BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TÀI LIỆUTHÍ NGHIỆM THỰC HÀNH

TRƯỜNG TRUNG HỌC PHỔ THÔNG

Môn Sinh học

(Tài liệu lưu hành nội bộ)

Hà Nội, tháng 9 năm 2011

1

CHƯƠNG TRÌNH PHÁT TRIỂN GIÁO DỤC TRUNG HỌC

VỤ GIÁO DỤC TRUNG HỌC

Nhóm tác giả biên soạn tài liệu

1. GS.TS. Vũ Văn Vụ

2. PGS.TS. Mai Sỹ Tuấn

3. ThS. Lê Đình Tuấn

4. TS. Ngô Văn Hưng

5. ThS. Nguyễn Thị Linh

Biên tập nội dung

TS. Ngô Văn Hưng

2

Lời nói đầu

Nhằm triển khai Đề án phát triển hệ thống trường THPT chuyên giai đoạn

2010 - 2020, với mục tiêu nâng cao chất lượng dạy học trong các trường THPT

chuyên và phát triển chuyên môn cho giáo viên chuyên sinh, Bộ Giáo dục và

Đào tạo tổ chức biên soạn tài liệu “Thí nghiệm thực hành trường THPT môn

Sinh học”. Để đáp ứng yêu cầu đổi mới dạy học tăng cường dạy thí nghiệm

thực hành và thi chọn học sinh giỏi sinh học THPT, Bộ Giáo dục và Đào tạo đã

mời các cán bộ quản lý chỉ đạo dạy học, các giảng viên đại học và các nhà

khoa học, giáo viên trực tiếp giảng dạy chương trình chuyên sinh học có nhiều

thành tích trong công tác bồi dưỡng học sinh giỏi và nghiên cứu khoa học,

tham gia viết tài liệu này. Cấu trúc tài liệu gồm có:

Phần 1. Giới thiệu chung về thí nghiệm thực hành môn Sinh học

Phần 2. 10 bài thí nghiệm thực hành môn Sinh học. Mỗi bài được viết

theo cấu trúc:

- Mục tiêu

- Cơ sở khoa học

- Thiết bị, hóa chất, mẫu vật

- Tiến hành thí nghiệm

- Phân tích kết quả và lập báo cáo

- Câu hỏi đánh giá và mở rộng vấn đề

Phần 3. Phụ lục (giới thiệu một số bài thi thực hành của IBO).

Mặc dù tài liệu được viết rất công phu, Tiểu ban thẩm định môn Sinh

học đọc góp ý và biên tập nội dung nhưng khó tránh khỏi còn có những sơ

sót nhất định. Các tác giả mong nhận được góp ý của quý thầy cô giáo và

độc giả khi sử dụng tài liệu.

Trân trọng cám ơn Tiểu ban thẩm định và bạn đọc.

