Dikontrol ganda pengiriman faktor pertumbuhan fibroblast-2 dan Interleukin-10 oleh coacervateberbasis

heparin sinergis meningkatkan perbaikan jantung iskemik

Abstrak

Infark miokard (MI) menyebabkan nekrosis infark

miokard, memicu respon inflamasi kronis, danmengarah ke renovasi patologis. Dikontrol pengiriman kombinasi protein angiogen

ik danimmunoregulatory mungkin pendekatan terapeutik yang menjanjikan untuk MI. Kita menyelidikibioactivity dan potensi ter

apeutik suntik, heparin berbasis coacervate bersama - sama memberikan angiogenik faktor, faktor pertumbuhan fibroblast-

2 (FGF2) dan sitokin anti-inflamasi, 10 Interleukin(IL-

10) dalam cara yang terkontrol temporal dan manusiawi. Pengiriman coacervate FGF2 dan IL-10diawetkan mereka miokardiak p

ada proliferasi sel jantung stroma secara in vitro. Berdasarkanintramyocardial injeksi ke model tikus MI, ekokardiografi mengung

kapkan bahwa FGF2/IL-10coacervate diperlakukan kelompok menunjukkan secara signifikan meningkatkan jangka

panjang LVkontraktil fungsi dan diperbaiki LV dilatasi. FGF2/IL-10 coacervate secara

substansial ditambah LVmiokard elastisitas. Selain itu, FGF2/IL-10 coacervate terutama ditingkatkan revaskularisasi jangka

panjang, terutama di daerah penanganan pasien

yang mengalami. Selain itu, coacervate dimuatdengan 500 ng FGF2 dan 500 ng IL-10 berkurang secara

signifikan LV fibrosis, jauh diawetkanpenanganan pasien

yang mengalami ketebalan dinding dan sangat menghambat peradangan kronisdi daerah penanganan pasien

yang mengalami. Hasil ini menunjukkan bahwa coacervate FGF2/IL-10memiliki potensi terapeutik yang terutama lebih

besar daripada coacervate yang mengandung hanyaFGF2. Secara keseluruhan, data kami menunjukkan efek terapi sinergis FGF-

2/IL-10 coacervate,terutama coacervate dengan FGF2 dan 500 ng IL-10, untuk pengobatan penyakit jantung iskemik.

Kata kunci

Traktor; Angiogenesis; Anti-peradangan; Infark miokard; Coacervate; Faktor pertumbuhan fibroblast-2; Interleukin-10

1. Pendahuluan

Penyakit jantung koroner (PJK) mempengaruhi 15,4 juta orang

Amerika dan adalah jenis yang palingumum penyakit jantung. Penyakit jantung

koroner sendiri account untuk 385,000 kematian dan biayaperkiraan total sebesar $108,9 miliar per tahun (langsung dan tidak

langsung) di Amerika Serikat [1].Penyakit jantung

koroner yang disebabkan oleh penyumbatan patologis sirkulasi koroner dapatmenyebabkan iskemia berkepanjangan yang pada gi

lirannya mengakibatkan cardiomyopathypermanen dan/atau infark miokard (MI) [2]. MI menyebabkan kematian jantung myocyt

es danmemicu respons peradangan lokal dan pembentukan parut kompensasi, mengarah ke patologisrenovasi dan akhirnya gagal 

jantung (HF) [2]. Hari percobaan terapi untuk jantung perbaikan terutamafokus pada revaskularisasi dan regenerasi gangguan mi

okardium [3], [4] dan [5]. Namun, untukmemecahkan lingkaran setan MI di-HF, sangat penting untuk tidak hanya mempromosik

anrevaskularisasi jaringan iskemik tetapi juga memodulasi over diaktifkan dan berkepanjanganperadangan setelah infark

miokard cedera [6].

Tim riset kami baru-baru

ini telah mengembangkan sistem pengiriman dikontrol yang memanfaatkanbiaya interaksi antara polycation biodegradable, Poli

(ethylene argininylaspartate digliserida) (PEAD),dan polyanion alam, heparin, untuk bentuk coacervate. Platform berbasis

heparin coacervatepengiriman ini melindungi dan terus rilis heparin

mengikat faktor pertumbuhan, termasuk faktorpertumbuhan fibroblast-2 (FGF2) [7] faktor pertumbuhan saraf (NGF) [7], heparin

mengikat epidermalfaktor pertumbuhan-seperti faktor pertumbuhan (HB-EGF) [8], stroma sel yang diturunkan faktor(SDF)-1α [9

], dan tulang morphogenetic protein-2 [10]. Selain itu, coacervate berbasis

heparin telahditunjukkan untuk efisien memberikan HB-EGF dalam model tikus kulit luka penyembuhan,mempercepat keratinoc

yte migrasi dan luka penutupan [8], dan FGF2 dalam model tikus injeksisubkutan, mempromosikan lokal neoangiogenesis dan pe

mbuluh darah pematangan [11]. Selain

itu,dalam model tumore MI, coacervate berisi 500 ng FGF2 telah terbukti efektif dalam peningkatanfungsional stabilisasi angioge

nesis dan pembuluh darah, mengurangi cardiomyocyte kematian danperi-penanganan pasien

yang mengalami fibrosis dan meningkatkan fungsi jantung [12].Memanfaatkan kapasitas protein

mengikat serbaguna heparin, kami berteori bahwa pengiriman dualFGF2 dan agen anti-inflamasi oleh coacervate dapat terapi lebi

h efektif daripada pengiriman FGF2sendirian.

