Kefir merupakan produk susu dari kelompok dari susu fermentasi di mana laktosa hidrolisis selama fermentasi terjadi dengan tindakan simultan bakteri dan ragi yang terkandung dalam biji-bijian kefir. meskipun asam laktat adalah metabolit utama, karena aktivitas ragi kefir juga mengandung jumlah yang signifikan dari CO2 dan variabel kuantitas alkohol. Karena asosiatif pertumbuhan berbagai spesies mikroba dalam kefir, selama fermentasi senyawa organik lain dibentuk, seperti bioaktif peptida, exopolysaccharides, bakteriosin yang diduga memiliki efek probiotik terhadap kesehatan manusia (Kosikowski dan Mistry, 1999; Stepaniak dan Fetliski, 2003; L Opitz-Otsoa et al, 2006.; Hong et al., 2010). Populasi mikroba butir kefir terdiri berbagai jenis bakteri asam laktat, bakteri asam asetat, ragi dan kapang berfilamen yang mengembangkan hubungan simbiosis kompleks dalam komunitas mikroba (Marshall et al., * Sesuai penulis / Dopisni autor: Telepon / Tel .: 385 (0) 1 239 3646; E-mail: tpogacic@agr.hr Review - Pregledni rad UDK: 637.146.21 Mikrobiota butir kefir Tomislav Pogai *, Sanja Sinko, Simun Zamberlin, Dubravka Samarija Departemen Ilmu Dairy, Fakultas Pertanian Universitas Zagreb, Svetoimunska 25, 10000 Zagreb, Kroasia Diterima - Prispjelo: 2012/07/12. Diterima - Prihvaeno: 2013/02/15. Ringkasan Kefir butir mewakili komunitas mikroba unik yang terdiri dari bakteri, ragi, dan kadang-kadang cetakan filamen menciptakan komunitas simbiosis kompleks. Kompleksitas fisik mereka dan struktur mikroba adalah alasan bahwa butir kefir masih belum tegas dijelaskan. mikrobiota butiran kefir telah dipelajari menggunakan banyak pendekatan mikrobiologi dan molekul. The pengembangan metagenomics, berdasarkan identifikasi tanpa budidaya, membuka kemungkinan-kemungkinan baru untuk identifikasi sebelumnya non-terisolasi dan non-mengidentifikasi spesies mikroba dari kefir biji-bijian. Menurut studi terbaru, ada lebih dari 50 spesies mikroba yang terkait dengan butir kefir. Tujuan dari kajian ini adalah untuk meringkas struktur mikrobiota butir kefir. Selain itu, karena signifikansi teknologi dan mikrobiologis butir kefir, kertas memberikan wawasan mikrobiologi dan molecular metode yang diterapkan untuk mempelajari keanekaragaman hayati mikroba butir kefir. Kata kunci: kefir, biji-bijian kefir, metode molekuler, mikrobiota 1984; Farnworth, 2005). Juga, kehadiran spesies mikroba tertentu dalam butir kefir ditentukan dengan daerah asal (Angulo et al, 1993.; Lin et al., 1999). Peneliti ilmiah memiliki, antara lain, mencoba menjelaskan interior dan eksterior struktur fisik butir kefir yang merupakan ekosistem mikroba yang unik. Namun, karena banyak spesies dan fenomena asosiasi mereka, mikrobiota butir kefir masih belum benar-benar dijelaskan (L eite et al, 2012;. Wang et al., 2012). Dalam penyelidikan komposisi mikrobiota kefir berbagai metode mikrobiologi dan molekuler dari mengisolasi identifikasi telah digunakan, serta pendekatan molekuler seperti baru metagenomik berbasis pada identifikasi populasi mikroba tanpa budidaya mikroorganisme pada nutrisi menengah (Unsal, 2008;. L eite et al, 2012; Gao et al., 2013). Penyelidikan sistem eco unik khas untuk biji-bijian kefir memiliki beberapa ilmiah tujuan. Terlepas dari deskripsi, mikroba ini isolasi spesies dapat digunakan untuk komposisi kultur starter. Tujuan dari penyelidikan butir kefir didasarkan juga pada isolasi isolat dengan Karakteristik probiotik dan biokimia berpotensi berbeda (Hertzler dan Clanci 2003; Santos et al, 2003.; Liu et al, 2005.; Farnworth, 2005; L Opitz-Otsoa et al, 2006.; Powel, 2006; Ferreira et al, 2010.; Hong et al, 2010.; Magalhes et al., 2011; Dimitreli dan Antoniou, 2011; Purnomo dan Muslimin, 2012). Berdasarkan penelitian ilmiah yang dilakukan di beberapa tahun terakhir terakhir, tujuan dari penelitian ini adalah untuk memberikan tinjauan hasil penelitian mikroba butir kefir penduduk. Juga, karena signifikansi butiran kefir di teknologi dan mikrobiologi akal, makalah ini menyajikan rincian lebih lanjut terkait dengan mikrobiologi dan molecular eksperimental pendekatan yang digunakan dalam penelitian keanekaragaman hayati mikroba butir kefir. kefir Kefir adalah produk susu fermentasi tradisional yang telah diproduksi dan dikonsumsi untuk seribu tahun di bidang dari Eropa Timur ke Mongolia. Hal ini diyakini bahwa bersumber nama