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TESE DE MESTRADO
Caracterização do efeito do (-)-epigalocatecino-3-galato na
actividade da bomba de Na+, K+ inibida pelo IFN-γ e pela ubaína.
Orientador: Professor Doutor Patricio Soares da Silva (FMUP)
Co-orientador: Professor Doutor Carlos Fonseca (FEUP)
Aluno: Bruno Azevedo Igreja
Porto,
Agosto de 2005
2
FACULDADE DE ENGENHARIA DA UNIVERSIDADE DO PORTO
Departamento de Engenharia Electrotécnica e de Computadores
e
FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DO PORTO
Instituto de Farmacologia e Terapêutica
Caracterização do efeito do (-)-epigalocatecino-3-galato na
actividade da bomba de Na+, K+ inibida pelo IFN-γ e pela ubaína.
Bruno Azevedo Igreja
Licenciado em Bioquímica pela Faculdade de Ciências da Universidade do Porto
Dissertação submetida para satisfação parcial dos
Requisitos do grau de mestre
em
Engenharia Biomédica
Dissertação realizada sob a supervisão de
Professor Doutor Patrício Soares da Silva,
do Instituto de Farmacologia e Terapêutica
da Faculdade de Medicina da Universidade do Porto
e
Professor Doutor Carlos Fonseca,
do Departamento de Engenharia Electrotécnica e de Computadores
da Faculdade de Engenharia da Universidade do Porto
Porto, Agosto de 2005
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RESUMO
A corrente de curto-circuito (Isc) induzida pela anfotericina B, nas células
Caco-2 em meio contendo 143mM de Na+, é uma medida da actividade da bomba de
Na+, K+ (NKA) e foi usada para caracterizar o efeito do (-)-epigalocatecino-3-galato
na actividade desta enzima inibida pelo interferão-γ (IFN-γ) e pela ubaína. No
presente trabalho verificou-se que o IFN-γ e a ubaína reduzem significativamente
esta Isc, no entanto, a remoção da ubaína durante 24 horas faz com que a actividade
da NKA volte aos valores idênticos ao da situação controlo, ao contrário do que
acontece com o IFN-γ, que mesmo 24 horas após a sua remoção mantém inibida a
NKA. Verificou-se ainda que nem o IFN-γ, nem a ubaína alteram significativamente
a expressão da NKA. Por outro lado o EGCG, um inibidor do transdutor de sinal e
activador da transcrição 1 (STAT1), não consegue reverter o efeito da ubaína, mas
reverte o efeito do IFN-γ na actividade da NKA para o qual apresenta um EC50 = 1.43
µM. O STAT1 está envolvido na cascata de sinalização celular desencadeada pela
ligação do IFN-γ ao seu receptor, que vai levar à inibição da NKA. Nas células Caco-
2, o EGCG inibiu a activação do STAT1 induzida pelo IFN-γ, apresentando um EC50
= 1.69 µM, ao contrário do (-)-catecino, do (-)-epicatecino (EC), do (-)-catecino-3-
galato (CG), do (-)-epicatecino-3-galato (ECG), do (-)-epigalocatecino (EGC) e do (-
)-epigalocatecino mais ácido gálico (EGC+AG), que não inibiram a fosforilação da
tirosina 701 do STAT1.
A administração intraperitoneal de ratinhos NMRi com 10000 U de IFN-γ de
ratinho resulta, no colon, num modelo idêntico ao das células Caco-2, onde se
verifica uma diminuição da actividade da NKA sem alteração da expressão. Assim
estudou-se o efeito do EGCG e do EGC 20 mg/Kg, administrado por via oral, neste
modelo animal e verificou-se que apenas o EGCG reverte o efeito do IFN-γ na
actividade da NKA das células epiteliais do colon de ratinhos NMRi.
4
ABSTRACT
The short-circuit current (Isc) induced by the addition of amphotericin B, in
Caco-2 cells monolayers bathed with Na+ 143 mM, is due to the transport of Na+
across the basolateral membrane by the Na+, K+ pump (NKA) and it was used to
characterize the effect of (-)-epigallocatechin-3-gallate (EGCG) in NKA activity
inhibited by interferon-γ (IFN-γ) and ouabain. In the present work we show that
IFN-γ and ouabain significantly decrease this Isc, nevertheless removal of ouabain
for 24 h returns NKA activity to values identical to controls on the contrary to IFN-γ
that even when removed for 24 h keeps the NKA enzyme inhibited. In the present
study we find out that IFN-γ and ouabain don’t significantly changes NKA
expression. On the other hand, the signal transducer and activator of transcription 1
(STAT1) inhibitor, EGCG, is unable to change the effect of ouabain in NKA activity,
but it inhibits IFN-γ effect in enzyme activity and presents an EC50 = 1.43 µM.
STAT1 is involved in the signal transduction pathway initiated by binding of IFN-γ
to its receptor which leads to NKA inhibition. In Caco-2 cells EGCG inhibit STAT1
activation induced by IFN-γ and presents an EC50 = 1.69 µM, unlike (-)-catechin, (-)-
epicatechin (EC), (-)-catechin-3-gallate (CG), (-)-epicatechin-3-gallate (ECG), (-)-
epigallocatechin (EGC) and (-)-epigallocatechin plus galic acid (EGC+AG), that
didn’t inhibit tyrosine 701 phosphorylation of STAT1.
The intraperitoneal administration of mouse IFN-γ 10000 U in NMRi mice
results, in colon, in a model identical to Caco-2 cells, where there is a decrease in
NKA activity without any change in NKA expression. So, we study the effect of
EGCG and EGC 20 mg/Kg with per oral administration in these model and we
verified that only EGCG is able to revert the effect of IFN-γ in NKA activity of colon
epithelial cells from NMRi mice.
5
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Doutor Patrício Soares da Silva quero agradecer as oportunidades
concedidas nos projectos e equipas de investigação que lidera, o rigor colocado no
trabalho e as valiosas sugestões que contribuiram para a realização deste trabalho.
Ao Doutor Carlos Fonseca agradeço por ter aceite co-orientar esta tese e pela
disponibilidade demonstrada nas várias etapas que levaram à sua elaboração.
A todos os membros do Instituto de Farmacologia e Terapêutica da FMUP
agradeço a disponibilidade, simpatia e apoio transmitidos.
Ao meu pai e à minha mãe agradeço a visão de futuro para os filhos e o
constante apoio e incentivo que sempre demonstraram.
À Lia agradeço o seu “presente” contínuo.