Interleukin-10 (IL-10) adalah sitokin pleiotropic yang menunjukkan immunoregulatory luas dan anti-inflamasi kegiatan [13]. IL-

10 manusia mengikat heparin dengan afinitas tinggi pada pH 7,4 (Kd = 54± 7 nM) [14]. Peran IL-10 dalam lingkungan jantung te

lah diselidiki dalam beberapa tahun terakhir[15]. Pada congestive HF pasien lebih tinggi kadar plasma mediator anti-

inflamasi seperti IL-10terutama berkorelasi dengan ditambah kontraktil fungsi ventrikel kiri (LV) [16]. arian subkutan suntikan re

kombinan manusia IL-10 (rhIL-10, 75 μg/kg-day) selama 4 minggu dalammodel tikus akut MI (AMI) mengakibatkan secara

signifikan mengurangi produksi sitokin pro-inflamasi, berkurang infiltrasi miokard makrofag, dan ditambah fungsi LV [17]. Mes

kipun demikian,karena singkat paruhnya (2,7-4,5 h) setelah subkutan injeksi [18], biasanya memerlukan ulangadministrasi dosis

tinggi IL-10 untuk mencapai potensi terapeutik, mengarah ke peningkatan risikoefek

samping dan biaya tinggi pengobatan. Mengingat afinitas heparin

mengikat tinggi, coacervatemungkin berfungsi sebagai kendaraan yang ideal untuk pengiriman yang berkelanjutan, lokal IL-

10dan mengurangi dosis terapi yang diperlukan.

Dikontrol bersama pengiriman dua faktor trophic untuk mempromosikan perbaikan jaringan akhir-akhir

ini telah dieksplorasi [19], [20], [21], [22] dan [23]. Secara khusus, berkelanjutan pengiriman FGF2dan hepatosit faktor pertumbu

han (HGF) melalui polietilena albumin-alginate microcapsulesditambah angiogenik dan arteriogenic tanggapan, meningkatkan pe

rfusi jantung dan fungsi, dandilemahkan hipertrofi jantung dan fibrosis [21]. Pengiriman co angiogenik FGF-

2 dan arteriogenicditurunkan trombosit faktor pertumbuhan (PDGF)-

BB dengan diri perakitan peptida mengakibatkanpenanganan pasien

yang mengalami penurunan ukuran, stabil kapal pembentukan dan peningkatanfungsi jantung [22]. Menggunakan Poli (D, L-

laktat-co-glikolat asam) microsphere

alginate hydrogelsistem hibrida, pengiriman gabungan faktor pertumbuhan endotel vaskular (VEGF) dan angiopoietin-1 sinergis 

ditingkatkan pematangan pembuluh darah dan otot diinaktivasi degenerasi di lokasiiskemik di tumore model iskemia hind-

ekstremitas, lebih efektif daripada faktor tunggal pengiriman[23]. Di sisi lain, kelompok kami baru-baru

ini menunjukkan bahwa coacervate berbasis

heparinmampu menggabungkan dan mempertahankan pelepasan VEGF dan HGF selama setidaknya tigaminggu [24]. Dual pengi

riman VEGF dan HGF oleh coacervate menunjukkan kuat efek angiogenikpada endotel proliferasi dan tube pembentukan sel sec

ara in vitro daripada gratis atau coacervatepengiriman individu faktor [24]. Akibatnya, kami berhipotesis bahwa pengiriman dual 

FGF2 dan IL-10sinergis meningkatkan potensi mereka angiogenik dan/atau diperlihatkan di jantung iskemik.

Dalam penelitian ini, kita dicirikan FGF2/IL-10 coacervate dan diselidiki dengan bioactivity padajantung stroma sel secara in vitr

o. Efektivitas terapi FGF2/IL-10 coacervate dievaluasi dalam modeltikus AMI. Data kami menunjukkan bahwa rilis dikendalikan 

FGF2 dan IL-10 oleh coacervate berbasis heparin diberikannya efek sinergis dalam meningkatkan fungsi jantung jangka

panjang, peningkatanelastisitas infark

miokard, mempromosikan revaskularisasi, ameliorating miokard fibrosis danmenghambat peradangan kronis.

2. bahan dan metode

2.1. persiapan FGF-2/IL-10 coacervate

Poli (ethylene argininylaspartate digliserida) (PEAD) disintesis sebagai dijelaskan sebelumnya [7] dan[25]. PEAD dan klinis-

grade heparin (ilmiah Protein Labs, Waunakee, WI, Amerika

Serikat) dilarutkandalam 0.9% normal saline (Baxter Healthcare, Deerfield, IL, USA) 10 mg ml−1 secara

terpisah dandisterilkan dengan melewati 0.22 μm jarum

suntik filter. 5:1 rasio PEAD dan heparin berat yangdigunakan untuk mempertahankan listrik netral seperti dijelaskan sebelumny

a [7]. Heparin inipertama dikomplekskan dengan jumlah yang ditentukan, sama rekombinan manusia FGF-2 (rhFGF-2;17.2 kDa 

protein terdiri dari 154 residu asam amino) dan IL-10 (rhIL-10; 18.6 kDa protein terdiri dari161 asam amino residu) (keduanya d

ari PeproTech, Rocky Hill, NJ, Amerika Serikat) dan dicampurdengan baik. PEAD kemudian ditambahkan ke dalam larutan yang

mengandung [heparin: FGF-2/IL-10] kompleks. Diri perakitan dari PEAD dan [heparin: FGF-2/IL-

10] segera diendapkan kompleks ternerdari solusi untuk membentuk FGF-2/IL-10 coacervate. Curah

hujan coacervate kompleks segerameningkat buram kekeruhan dalam larutan. Coacervate segar disiapkan segera sebelum semuap

ercobaan secara in vitro dan in vivo untuk menghindari agregasi. Coacervate tetesan ukuran diukuroleh Zetasizer Nano ZS90 (Ma

lvern, Worcestershire, Inggris) dan dilaporkan sebagai berarti denganindeks polydispersity (PDI) dari 25 pengukuran. Hasil yang 

kemudian rata-rata dari pengukuran tigasampel coacervate independen. PDI di daerah penyebaran cahaya menggambarkan distrib

usi ukurantetesan.