kefir dari daerah pegunungan Caucas atau Caucasia di mana, menurut legenda, aboriginals mendapat langsung dari Nabi Muhammad (Gaware et al., 2011). Nama kefir yang paling mungkin bersumber dari kata Turki kefy atau Keith berarti kebahagiaan, kepuasan (Kurman et al., 1992). Terlepas dari nama kefir, nama-nama berikut digunakan untuk produk yang sama: kepyr, kephir, Kefer, kiaphur, knapson, Kepi dan kiipi (Rattray dan O'Connell, 2011). Industri kefir yang sebagian besar diproduksi di Rusia dan negara-negara lain dari mantan Uni Soviet, maka dalam Polandia, Swedia, Hungaria, Norwegia, Finlandia, Jerman, Republik Ceko, Denmark dan Swiss. Kefir juga diproduksi di Yunani, Austria, dan Brazil (Saloff-Coste, 1996). Karena dianggap sebagai produk etnis, popularitas kefir meningkat di Amerika Serikat dan Jepang akhir-akhir ini. Menurut data yang tersedia di Kroasia, kefir diproduksi di Kroasia dalam jumlah yang relatif kecil dengan hanya sedikit susu, secara eksklusif oleh penambahan budaya komersial. Berbagai teknologi yang digunakan dalam produksi kefir, tetapi mereka dapat pada dasarnya digambarkan sebagai proses manufaktur tradisional atau industri. The cara tradisional pembuatan adalah inokulasi langsung butiran kefir ke dalam susu, atau susu yang diinokulasi oleh kultur teknis dibuat dari biji-bijian kefir. Tidak seperti ini, istilah proses industri di kefir pembuatan, berarti penggunaan komersial, sebagian besar Budaya dvs (Wszolek et al., 2006). komersial budaya mengandung isolat berbagai bakteri asam laktat dan spesies / atau ragi yang diisolasi dari biji-bijian kefir. Dibandingkan dengan kefir dibuat dari butir kefir, kefir dibuat dengan biakan murni secara signifikan kurang keasliannya (Otles dan Caginidi, 2003; Farnworth, 2005; Garcia Fontn et al, 2006.; Wszolek et al., 2006). kerugian keaslian adalah yang paling sering terhubung ke jumlah yang relatif kecil dari berbagai mikroba spesies yang terkandung dalam biakan murni. Namun, di Polandia, kefir diproduksi oleh susu inokulasi yang budaya lyophilised sendiri dihasilkan dari biji-bijian kefir. Dengan menggunakan metode ini "dimodifikasi" kefir kurang asam dibandingkan yang tradisional dan ditandai oleh berkrim konsistensi, namun dengan peningkatan yang signifikan dalam kualitas permanen, keasliannya belum secara signifikan berubah (Libudzizs dan Piatkoiewicz, 1990; Muir et al., 1999). Apapun metode manufaktur dan Jenis budaya sesuai dengan standar Codex Allimentarius (Codex Stan 243-2003) mikroba khas populasi kefir harus mengandung Lb. kefiri juga sebagai spesies Leuconostoc, Lactococcus dan Acetobacter (diolah dari biji-bijian kefir) dan ragi yang fermentasi laktosa (Kluyveromyces marxianus) serta ragi yang tidak memfermentasi laktosa (Saccharomyces cerevisiae dan Saccharomyces exigous) ketika kefir biji-bijian digunakan untuk budaya. Menurut standar yang sama, kefir khas harus mengandung setidaknya 2,8% protein, kurang dari 10% lemak, setidaknya 0,6% laktat asam, sedangkan persentase alkohol tidak ditentukan. Jumlah total mikroorganisme tertentu dari budaya harus minimal 107 cfu / mL, dan jumlah ragi tidak di bawah 104 cfu / mL. Pada akhir fermentasi, yang meliputi tiga hari pematangan dingin, nilai pH yang khas kefir adalah antara 4,2-4,7, berisi antara 0,8-1,2% asam laktat, 0,5-0,7% etanol dan sekitar 0,20% dari CO2. Terlepas dari ini senyawa, kefir juga mengandung berbagai aromatik senyawa seperti asetaldehida, diacetyl dan acetoin, asam organik lain seperti format, asetat dan / atau propionat dan alkohol isoamil dalam jejak (Wszolek et al., 2006). Selain itu, banyak studi ilmiah mengkonfirmasi bahwa terlepas dari nilai gizi kefir juga memiliki probiotik yang kuat efek (Farnworth, 2005; L opitiz-Otsoa et al, 2006.; Rattray dan O'Connell, 2011). kefir butir Kefir butir merupakan ekosistem yang unik di alam, dibentuk oleh hubungan simbiosis antara bakteri dan ragi. Sebuah komunitas mikroba kompleks butir kefir mengandung lebih dari 50 berbagai jenis bakteri dan ragi dan, tergantung pada asal mereka, beberapa spesies cetakan berserabut (Angulo et al, 1993.; Garrote et al, 2001.; Jukic et al., 2001; Stepaniak dan Fetliski, 2002; Sarkar et al, 2008.; Wang et al., 2008). Namun, ransum dan jumlah spesies mikroba individu dalam sebutir kefir tergantung secara signifikan pada asal dan metode budidaya (Koroleva et al, 