6
ÍNDICE
RESUMO ....................................................................................................................3
ABSTRACT ................................................................................................................4
AGRADECIMENTOS ..............................................................................................5
LISTA DE ABREVIATURAS ..................................................................................8
1 - INTRODUÇÃO .................................................................................................. 10
1.1 - DOENÇA DE CROHN ...................................................................................... 10
1.2 - BOMBA DA NA+, K+ ...................................................................................... 12
1.3 - EPIGALOCATECINO-3-GALATO...................................................................... 15
2 - MATERIAIS E MÉTODOS.............................................................................. 19
2.1 - FÁRMACOS .................................................................................................... 19
2.2 - REAGENTES E SOLUÇÕES ............................................................................... 19
2.3 - CÉLULAS ....................................................................................................... 20
2.4 - CRESCIMENTO DE CÉLULAS........................................................................... 21
2.5 - CULTIVO DE CÉLULAS ................................................................................... 21
2.6 - ACTIVIDADE DA NKA - MÉTODO ELECTROFISIOLÓGICO .............................. 21
2.7 - EXPRESSÃO DA SUB-UNIDADE α1 DA NKA ................................................... 22
2.8 - EXPRESSÃO DO STAT1 E DO PHOSPHOSTAT1............................................. 23
2.9 - ANIMAIS........................................................................................................ 23
2.10 - ADMINISTRAÇÃO......................................................................................... 24
7
2.11 - OBTENÇÃO E PREPARAÇÃO DAS CÉLULAS EPITELIAIS.................................. 24
2.12 - DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO PROTEICA – MÉTODO DE BRADFORD 24
2.13 - ACTIVIDADE DA NKA – MÉTODO BIOQUÍMICO.......................................... 25
3 - RESULTADOS................................................................................................... 26
3.1 - CÉLULAS CACO-2.......................................................................................... 26
3.2 - RATINHOS NMRI .......................................................................................... 36
4 - DISCUSSÃO ....................................................................................................... 39
5 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................. 43
8
LISTA DE ABREVIATURAS
ATP – adenosina trifosfato
ATPases – enzimas que consomem ATP
Células Th – células T ajuda
Citocinas Th – citocinas produzidas pelas células T ajuda
CG – (-)-catecino-3-galato
ddp – diferença de potencial
DTT – ditiotreitol
EC – (-)-epicatecino
EC50 – concentração 50% eficaz
ECG – (-)-epicatecino-3-galato
EDTA – ácido etilenodiaminotetraacético
EGC – (-)-epigalocatecino
EGCG – (-)-epigalocatecino-3-galato
ERK – “extracellular signal-regulated kinase”
FBS – soro bovino fetal
GAS – sequência de activação γ
HBSS – solução de Hanks sem cálcio
IFN – interferão
IL – interleucina
Isc – corrente de curto-circuito
JAK – “Janus kinase”
MAPK – “mitogen-activated protein kinase”
MEM – meio mínimo essencial
MEK – “MAPK kinase”
mRNA – RNA mensageiro
NKA – bomba de Na+, K+
PBS – solução salina de tampão fosfato
PBST – solução salina de tampão fosfato com 0.05% de tween 20
RNA – ácido ribonucleico
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rpm – rotações por minuto
SDS – Dodecilsulfato de sódio
SEM – erro padrão da média
STAT – transductor de sinal e activador da transcrição
TNF – factor de necrose tumoral
VCAM – molécula de adesão de células vasculares
10
1 - INTRODUÇÃO
O sistema imunitário constitui o nosso mecanismo de defesa natural, capaz de
distinguir entre estruturas próprias e estranhas e ainda entre antigénios estranhos
inofensivos e perigosos de modo a evitar respostas imunes desnecessárias e auto-
destrutivas. A resposta inflamatória consiste na libertação sequencial de uma série de
mediadores e o recrutamento de leucócitos circulantes que se tornam activos no local
da inflamação libertando novos mediadores. Na maioria dos casos a resposta
inflamatória desaparece, num espaço de tempo adequado, devido à libertação de
mediadores endógenos anti-inflamatórios e da acumulação intracelular de factores de
regulação negativa.
As células T CD4+ são responsáveis pela regulação de aspectos chave na
resposta imunológica. Estas células podem-se dividir em dois grupos funcionalmente
distintos, as células T-ajuda 1 (Th1) e as células T-ajuda 2 (Th2), de acordo com o
tipo de citocinas produzido. Assim, as células Th1 secretam principalmente IFN-γ e
interleucina 2 (IL-2), que têm uma acção pro-inflamatória, enquanto que as células
Th2 produzem predominantemente IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13, que têm uma acção
anti-inflamatória.
1.1 - DOENÇA DE CROHN
Em condições normais, os antigénios provenientes da comida e da flora
intetstinal, que estão continuamente em contacto com a mucosa intestinal, não
causam qualquer reacção imune, devido a um balanço adequado das citocinas
secretadas pelas células Th1 e pelas células Th2. No entanto, por vezes, pode ocorrer
um desequilíbrio no balanço citocinas Th1/Th2 e surgem, por exemplo, as doenças
inflamatórias intestinais, onde se incluem a doença de Chron e a colite ulcerativa.
Nestes casos o desequilíbrio parece resultar de uma resposta desadequada a
componetes normais da flora intestinal e dos alimentos. No entanto, existem vários
estudos que sugerem que a indução e a patogenese das doenças inflamatórias
intestinais, nomeadamente a doença de Crohn e a colite ulcerativa, são um processo
11
multifactorial, envolvendo interacções entre factores genéticos e ambientais, além
dos factores imunológicos (Adorini and Sinigaglia 1997; Sartor 1997).
Na doença de Crohn existe um desequilíbrio no balanço entre as células Th1
e Th2 em favor das Th1, enquanto que, na colite ulcerativa parece existir uma maior
actividade das células Th2 (Fuss, Neurath et al. 1996). Este conceito é suportado por
alguns estudos que revelam que pacientes com doença de Crohn apresentam um
aumento do número de células secretoras de IFN-γ e um aumento dos níveis de
mRNA para o IFN-γ (Breese, Braegger et al. 1993; Niessner and Volk 1995). A
biopsia da mucosa intestinal de pacientes com doença de Crohn revelou um aumento
da expressão de citocinas pro-inflamatórias, quimiocinas e moléculas de adesão
(Groux and Powrie 1999). Ainda de acordo com este conceito está o facto da IL-18,
uma citocina Th1 que actua sinergisticamente com a IL-12 no sentido de induzir a
síntese de IFN-γ pelas células Th1, estar sobreexpressa em pacientes com doença de
Crohn, mas não em pacientes com colite ulcerativa (Pizarro, Michie et al. 1999). Por
outro lado na colite ulcerativa verifica-se um aumento da secreção de IL-5 (Fuss,
Neurath et al. 1996) o que sugere um aumento da actividade das células Th2.
O IFN-γ é um produto dos linfócitos Th1 activados e a sua produção é
considerada o factor predominante na inflamação intestinal induzida pelas células
Th1, como é o caso da doença de Crohn, pelo facto do IFN-γ poder actuar em várias
vias que influenciam o desenrolar da inflamação, como por exemplo aumentar a
produção de mediadores pro-inflamatórios através da activação dos macrófagos,
influenciar o tráfico celular através da regulação da expressão de moléculas de
adesão e alterando a permeabilidade do epitélio intestinal (Billiau 1996). A
importância atribuída ao IFN-γ na inflamação intestinal induzida pelas células Th1
deve-se ainda ao facto da neutralização do IFN-γ através do anticorpo monoclonal
anti-IFN-γ atenuar significativamente o desenvolvimento de colite em ratinhos
(Powrie, Leach et al. 1994).
A doença de Crohn é uma doença inflamatória intestinal crónica, cujo
sintoma dominante é a diarreia. A perda de fluidos pelo intestino ocorre devido à
quebra do equilíbrio homeostático, provocado por uma desregulação no transporte de
electrólitos nas células, podendo-se tratar de um aumento da secreção do electrólito
12
Cl- ou uma diminuição da absorção do electrólito Na+. Estudos recentes sugerem que
o aparecimento de diarreia, na mucosa intestinal inflamada, se deve a uma redução
da absorção do electrólito Na+ e não a um aumento da secreção do electrólito Cl-
(Sundaram, Wisel et al. 1997). Esta observação está de acordo com o facto de a
mucosa do cólon de pacientes com doença de Crohn responderem pobremente a
secretagogos e a absorção de Na+ estar diminuida (Sandle, Higgs et al. 1990). Ainda
neste sentido apontam o facto do IFN-γ reduzir a secreção intestinal de Cl- (Colgan,
Parkos et al. 1994), o co-transporte de Na+-K+-2Cl- (Zund, Madara et al. 1996), a
actividade do trocador Na+/H+ (Rocha, Musch et al. 2001) e a actividade da NKA
(Sugi, Musch et al. 2001; Magro, Fraga et al. 2004).
A absorção de Na+ no intestino envolve a participação de várias proteínas, no
entanto, a mais importante é a NKA que se localiza na membrana basal da célula
epitelial e por isso a sua inibição parece estar directamente relacionada com o
aparecimento de diarreia em pacientes com doença de Crohn (Sugi, Musch et al.
2001; Musch, Clarke et al. 2002).