Thay mặt các tác giả

TS. Ngô Văn Hưng

3

Mục lục

Trang

Lời nói đầu 3

Mục lục 4

Hướng dẫn sử dụng tài liệu 5

Phần 1. Giới thiệu chung về thí nghiệm thực hành môn Sinh học 7

Vai trò của dạy học thực hành đối với học sinh trường THPT chuyên 7

Thực trạng thí nghiệm thực hành môn Sinh học THPTvà các giải pháp

cải tiến thực trạng 8

Những yêu cầu cần thiết dạy thực hành sinh học có hiệu quả 9

An toàn thí nghiệm thực hành sinh học 13

Yêu cầu về kỹ năng thực hành sinh học (theo IBO) 30

Phần 2. 10 bài thí nghiệm thực hành môn Sinh học 34

Bài 1. Nhận biết một số thành phần hóa học của tế bào 34

Bài 2. Ảnh hưởng nhiệt độ, pH, các chất kìm hãm lên hoạt độ

của enzym. Xác định hoạt độ của một số enzyme 50

Bài 3. Quan sát tế bào dưới kính hiển vi. 64

Thí nghiệm co và phản co nguyên sinh

Bài 4. Thực hành lên men etilic 69

Bài 5. Tìm hiểu hoạt động của tim ếch 73

Bài 6. Thí nghiệm về điện sinh học 80

Bài 7. Chiết rút sắc tố từ lá. Xác định tính cảm quang của clorophin 85

Bài 8. Chứng minh quá trình hô hấp tỏa nhiệt mạnh 91

Bài 9. Quan sát các dạng đột biến NST trên tiêu bản cố định

hay trên tiêu bản tạm thời 94

Bài 10. Tính độ phong phú của loài và kích thước quần thể 110

Phần 3. Phụ lục 123

Phụ lục 123

Tài liệu tham khảo 163

Thông tin về tác giả 165

4

HƯỚNG DẪN SỬ DỤNG TÀI LIỆU

Cuốn tài liệu này được sử dụng cùng với cuốn “Tài liệu bồi dưỡng

phát triển chuyên môn cho giáo viên trường THPT chuyên năm 2011 môn

Sinh học” của Bộ GDĐT (tháng 7 năm 2011).

Có hai quan niệm sai lầm cần tránh là:

- Chỉ khi nào có đủ trang thiết bị, hóa chất, mẫu vật như trong tài liệu

thì mới có thể tiến hành thí nghiệm thực hành sinh học được. Năm đầu tiên

có thể chọn những thí nghiệm thực hành phù hợp với điều kiện của địa

phương để thực hiện trước (ví dụ như bài nhận biết các chất hữu cơ trong

tế bào, bài quan sát tế bào, bài lên men, bài chiết rút sắc tố, quan sát tiêu

bản NST,…) đồng thời có kế hoạch khắc phục khó khăn, trở ngại để thực

hiện hết các nội dung thực hành trong những năm sau.

- Sẽ sai lầm nếu cho rằng chỉ cần thực hiện như nội dung các bài thực

hành trong tài liệu là tốt rồi. Những nơi có điều kiện về trang thiết bị và

giáo viên có thể mở rộng nội dung bài thực hành. Ví dụ bài 1 có thể 5ung

nội dung nhận biết 5ung5ic và axit 5ung5ic; bài 3 có thể 5ung nội dung

đếm số lượng tế bào; … Trong cuốn “Tài liệu bồi dưỡng phát triển chuyên

môn cho giáo viên trường THPT chuyên năm 2011 môn Sinh học” có giới

thiệu rất nhiều bài thực hành khác nữa.

Để sử dụng tài liệu hiệu quả nhất xin lưu ý mấy điểm sau:

- Đọc kĩ nội dung phần 1: “Giới thiệu chung về thí nghiệm thực hành

môn Sinh học”. Giáo viên và học sinh phải tường minh những yêu cầu cần

thiết dạy thực hành sinh học có hiệu quả, quy trình một bài thực hành sinh

học, quy tắc làm việc trong phòng thí nghiệm, và đặc biệt là “yêu cầu về kĩ

năng thực hành sinh học”.

- Đọc kĩ nội dung từng bài thực hành ở phần 2, căn cứ vào thực tiễn

địa phương để quyết định mục tiêu cụ thể cho từng nội dung thực hành thí

nghiệm đã chọn cho dạy học hay thi tuyển học sinh giỏi. Khi chọn nội

dung thực hành cần tính đến thời gian hoàn thành cho mỗi nội dung đó để

bố trí dạy học hay thi cử cho hợp lý.

5

- Nghiên cứu kĩ phần cơ sở khoa học của thí nghiệm thực hành. Đây

chính là căn cứ để giải thích các hiện tượng quan sát được trong thí

nghiệm. Giáo viên có thể dành thời gian hướng dẫn (hoặc kiểm tra) học

sinh nội dung này.

- Giáo viên phải tìm hiểu và chuẩn bị đầy đủ thiết bị, hóa chất, mẫu

vật yêu cầu trong mỗi thí nghiệm thực hành (chú ý: có thể thay thế thiết bị,

hóa chất, mẫu vật sẵn có của địa phương mà không nhất thiết phải đúng

như trong tài liệu đã viết; để kích thích tư duy của học sinh có thể thay đổi

số liệu khác với hướng dẫn trong tài liệu rồi yêu cầu học sinh giải thích vì

sao kết quả thí nghiệm lại khác so với trong tài liệu). Trước khi thực hành

nhất định học sinh phải thành thạo các bước: kiểm tra dụng cụ thiết bị, hóa

chất, mẫu vật; trình tự các bước làm thí nghiệm thực hành.