1988;. Tamime dan Marshall, 1997; Ferreira et al., 2010). Terlepas dari banyak spesies mikroba, sebutir kefir terbuat dari struktur fibrillated spons dengan reticular matriks laminar dan berserat klaster yang, khususnya di butir pusat, cabang dan interkoneksi dengan rantai panjang. Struktur yang kompleks ini terbuat dari protein, polisakarida, berbagai elemen seluler dan berbagai komponen masih terdefinisi lainnya. Sebuah air-kefiran zat larut membuat polisakarida komponen dengan sekitar 25% dari berat gabah kering. Kefiran, yang dalam eksopolisakarida kompleks Struktur mengandung D-glukosa dan D-galaktosa dalam 1: 1 Rasio bertanggung jawab untuk koneksi saling mikroba komunitas sebutir kefir (La Riviere et al., 1967; K ander dan Kunath, 1983; Marshall et al., 1984; Micheli et al., 1999). Juga, dianggap kefiran yang berisi komunitas mikroba dalam kefir yang biji-bijian dalam simbiosis dengan cara yang populasi mikroba ada sesuai dengan pola ditentukan dengan tepat. A bagian perifer dari biji-bijian hampir secara eksklusif mengandung bakteri, sedangkan ragi mendominasi di tengah. Area antara pusat dan bagian perifer dari kefir yang biji-bijian mengandung bakteri dan ragi, tetapi rasio mereka perubahan progresif tergantung pada jarak dari pusat gandum (Bottazzi dan Bianchi, 1980; Lin et al., 1999). Dengan demikian, Lactobacillus bersifat homofermentatif spesies yang membentuk kefiran seperti bakteri Lb. kefiri dan Lb. kefiranofaciens yang berbeda ditempatkan dalam butiran kefir. Lb. kefiranofaciens dapat ditemukan di tengah-tengah biji kefir di mana kondisi pertumbuhan yang anaerobik dan di mana etanol hadir, dan Lb. kefiri di bagian perifer. Lactobacilli juga terletak di bagian perifer dari matriks, serta ragi yang tidak membentuk kefiran dan yang biasanya tidak bisa lewat melalui bagian polisakarida ke dalam interior (Zhou et al, 2007.; Dimitreli et al., 2011). bakteri Mesenteroides Leuconostoc dan Kluyveromyces ragi marxianus juga spesies mikroba dominan dari lapisan perifer (Lin et al., 2007). Sejauh ini, banyak spesies lactococci, lactobacilli, streptococci, beberapa Jenis dari acetobacter genus, ragi dan kapang telah diisolasi dari biji-bijian kefir (FAO / WHO, 2001). Beberapa spesies seperti Lb. kefiri atau Lb. kefiranofaciens diberi nama sesuai dengan kefir. mengenai rasio keberadaan spesies mikroba, tergantung pada asal, sebutir kefir mengandung sekitar 109 lactococci, antara 107-108 spesies Leuconostoc, 107-108 thermophile lactobacilli, 104-105 ragi dan 104-105 bakteri asam asetat, dan di antara berserabut cetakan Geotrichum candidum (Kurman et al., 1992). Namun, harus ditekankan bahwa tidak struktur populasi mikroba maupun kefir grain tunggal tegas ditentukan. Ukuran butir kefir adalah antara 0,2-3 cm. mereka adalah bentuk tidak teratur tampak seperti kembang kol. mereka adalah licin, tetapi konsistensi perusahaan. Dengan inokulasi berulang ke dalam susu, biji-bijian kefir meningkatkan massa mereka dengan sekitar 25% dan memiliki aroma yang khas. Warna butir kefir adalah gading atau pucat kekuningan (Wszolek et al, 2006;.. Gaware et al, 2011). Sebelum digunakan mereka berikutnya, biji-bijian kefir dilestarikan dengan metode pengeringan konvensional pada suhu dari 33 C atau dengan pengeringan dalam ruang hampa. Di menguntungkan dan kondisi konservasi stabil, biji-bijian tetap stabil untuk beberapa tahun tanpa kehilangan aktivitasnya (Wszolek et al., 2006). Re-aktivasi butir kefir diperoleh dengan inkubasi mereka diulang dalam dipasteurisasi atau dibentuk kembali susu (Sarkar et al., 2008). Selama inkubasi, biji-bijian kering kembali struktur lembut, pertama dengan lambat dan kemudian oleh pertumbuhan yang lebih cepat dan butir kefir baru terbentuk. Keanekaragaman spesies mikroba Karena komposisi mikroba kompleks kefir biji-bijian, isolasi dan identifikasi individu spesies telah secara metodologis menuntut dan 6 T. POGAI et al .: mikrobiota butir kefir, Mljekarstvo 63 (1), 3-14 (2013) kompleks. Oleh karena itu, tidak mengherankan bahwa mikroba komposisi butiran kefir telah berbeda ditafsirkan dalam literatur. Terlepas dari asal yang berbeda butir kefir, pilihan metode untuk mikroba identifikasi yang digunakan dalam berbagai penelitian jelas salah satu faktor yang signifikan dari keanekaragaman disebutkan. Pembiakan dan isolasi bakteri dan ragi Berbagai mikrobiologi