1.2 - BOMBA DE NA+, K+
A bomba de Na+, K+ é uma proteína heterodimérica transmembranar
constituída por uma subunidade α de aproximadamente 112 KDa, uma subunidade β
altamente glicosilada, que pode variar entre 40 e 60 KDa dependendo do grau de
glicosilação, que varia com o tipo de tecido e da espécie em causa e uma pequena
subunidade γ, que varia entre 8-14 KDa. A subunidade α da NKA possui os locais de
ligação para os catiões, para o ATP e para a ubaína (Lingrel, Orlowski et al. 1990) e
é responsável pelas propriedades catalítica e de transporte da enzima. A subunidade
β é essencial para a actividade da NKA e parece estar envolvida na estabilização e
correcto enrolamento da subunidade α, facilitando a sua entrega na membrana
plasmática (McDonough, Geering et al. 1990). A subunidade β parece também ser
responsável pela oclusão do K+ (Lutsenko and Kaplan 1993) e pela modulação da
afinidade da NKA para o K+ e para o Na+ (Eakle, Kabalin et al. 1994; Eakle, Lyu et
al. 1995). A função da subunidade γ ainda não é completamente clara, no entanto
alguns estudos revelam que esta subunidade consegue modificar a activação do
13
potássio dependente da voltagem (Beguin, Wang et al. 1997), enquanto que outros
sugerem que a subunidade γ é capaz de estabilizar a conformação E1 da enzima
(Therien, Goldshleger et al. 1997). A NKA está presente em todas as células de
mamíferos e converte entre 20 e 30% do ATP produzido nas células no transporte de
Na+ e K+ no intestino, rim, sistema nervoso central e noutros tecidos onde é
necessário um gradiente de Na+ e K+ para a manutenção do volume celular e do
potencial de membrana (Jorgensen and Pedersen 2001). A NKA é responsável pelo
estabelecimento e manutenção de um gradiente electroquímico (Fig. 1), característico
da maior parte das células animais, e que consiste na acumulação de carga positiva
no lado extracelular, na concentração de K+ intracelular superior à concentração
extracelular e na concentração de
Na+ intracelular inferior à
concentração extracelular.
Este gradiente electroquímico, é
conseguido através da energia
proveniente da hidrólise de uma
molécula de ATP, que vai permitir
à NKA transportar, contra o
gradiente de concentração, três iões
Na+ para o exterior e dois iões K+
para o interior da célula (Fig. 1). A
NKA, constitui por isso um dos
principais reguladores da
homeostasia celular do Na+ e do K+, assim como um dos principais responsáveis pelo
estabelecimento e manutenção dos gradientes eléctrico e químico transmembranar, à
custa de ATP. Este gradiente electroquímico transmembranar é fundamental na
manutenção do volume celular, do equilíbrio osmótico celular, na manutenção do
potencial de repouso das membranas e pelas propriedades excitáveis das células
musculares e nervosas. O gradiente transmembranar de Na+ vai ainda fornecer
energia para o co-transporte de vários iões (H+, HCO3-), substratos (glucose e
aminoácidos) e neurotransmissores através da membrana plasmática (Jorgensen
Fig. 1: Esquema representativo da bomba de Na+, K+ e do gradiente de concentração do Na+ e do K+.
14
1990; Lingrel, Orlowski et al. 1990; Jorgensen and Pedersen 2001). No intestino a
NKA desempenha um importante papel na absorção de Na+ e água, sendo por isso
fundamental na manutenção dos fluidos corporais. Assim, a inibição da NKA pelo
IFN-γ parece ser um dos principais responsáveis pela perda de fluidos pelo intestino.
A inibição da NKA pelo IFN-γ não é directa, mas envolve uma complexa cascata de
sinalização celular. A ligação do
IFN-γ ao lado extracelular do seu
receptor transmembranar leva à
activação da “Janus Kinase” (JAK)
1 e 2 e à sua associação com o
receptor do IFN-γ no lado
intracelular (Fig. 2) (Haque and
Williams 1998; Akira 1999). A
JAK vai então fosforilar o receptor
do IFN-γ em resíduos específicos
de tirosina, que servem de local de
âncora para o STAT1, através do
reconhecimento das fosfotirosinas
do receptor do IFN-γ pelo domínio
SH2 do STAT1 (Fig. 2) (Ihle,
Witthuhn et al. 1994). Em seguida
a JAK activada fosforila o STAT1
num resíduo específico de tirosina, a Tyr701, o que leva à sua separação do receptor
e posterior homodimerização (Fig. 2) (Ihle 1995). Os homodímeros STAT1 são
translocados para o núcleo para activar a transcrição através da sua interacção com
sequências GAS (locais de activação γ) existentes em muitos promotores activados
pelo IFN-γ (Akira 1999). Além da fosforilação dos resíduos de tirosina do STAT1,
necessária à sua homodimerização e posterior translocação até ao núcleo, é também
necessária a fosforilação de um resíduo de serina (Ser727) para o STAT1 se tornar
transcripcionalmente activo (Wen, Zhong et al. 1995; Zhang, Blenis et al. 1995). A
região carboxi-terminal do STAT1 possui a sequência consenso reconhecida pela
IFN-γ
IFN-γ
Fig. 2: Esquema representativo da cascata de sinalização celular iniciada pela ligação do IFN-γ ao seu receptor e consequente fosforilação da tirosina 701 do STAT1 necessária à sua homodimerização e posterior translocação até ao núcleo.
15
MAPK, que se pensa estar envolvida nesta fosforilação do resíduo de serina do
STAT1. Estudos recentes mostram que o IFN-γ também estimula a actividade da
MAPK, que é constituída pelas ERK1, ERK2 (Liu, Brownsey et al. 1994) e
p38MAPK (Verma, Deb et al. 2002). A activação das MAPKs é controlada através
de complexos de sinalização membranar e envolve uma rede que inclui as proteínas
Ras, as cínases de serinas da família das Raf e as cínases da MAPK (MEK1, MEK2,
MEK3 e MEK6) (Chen, Gibson et al. 2001; Pearson, Robinson et al. 2001; Magro,
Fraga et al. 2004).
1.3 - EPIGALOCATECINO-3-GALATO
Um número crescente de estudos epidemiológicos e experimentais sugerem
que o consumo de chá verde reduz a incidência de várias patologias, nomeadamente,
cancro, diabetes, doenças cardiovasculares e obesidade. Apesar de não serem ainda
conhecidos todos os mecanismos envolvidos, existem evidências que apontam para
as propriedades antioxidantes dos flavonóides existentes no chá verde como sendo
um factor importante para o seu efeito em patologias tão diversas. Por exemplo,
alguns estudos revelam a capacidade de compostos da família do catecino existentes
no chá verde inibirem a oxidação lipídica no plasma, a oxidação do β-caroteno e do
α-tocoferol (Lotito and Fraga 2000; Leung, Su et al. 2001). Todos os compostos da
família do catecino existentes no chá verde apresentam propriedades antioxidantes,
no entanto, ambos os estudos revelam que o ECG é o polifenol existente no chá
verde com maior poder anti-oxidante, seguido do EGCG. Apesar de todos os
compostos da família do catecino terem propriedades antioxidantes, existem
determinadas actividades que são mais específicas e estão restringidas a um menor
número de membros da família do catecino.
