teklab fix.docx
TRANSCRIPT
A. Spektrofotometer Uv-Vis
1. Pendahuluan
Gambar 1. Spektrofotometer Uv-Vis
Spektrofotometri merupakan salah satu metode dalam kimia analisis yang
digunakan untuk menentukan komposisi suatu sampel baik secara kuantitatif dan
kualitatif yang didasarkan pada interaksi antara materi dengan cahaya. Peralatan yang
digunakan dalam spektrofotometri disebut spektrofotometer. Cahaya yang dimaksud
dapat berupa cahaya visibel, UV dan inframerah, sedangkan materi dapat berupa
atom dan molekul namun yang lebih berperan adalah elektron valensi.
Dalam interaksi materi dengan cahaya atau radiasi elektromagnetik, radiasi
elektromagnetik kemungkinanan dihamburkan, diabsorbsi atau dihamburkan
sehingga dikenal adanya spektroskopi hamburan, spektroskopi absorbsi ataupun
spektroskopi emisi. Interaksi antara materi dengan cahaya disini adalah terjadi
penyerapan cahaya, baik cahaya Uv, Vis maupun Ir oleh materi sehingga
spektrofotometri disebut juga sebagai spektroskopi absorbsi.
Spektrofotometri UV-Vis merupakan gabungan antara spektrofotometri UV
dan Visible. Alat ini menggunakan dua buah sumber cahaya yang berbeda, yaitu
sumber cahaya UV dan sumber cahaya Visible. Larutan yang dianalisis diukur
serapan sinar ultra violet atau sinar tampaknya. Konsentrasi larutan yang dianalisis
akan sebanding dengan jumlah sinar yang diserap oleh zat yang terapat dalam larutan
tersebut.
Warna yang diserap oleh suatu senyawa merupakan warna komplementer dari
warna yang teramati. Beberapa warna yang diamati dan warna komplementernya
terdapat pada tabel berikut ini :
Tabel 1. Spektrum Warna
Panjang
GelombangWarna Terlihat Warna Komplementer
<400 Ultraviolet -
400-450 Violet Kuning
450-490 Biru Jingga
490-550 Hijau Merah
550-580 Kuning Ungu
580-650 Jingga Biru
650-700 Merah Hijau
>700 Inframerah
2. Prinsip Kerja
Prinsip kerja pada spektrofotometer uv-vis berdasarkan adanya interaksi
antara materi dengan cahaya yang memiliki panjang gelombang tertentu.
Spektrofotometri uv-vis mengacu pada hukum Lambert-Beer. Apabila cahaya
monokromatik melalui suatu media (larutan), maka sebagian cahaya tersebut akan
diserap, sebagian dipantulkan dan sebagian lagi akan dipancarkan.
Bunyi Hukun Lambert-Beer : “Jumlah radiasi cahaya tampak (ultraviolet,
inframerah dan sebagainya) yang diserap atau ditransmisikan oleh suatu
larutan merupakan suatu fungsi eksponen dari konsentrasi zat dan tebal
larutan”.
Berdasarkan hukum Lambert-Beer, rumus yang digunakan untuk menghitung
banyaknya cahaya yang hamburkan:
T=I tI 0
atau%T=I tI 0
x100 %
dan absorbansi dinyatakan dengan rumus :
A=−logT=−logI tI 0
dimana I0 merupakan intensitas cahaya datang dan It atau I1 adalah intensitas cahaya
setelah melewati sampel.
Rumus yang diturunkan dari Hukum Beer dapat ditulis sebagai:
A=a .b . catau A=ε .b .c
dimana:
A = absorbansi
b = tebal larutan (tebal kuvet diperhitungkan juga umumnya 1 cm)
c = konsentrasi larutan yang diukur
ε = tetapan absorptivitas molar (jika konsentrasi larutan yang diukur dalam
molar)
a = tetapan absorptivitas (jika konsentrasi larutan yang diukur dalam ppm).
3. Bagian-Bagian Alat
Gambar 2. Skema Alat Spektrofotometer UV-Vis
a. Sumber cahaya
Sumber cahaya pada spektrofotometer harus memiliki panacaran radiasi yang
stabil dan intensitasnya tinggi. Sumber cahaya pada spektrofotometer UV-Vis
ada dua macam :
1) Lampu Tungsten (Wolfram)
Lampu ini digunakan untuk mengukur sampel pada daerah tampak. Bentuk
lampu ini mirip dengna bola lampu pijar biasa. Memiliki panjang gelombang
antara 350-2200 nm. Spektrum radiasianya berupa garis lengkung. Umumnya
memiliki waktu 1000 jam pemakaian.