dan molekul eksperimental pendekatan telah digunakan untuk investigasi populasi mikroba komposisi butir kefir. Yang paling mewakili dan masih paling diterima eksperimental Pendekatan adalah budidaya klasik mikroorganisme pada lebih atau kurang selektif media nutrisi (Jukic et al, 2001;. Irigoyen et al, 2005;. Wang et al, 2008.; Chen et al, 2008.; Chen et al., 2009) dan Identifikasi molekul isolat. identifikasi tanpa budidaya dan isolasi isolat (metagenomik identifikasi) telah digunakan dalam terakhir beberapa tahun dalam penyelidikan butir kefir mikroba populasi (. L eite et al, 2012; Gao et al, 2013.). Ini didasarkan pada amplifikasi DNA mikroba (tertentu gen atau wilayah variabel) diisolasi langsung dari sampel (Juste et al, 2008;. Ndoye et al, 2011.). Media yang paling sering digunakan untuk klasik budidaya spesies mikroba komersial standar media budidaya lactobacillus (MRS agar, agar HUKUM, ROGOSA agar, LamVab), lactococci (M17 agar), spesies Leuconostoc (MSE agar) dan ragi (Sabouraud agar, potato dextrose agar) (Simova et al, 2006;. Irigoyen et al, 2005;. Garca- Fontn et al., 2006, Wang et al., 2008). juga, media nutrisi non-selektif PCA (Plate count agar) yang paling sering digunakan untuk penentuan bakteri mesofilik aerobik Jumlah (Garca- Fontn et al., 2006, Wang, et al., 2012). Pemurnian isolat adalah prosedur standar yang harus dilakukan dalam rangka untuk memastikan bahwa mikroorganisme yang diisolasi dari satu koloni merupakan hanya satu isolat - satu spesies bakteri, yang sangat sering tidak terjadi setelah prosedur budidaya pertama. Oleh karena itu, satu, dua atau tiga subcultivations ini harus dilakukan pada media nutrisi yang sama dalam kondisi yang sama (suhu, dengan atau tanpa adanya oksigen). Juga, setelah masing-masing budidaya, koloni terisolasi telah diperiksa di bawah mikroskop untuk menentukan apakah itu isolat murni atau beberapa morphotypes dan jika lain subcultivation harus dilakukan untuk mendapatkan satu "murni" isolat (Caprette, 2005), yang digunakan kemudian untuk isolasi DNA genom untuk lebih lanjut identifikasi molekuler. Budidaya, pemurnian dan isolasi mikroorganisme adalah mikrobiologi sangat sensitif dan penting teknik. Budidaya dan / atau isolasi sendiri kadang-kadang dapat mewakili jauh lebih serius masalah masalah dari identifikasi molekuler yang kadang-kadang bisa menjadi analisis rutin. memiliki ditekankan karena banyak mikroba autochthone spesies sangat sulit untuk menumbuhkan pada standar media nutrisi komersial. Juga, penggunaan rutin dari standar media yang tersedia secara komersial dikembangkan di tiga puluh tahun terakhir dapat cocok untuk pertumbuhan selalu spesies mikroba yang sama terlepas dari jumlah sebenarnya spesies dalam sampel diperiksa (Neviani et al, 2009;.. Vartoukian et al, 2009), menyajikan hanya gambar parsial populasi mikroba yang akan dibudidayakan pada media nutrisi. Karena metode molekuler berdasarkan terisolasi DNA dan / atau RNA digunakan sebagian besar untuk identifikasi mikroorganisme, dasar-dasar molekuler identifikasi akan dijelaskan. identifikasi molekuler Isolasi DNA dari isolat Isolasi DNA genom mikroba dari isolat telah mengalami perkembangan yang signifikan dari prosedur isolasi klasik berdasarkan penggunaan fenol-kloroform. Hari ini, kit komersial terkenal produsen telah paling sering digunakan dalam isolasi DNA rutin dan isolasi adalah dilakukan sesuai dengan protokol pabrik. Oleh karena itu, hanya beberapa kekhususan umum Isolasi DNA dari isolat tersebut akan disebutkan. Dalam rangka untuk mengisolasi DNA dari isolat, koloni (sebelumnya dimurnikan dengan 2-3 subcultivations) harus diinokulasi dalam media cair, yang menjamin pertumbuhan bakteri pada periode 12-24 jam. inkubasi periode isolat selama 12-24 jam biasanya cukup untuk mendapatkan kepadatan sel yang diperlukan untuk isolasi DNA. Namun, untuk beberapa isolat, dapat bahkan 48 jam untuk memastikan jumlah yang cukup sel selama inkubasi, atau inokulasi lain (transplantasi) dari mengisolasi dalam media cair diperlukan. Yakni, Adanya fitur tertentu dari masing-masing isolat yang T. POGAI et al .: mikrobiota butir kefir, Mljekarstvo 63 (1), 3-14 (2013) 7 tidak dapat diprediksi sebelumnya harus dibawa ke Akun. Sampel 1-2 mL diambil dari tumbuh sel-sel dalam biakan murni, untuk isolasi DNA dari medium cair, atau volume sampel ditentukan oleh