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O epigalocatecino-3-galato (Fig. 3) é polifenol mais abundante, mais activo e
também o mais estudado, existente no chá verde e está descrito como tendo várias
actividades fisiológicas, nomeadamente anticarcinogénica, anti-inflamatória,
antioxidante, antiangiogénica, antiaterosclerótica e antiviral. Algumas destas
propriedades do EGCG devem-se às suas características antioxidantes, enquanto que
outras parecem ser mais específicas e estão relacionadas com a capacidade do EGCG
inibir algumas enzimas relacionadas com o cancro, como por exemplo as
topoisomerases (Suzuki, Yahara et al. 2001) e também com a capacidade de inibir a
fosforilação de proteínas envolvidas na sinalização celular. O EGCG inibe várias
cascatas de sinalização celular envolvidas em diversos mecanismos celulares, sendo
a mais relevante para o presente trabalho a sinalização celular desencadeada pelas
citocinas pro-inflamatórias. Vários estudos revelam esta capacidade do EGCG
reverter o efeito de citocinas pro-inflamatórias, como por exemplo, a supressão dos
danos das células β do pâncreas induzido pela IL-1β e pelo IFN-γ (Han 2003); a
inibição do desenvolvimento da inflamação e dos danos nas cartilagens, induzido
Fig. 3: Estrutura 3D do (-)-epigalocatecino-3-galato. As barras azuis correspondem à ligação dos carbonos, as barras vermelhas correspondem à ligação dos oxigénios e as barras brancas correspondem à ligação dos hidrogénios.
17
monocam
adacelular
Lado basal Lado apical
Sistema de oxigenação eaquecimento das soluçõesapical e basal
Sistema de voltage-clamp
Fig. 4: Esquema do sistema de Ussing usado para medira corrente de curto-circuito (Isc) induzida pelaanfotericina B.
pela IL-1β, em modelos animais de artrite (Singh, Ahmed et al. 2003); a redução da
expressão de VCAM-1 e adesão de monócitos às células endoteliais induzida pelo
TNF-α e IL-1β (Ludwig, Lorenz et al. 2004). A redução da actividade da NKA pelo
IFN-γ pode também ser revertida pelo EGCG, uma vez que este vai impedir a
fosforilação do STAT1 e consequentemente a sua activação (Menegazzi, Tedeschi et
al. 2001; Magro, Fraga et al. 2004).
Neste trabalho pretendeu-se estudar um pouco melhor a acção do EGCG (Fig.
3), na reversão do efeito do IFN-γ sobre a NKA. Para isso foram usadas técnicas de
biologia molecular e bioquímicas para determinar a expressão e a actividade da NKA
in vitro ex vivo e para avaliar a expressão e a actividade da NKA e do STAT1 in
vitro. Para avaliar in vitro a actividade da NKA, que se localiza no lado basal das
células do epitélio intestinal, assim como a sua resposta a uma série de compostos da
família do catecino foi usada uma técnica electrofisiológica, que consiste em medir a
corrente eléctrica necessária para anular a diferença de potencial (corrente de curto-
circuito – Isc) criada, pelo transporte de Na+, entre o lado extracelular basal e apical
(Fig. 4).
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A adição de anfotericina B, que é um ionóforo para o ião Na+, ao lado apical
da monocamada celular permite a entrada de sódio para a célula de forma a saturar a
NKA (Vieira-Coelho and Soares-da-Silva 2001; Gomes and Soares-Da-Silva 2002).
Nestas condições a corrente de curto-circuito observada é uma medida da actividade
da NKA existente na membrana basal da célula e deve-se ao transporte de Na+
através da membrana basal pela NKA, que retira três iões Na+ da célula para o meio
extracelular e retira apenas dois iões K+ do meio extracelular para a célula.
Assim a actividade da NKA leva a um aumento de cargas positivas no meio
extracelular do lado basal das células epiteliais, o que levaria à criação de uma ddp
transepitelial, no entanto, o sistema utilizado (Fig. 4) mantém a ddp transepitelial
constante (voltage clamp) e igual a zero. Deste modo, a corrente fornecida pelo
sistema, para manter a ddp transepitelial igual a zero, é uma medida da actividade da
NKA.
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2 - Materiais e métodos
2.1 - FÁRMACOS
Os fármacos usados foram: interferão-γ humano e de ratinho, ubaína, (-)-
catecino, (-)-catecino-3-galato, (-)-epicatecino, (-)-epicatecino-3-galato, (-)-
epigalocatecino, (-)-epigalocatecino-3-galato, ácido gálico, anfotericina B, amilorido,
furosemida, cloreto de bário, DIDS.
2.2 - REAGENTES E SOLUÇÕES
- Meio de cultura sem soro – MEM (meio mínimo essencial) com 25mM de
HEPES, 26 mM de NaHCO3. Ajustar o pH a 7.2 com NaOH, esterilizar por filtração
e adicionar 100 U/ml de Penicilina G, 0.25 µg/ml de anfotericina B, 100 µg/ml de
estreptomicina. Guardar a 4ºC.
- Meio de cultura com soro – Meio de cultura sem soro com 20% FBS (soro
bovino fetal).
- Solução de Krebs Apical (para electrofisiologia) – 118 mM de NaCl, 4.7
mM de KCl, 1.2 mM de KH2PO4, 25 mM de NaHCO3, 1.2 mM de MgSO4, 2.5 mM
de CaCl2, 10 mM de Manitol. Gaseificar a solução com 95% O2 e 5% CO2 durante 15
minutos e ajustar o pH a 7.4.
- Solução de Krebs Basal (para electrofisiologia) – 118 mM de NaCl, 4.7
mM de KCl, 1.2 mM de KH2PO4, 25 mM de NaHCO3, 1.2 mM de MgSO4, 2.5 mM
de CaCl2, 10 mM de D-Glucose, 1,0 mM de ácido ascórbico. Gaseificar a solução
com 95% O2 e 5% CO2 durante 15 minutos e ajustar o pH a 7.4.
- PBS (Solução salina de tampão fosfato) – 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 5.4
mM Na2HPO4, 1.75 mM KH2PO4. Ajustar o pH a 7.4.
- PBST – PBS com 0.05% de tween 20.
- Tampão de lise (para expressão da NKA) – 50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 150
mM NaCl, 0.1% SDS, 0.5% deoxycholate de sódio, 100 µg/ml PMSF, 2 µg/ml
aprotinin.
20
- Tampão de amostra 6X concentrado (para expressão da NKA) – 375 mM
Tris-HCl, 12% SDS, 60% glicerol, 12% DTT 50mM, 0.6% azul de bromofenol.
- Tampão de amostra 1X concentrado (para expressão do STAT1) – 62.5 mM
Tris-HCl, 2% SDS, 10% glicerol, 2% DTT 50 mM, 0.1% azul de bromofenol.
- Soro fisiológico – 0.9% de NaCl em água.
- HBSS (solução de Hanks sem cálcio) – 137 mM NaCl, 5.0 mM KCl, 0.8
mM MgSO4·7H2O, 0.33 mM Na2HPO4, 0.44 mM KH2PO4, 1.0 mM MgCl 2·6H2O,
1.0 mM butirato de sódio, 10 mM Tris-HCl. Gaseificar a solução com 95% O2 e 5%
CO2 durante 15 minutos e ajustar o pH a 7.4.
- Solução de Krebs modificado (para obtenção das células epiteliais) – 118
mM NaCl, 4.0 mM KCl, 27.2 mM NaHCO3, 1.2 mM MgCl 2·6H2O, 1.25 mM
CaCl2·2H2O, 10 mM HEPES, 5 mM glicose. Gaseificar a solução com 95% O2 e 5%
CO2 durante 15 minutos e ajustar o pH a 7.4.
- Reagente de proteínas – 100 mg de azul G brilhante, 50 ml de etanol, 100
ml de ácido orto-fosfórico, completar com água bidestilada até 1000 ml.
- Solução A (para determinação da actividade de todas as ATPases) – 0.75
M Imidazole, 1.0 M NaCl, 0.1 M KCl, 0.1 M MgCl2·6H2O, 0.12 M Na AZIDE, 20
mM Na4EGTA pH=7.4, 1.0 M TRIS/HCl pH 7.4.
- Solução B (para determinação da actividade das ATPases insensíveis à
ubaína) – 0.75 M Imidazole, 0.1 M MgCl2·6H2O, 0.12 M Na AZIDE, 20 mM
Na4EGTA pH=7.4, 1.0 M TRIS/HCl pH 7.4.
- Reagente de cor (para determinação dos fosfatos livres) – 50 mg/ml
FeSO4·7H2O em 10% (v:v) de molibdato de amónio.