2) Lampu Deuterium
Lampu ini dipakai pada panjang gelombang 190-380 nm. Spektrum energy
radiasinya lurus, dan digunakan untuk mengukur sampel yang terletak pada
daerah uv. Memiliki waktu 500 jam pemakaian.
b. Monokromator
Monokromator adalah alat yang akan memecah cahaya polikromatis menjadi
cahaya tunggal (monokromatis) dengan komponen panjang gelombang tertentu.
Bagian-bagian monokromator, yaitu :
1) Prisma
Prisma akan mendispersikan radiasi elektromagnetik sebesar mungkin supaya
di dapatkan resolusi yang baik dari radiasi polikromatis.
2) Grating (kisi difraksi)
Kisi difraksi memberi keuntungan lebih bagi proses spektroskopi. Dispersi
sinar akan disebarkan merata, dengan pendispersi yang sama, hasil dispersi
akan lebih baik. Selain itu kisi difraksi dapat digunakan dalam seluruh
jangkauan spektrum.
3) Celah optis
Celah ini digunakan untuk mengarahkan sinar monokromatis yang diharapkan
dari sumber radiasi. Apabila celah berada pada posisi yang tepat, maka radiasi
akan dirotasikan melalui prisma, sehingga diperoleh panjang gelombang yang
diharapkan.
4) Filter
Berfungsi untuk menyerap warna komplementer sehingga cahaya yang
diteruskan merupakan cahaya berwarna yang sesuai dengan panjang
gelombang yang dipilih.
c. Kompartemen sampel
Kompartemen ini digunakan sebagai tempat diletakkannya kuvet. kuvet
merupakan wadah yang digunakan untuk menaruh sampel yang akan dianalisis.
Pada spektrofotometer double beam, terdapat dua tempat kuvet. Satu kuvet
digunakan sebagai tempat untuk menaruh sampel, sementara kuvet lain
digunakan untuk menaruh blanko. Sementara pada spektrofotometer single beam,
hanya terdapat satu kuvet.
Kuvet yang baik harus memenuhi beberapa syarat sebagai berikut :
1) Permukaannya harus sejajar secara optis
2) Tidak berwarna sehingga semua cahaya dapat di transmisikan
3) Tidak ikut bereaksi terhadap bahan-bahan kimia
4) Tidak rapuh
5) Bentuknya sederhana
Terdapat berbagai jenis dan bentuk kuvet pada spektrofotometer. Umumnya pada
pengukuran di daerah UV, digunakan kuvet yang terbuat dari bahan kuarsa atau
plexiglass. Kuvet kaca tidak dapat mengabsorbsi sinar uv, sehingga tidak
digunakan pada saat pengukuran di daerah UV. Oleh karena itu, bahan kuvet
dipilih berdasarkan daerah panjang gelombang yang digunakan. Gunanya agar
dapat melewatkan daerah panjang gelombang yang digunakan.
UV : fused silika, kuarsa
Visible : gelas biasa, silika atau plastic
IR : KBr, NaCl, IRTRAN atau kristal dari senyawa ion
Tabel 2. Bahan Kuvet dan Panjang Gelombangnya
Bahan Panjang gelombang
Silika 150-3000
Gelas 375-2000
Plastik 380-800
d. Detektor
Detektor akan menangkap sinar yang diteruskan oleh larutan. Sinar kemudian
diubah menjadi sinyal listrik oleh amplifier dan dalam rekorder dan ditampilkan
dalam bentuk angka-angka pada reader (komputer).
Terdapat beberapa jenis detector pada spektrofotometer :
Tabel 3. Jenis Detektor Berdasarkan Panjang Gelombang
Jenis detector λ range (nm) Sifat pengukuran Penggunaan
Phototube 150 – 1000 arus listrik UV
Photomultiplier 150 – 1000 arus listrik UV/Vis
Solid state 350 – 3000
Thermocouple 600 – 20.000 arus listrik IR
Thermistor 600 – 20.000 hambatan listrik IR
Syarat-syarat ideal sebuah detector adalah :
1) Mempunyai kepekaan tinggi
2) Respon konstan pada berbagai panjang gelombang
3) Waktu respon cepat dan sinyal minimum tanpa radiasi
4) Sinyal listrik ayng dihasilkan harus sebanding dengan tenaga radiasi
e. Visual display
Merupakan system baca yang memperagakan besarnya isyarat listrik,
menyatakan dalam bentuk % Transmitan maupun Absorbansi.