estimasi berpengalaman kekeruhan media atau dengan mengukur densitas optik. protokol untuk Isolasi DNA berbeda di antara mereka sendiri untuk yang lebih rendah atau tingkat yang lebih besar, yaitu ada banyak variasi protokol yang sangat mirip. Perbedaan ini biasanya konsentrasi reagen tertentu atau komposisi reagen tertentu merupakan rahasia manufaktur dan komposisi yang tepat tidak diketahui. Namun, lisis awal dari dinding sel bakteri dengan tambahan enzim lisozim dan proteinase K adalah umum di sebagian besar protokol untuk isolasi DNA efisien. Setelah isolasi, konsentrasi DNA (ng / uL) adalah ditentukan dengan metode spektrofotometri atau elektroforesis metode (elektroforesis gel). prosedur ini penting untuk penentuan yang tepat Microlitres DNA yang harus ditambahkan secara pasti Konsentrasi DNA (ng / mL) dalam campuran reaksi, pada langkah berikutnya dari PCR amplifikasi (Kuchta et al., 2006). Konsentrasi DNA dalam reaksi PCR paling sering bervariasi dari 20 sampai 100 ng / mL, yang tergantung pada banyak faktor. Namun, protokol kadang-kadang jauh lebih sederhana untuk isolasi DNA diimplementasikan, hanya berdasarkan lisis dinding sel dan sel segaris digunakan sebagai DNA template untuk reaksi PCR (Juste et al, 2008.; Ndoye et al., 2011), atau seluruh koloni digunakan untuk PCR reaksi (koloni-PCR) tanpa isolasi DNA atau lisis sel sebelumnya (Unsal, 2008). Identifikasi isolat dengan metode PCR Identifikasi mikroorganisme terisolasi dengan metode berdasarkan PCR polymerase chain reaction telah diterapkan sejak pertengahan tahun 1980-ies (Stefan et al., 1988). Dalam periode itu, banyak variasi PCR Metode yang dikembangkan dan diperkenalkan oleh yang gen yang ditargetkan tertentu atau daerah gen variabel diperkuat in vitro (Bartlett dan Stirling, 2003). Primer ditambahkan ke campuran reaksi PCR (artifisial oligonukleotida disintesis 5'-3 'dan 3'-5' arah), DNA terisolasi (DNA template), enzim Taq polimerase, deoksiribonukleotida (A, T, C, G), puffer dan air steril. Magnesium yang ditambahkan juga dapat menjadi bagian integral dari puffer atau ditambahkan secara terpisah. Campuran reaksi PCR adalah yang paling sering disiapkan dalam volume 25 atau 50 uL. Sangat PCR reaksi terdiri dari tiga langkah utama siklus: denaturasi langkah dua untai molekul DNA, primer anil langkah dan langkah ekstensi untai (Kuchta et al., 2006). Metode PCR didasarkan pada kegiatan enzim polimerase Taq, terisolasi dari bakteri Thermus aquaticus yang memiliki habitat alami sebagai sumber panas dan karena itu tidak kehilangan kemampuan memperkuat DNA pada suhu PCR reaksi, umumnya 60-95 C (Kuchta et al., 2006). Optimalisasi langkah-langkah tertentu reaksi PCR (suhu, siklus berulang) dan konsentrasi tertentu reagen (primer, DNA, enzim, deoksiribonukleotida) adalah masalah yang paling sering yang dapat terjadi selama percobaan. juga, potensi masalah bisa menjadi kontaminasi primer atau reagen atau tidak aktif enzim Taq lainnya polimerase. Kadang-kadang sulit untuk menetapkan penyebab kegagalan percobaan dan dengan beberapa isolat mereka tidak pernah dibentuk. Tujuan Reaksi PCR adalah untuk memperkuat gen yang ditargetkan atau gen Wilayah penting untuk identifikasi mikroorganisme. Target yang paling sering amplifikasi pada bakteri adalah 16S rRNA gen atau salah satu wilayah variabel (V1-V9) dari gen 16S rRNA (Cardenas dan Tiedje, 2008), untuk yang amplifikasi yang universal atau primer spesifik genus yang digunakan. Dengan ragi, yang Target yang paling sering amplifikasi adalah wilayah D1 gen 26S rRNA (Cocolin et al, 2002;. Wang et al., 2008). Dalam kasus ketika ada banyak isolat, untuk isolat tertentu untuk mendapatkan hasil yang valid, baik kondisi reaksi PCR atau primer harus berubah, karena protokol yang diterapkan tidak harus sama-sama efisien untuk semua isolat. Dalam langkah lebih lanjut produk PCR dimurnikan dan maka sebagian besar terpisah dicerna dengan enzim kombinasi (2, 3 atau 4 enzim). setiap enzim spesifik untuk pencernaan diperkuat PCR produk. Profil khusus untuk spesies yang pasti diperoleh kombinasi berbagai pembatasan enzim (Mancini et al., 2012). produk yang diperoleh dengan PCR reaksi dan enzim pencernaan berbeda-beda dalam jumlah pasangan basa dan dipisahkan dengan elektroforesis di agarosa atau poliakrilamid gel untuk mendapatkan profil tertentu (L ushai et al, 1999;. Kuchta et al, 