- Trong mỗi bài thí nghiệm thực hành, giáo viên cần nghiên cứu thật

kĩ nội dung “phân tích kết quả và báo cáo” để hướng dẫn học sinh ghi chép

kết quả thực hành, xử lí các số liệu thu được, trình bày báo cáo.

- Phần câu hỏi đánh giá và mở rộng vấn đề là những gợi ý bước đầu.

Trong thực tiễn dạy học thực hành giáo viên có thể đưa 6ung nhiều tình

huống mới để kích thích tư duy cho học sinh, thậm chí lấy ngay tình huống

cụ thể trong buổi thực hành để học sinh phân tích, thảo luận. Chú ý tham

khảo các bài thi thực hành của IBO được giới thiệu ở phần phụ lục.

- Giáo viên và học sinh có thể vào trang WEB của bộ môn Sinh

học: http://sites.google.com/site/diendanchuyensinh để tải về những tư

liệu và bài thực hành đã được quay băng.

Cuối cùng nếu trong quá trình thực hiện có gặp khó khăn gì thì liên hệ

với chúng tôi theo địa chỉ trong mục “Thông tin về tác giả” ở cuối tài liệu.

6

Phần 1. Giới thiệu chung về thí nghiệm thực hành môn Sinh học

I. Vai trò của dạy học thực hành đối với học sinh trường THPT chuyên

“… Không thể hình dung được việc giảng dạy sinh vật học trong nhà

trường mà lại không có quan sát, không có thí nghiệm học tập.” B.P.

Exipốp (trong cuốn những cơ sở của LLDH). Quan sát và thí nghiệm là các

phương pháp nghiên cứu cơ bản của khoa học tự nhiên, của các môn khoa

học thực nghiệm, trong đó có sinh học. Sinh học là một khoa học đã và sẽ

không thể phát triển được nếu không có quan sát, thí nghiệm.

Quan sát và thí nghiệm đã tạo khả năng cho các nhà khoa học phát

hiện và khai thác các sự kiện, hiện tượng mới, xác định những quy luật

mới, rút ra những kết luận khoa học và tìm cách vận dụng vào thực tiễn.

Đối với quá trình dạy học các môn khoa học tự nhiên, khoa học thực

nghiệm, quan sát và thí nghiệm cũng là phương pháp làm việc của học sinh

(HS), nhưng với HS những bài tập quan sát hoặc các thí nghiệm được giáo

viên (GV) trình bày hay do chính các em tiến hành một cách độc lập (thực

hành quan sát, thí nghiệm của HS) dưới sự tổ chức, hướng dẫn của GV

thường để giải quyết những vấn đề đã biết trong khoa học, rút ra những kết

luận cũng đã biết tuy vậy đối với các em HS vẫn là mới.

Thông qua quan sát, thí nghiệm, bằng các thao tác tư duy phân tích,

tổng hợp, trừu tượng hóa và khái quát hóa giúp các em xây dựng các khái

niệm. Bằng cách đó các em nắm kiến thức một cách vững chắc và giúp cho

tư duy phát triển.

Quan sát và thí nghiệm đòi hỏi phải có những thiết bị dạy học như

tranh ảnh, mô hình, các mẫu vật tự nhiên và các phương tiện thiết bị phục

vụ cho việc tiến hành các thí nghiệm.

Quan sát và thí nghiệm không chỉ cho phép HS lĩnh hội tri thức một

cách sâu sắc, vững chắc mà còn tạo cho các em một động lực bên trong,

thúc đẩy các em thêm hăng say học tập.

Tục ngữ có câu “Trăm nghe không bằng một thấy”, đủ nói lên vai trò

của quan sát thí nghiệm. Người Ấn Độ và người Trung Hoa cũng đã nói:

“Nghe thì quen, nhìn thì nhớ, làm thì hiểu”. 7

Những phân tích trên đây không chỉ cho chúng ta thấy rõ tầm quan

trọng của thí nghiệm thực hành mà còn nhấn mạnh đến phương pháp sử

dụng các thí nghiệm thực hành đó để có thể đạt được hiệu quả cao đáp ứng

mục tiêu dạy học hiện nay của sự nghiệp giáo dục.