4. Cara Kerja
Cahaya yang berasal dari lampu deuterium maupun wolfram yang bersifat
polikromatis di teruskan melalui lensa menuju ke monokromator pada
spektrofotometer dan filter cahaya pada fotometer. Monokromator kemudian akan
mengubah cahaya polikromatis menjadi cahaya monokromatis (tunggal). Berkas-
berkas cahaya dengan panjang tertentu kemudian akan dilewatkan pada sampel yang
mengandung suatu zat dalam konsentrasi tertentu. Oleh karena itu, terdapat cahaya
yang diserap (diabsorbsi) dan ada pula yang dilewatkan. Cahaya yang dilewatkan ini
kemudian di terima oleh detector. Detector kemudian akan menghitung cahaya yang
diterima dan mengetahui cahaya yang diserap oleh sampel. Cahaya yang diserap
sebanding dengan konsentrasi zat yang terkandung dalam sampel sehingga akan
diketahui konsentrasi zat dalam sampel secara kuantitatif.
B. Elektroforesis Kapiler
1. Pendahuluan
Elektroforesis adalah teknik pemisahan suatu partikel/ spesies/ ion atau
partikel koloid berdasarkan kemampuan berpindah melalui medium konduktif,
biasanya berupa larutan bufer, sebagai respon adanya suatu medan listrik. Secara
teknis, elektroforesis merupakan istilah yang diberikan untuk migrasi partikel yang
bermuatan akibat diberikan arus listrik searah atau DC (Direct Current). Umumnya
teknik dari cikal-bakal elektroforesis digunakan untuk menentukan muatan dari suatu
koloid. Teknik elektroforesis ditentukan oleh ciri molekular ionik dan adanya muatan
sebagai sifat fisik. Arah dan laju pergerakan tergantung pada spot dan intensitas
muatan ionik.
Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada
pada makromolekul misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang
bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik
dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan
bergerak dari kutub negatif ke kutub positif.
Elektroforesis kapiler adalah metode elektroforesis yang digunakan untuk
memisahkan asam amino, protein, lipid, karbohidrat, dan nukleotida dengan resolusi
tinggi yang dilakukan pada pipa kapiler berisi buffer. Elektroforesis kapiler
menggunakan listrik bertegangan tinggi yang menyebabkan semua komponen ion
atau molekul netral bergerak ke katoda. Deteksi dapat dilakukan dengan teknik
pendeteksian spektrometri atau elektrokimia. Teknik pemisahan ini dipengaruhi oleh
tegangan listrik, koefisien difusi, panjang, dan diameter pipa kapiler, serta
konsentrasi sampel. Metode ini memiliki efisiensi dan selektivitas yang baik namun
boros listrik karena menggunakan tegangan tinggi dan alatnya juga mahal.
Gambar 3. Elektroforesis Kapiler
2. Prinsip Kerja
Prinsip kerja dari elektroforesis adalah adanya pergerakan komponen
bermuatan positif (+) pada kutub negatif (-) serta komponen bermuatan negatif (-)
pada kutub positif (+). Pegerakan yang terjadi disebut "elektrokinetik" . Hasil yang
didapatkan dari elektroforesis adalaha elektroforegram yang memberikan informasi
mengenai seberapa cepat perpindahan komponen (tm) atau biasa disebut kecepatan
migrasi. Besaran yang digunakan sama dengan pada proses kromatografi.
Gambar 4. Skema Elektroforesis
Dari gambar diatas dapat dilihat bahwa komponen yang bermuatan positif
akan bergerak searah dengan medan listrik menuju kutub negatif. Apabila dalam
campuran terdapat dua jenis komponen, yakni (1) komponen negatif (-), dan (2)
komponen netral (N), maka komponen negatif akan bergerak menuju kutub positif
(+) sedangkan komponen netral (N) akan tetap diam. Skema alat elektroforesis secara
sederhana dapat dilihat pada gambar di bawah ini. Pada gambar tersebut dapat dilihat
komponen yang bermuatan positif akan mengalir ke arah kutub negatif, sedangkan
komponen bermuatan negatif akan mengalir ke arah kutub positif.
3. Bagian-Bagian Alat
Gambar 5. Bagian Alat Elektroforesis Kapiler
a. Pipa kapiler
Pipa kapiler bertindak sebagai kolom tempat proses pemisahan pengganti kertas
atau agar-agar pada elektroforesis konvensional. Pipa kapiler terbuat dari gelas
dengan diameter dalam berkisar antara 25-100 µm dan panjang antara 50-100 cm.
semakin kecil ukuran diameter pipa kapiler maka semakin besar harga N. Oleh
karena itu, semakin besar diameter (>100) maka pemisahan semakin tidak efisien.
