and Cat.MansonPublishing,London2005,9-10.
2. ShawS.:Otherarthropod-borneinfectionsofdogsandcats.W:ShawS.E.,DayM.J.:Arthropodborne Infectious Diseases of the Dog and Cat.MansonPublishing,Lon-don2005,138-142.
3. SiudaK.:Stawonogia chorobytransmisyjne.W:Dery-łoA.:Parazytologia i akaroentomologia medyczna.Wy-dawnictwoNaukowePWN,Warszawa2002,423-444.
4. FukumotoS,SuzukiH,IgarashiI,XuanX.:Fatalexperi-mentaltransplacentalBabesia gibsoniinfectionsindogs.Int. J. Parasitol.2005,35,1031-1035.
5. IrwinP.J.:Caninebabesiosis:frommoleculartaxonomytocontrol.Parasit. Vectors2009,2(Suppl1):S4.
6. JohnsonE.M.,AllenK.E.,PancieraR.J.,LittleS.E.,EwingS.A.:InfectivityofHepatozoon americanum cystozoitesfora dog.Vet. Parasitol.2008,154,148-150.
7. IrwinP.:Babesiosisandcytauxzoonosis.W:ShawS.E.,DayM.J.:Arthropodborne Infectious Diseases of the Dog and Cat.MansonPublishing,London2005,63-77.
8. TaskerS.:Felineinfectiousanaemia.W:ChandlerE.A.,GaskellC.J.,GaskellR.M.:Feline Medicine and Therapeutics.BlackwellPublishing,BSAVA,3rded.Oxford2004,669-678.
9. HarveyJ.W.:Hemotrophicmycoplasmosis(hemobarto-nellosis).W:GreeneC.E.:Infectious Diseases of the Dog and Cat.SaundersElsevier,St.Louis2006,252-260.
Prace poglądowe
26 Życie Weterynaryjne • 2011 • 86(1)
10. BanethG.,Vincent-JohnsosnN.:Hepatozoonosis.W:ShawS.E.,DayM.J.:ArthropodBorne Infectious Diseases of the Dog and Cat.MansonPublishing,London2005,78-88.
11. FerasinL.,KnightD.:Filarialinfections.W:ShawS.E.,DayM.J.:ArthropodBorne Infectious Diseases of the Dog and Cat.MansonPublishing,London2005,51-61.
12. TaylorM.A.,CoopR.L.,WallR.L.:Veterinary Parasitology.3rded.BlackwellPublishing,Oxford2007.
13. GreigB.,ArmstrongP.J.:Caninegranulocytotropicana-plasmosis (A. phagocytophilum infection).W:GreeneC.E.:Infectious Diseases of the Dog and Cat.SaundersEl-sevier,St.Louis2006,219-224.
14. HarrusS.,WanerT.,BjoersdorfA.,ShawS.:Ehrlichiosisandanaplasmosis.W:ShawS.E.,DayM.J.:Arthropodborne Infectious Diseases of the Dog and Cat.MansonPubli-shing,London2005,120-133.
15. ArandaC.,PanyellaO.,EritjaR.,CastellaJ.:Caninefi-lariasis importanceand transmission in theBaixLlo-bregatarea,Barcelona(Spain).Vet. Parasitol.1998,77,267-275.
16. CieleckaD.,SzymańskaK.,SalamatinR.,TomaszewskaA.:PrzypadekinwazjiDirofilaria repens(Leidy,1856)(Ne-matoda:Filarioidea:Onchocercidae)u pacjentaw War-szawie.Wiad. Parazyt.2007,53 (suplement),165.
17. WesołowskaM.,SzalińskiM.,ZielińskiM.,OkulewiczA.,KiszaK.,Misiuk-HojłoM.:Dirofilaria repens–pierwszyprzypadekdirofilariozypodspojówkowejw Polsce.Przewodnik Lekarza2009,12,65.
18. DemiaszkiewiczA.W.,PolanczykG.,PyzielA.M.,Ku-ligowska I.,Lachowicz J.:Pierwszeogniskadirofilario-zypsówwywołanejprzezDirofilaria repensRaillietetHenry,1911w centralnejPolsce.Wiad. Parazyt.2009,55,367-370.
19. SapierzyńskiR.,WojtczakM.,SapierzyńskaE.:Leiszma-niozau psów.Życie Wet.2008,83,113-117.
20. GreeneC.E.,MeinkothJ.,KocanA.A.Cytauxzoonosis.W:GreeneC.E.:Infectious Diseases of the Dog and Cat.SaundersElsevier,St.Louis,2006,716-722.