II. Thực trạng thí nghiệm thực hành môn Sinh học THPTvà các giải pháp cải tiến thực trạng

Hiện nay số lượng và chất lượng thí nghiệm thực hành sinh học chưa

đáp ứng được yêu cầu của việc dạy học nói chung và đặc biệt là yêu cầu

việc đổi mới dạy học nói riêng. Tình trạng đó có thể có nhiều nguyên nhân,

phần vì kinh phí cho khu vực này còn hạn hẹp tuy đã có nhiều cố gắng,

phần vì trách nhiệm của nhà sản xuất (còn mà không dùng được, dùng

được thì cũng chóng hỏng), phần vì thiếu một sự quản lí chỉ đạo, động viên

những người tốt, việc tốt trong sử dụng và cải tiến sáng tạo thí nghiệm

thực hành sinh học hiện có. Như đã phân tích, hiệu quả dạy học còn tùy

thuộc vào phương pháp sử dụng các thí nghiệm thực hành. Nếu một bức

tranh, một thí nghiệm chỉ được sử dụng để minh họa và củng cố những

điều GV đã trình bày đầy đủ về phương diện lý thuyết sẽ hạn chế tư duy

sáng tạo của HS, HS hầu như không thu lượm được thêm gì về kiến thức,

nếu không phải chỉ để rèn luyện kĩ năng quan sát, thí nghiệm.

Nhưng nếu được sử dụng theo con đường tìm tòi nghiên cứu (khám

phá) để đi đến kiến thức cần lĩnh hội (kiến thức mới) sẽ có ý nghĩa khác

biệt cơ bản so với loại hình thí nghiệm nêu trên, nó giúp HS có điều kiện,

cơ hội phát triển tư duy sáng tạo – một phẩm chất và năng lực cần có ở con

người mới mà nhà trường có trách nhiệm đào tạo.

Đi theo con đường này, sau khi đã hiểu được nhiệm vụ cần làm sáng

tỏ (mục đích của thí nghiệm) bằng tư duy tích cực, HS sẽ hình thành được

các giả định (trong nghiên cứu khoa học đây chính là bước xây dựng giả

thuyết về vấn đề nghiên cứu từ sự nảy sinh câu hỏi: “Điều gì sẽ xảy ra

nếu…?”). Câu hỏi được hình thành từ những liên tưởng dựa trên vốn kiến

thức và kinh nghiệm đã có của HS.

8

Khi giả định được hình thành, trong đó hàm chứa con đường phải giải

quyết, HS xây dựng kế hoạch giải quyết để chứng minh cho giả định đã

nêu. Hai bước nêu giả định và xây dựng kế hoạch giải quyết chứng minh

cho giả định là hai bước đòi hỏi tư duy tích cực và sáng tạo. Đây là những

cơ hội rèn luyện tu duy sáng tạo cho HS rất tốt, là giai đoạn tiến hành thí

nghiệm tưởng tượng (“thí nghiệm trong tư duy”) định hướng cho hành

động thí nghiệm tiếp theo dựa trên kế hoạch đã được HS thiết kế (kế hoạch

dự kiến). Cuối cùng, căn cứ vào kết quả của thí nghiệm, HS rút ra kết luận,

nghĩa là HS lĩnh hội được kiến thức từ thí nghiệm một cách chủ động (mà

không phải do thày truyền đạt và HS tiếp thu một cách thụ động).

Hiện nay hầu hết các bài thực hành thí nghiệm sinh học ở THPT trong

chương trình và SGK được bố trí ở cuối mỗi chương chỉ mang tính chất

củng cố minh họa cho các kiến thức lý thuyết đã được trình bày trong các

bài học của chương trình dưới hình thức phần lớn là “bày sẵn” từng bước

cho HS. Hơn nữa số tiết thực hành quy định trong chương trình và SGK

cũng còn rất hạn chế. Rồi đây, chắc chắn số tiết này có thể sẽ được nâng

lên cho phù hợp với xu thế chung của giáo dục thế giới và tương ứng với

tính chất của các môn khoa học thực nghiệm.