2.2. neon label FGF-2/IL-10 coacervate

Untuk fluorescently memvisualisasikan penggabungan FGF2 dan IL-10 dalam kompleks coacervate,pewarna reaktif

amina (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) yang digunakan untuk label FGF2 danIL-10 molekul, mengikuti petunjuk produ

sen. Secara singkat, FGF2 dan IL-10 solusi ditambahkan ke dalam cawan-cawan berisi terkonsentrasi NHS ester-

diaktifkan derivatif DyLight 488 dan DyLight 594masing-masing dan bereaksi pada suhu kamar untuk 1 h. Kolom desalting spin 

digunakan untukmenghapus bahan pewarna. Triply label biologis komponen dalam FGF-2/IL-10 coacervate, FGF2 danIL10 pert

ama dicap dengan 488 NHS-DyLight dan 405 NHS-DyLight secara individual. FGF2-DL488dan IL-10-

DL405 kemudian dicampur dengan heparin sebelum rhodamine conjugated ulex europaeusagglutinin saya (UAS-1) diaplikasikan 

pada label heparin. PEAD kemudian ditambahkan ke dalamlarutan yang mengandung [heparin-rhodamine: FGF2-DL488/IL-10-

DL405] kompleks untuk bentukcoacervate.

2.3. In vitro rilis profil FGF-2/IL-10 coacervate

Profil coacervate FGF2/IL-10 rilis bertekad in vitro seperti sebelumnya dijelaskan [7] dan [24]. Secara singkat, FGF2/IL-10

coacervate segar disiapkan dengan rasio massa PEAD:heparin:FGF2:IL-10 = 500:100:1:1, menggunakan 100 ng setiap FGF2 dan

IL-10. Untuk mensimulasikan rilis molekul kargo di vivo, tambahan buffered fosfat saline (PBS) dilengkapi dengan U/mL 0.5

heparinase II telah ditambahkan ke setiap sampel untuk memunculkan volume akhir untuk 200 μL. Empat sampel independen

kemudiannya ditempatkan statis di inkubator budaya dilembabkan sel di 37 ° C. Hari 0, 0,5, 1, 4, 7, 10, 14 dan 21, sampel yang

pelleted oleh sentrifugasi (12,100 g untuk 10 min), diikuti oleh kumpulan supernatants. Sampel kemudian diisi dengan solusi

segar dan tercampur sebelum diserahkan ke inkubator. Solusi yang disimpan di −80 ° C untuk analisis masa depan. Setelah

koleksi akhir pada 21 hari, sampel yang diisi dengan PBS dilengkapi dengan U/mL 2 heparinase II dan diinkubasi pada 37 ° C

dalam semalam untuk memecahkan coacervate tersisa. Jumlah FGF2 dan dilepaskan ke supernatant IL-10 adalah diukur oleh

enzim-linked immunosorbent assay (ELISA) untuk FGF2 atau IL-10 masing-masing (baik dari Abcam, Cambridge, MA, USA),

mengikuti petunjuk produsen. Supernatants dikumpulkan dari sampel empat poin all-time dianalisis secara bersamaan.

Absorbansi direkam oleh pembaca piring terbatas 200 PRO (Tecan, Männedorf, Swiss) atau SynergyMX (Biotek, Winooski, VT,

Amerika Serikat). Hasil yang rata-rata. Efisiensi pemuatan ditentukan dari koleksi pertama segera setelah resuspension awal (hari

0).

2.4. dasar sel isolasi dan budaya

Satu donor yang diturunkan manusia pusar vena sel-sel endotel (HUVECs) dan fibroblas jantungmanusia (hCFs) yang dibeli dari 

Lonza (Allendale, NJ, Amerika Serikat) dan masing-

masingberkembang di media pertumbuhan sel endotel yang lengkap 2 (RUPSLB-2, Lonza) dan DMEM tinggiglukosa dilengkapi 

dengan 10% janin sapi serum (FBS) dan 1% penisilin-Streptomisin (P/S) (semuadari Life Technologies, Grand Island, NY, Amer

ika

Serikat). Mouse jantung fibroblas (mCFs) yangterisolasi seperti yang dijelaskan sebelumnya [26] dan diperluas DMEM tinggi glu

kosa dengan 10%FBS dan 1% P/S. manusia jantung pericytes (hHPs) yang terisolasi dan dimurnikan oleh sitometri aliranarus sep

erti kami sebelumnya dilaporkan [27], sesuai

dengan protokol institusional 0506176 diUniversity of Pittsburgh. hHPs yang berkembang di DMEM glucose yang tinggi dengan 

20% FBS dan1% P/S. utama sel pada bagian 5 – 7 yang digunakan dalam percobaan berikutnya.