21. OsbornM.:Immunofluorescencemicroscopyofcultu-redcells.W:CelisJ.E.:Cell Biology, A Laboratory Handbook,VolumeI.3rded.ElsevierAcademicPress,London2006,549-555.
22. Dolka I.: Immunohistochemia w diagnostyceweterynaryjnej–szerokiespektrumzastosowań.Medycyna Wet.2009,65,752-757.
23. LichtensteigerC.A.GreeneC.E.:WestNilevirusinfec-tion.W:GreeneC.E.:Infectious Diseases of the Dog and Cat. SaundersElsevier,St.Louis2006,192-195.
24. TipoldA.,VandeveldeM.:CentralEuropeantick-borneencephalitis.W:GreeneC.E.:Infectious Diseases of the Dog and Cat.SaundersElsevier,St.Louis,2006,195-196.
25. ReidH.W.:Louping-Ill.W:GreeneC.E.: Infectious Diseases of the Dog and Cat.SaundersElsevier,St.Louis,2006,196-197.
26. BinekM.,RzewuskaM.:Badaniaukierunkowanew za-kresiekrętków.W:MalickiK.,BinekM.:Zarys klinicznej bakteriologii weterynaryjnej,TomII.WydawnictwoSGGW,Warszawa2004,23-43.
27. BinekM.:Wykrywanietlenowychgramujemnychpałe-czeki ziarniaków.W:MalickiK.,BinekM.:Zarys klinicznej bakteriologii weterynaryjnej, TomII.WydawnictwoSGGW,Warszawa2004,49-85.
28. BinekM.:Badaniaw zakresieriketsji.W:MalickiK.,Bi-nekM.:Zarys klinicznej bakteriologii weterynaryjnej,TomII.WydawnictwoSGGW,Warszawa2004,229-233.
29. JakubczakA.:Diagnostykalaboratoryjnadżumyi yersi-nioz.W:MalickiK.,BinekM.:Zarys klinicznej bakteriologii weterynaryjnej,TomII.WydawnictwoSGGW,War-szawa2004,166-179.
30. AdaszekŁ.,KalinowskiM.,KutrzebaJ.,ZiętekJ.,Winiar-czykS.:Trudnościw diagnostyceboreliozyu psów.Życie Wet.2010,85,414-417.
31. GrygorczukS.,Hermanowska-SzpakowiczT.:PałeczkaYersinia pestis jakoniebezpiecznabrońbiologiczna.Medycyna Pracy2002,53,343-348.
32. KennyM.:Laboratorydiagnosisofarthropod-transmit-tedinfections.W:ShawS.E.,DayM.J.:Arthropodborne Infectious Diseases of the Dog and Cat.MansonPubli-shing,London2005,41-50.
33. BirtlesR.:Bartonellosis.W:ShawS.E.,DayM.J.:Arthropodborne Infectious Diseases of the Dog and Cat.Man-sonPublishing,London2005,110-119.
34. LaurentiM.D.,OrnA.,SinhoriniI.L.,CorbettC.E.P.:TheroleofcomplementintheearlyphaseofLeishmania (Leishmania)amazonensis infectioninBALB/cmice.Braz. J. Med. Biol. Res.2004,37,427-434.
35. WuZ.L.,EthenC.M.,LarsonS.,PratherB., JiangW:A versatilepolyacrylamidegelelectrophoresisbasedsul-fotransferaseassay.BMC Biotechnology2010,10,11(http://www.biomedcentral.com/1472-6750/10/11).
36. TowbinH.,StaehelinT.,GordonJ.:Electrophoretictrans-ferofproteinsfrompolyacrylamidegelstonitrocellulo-sesheets:Procedureandsomeapplications.Proc.Natl. Acad. Sci. USA1979,76,4350-4354.
37. Tylewska-WierzbanowskaS.,ChmielewskiT.Diagnosty-kaserologicznaboreliozyz Lyme,wytyczneeuropejskie.Post. Mikrobiol.2005,44,289-293.
38. GasserR.B.:PCR-basedtechnologyinveterinaryparasi-tology.Vet. Parasitol.1999,84,229-258.
39. Bartkowiak J.:Badaniamolekularnew rozpoznawaniui różnicowaniuchoróbzakaźnych. Przegl. Epidemiol,2003,57,381-389.
40. TurnerP.C.,McLennanA.G.,BatesA.D.,WhiteM.R.H.:Biologia molekularna.WydawnictwoNaukowePWN,Warszawa1999.
41. AltschulS.F.,GishW,MillerW.,MyersE.W.,LipmanD.J.:Basiclocalalignmentsearchtool.J. Mol. Biol.1990,215,403-410.
42. HiggsP.G.,AttwoodT.K.:Bioinformatyka i ewolucja molekularna.WydawnictwoNaukowePWN,Warszawa2008.
43. HoviusK.E.:Borreliosis.W:ShawS.E.,DayM.J.Arthropodborne Infectious Diseases of the Dog and Cat.Man-sonPublishing,London2005,100-109.