2.3 - CÉLULAS
Células Caco-2 (DSMZ, nº ACC 169) - Linha celular derivada de células de
adenocarcinoma de colon humano provenientes do banco Alemão (DSMZ-Deutsche
Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH).
21
2.4 - CRESCIMENTO DE CÉLULAS
As células Caco-2 são cultivadas em meio de cultura com soro e mantidas
numa atmosfera húmida com 95% H2O e 5% CO2 a 37 ºC. O meio de cultura é
mudado de 2 em 2 dias e as células atingem a confluência 5 dias após terem sido
cultivadas. As experiências são realizadas 7 dias após terem sido cultivadas e o meio
de cultura com soro é mudado para meio de cultura sem soro 24 horas antes de cada
experiência.
2.5 - CULTIVO DE CÉLULAS
As células em monocamada são dissociadas com 0,05% de tripsina-EDTA e
ressuspendidas em 3 ml de meio de cultura com soro – suspensão de células.
Para cultivar novas placas de petri de 21 cm2 são colocados 1 ml da suspensão de
células e 5 ml de meio de cultura com soro nas novas placas de petri.
Para os estudos de electrofisiologia as células são cultivadas em filtros de
policarbonato com 12 mm de diâmetro e 0.4 µm de tamanho de poro (Snapwell;
Costar) onde são colocados 100 µl da suspensão de células e 500 µl de meio de
cultura com soro na parte apical de cada filtro e 1000 µl de meio de cultura com soro
na parte basal.
Para os estudos de expressão da NKA e da STAT1 as células são cultivadas em
placas com 6 poços com 9.5 cm2 onde são colocados 500 µl da suspensão de células
e 2.5 ml de meio de cultura com soro.
2.6 - ACTIVIDADE DA NKA - MÉTODO ELECTROFISIOLÓGICO
As células Caco-2 cultivadas nos filtros de policarbonato são colocadas nas
câmaras de Ussing (1,0 cm2) equipadas com um sistema de recirculação de água a
37ºC e de gaseificação das soluções com 5% CO2 e 95% O2. Em seguida colocam-se
no lado apical e no lado basal 10 ml da solução de Krebs Apical e Basal
respectivamente (Vieira-Coelho, Serrao et al. 2000; Vieira-Coelho and Soares-da-
Silva 2000; Gomes and Soares-da-Silva 2002; Gomes, Xu et al. 2002). A resistência
transepitelial (Ωcm2) é determinada, através da lei de Ohm, aplicando uma diferença
de potencial de 3mV e medindo a corrente transepitelial. Em seguida deixam-se as
22
células estabilizar durante 20 minutos. Depois das células terem estabilizado
procede-se à permeabilização do lado apical com anfotericina B, permitindo a
entrada de sódio na célula, de modo a saturar a NKA (DuVall, Guo et al. 1998;
Vieira-Coelho and Soares-da-Silva 2001; Gomes and Soares-da-Silva 2002). Nestas
condições a corrente de curto circuito observada deve-se ao transporte do ião Na+
através da membrana basal pela NKA. O sistema de manutenção da ddp e da corrente
(“voltage-current clamp”) foi ligado a um PC através de um sistema de aquisição de
dados BIOPAC MP1000 (BIOPAC Systems, Goleta, CA). A análise dos dados foi
feita através do software AcqKnowledge 2.0 (BIOPAC Systems).
2.7 - EXPRESSÃO DA SUB-UNIDADE α1 DA NKA
As células Caco-2 cultivadas nas placas de 6 poços são lavadas duas vezes
com PBS e em seguida adiciona-se 300 µl de tampão de lise frio, sonica-se duas
vezes durante 10 segundos e mantem-se as amostras no gelo durante 1 hora. Depois,
centrifuga-se durante 15 minutos, a 4ºC, a 13000 rpm, guarda-se o sobrenadante e
determina-se a sua concentração proteica pelo método de Bradford (as amostras
devem ser diluídas 1/10 em PBS para diluir a absorção do tampão de lise). A
concentração proteica das amostras é ajustada de modo a ficarem todas iguais e em
seguida adiciona-se 1:6 de tampão de amostra 6X concentrado. As amostras são
aquecidas a 37ºC durante 15 minutos e depois arrefecidas em gelo e centrifugadas a
13000 rpm durante 5 minutos. Os geis de electroforese são carregados com 15 µg de
proteínas e estas são separadas por electroforese desnaturante durante
aproximadamente 2 horas a 150V e são depois transferidas electroforeticamente para
membranas de nitrocelulose durante 1h45min. a 25V. Em seguida a membrana é
bloqueada, com uma solução 10% de leite em pó magro em PBS, durante 30
minutos, com agitação e é depois incubada com o anticorpo primário de ratinho, anti
subunidade α1 da NKA diluído 1:10000, durante a noite, a 4ºC com agitação. No dia
seguinte a membrana é lavada 3 vezes 15 minutos com PBST e depois incubada com
o anticorpo secundário de ratinho diluído 1:3000, durante 1 hora. No final lava-se 3
vezes 10 minutos com PBST e depois água. Em seguida incuba-se a membrana com
500 µl de cada um dos reagentes de detecção, durante 1 minuto, seca-se, expõe-se ao
23
filme de raio-X, durante aproximadamente 10 segundos e por fim procede-se à
revelação.
2.8 - EXPRESSÃO DO STAT1 E DO PHOSPHOSTAT1
As células Caco-2 cultivadas nas placas de 6 poços são lavadas duas vezes
com PBS e lisadas com 200 µl de tampão de amostra 1X. Em seguida as células são
removidas para um tubo de 500 µl no gelo, sonicadas duas vezes durante 10
segundos, e são depois mantidas no gelo durante 1 hora. Antes de se carregarem os
geis de electroforese as amostras são aquecidas a 95ºC durante 5 minutos, arrefecidas
em gelo e centrifugadas a 13000 rpm durante 5 minutos. Os geis de electroforese
(têm que ser preparados em duplicado, porque um é para avaliar a expressão do
STAT1 e o outro do fosfoSTAT1) são carregados com 25 µg de proteínas e estas são
separadas por electroforese desnaturante durante aproximadamente 2h30min a 125 V
e são depois transferidas electroforeticamente para membranas de nitrocelulose
durante 2h15min a 25 V. Em seguida as membranas são lavadas com PBST e
bloqueadas com uma solução 5% de leite em pó magro em PBST, durante 3 horas à
temperatura ambiente, com agitação. Depois uma membrana é incubada com o
anticorpo primário de coelho, anti-STAT1 diluído 1:1000 e a outra é incubada com o
anticorpo primário de coelho, anti-fosfoSTAT1 diluído 1:1000, durante a noite, a 4ºC
com agitação. No dia seguinte as membranas são lavadas 3 vezes 15 minutos com
PBST e depois incubadas com o anticorpo secundário anti-coelho diluído 1:2000,
durante 1 hora à temperatura ambiente. No final lava-se 3 vezes 10 minutos com
PBST e depois água. Em seguida incuba-se as membranas com 500 µl de cada um
dos reagentes de detecção diluídos em 9 ml de água, durante 1 minuto com agitação
suave, remove-se o excesso de reagente de detecção expõe-se ao filme de raio-X
durante 30 segundos e procede-se à revelação.
2.9 - ANIMAIS
Ratinhos NMRi machos (Harlan-Interfauna, Barcelona, Espanha) com peso
entre 30-35 g são mantidos com água e comida à descrição, em condições ambientais
24
controladas de temperatura (22 ± 2 ºC) e ciclo cicardiano (12h + 12h), pelo menos
uma semana antes do início das experiências.
2.10 - ADMINISTRAÇÃO
O IFN-γ de ratinho 10000 U é administrado intraperitonealmente aos ratinhos
NMRi 24 horas antes da remoção do intestino. O EGCG e o EGC são administrados
por via oral, numa concentração de 20 mg/Kg, 1 hora antes da administração do IFN-
γ de ratinho.