2.5. pengukuran proliferasi sel secara in vitro

HUVECs, hCFs, hHPs, dan mCFs trypsinized dan dilapisi dalam rangkap

tiga (1.5 × 103 sel/well)semalam dengan lengkap 100 μl media kultur di bawah wells HTS transwell-96 baik permeabel sistempe

ndukung (Corning, Tewksbury, MA, USA). Segera sebelum transwell dukungan berkumpul, Semuabawah sumur yang pertama d

iisi dengan 135 μl media bebas serum basal segar (EBM-

2 untukHUVECs dan DMEM hCFs, hHPs dan mCFs; keduanya dilengkapi dengan 1% P/S) dengan atau tanpa10 ng/ml (untuk H

UVECs) atau 100 ng/ml (untuk semua jenis sel lain) tumor necrosis factor alpha(TNF-α). Gratis 500 ng FGF2 dikombinasikan de

ngan 100 baik ng atau 500 ng IL-10 dan coacervateyang

mengandung beban tetap 500 ng FGF2 sendiri atau dikombinasikan dengan 100 baik ng atau500 ng IL-10 resuspended dalam 75 

μl bebas

serum basal media dan kemudian ditambahkan ketranswells. Kontrol transwells ditambahkan dengan media basal polos dengan at

au tanpa kosongcoacervate kendaraan. Akhir konsentrasi serum sekitar 33% itu pada media kultur yang lengkap disetiap sumur. 

Piring berkumpul dan kemudian diinkubasi selama 72 h kondisi ambient. Setelahmencuci semua sumur, reagen CellTiter 96

® berair satu solusi sel proliferasi Assay (MTS) (Promega,Madison, WI, Amerika

Serikat) dalam DMEM ditambahkan. Piring adalah diinkubasi di 5% CO2 pada37 °

C selama 3 jam, di mana titik absorbansi di 490 nm (dengan referensi di 650 nm) membacadengan pembaca piring terbatas 200 P

RO (Tecan, Männedorf, Swiss). Semua percobaan secara mandiri diulang 3 kali. Hasil secara

individual dinormalisasi untuk setiap kontrol eksperimental dankemudian rata-rata.

2.6. eksperimen dengan hewan

Kelembagaan Animal Care dan penggunaan Komite di University of Pittsburgh menyetujuipenggunaan hewan dan prosedur beda

h dilakukan dalam studi ini (protokol 12010140). Total 77 laki-laki BALB cJ tikus di 9 –

12 bulan (Jackson Laboratory, Bar harbor, ME, Amerika Serikat) digunakanuntuk studi ini.

2.7. Intramyocardial administrasi FGF-2/IL-10 coacervate dalam model mouse infark miokard akut(AMI)

Setelah induksi anestesi dengan gas isoflurane 4%, tikus intubated dan inhalationally membiusdengan gas isoflurane 2% seluruh 

operasi. Induksi infark miokard (MI) dan injeksi intramyocardialtelah dilakukan seperti yang kita sebelumnya dilaporkan [12] da

n [28]. Secara singkat, MI mikroskopisdisebabkan oleh permanen ligasi kiri anterior menurun arteri koroner (LAD). Tikus kemud

ian secara acak ditugaskan untuk salah satu kelompok lima: kontrol saline, FGF2 500 ng coacervate (Coa-F-

500),ng gratis FGF2/IL-10 500/500 (Free-F/i-500/500), FGF2/IL-10 500/100 ng coacervate (Coa-F/i-500/100), atau FGF2/IL-10 

500/500 ng coacervate (Coa-F/i-500/500). Lima menit setelah induksi MI,free atau coacervate FGF2/IL-10 diencerkan dalam 30 

μl steril 0.9% normal saline disuntikkan di tigatempat dari miokardium iskemik (Pusat dan dua perbatasan penanganan pasien

yang mengalami).Mengendalikan tikus menerima suntikan 30 μl saline.

2.10 Histologi dan immunohistochemistry

Tikus dikorbankan di 6 minggu pasca bedah. Intraventrikular injeksi 1 M kalium klorida (KCl) dilakukan untuk menangkap hati

di diastole. Untuk Histologi dan immunohistochemistry, dipanen hati yang flash beku dalam 2-methylbutane (Sigma-Aldrich, St

Louis, MO, Amerika Serikat) pra-didinginkan dalam nitrogen cair, disimpan di −80 ° C, dan kemudian diproses sebagai

sebelumnya dijelaskan [12] dan [28]. Secara singkat, beku hati adalah serial cryosectioned pada 6 – 8 μm ketebalan dari puncak

ke tingkat ligasi (sekitar 0.5 mm panjang). Setiap seri terdapat 18-21 jantung bagian dan itu dikumpulkan pada slide kaca satu.

Hematoxylin dan eosin (H & E) pewarnaan dilakukan mengikuti protokol standar. Untuk immunohistochemistry, Bagian yang

ditetapkan dalam pra-didinginkan campuran (−20 ° C) metanol dan aseton (1:1) untuk 5 menit atau di paraformaldehyde 4%

selama 8 menit sebelum pewarnaan. Antibodi non-spesifik mengikat diblokir dengan 10% naik keledai atau kambing serum

untuk 1-2 h pada suhu kamar (RT), dan, jika perlu, dengan antibodi Mouse pada Mouse pewarnaan kit (vektor laboratorium,

Burlingame, CA, USA). Bagian yang diinkubasi semalam pada 4 ° C dengan antibodi utama berikut (semua diencerkan dengan

5% keledai atau kambing serum di PBS): antibodi CD31 anti-tikus tikus (diencerkan pada 1: 100; Becton–Dickinson

Biosciences, Franklin Lakes, NJ, Amerika Serikat), mouse anti-mamalia alpha-halus otot aktin (αSMA)-FITC (diencerkan pada

1: 100; Sigma–Aldrich, St Louis, MO, Amerika Serikat), dan/atau antibodi CD68 anti-tikus tikus (diencerkan pada 1: 200;

Abcam, Cambridge, MA, USA). Bagian kemudian diinkubasi di RT untuk 1 h dengan antibodi fluorochrome conjugated berikut:

keledai IgG rat-Alexa594 atau kambing IgG rat-Alexa488 (keduanya diencerkan pada 1:250; Jackson Laboratory, Bar Harbor,

ME, Amerika Serikat). Inti yang diwarnai dengan 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (1: 1000, Life Technologies, Grand

Island, NY, Amerika Serikat) di RT untuk 5 menit Immunofluorescent gambar yang diambil oleh Nikon Eclipse Ti fluoresensi

mikroskop dilengkapi dengan unsur NIS AR imaging software (keduanya dari Nikon, Tokyo, Jepang).