2006.; Copola et al., 2008). identifikasi profil yang diperoleh dapat dilakukan dalam dua cara. Yang pertama adalah perbandingan yang diperoleh profil dengan profil strain referensi dan lainnya dapat dilakukan secara mandiri dari yang pertama atau sebagai suplemen untuk yang pertama, adalah sebuah sequencing 16S rRNA gen dari perwakilan profil (Copola et al, 2008;. Mancini et al., 2012). Urutan yang diperoleh dibandingkan ke beberapa database yang tersedia di internet sebagai BLAST. Untuk beberapa jenis identifikasi yang tepat dengan perbandingan profil yang diperoleh dimungkinkan dengan penggunaan hanya satu enzim restriksi, tetapi dalam beberapa spesies yang secara genetik sangat dekat, 3 atau 4 enzim telah diterapkan untuk identifikasi sukses dari isolat, karena profil genetik sangat spesies mikroba dekat, diperoleh dengan menggunakan satu atau dua enzim, dalam beberapa kasus identik, yang mencegah identifikasi unequiocal spesies. Salah satu kemungkinan prosedur molekul identifikasi isolat, independen dari enzim pencernaan dan sequencing gen 16S rRNA adalah penggunaan primer spesies-spesifik untuk membuktikan keberadaan dari spesies tertentu. Seperti identifikasi molekuler tidak sering digunakan karena banyak spesies-spesifik primer telah digunakan, yaitu sebanyak jumlah diharapkan spesies. Namun, pendekatan ini dapat konfirmasi akhir untuk identifikasi spesies atau subspesies yang tidak dapat diidentifikasi dengan lainnya metode dan dapat digunakan untuk konfirmasi akhir identifikasi (Temmerman et al., 2004). Juga, jika hasil 16S rRNA urutan gen tidak menyediakan identifikasi tegas, daripada meninggalkan kemungkinan bahwa hasilnya mungkin dua atau tiga spesies genetik dekat. Konfirmasi akhir identifikasi dapat dilakukan dengan primer spesies-spesifik (Temmerman et al., 2004) atau hibridisasi DNA-DNA (Goris et al., 2007). identifikasi metagenomik Budidaya populasi mikroba memberikan wawasan parsial ke dalam struktur populasi mikroba masyarakat yang kompleks karena banyak spesies baik tidak ditanami atau budidaya dan isolasi adalah ragu-ragu (Giraffa dan Neviani, 2001; Copola et al, 2008.; L eite et al., 2012). Identifikasi metagenomik, tanpa budidaya dan isolasi mikroorganisme, mewakili spektrum yang luas dari struktur kemungkinan investigasi dan dinamika mikroba populasi sistem mikroba (Huson et al., 2009). Oleh pendekatan molekuler seperti itu adalah mungkin untuk mengisolasi total DNA mikroba (atau RNA) dari kefir atau biji-bijian kefir, yang kit komersial berbagai produsen digunakan dan wilayah target Gen 16S rRNA pada bakteri atau 26S rRNA gen dalam ragi (yang paling sering, tapi bukan satu-satunya target amplifikasi) dapat diperkuat dengan Reaksi PCR untuk mendapatkan wawasan dalam struktur dari komunitas mikroba (nsal, 2008; Zhou et al, 2009.; Cruz et al, 2010.; Gao et al., 2013). Untuk penyelidikan populasi mikroba kefir oleh identifikasi tanpa budidaya, yang paling sering Metode yang digunakan adalah PCR-DGGE (denaturasi Gradient Gel Elektroforesis) dan dalam beberapa terakhir tahun pyrosequencing (Wang et al, 2008;. Ninane et al. 2007; Chen et al, 2008.; Miguel et al, 2010.; L eite et al., 2012). Juga, metode kloning diperkuat DNA (terisolasi langsung dari biji-bijian kefir) digunakan dalam E. colli dan sequencing dari V1 dan V2 wilayah gen 16S rRNA (Veronique et al., 2007). DNA mikroba benar-benar terisolasi diperkuat dalam reaksi PCR terdeteksi dengan metode PCR-DGGE pada gel poliakrilat sebagai fragmen (dengan ukuran yang sama mengenai jumlah pasangan basa, tapi dari spesifik urutan nukleotida untuk setiap jenis mikroba) yang bermigrasi dalam gel untuk berbagai posisi (Muyzer dan Smalla, 1998). Identifikasi fragmen DNA mungkin baik dengan perbandingan posisi fragmen dengan posisi fragmen referensi regangan atau dengan sekuensing fragmen dipotong dari berbagai posisi dalam gel (Muyzer dan Smalla, 1998; Copola et al, 2008.; Jianzhong et al., 2009). Untuk bandingkan posisi fragmen dalam gel, gel dinormalisasi dan dianalisis dengan program bioinformatika. Namun, salah satu kelemahan utama menyelidiki struktur komunitas mikroba kompleks adalah bahwa spesies yang hadir dalam jumlah kecil, paling sering tidak akan diperkuat atau DNA mereka tidak akan terisolasi sama sekali (Ercolini, 2004). The Metode baru yang telah digunakan baru-baru ini di populasi mikroba