Trước mắt trong khi chờ đợi, đòi hỏi lòng nhiệt tâm vì sự nghiệp giáo

dục của các thầy cô đang tiến hành các bài thực hành hiện có theo phương

thức mới ở những nội dung phù hợp và cũng có thể bổ sung thêm các thí

nghiệm thực hành sinh học vào các tiết dạy khi có thể và có điều kiện thích

hợp.

Trong tài liệu này, ngoài một số thí nghiệm thực hành đã quen làm,

chúng tôi sẽ giới thiệu một số bài thí nghiệm thực hành có tính gợi ý để

các đơn vị tham khảo và vận dụng trong điều kiện có thể, cũng có thể tiến

hành hình thức ngoại khóa hoặc đi đến các cơ sở có điều kiện về trang thiết

bị thí nghiệm thực hành sinh học để học tập.

III. Những yêu cầu cần thiết dạy thực hành sinh học có hiệu quả

Dạy thực hành, mục đích chính lx à rèn các kỹ năng thao tác chân

tay, các đức tính kiên nhẫn, biết chấp nhận thử thách và tự tìm cách vượt

9

qua các thách thức để đạt được mục tiêu của mình. Vì vậy học sinh phải tự

mình làm thí nghiệm cho dù các thao tác ban đầu còn vụng về và có thể

thất bại. Như vậy, nếu quan niệm thực hành chỉ là minh họa, trình diễn để

học sinh xem thì việc tổ chức cho cả lớp học sinh vào một phòng thí

nghiệm làm cùng lúc là được nhưng học sinh không thể hình thành được

kỹ năng cũng như rèn luyện được những đức tính cần thiết của người làm

khoa học. Còn nếu để học sinh tự làm thì lại phải chia lớp thành nhiều

nhóm nhỏ (tối đa khoảng 10 em) thì các em mới có thể tự làm thí nghiệm

được và học sinh chỉ hình thành được kỹ năng khi được làm đi làm lại

nhiều lần một kỹ năng nhất định.

Một quan niệm không đúng về dạy thực hành là giáo viên thường

không đưa ra các tình huống khác thường để dạy học sinh cách phân tích

rút ra các kết luận phù hợp cũng như không biết cách tìm ra nguyên nhân

khi thí nghiệm không ủng hộ giả thiết ban đầu. Có thể lấy ví dụ cụ thể: Khi

làm bài thực hành chứng minh ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến tốc

độ quang hợp ở cây thủy sinh là rong đuôi chó. Cường độ quang hợp được

tính bằng lượng O2 thoát ra (đếm bằng số bọt khí/phút hoặc bằng khối

lượng O2 thu được trong ống nghiệm) còn cường độ ánh sáng có thể được

thay đổi bởi khoảng cách chiếu sáng hoặc bởi công suất của bóng đèn.