2.11. pengukuran ketebalan dinding fibrosis dan penanganan pasien yang mengalami jantung

Masson's trichrome pewarnaan kit (IMEB, San Marcos, CA, USA) digunakan untuk mengungkapkandeposisi kolagen pada lintas

-bagian serial jantung, mengikuti instruksi dari pabriknya. Daerahdeposisi kolagen (mewakili fibrosis

scar) dan daerah seluruh kiri ventrikel jantung jaringan (termasukarea septum tetapi tidak

termasuk ventrikel kanan dan ruang kosong di rongga chamber) secara

terpisah diukur menggunakan gambar digital analyzer (gambar J, National Institutes of Health,Bethesda, MD, USA). Sebagian

kecil pada daerah diperkirakan sebagai rasio jaringan pada ventrikelkiri ke seluruh jaringan ventrikel kiri. Hasil yang rata-rata dar

i 6 bagian yang dipilih secara acak disebanding penanganan pasien

yang mengalami tingkat per hati. Ketebalan dinding ventrikel kiri dipusat penanganan pasien

yang mengalami diperkirakan sebagai rata-rata 3 berdekatan pengukuran(0.25 mm terpisah) dan rata-rata dari 6 bagian yang dipil

ih secara acak di sebanding penanganan pasien yang mengalami tingkat per hati.

2.12. kuantifikasi peradangan kronis dan revaskularisasi

Untuk mengevaluasi peradangan kronis dalam penanganan pasien

yang mengalami wilayah,pewarnaan immunofluorescent penanda fagositik sel CD68 dilakukan pada serial cryosections sebagaid

ijelaskan di atas. Indeks infiltrasi, diwakili oleh jumlah CD68 +

fagositik sel per mm2, kemudiandihitung dengan seorang penyelidik buta dari 6 untuk 8 gambar yang dipilih secara

acak dari wilayahpenanganan pasien yang mengalami setiap hati di tingkat pertengahan penanganan pasien

yangmengalami, menggunakan gambar J. Untuk mengukur revaskularisasi posting-MI, immunofluorescentpewarnaan sel endotel 

(EC) penanda CD31 dan otot polos vaskular sel (VSMC) penanda αSMA secara

berurutan dilakukan pada serial cryosections. Kepadatan yang kapiler, yang diwakili oleh jumlah CD31 +

kapiler ECs per mm2, kemudian dihitung dengan seorang penyelidik buta dari 6 gambar yangdipilih secara

acak dari daerah penanganan pasien yang mengalami atau peri-penanganan pasien

yang mengalami setiap hati pada pertengahan penanganan pasien

yang mengalami tingkat,menggunakan J gambar seperti yang dijelaskan sebelumnya [12] dan [28]. Kepadatan VSMC, diwakiliol

eh jumlah αSMA perivascular (yakni berdekatan dengan CD31 + ECs dan/atau struktur sekitarnyavaskular) +

sel per mm2, kemudian dihitung dari 6 gambar yang dipilih secara acak dari penanganan pasien yang mengalami wilayah peri-

penanganan pasien yang mengalami daerah atau setiap hati ditingkat pertengahan penanganan pasien

yang mengalami, menggunakan gambar J.

2.13. foton multi eksitasi pencitraan

Untuk pencitraan foton multi eksitasi (MPE), rhodamine ditandai dengan UEA-

1 (2 μg) dicampurdengan heparin sebelum PEAD ditambahkan ke dalam larutan yang mengandung [heparin:

rhodamine] kompleks untuk bentuk coacervate. Intramyocardial injeksi gratis atau heparin-terikatrhodamine-UEA-1 (2 μg) atau r

hodamine-UEA-1 coacervate (semua diencerkan dalam 30 μl steril0.9% normal saline) dilakukan setelah induksi MI seperti dijel

askan di atas. Hati yang dipanen pada 5,14, dan 28 hari pasca

injeksi, dicuci 3 kali di PBS, dan segera diperbaiki dalam segar paraformaldehyde4% dalam

semalam. Hati yang kemudian dicuci dengan PBS dua kali dan kemudian tenggelam dalamScaleView-

A2 optik kliring agen (Olympus ilmiah solusi Americas, Waltham, MA, USA) di 4 ° C selama7-

10 hari. Olahan hati yang dipotong blok pada 1 mm ketebalan untuk mendapatkan lintas-

bagiandari puncak ke pengikat segera sebelum melakukan MPE pencitraan pada mikroskop Olympusmultiphoton di pusat untuk 

biologik Imaging, University of Pittsburgh.

2.14. analisis statistik

Semua data diukur disajikan sebagai berarti ± standar deviasi (SD). Kaplan-Meier kelangsungan hidupkurva estimasi dengan log-

peringkat tes dilakukan untuk membandingkan tingkat kelangsungan

hidup hewan antara kelompok pengobatan. Perbedaan antara kelompok Statistik dianalisis olehANOVA sekali

jalan (beberapa kelompok) atau dua

arah mengulangi ANOVA (untuk pengukuranechocardiographic berulang) dengan interval keyakinan 95%. Signifikansi Statistik 

ditetapkan di p ≦0,05. Bonferroni beberapa perbandingan tes dilakukan untuk ANOVA post-hoc analisa. AnalisisStatistik dilaku

kan dengan SigmaStat 3.5 (Systat perangkat lunak) dan perangkat lunak statistikSPSS21 (IBM).