penyelidikan kefir yang pyrosequencing (Dobson et al, 2011;.. L eite et al, 2012). Pyrosequencing otomatis dan canggih Teknik berdasarkan sintesis satu-tegang DNA dan deteksi urutan nukleotida (Magra et al., 2012). Keuntungan utama dari metode ini adalah bahwa memberikan wawasan ke dalam struktur kecil hadir populasi mikroba dalam mikroba diselidiki sistem (Quigley et al., 2012).Tabel mikroorganisme ( di jurnal)Spesies mikroba butir kefir Banyak spesies mikroba dalam butir kefir dan kefir diidentifikasi oleh mikrobiologi yang berbeda dan teknik molekuler. Keragaman diidentifikasi jenis bakteri dan ragi menegaskan struktur mikroba kompleks yang mikroba alami sistem. Menurut sumber-sumber ilmiah baru-baru ini, populasi mikroba dari gandum kefir termasuk lebih dari 50 berbagai jenis mikroorganisme (Tabel 1). Jumlah ini mungkin akan meningkat dengan pengembangan lebih lanjut dari identifikasi metagenomik, tetapi juga dengan meningkatkan budidaya klasik, karena tidak ada satupun pendekatan yang sempurna dan tidak bisa memberikan lengkap wawasan ke dalam struktur populasi mikroba. Unsal (2008) diisolasi dan diidentifikasi oleh PCRDGGE Metode dari Acetobacter butir kefir syzygii, Leuconostoc mesenteroides, Enterococcus faecium, Lactobacillus kefiri / parabuchneri, dan Lactococcus lactis subsp. lactis, sedangkan berikut diidentifikasi dalam kefir dengan pendekatan metagenomik tanpa isolasi: Lactococcus lactis subsp. lactis, Kefiranofaciens Lactobacillus, Lactobacillus helveticus, Acetobacter lovaniensis. Dalam makalah ini sama jumlah mikroorganisme diidentifikasi oleh kedua pendekatan. Namun, Zhou et al. (2009) mengidentifikasi dengan metode PCR-DGGE tanpa isolasi bakteri 10 spesies dalam butir kefir: kefiranofaciens Lactobacillus, Lactobacillus helveticus, Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactobacillus casei, Lactobacillus kefiri, Leuconostoc mesenteroides, Pseudomonas sp., Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida dan tujuh spesies ragi: Kazachstania unispora, Kazachstania exigua, Kluyveromyces marxianus, Kluyveromyces lactis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces martiniae, Saccharomyces unisporus. Rute 17 mikroorganisme mungkin mungkin telah sejauh ini jumlah terbesar dari mengidentifikasi mikroorganisme dalam satu studi. Gao et al. (2012) diisolasi dan diidentifikasi 11 spesies mikroorganisme dari kefir Tibet: Bacillus subtilis, Lactococcus lactis, Lactobacillus kefiri, Leuconostoc lactis, Lactobacillus plantarum, Kluyveromyces marxianus, Saccharomyces cerevisiae, Pichia kudriavzevii, Kazachstania unispora, Acetobacter fabarum, Pichia guilliermondii. Simova et al., (2002) diisolasi dan diidentifikasi dari biji-bijian kefir Lactococcus lactis subsp. lactis, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus casei subsp. pseudoplantarum, Lactobacillus brevis, Kluyveromyces marxianus var. lactis, Saccharomyces cerevisiae, Candida inconspicua, Candida maris. Wang et al., (2008) terisolasi dan diidentifikasi dari ragi gandum kefir Kluyveromyces marxianus, Saccharomyces turicensis, Pichia fermentans dan Saccharomyces unisporus. Jianzhong et al. (2009) meneliti komposisi Tibet kefir mikroba penduduk menurut PCRDGGE Metode tanpa mikroorganisme sebelumnya budidaya. Primer 338F-GC dan 518R digunakan untuk PCR reaksi untuk DNA bakteri, dan target amplifikasi adalah wilayah V3 gen 16S rRNA, dan untuk DNA ragi primers NL1GC dan LS2 digunakan. Dengan cara yang sama, bakteri berikut diidentifikasi:. Pseudomonas sp, Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus kefiranofaciens, Lactococcus lactis, Lactobacillus kefiri, Lactobacillus casei, dan ragi: Kazachstania unispora, Kluyveromyces marxianus, Saccharomyces cerevisiae dan Kazachstania exigua (Jianzhoung et al., 2009). L eite et al., (2012) diperkuat wilayah V3 gen 16S rRNA dengan primer universal F357- GC dan R518, untuk mengeksplorasi mikrobiota kefir Brasil. Primer spesifik juga digunakan untuk identifikasi bakteri asam laktat: Lac1 dan Lac2-GC untuk identifikasi bakteri dari genera Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc dan Weissella, dan primer Lac3 bakteri dari genera Lactococcus, Streptococcus, Enterococcus, Tetragenococcus dan Vagococcus. D1 domain 26S rRNA gen ragi diamplifikasi oleh primer NL1-GC dan LS2. Semua primer GC terdapat 39 nukleotida bp GC