Trong bài học này ngoài thí nghiệm trên, giáo viên có thể tạo ra tình huống

trong đó cùng một cây rong đuôi chó ở thí nghiệm trước tạo ra rất nhiều O2

thì trong thí nghiệm khác lại không nhả ra một bọt khí O2 nào cho dù có

cho đèn vào gần hơn hoặc công suất bóng đèn tăng lên nhiều lần. Học sinh

được yêu cầu phải tìm ra nguyên nhân (đưa ra giả thuyết) và làm thí

nghiệm ủng hộ giả thuyết của mình là đúng. Như vậy mục đích cốt lõi của

dạy thực hành là rèn các kỹ năng khéo léo trong các thao tác tay chân,

các kỹ năng bố trí thí nghiệm, thu thập kết quả, giải thích kết quả thực

nghiệm, lý giải đưa ra các giả thuyết và tự tiến hành các thí nghiệm ủng

hộ hay bác bỏ giả thuyết của mình chứ không đơn thuần là minh họa cho

các bài lý thuyết. Như vậy dạy thực hành phát triển các kỹ năng tổng hợp

và do vậy tất cả các học sinh cần được dạy thực hành. Lưu ý là ngay cả

10

trong các kỳ thi Olympic Sinh học Quốc tế có sử dụng các trang thiết bị

hiện đại như điện di sắc ký, quang phổ vv… thì điểm của học sinh cao hay

thấp không phụ thuộc nhiều vào thiết bị (trừ phi học sinh chưa được làm

quen với thiết bị đó). Vì sử dụng thiết bị hiện đại cũng chỉ để thu thập số

liệu, trong khi đó các kỹ năng đơn giản như pha loãng hóa chất, xử lý số

liệu thu được như vẽ đồ thị, rút ra các kết luận phù hợp, biết cách sắp xếp

thời gian hợp lý vv… lại quyết định kết quả cuối cùng.

Qui trình cho một bài thí nghiệm có thể gồm các bước như sau:

- Chuẩn bị thí nghiệm: GV phải có kế hoạch đảm bảo chuẩn bị đầy đủ

dụng cụ, hóa chất, mẫu vật và các điều kiện cần thiết khác để thí nghiệm

thành công. Có thể giao cho HS chuẩn bị nhưng phải kiểm tra.

- Phổ biến nội qui an toàn phòng thí nghiệm: Ngay khi bắt đầu một

bài thực hành, giáo viên cần phải hướng dẫn cho học sinh về qui tắc an

toàn trong phòng thí nghiệm. Điều này là hết sức cần thiết và phải làm

ngay mỗi lần học sinh vào phòng thí nghiệm. Bên cạnh đó cũng cần phổ

biến cách cấp cứu trong những trường hợp cần thiết như bỏng hóa chất,

băng bó khi bị thương vv…

- Bước 1: GV nêu mục tiêu thí nghiệm (hoặc hướng dẫn học sinh

phát biểu mục tiêu thực hành), phải đảm bảo mỗi HS nhận thức rõ mục

tiêu làm thí nghiệm để làm gì?

- Bước 2: GV hướng dẫn HS cách tiến hành thí nghiệm, phải đảm

bảo mỗi HS nhận thức rõ làm thí nghiệm như thế nào? Bằng cách nào?

Giáo viên giới thiệu qui trình thí nghiệm: Học sinh có thể tự đọc qui

trình thí nghiệm (nếu có sẵn trong bài thực hành) hoặc giáo viên giới thiệu

cho học sinh. Sau đó học sinh tự kiểm tra các loại hóa chất thiết bị, mẫu

vật xem có đáp ứng được với yêu cầu bài thực hành hay không.

Tiến hành thí nghiệm: Học sinh tự tiến hành thí nghiệm theo qui trình

đã cho để thu thập số liệu.

- Bước 3: Mô tả kết quả thí nghiệm. HS viết ra (hoặc nói ra) các

kết quả mà họ quan sát thấy trong quá trình làm thí nghiệm.

11

Xử lý số liệu thực nghiệm: Học sinh xử lý số liệu và viết báo cáo thí

nghiệm nộp cho giáo viên. Cuối buổi giáo viên có thể đưa ra các tình

huống khác với thí nghiệm để học sinh suy ngẫm và tìm cách lý giải. Phần

này GV có thể tham khảo sách Sinh học của Campbell & Reece ở mục

“Điều gì nếu?” sau mỗi thí nghiệm mà sách đưa ra.

- Giải thích các hiện tượng quan sát được: đây là giai đoạn có

nhiều thuận lợi để tổ chức HS học theo phương pháp tích cực. GV có thể

dùng hệ thống câu hỏi dẫn dắt theo kiểu nêu vấn đề giúp HS tự giải thích

các kết quả.

- Rút ra kết luận cần thiết: GV yêu cầu HS căn cứ vào mục tiêu

ban đầu trước khi làm thí nghiệm để đánh giá công việc đã làm.