b. Larutan buffer
Pipa kapiler diisi dengan larutan buffer dan kedua ujung pipa kapiler tersebut
tercelup dalam larutan buffer. Larutan buffer berfungsi sebagai larutan elektrolit
untuk menghantarkan arus listrik dan untuk pengontrol muatan molekul. Karena
molekul dapat bermuatan positif, negative, atau netral bergantung pada pH
larutan dan sebagaimana fungsi buffer dalam menahan pH. Dengan kata lain, pH
buffer dapat mengontrok selektifitas pemisahan elektroforesis,
c. Sumber arus searah
Dalam elektoforesis konvesional dialirkan arus searah sekitar 100 volt tetapi
dalam elektroforesis kapiler dialirkan arus searah bertegangan sangat tinggi
10.000-30.000 volt. Oleh karena itu, ekperimen elektroforesis kapiler dapat
dilakukan dalam beberapa menit sedangkan eksperimen elektroforesis
konvensional dilakukan dalam waktu sehari.
d. Detector
Detector dapat diletakkan disalah satu ujung pipa kapiler yaitu dekat katoda.
Berbagai detector telah digunakan untuk mendeteksi komponen-komponen hasil
pemisahan, antara lain : spektrometri (seperti UV dan fluoresen) dan detector
elektrokimia (seperti konduktometri dan amperometri).
4. Cara Kerja
Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan pada kolom-kolom
(disebut well atau "sumur") pada sisi elektroda negatif, kemudian dialirkan listrik
dengan kutub yang terpisah satu sisi dengan sisi lainnya. Ketika aliran listrik
diberikan, maka terjadi pengaliran elektron, sehingga zat objek akan bergerak dari
elektroda negatif ke arah sisi elektroda positif. Molekul-molekul sampel tersebut
akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub listrik sesuai dengan
muatannya. Kecepatan pergerakan ini berbeda-beda, tergantung dari muatan dan
berat molekul DNA.
Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk
mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan.
Pada elektroforesis terdapat dua material dasar yang disebut fase diam dan fase
bergerak. Fase diam berfungsi menyaring objek yang akan dipisah, sementara fase
bergerak berfungsi membawa objek yang akan dipisah. Elektroda positif dan negatif
diletakkan pada masing-masing ujung aparat elektroforesis.
C. High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
1. Pendahuluan
Gambar 6. High Performance Liquid Chromatography
HPLC (High Performance Liquid Chromatography) atau biasa juga disebut
dengan Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dikembangkan pada akhir tahun
1960-an dan awal tahun 1970-an. Saat ini, HPLC merupakan teknik pemisahan yang
diterima secara luas untuk analisis bahan obat, baik dalam bulk atau dalam sediaan
farmasetik.
2. Prinsip Kerja
Pada prinsipnya kerja HPLC adalah sama yaitu pemisahan analit-analit
berdasarkan kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan
tertentu sebagai fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan
kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong
fasa gerak. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya dan
kecepatannya untuk sampai kedektetor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan
teramati pada spectrum yang puncak-puncaknya terpisah. Ukuran skala polaritas :
golongan fluorocarbon < golongan hidrokarbon < senyawa terhalogenasi < golongan
eter < golongan ester < golongan keton < golongan alcohol < golongan asam.
3. Bagian-Bagian Alat
Gambar 7. Skema HPLC
4. Cara Kerja
Adapun cara kerja dari alat HPLC adalah ketika suatu sampel yang akan
diuji diinjeksikan ke dalam kolom maka sampel tersebut kemudian akan terurai dan
terpisah menjadi senyawa-senyawa kimia (analit) sesuai dengan perbedaan
afinitasnya. Hasil pemisahan tersebut kemudian akan dideteksi oleh detector
(spektrofotometer UV, fluorometer atau indeks bias) pada panjang gelombang
tertentu, hasil yang muncul dari detektor tersebut selanjutnya dicatat oleh recorder
yang biasanya dapat ditampilkan menggunakan integrator atau menggunakan
personal computer (PC) yang terhubung online dengan alat HPLC tersebut.
D. Melting Point Apparatus
1. Pendahuluan
2. Prinsip Kerja
Menggunakan proses konduksi dari logam untuk penghantaran panas. Pada alat ini
terdapat dua lubangdi bagian atas yang digunakan untuk meletakkan pipa kapiler dan
thermometer. Sementara dua lubang di samping digunakan untuk mengamati
keadaan padatan yang akan menjadi cairan.
3. Bagian-Bagian Alat
4. Cara Kerja
Pertama manyalakan melting point apparatus dengan memutar pemutar suhu
hingga 20oC/menit. Kedua, ketika suhu pada termometra 60% dari titik lebur/titik
leleh suatu senyawa murni yang sudah di tetapkan oleh ilmuwan, maka pemutar suhu
diturunkan hingga mencapai 10oC/menit. Ketiga, jika pada thermometer suhunya
sudah mencapai suhu titik lebur/titik leleh pada suatu senyawa murni maka pemutar
suhu harus diputar kekiri hingga 1oC/menit.