2.11 - OBTENÇÃO E PREPARAÇÃO DAS CÉLULAS EPITELIAIS
24 horas após a administração do IFN-γ, os animais são mortos por
estiramento da coluna cervical e dissecados de modo a permitir a remoção do jejuno,
do íleo e do cólon. Em seguida os fragmentos de intestino removidos são abertos
longitudinalmente e lavados com soro fisiológico frio, para posterior remoção das
células epiteliais. Para a remoção das gorduras, os fragmentos do intestino são
incubados numa solução HBSS com 1.5 mgml-1 de DTT durante 10 minutos à
temperatura ambiente, com 3 agitações suaves. Para a obtenção das células epiteliais,
o tecido é colocado numa solução HBSS com 1 mM de EDTA à temperatura
ambiente durante 10 minutos com 4 agitações suaves. Remove-se o tecido para outro
tubo, repete-se o último procedimento mais duas vezes e coloca-se as suspensões de
células no gelo. No final da terceira incubação na solução HBSS com 1 mM de
EDTA remove-se o tecido e centrifugam-se os três tubos a 1200 rpm durante 4
minutos a 4 ºC. Em seguida os peletes são lavados com 3 ml de solução de Krebs
modificado, juntos, lavados novamente com 5 ml de solução de Krebs modificado e
por fim ressuspendidos em 1 ml de solução de Krebs modificado de modo a obter
uma suspensão com aproximadamente 1.5 mg proteína/ml.
2.12 - DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO PROTEICA – MÉTODO DE BRADFORD
Para determinar a concentração proteica de uma suspensão celular primeiro é
necessário lisar as células de modo a que o conteúdo celular, nomeadamente as
proteínas fiquem expostas. Depois preparam-se em duplicado: 800 µl de água + 10
25
µl de amostra + 200 µl de reagente de proteínas, mistura-se tudo, aguarda-se 10
minutos, mistura-se novamente e lê-se a absorvância a 595 nm. Por interpolação com
uma curva de calibração de proteínas do soro bovino (BSA) determina-se a
concentração proteica da suspensão celular.
2.13 - ACTIVIDADE DA NKA – MÉTODO BIOQUÍMICO
O método bioquímico utilizado para avaliar a actividade da NKA em células
epiteliais isoladas de jejuno, ileo e colon de ratinhos, consiste na medição do fosfato
inorgânico libertado (Pi) pelas ATPases na presença e na ausência de ubaína, sendo a
actividade da NKA a diferença entre os fosfatos libertados na ausência e os fosfatos
libertados na presença de ubaína. Os fosfatos libertados são medidos por
espectrofotometria a 740 nm. Depois de determinar a concentração proteica dos
extractos celulares acerta-se a sua concentração, de modo a termos 1.2 mg de
proteína por ml e coloca-se aproximadamentre 1ml num tubo de vidro, onde as
células são incubadas durante 15 minutos a 37 ºC e depois permeabilizadas através
da congelação rápida na mistura gelo seco-acetona seguida de descongelação à
temperatura ambiente. Preparam-se em triplicado, tubos para medir a actividade de
todas as ATPases e tubos para medir a actividade das ATPases insensiveis à ubaína,
do seguinte modo: 800 µl solução A + 100 µl de água + 100 µl da suspensão de
células para avaliar a actividade de todas as ATPases e 800 µl solução B + 100 µl de
ubaína 10 mM + 100 µl da suspensão de células para avaliar a actividade das
ATPases insensiveis à ubaína. Os tubos são colocados no banho a 37 ºC durante 5
minutos e em seguida a reacção é iniciada pela adição de 4 mM de ATP, começando
o tempo de incubação a contar 20 minutos a 37ºC. No final do tempo de incubação, a
reacção é terminada pela adição de 50 µl de Ácido Tricloroacético arrefecido em
gelo. Adiciona-se 1 ml de reagente de cor a cada tubo, aguardam-se 2 minutos,
centrifuga-se a 4000 rpm durante 2 minutos e lê-se a absorvância a 740 nm. A
actividade da NKA é expressa em nanomoles de fosfato inorgânico (Pi) por
miligrama de proteína por minuto e é determinada como a diferença entre o fosfato
libertado na ausência de ubaína (ATPase total) e na presença de ubaína (ATPase
insensível à ubaína).
26
3 - RESULTADOS
3.1 - Células Caco-2
A corrente de curto circuito (Isc), induzida pela anfotericina B, nas células
Caco-2 mergulhadas em meio contendo 143 mM de Na+, em ambos os lados (apical
e basal), é dependente da concentração de anfotericina B adicionada ao lado apical
(Fig. 5). Verificou-se ainda que esta Isc só se verifica na presença de Na+ no lado
apical, como se pode observar na figura 5.
Em seguida avaliou-se o efeito da inibição de uma série de transportadores na
Isc induzida pela anfotericina B e verificou-se, que esta Isc não era influenciada pela
presença de amilorido, inibidor do trocador Na+/H+ e bloqueador de canais de Na+, 1
Fig. 5: Gráfico representativo da corrente de curto-circuito (Isc) induzida pela anfotericina B 2.5 µg/ml (a) e anfotericina B 1.0 µg/ml (b) ao lado apical de células banhadas por uma solução com 143 mM de Na+; anfotericina B 2.5 µg/ml na ausência de sódio no lado apical (c).
200 400-10
0
10
20
30
40
b
a
c
Anfo
teric
ina
b
Tempo (s)
Isc
(µA
/cm
2 )
27
mM no lado apical o que exclui a possibilidade dos canais de sódio e do trocador
Na+/H+, existentes no lado apical, estarem envolvidos na Isc induzida pela
anfotericina B. A furosemida, inibidor do co-transporte Na+,K+,2Cl-, 10 µM no lado
basal, e o cloreto de bário, bloqueador dos canais de K+, 1 mM no lado basal também
não alteram a Isc induzida pela anfotericina B, o que exclui a possibilidade de
envolvimento do co-transportador Na+,K+,2Cl- e dos canais de potássio, existentes no
lado basal, na Isc observada. Por outro lado a adição de ubaína, inibidor da bomba de
Na+,K+, 100 µM ao lado basal, reduz significativamente (p<0.05) a Isc induzida pela
anfotericina B, o que evidencia a participação da NKA na Isc induzida pela
anfotericina B. Por outro lado o DIDS, inibidor do co-transporte Na+,HCO3-, 200 µM
no lado basal aumenta significativamente a Isc induzida pela anfotericina B (Fig. 6),
o que revela uma acção contrária à da NKA na Isc.
0
50
100
150
200
*
*
a b c d e f
Isc
(% d
o co
ntro
lo)
Fig. 6: Efeito do amilorido 1 mM no lado apical (b), ubaína 100 µM no lado basal (c), DIDS 200 µM no lado basal (d), cloreto de bário 1 mM no lado basal (e), furosemida 10 µM no lado basal (f) na corrente de curto-circuito induzida pela anfotericina B, em % de controlo. Situação controlo (a). Os valores apresentados são médias de 4 experiências e as barras representam o erro padrão da média (SEM). * significa estatisticamente diferente da situação controlo (p<0.05).
28
Os resultados anteriormente descritos mostram que a Isc induzida pela anfotericina B
é uma medida da actividade da NKA. Assim utilizou-se esta Isc para avaliar o efeito
do IFN-γ e da ubaína na actividade da NKA e verificou-se que as células Caco-2
expostas durante 24 horas ao IFN-γ e à ubaína apresentam uma redução significativa
(p<0.05) na actividade da NKA, no entanto, embora a redução da actividade da NKA
pela ubaína seja superior à do IFN-γ, a remoção da ubaína durante 24 horas após 24
horas de exposição faz com que a actividade da NKA volte aos valores idênticos ao
da situação controlo, enquanto que a remoção do IFN-γ por 24 horas após 24 horas
de exposição mantém a NKA inibida, como se pode observar na figura 7.