44. TangpukdeeN.,DuangdeeC.,WilairatanaP.,KrudsoodS.:Malariadiagnosis:A briefreview.Korean J. Parasitol,2009,47,93-102.
45. KimT.S.,KimH.H.,LeeS.S.,NaB.K.,LinK.,ChoS.H.,KangY.J.,KimD.K.,SohnY.,KimH.,LeeH.W.:PrevalenceofPlasmodium vivaxVK210andVK247subtypeinMyan-mar.Malar J.2010,9,195(doi:10.1186/1475-2875-9-195).
46. Kozak-CięszczykM.:Diagnostykamolekularnaw para-zytologii.Kosmos2005,54,49-60.
47. JarosS.,ZygnerW.,JarosD.:Zastosowanietechnikimi-kromacierzyw naukachmedycznych.Życie Wet.2006,81,42-49.
Dr Wojciech Zygner, Zakład Parazytologii i Inwazjologii, Katedra Nauk Przedklinicznych, Wydział Medycyny We-terynaryjnej SGGW, ul. Ciszewskiego 8, 02-786 Warszawa
Wiedzanatematwytwarzania,prze-mian i wydalaniamleczanówleży
u podstawzrozumieniawieluprocesówchorobowych,przebiegającychzewzro-stemstężeniamleczanówwekrwi(hiper-laktacydemią)i kwasicąmleczanową.Do-stępnenarynkuurządzeniadodiagnosty-kilaboratoryjnej,w tymprostew użyciuanalizatoryprzenośne(pointofcareana-lyzers),umożliwiają szybkieoznaczeniestężeniamleczanówwekrwiobwodo-wejpacjentów.Wyniktegobadaniamożebyć dobrym czynnikiem prognostycz-nymprzeżywalnościpsówz rozszerze-niemi skrętemżołądka(1),babeszjozą(2,
3)czyidiopatycznąniedokrwistościąhe-molitycznątłaimmunologicznego–IMHA(4),znajdującychsięw stanachkrytycznych(5)i pourazach(6).Udowodnionorównieżjegoprzydatnośćw rozpoznawaniuwysię-kuseptycznegoi o charakterzenowotwo-rowymdojamybrzusznej(7,8,9),obecno-ścipłynuw workuosierdziowym(10)i za-toruaortyu psówi kotów(11).Ponadto,parametrtenz powodzeniemstosowanyjestdookreślaniastopniauogólnionejhi-poperfuzjiwewstrząsiehipowolemicznym,a zarównow medycynie,jaki w weteryna-riijegowartośćponiżej2mmol/lprzyjmo-wanajestjakojedenz celówresuscytacji
krążeniowo-oddechowej(12,13).W arty-kulezostaniedokonanyprzeglądpublikacjiweryfikującychdotychczasprzyjętei pro-ponującychnowesposobywykorzystaniaocenystężeniamleczanóww diagnostyceweterynaryjnej.
Dwie twarze kwasu mlekowego
Spośróddwóchizomerówprzestrzennychkwasumlekowego,formLi D,z punktuwi-dzenialekarzamałychzwierząt,przydat-ne jestoznaczenie stężeniaL-mleczanuwekrwii tow odniesieniudotegozwiąz-kuużywasięokreśleń:hiperlaktacydemiai kwasicamleczanowa.Obydwaizomerypowstająz pirogronianuw wynikubeztle-nowegometabolizmuglukozy,przyudzialespecyficznejdehydrogenazymleczanowej:dehydrogenazyL-mleczanowej (L-LDH)dlakwasuL-mlekowegoorazdehydroge-nazyD-mleczanowej(D-LDH)dlakwasuD-mlekowego.W komórkachssakówniewystępujedehydrogenazaD-mleczanowa,a zatemkwasD-mlekowymożeu nichpo-chodzićalboz przemianmetyloglioksa-lu,albomożebyćdostarczanyspozaor-ganizmu.NajczęściejkwasD-mlekowy
Przydatność badania stężenia mleczanów we krwi obwodowej i płynach z jam ciała małych zwierząt
Magdalena Kalwas, Anna Winnicka, Andrzej Degórski
z Zakładu Patofizjologii Zwierząt Katedry Patologii i Diagnostyki Weterynaryjnej Wydziału Medycyny Weterynaryjnej w Warszawie
Prace poglądowe
27Życie Weterynaryjne • 2011 • 86(1)