3. hasil

3.1. karakterisasi FGF-2/IL-10 coacervate

FGF-2 dan IL-10 memiliki afinitas heparin mengikat tinggi (FGF-2: Kd ≈ 74 nM [34]; Il-

10: Kd ≈ 54 nM[14]). Campuran FGF2 dan IL-10 pertama dikomplekskan dengan heparin dan kemudian dimasukkanke

dalam terner [PEAD:heparin:FGF2 / IL-

10] coacervate tetesan dengan menambahkan PEAD. Kamitelah berteori bahwa empat komponen-komponen struktural FGF-2/

IL-10 coacervate (PEAD, heparin,FGF2 dan IL-10) yang merata ketika bentuk-bentuk coacervate, mengikuti berbasis

afinitas mengikatFGF2 dan IL-10 heparin, biaya interaksi antara heparin PEAD dan membentuk fisik FGF2 dan IL-10coacervate 

kompleks (Fig. 1A). Tetesan coacervate FGF2/IL-10 memiliki ukuran rata-rata 432.6 ± 42.1Nm diameter, lebih

kecil daripada ukuran tetesan coacervate yang mengandung hanya FGF2 (608.3 ±96.3 nm) atau IL-

10 (502.6 ± 101,5 nm) (Fig. 1B)

Terapi molekul menggunakan faktor-faktor trophic untuk mempromosikan jantung perbaikan danregenerasi telah secara

luas diinvestigasi [35] dan [36]. Untuk mempromosikan revaskularisasi dimiokardium iskemik, angiogenik GFs seperti FGF2 dan 

VEGF telah berhasil diuji dalam model pra-klinis dan MI [37] [38]. Namun, upaya klinis yang menggunakan angiogenik GFs tela

h menunjukkanhasil yang beragam, [37]. Salah

satu kendala utama molekuler terapi dengan eksogen GFs dan/atausitokin adalah paruh pendek di vivo faktor paling biologis. Sel

ain itu, ketersediaanhayati sistemikdisampaikan trophic factor(s) dalam sasaran jaringan/organ bervariasi secara

dramatis, sangattergantung pada ketersediaan pembuluh darah lokal. Kekurangan-

kekurangan ini telah menyebabkanumum administrasi dari dosis besar, berulang-ulang GFs mencapai efikasi terapi, sehinggamen

ingkatkan risiko pada sasaran dan/atau off-target efek samping. Misalnya, VEGF dapatmenyebabkan hipotensi oksida nitrat-

dimediasi ketika dosis selama 50 ng/kg/menit ini dikelola olehintracoronary infus pada pasien dengan infark

miokard iskemia [39]. Untuk secara

efektifmeningkatkan ketersediaanhayati lokal dan potensi eksogen trophic factor(s) dan meminimalkandosis terapi yang diperluk

an dalam konteks iskemik penghinaan, kendaraan yang cocok untukpengiriman berkelanjutan, lokal kritis yang diperlukan.

Namun

demikian, bukti baru menunjukkan bahwa mengikuti AMI, berlebihan peradangan dalammenanggapi cedera miokard iskemik me

nyebabkan efek yang merugikan pada LV model danmeningkatkan kemungkinan HF [6]. Selain itu, pengaruh lokal reaksi inflam

asi dan sel kekebalandalam jaringan endogen perbaikan dan regenerasi telah didirikan [40]. Akibatnya, kami mendalilkanbahwa r

ilis spasial dan temporal terkendali inflammatory/imunomodulator agen seperti IL-10, dalamkombinasi dengan angiogenik GF se

perti FGF2, dapat sinergis menambah endogen jantung perbaikandan lebih meningkatkan prognosis jangka

panjang mengikuti MI.

Dalam dekade terakhir, sejumlah platform traktor telah dikembangkan untuk pengiriman terapeutikprotein, seperti hydrogels, mik

ro / nano-bola, nanofibers electrospun peptida, dan pengiriman sistemberbasis

afinitas [38] dan [41]. Namun, banyak dari sistem pengiriman ini menghadapi tantanganyang berbeda termasuk rilis besar awal m

eledak, dikurangi bioactivity kargo protein akibatpenggunaan pelarut organik, rendah protein-loading efisiensi dan biaya tinggi. 

Baru saja kelompokkami telah dikembangkan dan dioptimalkan murah, biokompatibel berbasis

heparin coacervatesistem pengiriman yang spasial dan temporal mengontrol pelepasan heparin

mengikat GFs [7]. Kamijuga telah menunjukkan bahwa pengiriman FGF2 dikendalikan oleh coacervate menginduksiangiogenesi

s jangka panjang dan sel vaskular stroma perekrutan di peri-penanganan pasien yangmengalami perbatasan zona posting-

MI [12]. Pengobatan dengan FGF2 coacervate berkurang peri-penanganan pasien

yang mengalami peradangan dan fibrosis, mungkin melalui pendirian-kembalicepat dari pembuluh

darah fungsional [12]. Namun, efek menguntungkan dari FGF2 coacervate dalampenanganan pasien

yang mengalami wilayah itu hanya marjinal. Ini mungkin disebabkan, setidaknyasebagian, oleh mikro kasar inflamasi iskemik ep

isentrum posting-MI. Mengingat kemampuan loadingsangat serbaguna heparin dengan setiap satu atau beberapa heparin

mengikat trophic factor(s) [7][8], [9], [10] dan [24], coacervate dianggap cocok untuk pengiriman dikendalikan FGF2 dan IL-10.