Fig. 7: Efeito do IFN-γ 1000 U/ml durante 24 h (b), da remoção do IFN-γ por 24 h (c), da ubaína 100 nM, 24 h (d) e da remoção da ubaína durante 24 h (e) na actividade da NKA. Situação controlo (a). Os valores apresentados são médias de 15 experiências para (b) e (d), 4 experiências para (a) e (e) e 3 experiências para (c); as barras representam o erro padrão da média (SEM) e * significa estatisticamente diferente da situação controlo (p<0.05).
0
25
50
75
100
125
Act
ivid
ade
da N
KA
(% d
o co
ntro
lo)
a b c d e
29
Em seguida estudou-se o efeito do EGCG 20 µM, que é um inibidor do STAT1, na
actividade da NKA inibida pelo IFN-γ 1000 U/ml e pela ubaína 100 nM, em células
Caco-2 e verificou-se que, o EGCG reverte o efeito do IFN-γ na actividade da NKA
das células Caco-2, mas não consegue reverter o efeito da ubaína (Fig. 8), o que está
de acordo com os diferentes mecanismos de actuação da ubaína e do IFN-γ.
0
20
40
60
80
100
120
*
*
*
Act
ivid
ade
da N
KA
(% d
o co
ntro
lo)
a b c d e f
Fig. 8: Efeito do EGCG na actividade da NKA das células Caco-2 inibida pelo IFN-γ humano e pela ubaína. (a) - situação controlo, (b) - EGCG 20 µM, (c) - IFN-γ 1000 U/ml, (d) - EGCG 20 µM + IFN-γ 1000 U/ml, (e) - Ubaína 100 nM e (f) - EGCG 20 µM + Ubaína 100 nM. Os valores apresentados são médias de 12 experiências para (a), 6 experiências para (b), 15 experiências para (c) e (e), 5 experiências para (d) e 3 experiências para (f); as barras representam o erro padrão da média e * significa estatisticamente diferente da situação controlo (p<0.05).
30
Como a ubaína e o IFN-γ têm mecanismos de actuação distintos e como o EGCG
reverte o efeito do IFN-γ, fomos verificar se algum destes compostos actuam ao nível
da expressão da NKA e verificamos nem o IFN-γ 1000 U/ml, nem a ubaína 100 nM,
nem o EGCG 20 µM alteram significativamente a expressão da NKA, nas células
Caco-2 (Fig. 9).
Como o EGCG reverteu o efeito do IFN-γ na actividade da NKA das células Caco-2,
ao contrário da ubaína, caracterizou-se apenas o efeito deste polifenol na actividade
da NKA inibida pelo IFN-γ, através da dependência da inibição da actividade da
NKA com a concentração de EGCG. Assim obteve-se um EC50 = 1.43 µM e
verificou-se que para as concentrações de 20, 10, 5 e 2.5 µM a recuperação foi total,
ou seja são estatisticamente semelhantes à situação controlo enquanto que para as
concentrações mais baixas 1 e 0.1 µM não houve recuperação, ou seja são
0
5
10
15
20
25
Expr
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a)
a b c d e f
Fig. 9: Efeito do IFN-γ humano, da ubaína e do EGCG na expressão da NKA das células Caco-2. (a) - Situação controlo, (b) - EGCG 20 µM, (c) - IFN-γ 1000 U/ml, (d) - EGCG 20 µM + IFN-γ 1000 U/ml, (e) - Ubaína 100 nM e (f) - EGCG 20 µM +Ubaína 100 nM. Os valores apresentados são médias de 2 experiências e as barras representam o erro padrão da média.
31
4 5 6 7 840
60
80
100
120
EC50 = 1.43 µM
**
-log(conc.)
Act
ivid
ade
da N
KA
(% d
o co
ntro
lo)
estatisticamente semelhantes às células tratadas apenas com IFN-γ e estatisticamente
diferentes da situação controlo (Fig. 10).
Como o EGCG reverteu o efeito do IFN-γ na actividade da NKA das células
Caco-2 e como a cascata de sinalização celular, que vai desde a ligação do IFN-γ ao
seu receptor até à inibição da NKA, envolve a STAT1, fomos verificar se esta
recuperação da actividade da NKA mediada pelo EGCG estava relacionada com a
diminuição da concentração de STAT1 ou com a inibição da sua fosforilação e
consequentemente a sua inactivação. Nesse sentido fomos estudar o efeito do EGCG
na expressão do STAT1 e do phosphoSTAT1 em células Caco-2 tratadas com IFN-γ
e verificou-se que o IFN-γ aumenta quer a expressão de STAT1 quer a expressão de
Fig. 10: Dependência da actividade da NKA com a concentração de EGCG nas células Caco-2 inibidas pelo IFN-γ humano. Os valores apresentados são médias de 3 experiências e as barras representam o erro padrão da média. * significa estatisticamente diferente da situação controlo (p<0.05). .
32
phosphoSTAT1 (Fig. 11), contudo o EGCG apenas reduz a expressão de fosfo-
STAT1, ou seja inibe a activação do STAT1. No sentido de pesquisar qual a
estrutura ou parte da estrutura do EGCG relevante para a inibição do STAT1,
testaram-se outros derivados análogos do catecino, como o EGC, o EGC mais AG, o
ECG, o EC, o CG e o catecino, no entanto nenhum destes compostos preveniu o
aumento da expressão do STAT1 ou do phosphoSTAT1 induzida pelo IFN-γ (Fig.
11).
B
Con
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CG
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34
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a)
Fig. 11: Efeito de alguns derivados do catecino (20 µM) na expressão do STAT1 (A, C, E) e do phosphoSTAT1 (B, D, F), em células Caco-2, na presença de IFN-γ (1000U/ml). Os valores apresentados são médias de 3 experiências e as barras representam o erro padrão da média.
35
Os resultados obtidos nas células Caco-2 mostram que o EGCG é o único composto
testado, capaz de inibir a fosforilação do STAT1 e assim inibir o efeito do IFN-γ na
actividade da NKA das células Caco-2. Por isso decidiu-se caracterizar o efeito deste
composto da família do catecino na actividade do STAT1 estimulado pelo IFN-γ e
obtivemos um EC50 = 1.69 µM (Fig.12), idêntico ao valor obtido para o efeito deste
composto na recuperação da actividade da NKA inibida pelo IFN-γ, que foi de 1.43
µM (Fig. 10).
4 5 6 7 80
200
400
600
EC50 = 1.69 µM
-log(conc.)
Act
ivid
ade
da N
KA
(% d
o co
ntro
lo)
Fig. 12: Dependência da actividade do STAT1 estimulado pelo IFN-γ humano com a concentração de EGCG, nas células Caco-2. Os valores apresentados são médias de 2 experiências e as barras representam o erro padrão da média. * significa estatisticamente diferente da situação controlo (p<0.05).
36
3.2 - Ratinhos NMRi
Depois de caracterizar o efeito do EGCG na recuperação da actividade da NKA
inibida pelo IFN-γ e ainda na inibição da actividade do STAT1 estimulado pelo IFN-
γ, nas células Caco-2, pretendia-se estudar o efeito do EGCG 20 mg/Kg num modelo
animal. Para isso começou-se por avaliar o efeito do IFN-γ 10000 U, administrado
intraperitonealmente, na actividade da NKA ao longo do intestino do ratinho e
verificou-se que o IFN-γ 10000 U reduz a actividade da NKA nas células epiteliais
do cólon do ratinho, mas não tem qualquer efeito na actividade da NKA das células
epiteliais do jejuno e do íleo do ratinho (Fig. 13).
Fig. 13: Efeito do IFN-γ (10000 U) na actividade da NKA ao longo do intestino de ratinho. * significaactividade da NKA significativamente diferente da situação controlo (P < 0.05).