untuk mencegah Total denaturasi produk (L eite et al., 2012). Investigasi struktur populasi mikroba dari Kefir Brazil dengan pyrosequencing dan metode DGGE, potensi kedua metode di metagenomik identifikasi mikrobiota dibandingkan (L eite et al., 2012). Hanya 5 spesies mikroorganisme yang diidentifikasi dengan metode DGGE: Lb. kefiranofaciens, Lactococcus lactis, Lb. kefiri, Saccharomyces cerevisiae dan Kazachstania unispora, sedangkan yang sama spesies mikroba yang diidentifikasi oleh DGGE Metode juga diidentifikasi oleh pyrosequencing, tetapi juga perwakilan Bifidobacterium, Leuconostoc, Streptococcus, Acetobacter, Pseudomonas, Halococcus, serta berbagai perwakilan lactobacilli yang tidak diidentifikasi dengan metode DGGE: T. POGAI et al .: mikrobiota butir kefir, Mljekarstvo 63 (1), 3-14 (2013) 11 Lb. kefiranofaciens subsp. kefirgranum, Lb. kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens, Lb. parakefiri, Lb. parabuchneri, Lb. amylovorus, Lb. crispatus, Lb. buchneri, dan satu wakil dari Lactococcus Lc. lactis subsp. cremoris (L eite et al., 2012). seharusnya ditekankan bahwa beberapa spesies ini yang direpresentasikan dengan kurang dari 1% dari total populasi yang menekankan potensi pyrosquencing dalam investigasi struktur kompleks dan tidak sempurna komunitas mikroba diselidiki seperti kefir (L eite et al., 2012). Juga, Gao et al., (2013) diidentifikasi untuk pertama kalinya di Tibet kefir grains tanpa spesies budidaya dari genus Shewanella, Acinetobacter, Pelomonas, Dysgonomonas, Weissella dan Pseudomonas. Mengingat fakta bahwa ini spesies diidentifikasi untuk pertama kalinya, peran mereka dan signifikansi pada karakteristik khusus dari kefir yang yang masih harus dijelaskan. Hal tersebut hasil penyelidikan struktur kefir membuktikan populasi mikroba gandum bahwa jumlah spesies mikroba diidentifikasi meningkat dengan penggunaan metode metagenomik molekul baru dalam identifikasi dan kecenderungan itu akan dilanjutkan. Hal ini juga menunjukkan potensi yang lebih kecil dari identifikasi berbasis pada budidaya mikroorganisme pada media yang dikembangkan 30 atau lebih tahun yang lalu, karena faktanya adalah bahwa pengembangan media nutrisi baru belum sebagai intensif sebagai pengembangan identifikasi metagenomik (Huson et al, 2009;. Vieites et al, 2010.; Quigley et al, 2011.; Delmont et al., 2011). kesimpulan Studi populasi mikroba pribumi kefir grain dengan menggunakan mikrobiologi kontemporer dan metode molekuler memberikan ide-ide baru pada kompleksitas sistem mikroba butir kefir yang sejauh menghasilkan lebih dari 50 spesies mikroba diidentifikasi. Isolasi mikroorganisme dari biji-bijian kefir, karena mereka lebih jauh karakterisasi teknologi dan probiotik dapat berpotensi menghasilkan strain dengan karakteristik yang sama sekali baru. Pengembangan lebih lanjut dari metagenomics, berdasarkan identifikasi komunitas mikroba tanpa budidaya, pastikan bahwa mikroba biakan yang diisolasi sampai saat ini hanya mewakili satu bagian sistem mikroba kompleks yang mempengaruhi fitur khusus kefir. Namun, budidaya klasik dan isolasi masih akan tetap tak tergantikan untuk karakterisasi rinci isolat mikroba dan penemuan strain baru. Mikrobni sastav kefirnih zrna Saetak Bakterije i kvasci, sebuah ponekad i filamentozne plijesni u kefirnim zrnima ive u sloenom simbiotskom odnosu koji kefirna zrna Cini jedinstvenom mikrobnom zajednicom u prirodi. Sloenost i kompleksnost njihove fizike i mikrobne strukture razlogom su sto su kefirna zrna Yos uvijek mikrobioloki nedovoljno i nepotpuno istraena. U istraivanju mikrobnog sastava kefirnih zrna koriste se razliiti mikrobioloki i molekularni pristupi. Razvojem metagenomike, bazirane na identifikaciji bez kultivacije, otvaraju se nove mogunosti identifikacije melakukan sada JOS neidentificiranih mikrobnih vrsta sadranih u kefirnom zrnu. Apakah sada je identificirano Preko 50 vrsta mikroorganizama prisutnih u kefirnom zrnu. U radu su prikazane melakukan Danas identificirane vrste mikrobne sadrane u kefirnim zrnima razliitog podrijetla. Takoer, radhiyallahu tehnolokog i mikrobiolokog znaenja Koja Imaju kefirna zrna sama po sebi, u radu su detaljnije prikazani molekularni eksperimentalni pristupi koji se koriste u istraivanju njihove mikrobne bioraznolikosti. Kljune rijei: kefir, kefirna zrna, molekularne menggunakan metoda, mikrobne vrste