.

Selain mereka mengikat heparin afinitas, protein dapat secara

fisik dikemas melalui komplekscoacervation dengan malah dikenakan biaya komponen (gambar 1A). Hitam et al. akhir-akhir

inimenunjukkan bahwa sapi albumin serum (BSA) dapat dimasukkan secara efisien ke

dalam tetesancoacervate dibentuk oleh poly(l-lysine) (PLys) dan Poli (d/l-

glutamat asam) (PGlu) melalui interaksielektrostatik [42]. Selain

itu, pembukaan kapasitas hingga maksimum satu BSA per pasang PLys

PGludapat dicapai melalui enkapsulasi sementara tidak mengubah struktur sekunder kargo protein [42].Hasil ini menunjukkan ke

terlibatan bebas-afinitas berbasis loading selama kompleks coacervationdengan PEAD dan heparin dan tambahan dimensi loadin

g kemampuan luar berbasis afinitasmengikat. Namun, studi masa depan dianggap perlu menjelaskan peran dan kapasitas bebas-

afinitasberbasis pemuatan berbasis heparin coacervate.

Dalam penelitian ini, kami menunjukkan hampir bahkan penggabungan dan distribusi homogen dari FGF2 dan IL-10 dalam

tetesan coacervate. Coacervate FGF2/IL-10 tidak hanya memiliki efisiensi tinggi untuk FGF2 dan IL-10 (kira-kira 98% untuk

keduanya) tetapi juga dipamerkan rendah rilis awal sekitar 16.1% FGF2 dan 12.5% IL-10 hadapan heparinase selama pertama 12

h dan relatif linier rilis kedua faktor sesudahnya selama 21 hari. Rilis kumulatif tampaknya rendah IL-10 adalah terutama karena

degradasi spontan dirilis IL-10 dan molekul yang terperangkap dalam sisa coacervate. Pengiriman coacervate FGF2 dan IL-10

diawetkan mereka miokardiak pada proliferasi sel jantung stroma secara in vitro. FGF2/IL-10 coacervate berkelanjutan

proliferasi HUVEC dan hHP sekaligus mengurangi CF proliferasi secara umum, terutama di bawah kondisi stres inflamasi. Baru-

baru ini, berat molekul rendah FGF2 ditunjukkan menipiskan aktivasi myofibroblast jantung manusia (hCMF) dan hCMF-

dimediasi matriks ekstraseluler disregulasi/renovasi setelah transformasi faktor pertumbuhan (TGF)-β1 stimulasi, tetapi tidak

menginduksi apoptosis hCMF [43]. Namun demikian, Apakah FGF2/IL-10 coacervate juga memiliki peran dalam selular

apoptosis dan/atau aktivasi CMF selain dampak proliferatif harus lebih lanjut diselidiki di tingkat protein. Selain itu, kami telah

menguji kombinasi stres serum kekurangan dan hipoksia (2% O2) untuk erat mensimulasikan efek iskemik. Namun, kombinasi

stres ini tampaknya terlalu kasar dan berakibat kematian sel Massif (data tidak ditampilkan), menyiratkan pembatasan budaya

secara in vitro simulasi untuk iskemia. Secara keseluruhan, penelitian lebih lanjut diperlukan untuk menyediakan mekanistik

korelasi antara dosis relatif/durasi berbasis coacervate FGF2 dan IL-10 pengiriman dan proliferatif/apoptosis sinyal dalam

populasi sel stroma jantung yang berbeda.

Hati yang diperlakukan dengan FGF2/IL-10 coacervate, Coa-F/saya-500/500 khususnya, dipamerkanjangka panjang secara

signifikan meningkatkan LV kontraktil fungsi dan diperbaiki dilatasi LV,menunjukkan kemanjuran sinergis terapeutik dikontrol 

penyerahan FGF2 dan IL-10. FGF2/IL-10coacervate, terutama Coa-F/saya-500/500, ditambah revaskularisasi jangka

panjang, terutama didaerah penanganan pasien

yang mengalami. Data kami juga menyiratkan suatu korelasi positif efekrevascularizing dengan dosis IL-10. Apakah penguranga

n hilangnya pembuluh darah, promosineovascular pertumbuhan, atau keduanya, memainkan peran utama dalam FGF-2/IL-10-

dimediasimanfaat revascularizing setelah cedera iskemik memerlukan penyelidikan masa

depan, terutama padaawal titik waktu. Selain itu, coacervate yang mengandung FGF2 dan 500 ng IL-

10 berkurang LVfibrosis, diawetkan penanganan pasien

yang mengalami ketebalan dinding dan menghambat kronisfagositik sel infiltrasi di area penanganan pasien

yang mengalami, lebih efektif daripada coacervateyang sarat dengan FGF2 sendiri. Hasil ini lebih

lanjut menunjukkan efek sinergis dari coacervatedengan FGF2 dan IL-10 di anti fibrosis dan anti-

inflamasi. Namun, studi lebih diperlukan untukmengungkapkan efek coacervate disampaikan FGF2 dan IL-10 pada tanggapan inf

lamasi akut danfenotipe switching dari sel-sel inflamasi [6] dan [44].