Jejuno Ileo Colon70
80
90
100
110
120Veículo
IFN-γ
*
Activ
idad
e da
NKA
(% d
o co
ntro
lo)
37
Em seguida avaliou-se a expressão da NKA ao longo do intestino de ratinho tratado
com IFN-γ e verificou-se que este não altera a expressão da NKA no jejuno, no íleo e
no cólon (Fig. 14). Os resultados obtidos no cólon são idênticos aos obtidos nas
células Caco-2, onde também se verifica uma diminuição da actividade da NKA sem
haver diminuição na expressão da NKA.
Jejuno Ileo Colon0
10
20
30
40
50
60
70 VeículoIFN-γ
Exp
ress
ão d
asu
buni
dade
α1
da N
KA
(% d
a de
nsid
ade
rela
tiva)
Fig. 14: Efeito do IFN-γ (10000 U) na expressão da NKA ao longo do intestino de ratinho.
38
Como o IFN-γ 10000 U administrado intraperitonealmente apenas reduziu a
actividade da NKA no cólon de ratinho, foi neste tecido que se estudou o efeito do
EGCG e do EGC 20 mg/Kg, na actividade da NKA inibida pelo IFN-γ. Como se
pode observar na figura 15, o EGCG 20 mg/Kg reverte o efeito do IFN-γ 10000 U na
actividade da NKA, enquanto que o EGC, que não teve qualquer efeito na
fosforilação do STAT1 estimulada pelo IFN-γ nas células Caco-2 (Fig. 11B),
também não reverteu a inibição da actividade NKA induzida pelo IFN-γ 10000 U no
cólon de ratinho (Fig. 15).
Controlo EGC EGCG70
80
90
100
110
120VeículoIFN-γ
**
Act
ivid
ade
da N
KA
(% d
o co
ntro
lo)
Fig. 15: Efeito do EGC e EGCG (20 mg/Kg) na actividade da NKA inibida pelo IFN- γ (10000 U), no colon de ratinho. * significa actividade da NKA significativamente diferente da situação controlo (P < 0.05).
39
4 - DISCUSSÃO
O uso do antimicótico anfotericina B, formador de poros para o Na+, no lado
apical da célula, permitiu isolar as correntes de sódio originadas pela acção da NKA
(Vieira-Coelho and Soares-da-Silva 2001; Gomes and Soares-Da-Silva 2002), como
podemos confirmar nas experiências preliminares (Fig. 5 e 6), permitindo assim,
estudar o efeito do IFN-γ e da ubaína na actividade da NKA e ainda o efeito do
EGCG na actividade da NKA inibida pelo IFN-γ.
A inibição da actividade da NKA pela ubaína e pelo IFN-γ é desencadeada
através de mecanismos distintos, assim a ubaína, que é um ligando da NKA, inibe a
actividade da enzima por ligação directa (Lingrel, Orlowski et al. 1990), sendo o seu
efeito revertido 24 horas após a sua remoção (Fig. 7). Por outro lado a inibição da
NKA pelo IFN-γ não é directa, mas envolve o STAT1, numa complexa cascata de
sinalização celular (Darnell, Kerr et al. 1994; Akira 1999; Magro, Fraga et al. 2004)
e o seu efeito não é revertido 24 horas após a sua remoção (Fig. 7). Os resultados
obtidos com o EGCG, nas células Caco-2, estão de acordo com o anteriormente
descrito, uma vez que o EGCG, um inibidor do STAT1, reverteu o efeito do IFN-γ,
mas não reverteu o efeito da ubaína na actividade da NKA (Fig. 8). Apesar de terem
mecanismos de actuação distintos nenhum destes inibidores da NKA actua ao nível
da expressão desta enzima (Fig. 9).
A relevância deste trabalho advém do facto de muitos genes envolvidos em
processos inflamatórios e em respostas imunológicas dependerem da actividade do
STAT1 (Chatterjee-Kishore, van den Akker et al. 2000; Ramana, Chatterjee-Kishore
et al. 2000) e por isso, os inibidores do STAT1 podem desempenhar um importante
papel na modulação de vários processos envolvidos na inflamação. Assim procedeu-
-se à caracterização do efeito do EGCG na actividade da NKA inibida pelo IFN-γ e
na actividade do STAT1 estimulado pelo IFN-γ, através dos respectivos EC50. Os
resultados obtidos nas células Caco-2 revelam um EC50 = 1.43 µM na actividade da
NKA (Fig. 10) e um EC50 = 1.69 µM na actividade do STAT1 (Fig. 12). Em seguida
estudou-se o efeito de outros compostos estruturalmente semelhantes (Fig. 16), na
40
inactivação do STAT1, no sentido de averiguar se haveria alguma sub-estrutura do
EGCG particularmente relevante para o seu efeito.
Fig. 15: Estrutura dos compostos da família do catecino testados. a) (-)-catecino, b) (-)-catecino-3-galato, c) (-)-epicatecino, d) (-)-epicatecino-3-galato, e) (-)-epigalocatecino, f) (-)-epigalocatecino-3-galato.
OH
OOH
OH
OH
OHOOH
O
O
OH
OH
OH
OH
OH
OH
a) b)
OH
O
OH
OH
OH
OH
OOH
O
O
OH
OH
OH
OH
OH
OH
c) d)
OH
OH
O
OH
OH
OH
OH
OH
OOH
O
O
OH
OH
OH
OH
OH
OH
e) f)
41
Os resultados obtidos nas células Caco-2 mostram que apenas o EGCG
impede a activação do STAT1 induzida pelo IFN-γ (Fig.11), o que sugere que não
existe nenhum grupo funcional particularmente importante para a actuação do
EGCG, mas que este actua como um todo.
A inibição do efeito do IFN-γ na actividade da NKA pelo EGCG ocorre
através da inibição da fosforilação da tirosina 701 do STAT1 (Fig. 11B) que impede
a activação deste e não por inibição da expressão do STAT1 (Fig. 11A) nem por
outro processo relacionado com o seu poder antioxidante, já que nenhum dos outros
compostos da família do catecino conseguiu reverter o efeito do IFN-γ no STAT1,
apesar de também apresentarem propriedades antioxidantes (Lotito and Fraga 2000;
Leung, Su et al. 2001). Existem alguns exemplos de inibição do crescimento celular
por parte de vários compostos da família do catecino como é o caso do crescimento
das células do epitélio bronquico humano, 21BES, descrito por Yang onde não só o
EGCG, como também o EGC inibem o crescimento das referidas células (Yang, Liao
et al. 2000). Estes autores sugerem que o grupo galato é importante para a inibição
do crescimento da linha celular 21BES. Outro exemplo é o descrito por Chung para a
linha celular JB6 da epiderme de ratinho, onde todos os compostos da família do
catecino excepto o (-)-epicatecino, mostram uma forte inibição do crescimento
celular e da actividade da AP-1 (Chung, Huang et al. 1999). Os resultados obtidos,
no presente trabalho, sugerem que toda a estrutura do EGCG (Fig. 3) é importante
para a inibição do STAT1, já que nenhum dos outros compostos da família do
catecino testados e ainda o EGC juntamente com o AG conseguiram reverter o efeito
do IFN-γ (Fig. 11). Assim, em alguns casos, os efeitos atribuídos genericamente ao
chá verde, nomeadamente a sua acção antiinflamatória, podem na realidade ser da
exclusiva responsabilidade do EGCG.
Os resultados obtidos com a NKA isolada das células epiteliais do cólon de
ratinhos NMRi, mostram que o EGCG também é eficaz quando administrado por via
oral (Fig. 15), o que aumenta a importância deste composto, já que poderá ser
administrado oralmente para a supressão do efeito do IFN-γ sobre a NKA,
nomeadamente em pacientes com doença de Chron, para a diminuição de um dos
principais sintomas, que é a diarreia. Além disso como o EGCG actua sobre o
42
STAT1 poderá também ser usado para reverter outros mecanismos envolvidos na
inflamação, que utilizem uma cascata de sinalização celular que envolva este
transdutor de sinal.
43
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