Selain itu, Coa-F/saya-500/100 dan Coa-F/saya-500/500 secara substansial telah ditambah jangka

panjang elastisitas miokard LV, mempertahankan sekitar 80% dari ketegangan miokard normal.Menariknya, Coa-F-500 diperlak

ukan secara

signifikan peningkatan juga dipamerkan hati miokardelastisitas. Data ini menunjukkan efek utama dikontrol, lokal pengiriman F

GF2 pada elastisitas infark miokard, sebagian besar independen IL-10 dimediasi manfaat anti-

inflamasi. Ini mungkin disebabkanrevaskularisasi fungsional ditingkatkan dan mengurangi kematian cardiomyocyte dimediasi ole

hpelepasan terkendali FGF2 [12]. Namun

demikian, ekokardiografi dalam penelitian ini hanya dilakukandengan pemandangan pendek-sumbu. Parasternal lama-axis Lihat 

dengan pengukuran perubahanluas dan volume atas LV seluruh yang mengikuti MI lebih

lanjut akan memungkinkan Penilaiankuantitatif dan interpretasi dari regional dan global fungsi jantung dan elastisitas hati tumore 

renovasi[45]. Mekanisme yang diduga terlibat dalam FGF2/IL-10 coacervate jantung iskemik ditengahiperbaikan telah dirangku

m dengan penggambaran skematik di tambahan Fig. 3.

Sebelumnya kita telah menunjukkan coacervate yang dipamerkan distribusi spasial yang diinginkan dimiokardium infarcted di 3 

hari pasca

injeksi, yang sangat penting untuk pengiriman terapeutik proteinyang menargetkan jaringan lokal [12]. Hadir perkiraan durasi pe

ngobatan coacervate posting-MI olehMPE pencitraan menunjukkan coacervate yang disuntikkan punya distribusi yang sementara

sedikitnya 4 minggu di situ. Akibatnya, FGF2, IL-10, atau protein lain terapi dengan afinitas tinggiheparin akan kemungkinan ber

tahan dalam coacervate dan meningkatkan ketersediaanhayati merekajangka panjang dalam jaringan lokal. Namun, studi di masa

depan dengan pendekatan yang lebihsensitif yang diperlukan untuk tepat menentukan pelepasan dinamis coacervate disampaikan 

trophicfaktor di vivo.

Secara keseluruhan, Coa-F/saya-

500/500 dipamerkan potensi terapeutik tertinggi di antara semuakelompok pengobatan. Ini menjamin terjemahan pra-klinis coace

rvate pengiriman FGF2 dalamkombinasi dengan IL-10 dalam model binatang yang besar. Selain itu, aplikasi FGF2/IL-10 coacer

vateuntuk pengobatan kondisi lain iskemik seperti cedera reperfusi

darah miokard dan penyakit arteriperifer menuntut penyelidikan masa depan. Namun demikian, bagaimana dosis berbeda IL-

10berkorelasi dengan hasil terapi masih lebih lanjut perlu diperjelas. Saat

ini kami sedang menyelidikibergantung pada dosis effect(s) dan mechanism(s) tepat anti-

peradangan dan immunomodulationdimediasi oleh pelepasan terkendali IL-10.

5. kesimpulan

Dalam ringkasan, coacervate berbasis

heparin mewakili sebuah kendaraan yang menjanjikan untukpengiriman lokal, dikontrol kombinasi protein angiogenik dan anti-

inflamasi. Pengobatan coacervatetunggal dengan 500 ng setiap FGF2 dan IL-10 mengakibatkan jangka

panjang manfaat sinergis dalammodel tikus MI. Studi masa depan di pra-

klinis besar model binatang dibenarkan untuk mengevaluasipotensi terapi untuk mengobati penyakit jantung iskemik. Mengingat 

bahwa heparin mengikatberbagai faktor-faktor trophic, coacervate pengiriman satu atau beberapa protein terapeutik dapatlebih di

perluas ke aplikasi dalam kondisi patologis yang berbeda.

Pengungkapan benturan kepentingan

J.H. menerima remunerasi dari Cook MyoSite, Inc untuk layanan konsultasi dan royalti yang diterimadari teknologi perizinan sel

ama periode yang di atas penelitian dilakukan. Semua penulis lain memilikitanpa konflik kepentingan untuk mengungkapkan.

Kontribusi kepengarangan

W.C. dikonseptualisasikan dan dirancang penelitian, melakukan percobaan, menganalisis data, danmenulis naskah; B.G.L. dan D.

W.P. dilakukan percobaan dan menganalisis data; K.B.K. mempersiapkanbahan, melakukan percobaan, dan menganalisis data; H

.C. dikonseptualisasikan penelitian danmenyiapkan bahan; KK dirancang penelitian, menganalisis data, dan menyediakan ruang l

aboratoriumdan peralatan; J.H. dirancang penelitian, menyediakan peralatan dan pendanaan, dan menyuntingnaskah; Y.W. dikon

septualisasikan dan dirancang penelitian, menyediakan peralatan dan pendanaan,diedit dan disetujui naskah.

Pengakuan

Penulis sungguh-sungguh menghargai Greg Gibson, Dr. Simon Watkins dan pusat untuk pencitraanbiologis di University of Pitts

burgh membantu ahli microcopy foton multi dan confocal. Para penulisjuga ingin berterima kasih

kepada Protein laboratorium ilmiah untuk menyumbangkan heparin klinis-grade dan Drs. Jiao Yu dan Seunghan Ha bantuan tekn

is mereka dengan USG pemindai. Karya inididukung oleh hibah dari 12EIA9020016 American Heart Association didirikan Inves

tigator Award(Y.W.), Henry J. Mankin diberkahi kursi (J.H.) dan National Institute of Health1R21EB016774 (J.H.). Invivo hewa

n pencitraan dilakukan menggunakan scanner USG yang didukung oleh NIH bersamainstrumen grant NIH1S10RR027383 (KK).