- Chú ý: Các thí nghiệm sinh học có thể là thí nghiệm định tính

hay định lượng. Các thí nghiệm định tính thì không nên quá tiết kiệm

nguyên liệu, sẽ khó quan sát kết quả. Các thí nghiệm định lượng thì cần

chính xác hàm lượng các chất làm thí nghiệm mới có kết quả. Ví dụ: khi

làm thí nghiệm tách chiết ADN, nếu cho ít dịch lọc hay ít chất tẩy rửa hoặc

quá ít nước cốt dứa thì sẽ rất khó có kết quả khả quan.

Tóm tắt quy trình một bài thực hành

Bước 1. Xác định mục tiêu (cho GV và cho HS). Yêu cầu của

bước này là HS phải nhận thức được và phát biểu rõ mục tiêu (trả lời câu

hỏi: để làm gì?)

Bước 2. Kiểm tra kiến thức cơ sở và kiểm tra sự chuẩn bị thực

hành (trả lời câu hỏi: có làm được không?).

Bước 3. Xác định nội dung thực hành (trả lời câu hỏi: làm như

thế nào?)

Bước 4. Tiến hành các hoạt động thực hành (trả lời câu hỏi:

quan sát thấy gì? Thu được kết quả ra sao?).

Bước 5. Giải thích và trình bày kết quả, rút ra kết luận (trả lời

câu hỏi: tại sao? Mục tiêu đã hoàn thành hay chưa?).

Viết báo cáo thực hành.

12

IV. An toàn thí nghiệm thực hành sinh học

1. Nguyên lý an toàn sinh học

Nguyên lý cơ bản của an toàn sinh học là phòng ngừa, là làm giảm

thiểu hoặc hạn chế nguy cơ gây hại cho con người và môi trường khi tiếp

xúc với sinh vật và các vật liệu lây nhiễm lưu giữ trong phòng thí nghiệm.

Nguyên lý an toàn sinh học được xác định là sự kết hợp của ba nhân

tố phòng ngừa trong thực hành và kĩ thuật phòng thí nghiệm, thiết bị an

toàn và thiết kế điều kiện làm việc tốt. Người ta chia biện pháp phòng ngừa

thành hai loại, phòng ngừa sơ cấp và phòng ngừa thứ cấp.

Phòng ngừa sơ cấp : là bảo vệ người và môi trường thí nghiệm khỏi

tác hại của các tác nhân gây ô nhiễm. Phòng ngừa sơ cấp bao gồm chủ yếu

các kĩ thuật an toàn trong phòng thí nghiệm và khi tiếp xúc với sinh vật.

Phòng ngừa thứ cấp : là bảo vệ môi trường bên ngoài phòng thí

nghiệm khỏi sự phát tán của các vật liệu lây nhiễm, bao gồm cả việc thiết

kế phòng thí nghiệm, lớp học,... sao cho an toàn và đảm bảo vệ sinh lao

động.

- Phòng ngừa trong thực hành và kĩ thuật phòng thí nghiệm:

Phòng thí nghiệm cần phải được xây dựng đảm bảo quy định về an

toàn sinh học, trong đó cần xác định rõ các tác nhân và chất nguy hại có

thể có trong phòng thí nghiệm. Xác định rõ các kĩ thuật làm việc đặc biệt

và đưa ra các các quy định rõ ràng nhằm giảm thiểu hoặc hạn chế sự bùng

phát của các tác nhân gây hại.

Nhân viên mới được tuyển dụng vào làm việc trong phòng thí nghiệm,

học sinh và sinh viên tới học trong phòng thí nghiệm cần phải được chỉ

dẫn chu đáo về các tác nhân gây hại đặc hiệu, được học về kiến thức và kĩ

thuật phòng thí nghiệm, được phổ biến các quy định an toàn trong phòng

thí nghiệm sinh học.

- Thiết bị an toàn:

Thiết bị an toàn trước hết nhằm bảo vệ trực tiếp nhữnh người tiếp xúc

với sinh vật và các tác nhân hây hại. Các thiết bị an toàn phổ biến của

13

phòng thí nghiệm sinh học bao gồm tủ cấy an toàn sinh học, thiết bị li tâm

an toàn, các dụng cụ an toàn đựng mẫu vật (dụng cụ thủy tinh, ống

nghiệm,...), dụng cụ đảm bảo an toàn cá nhân như găng tay, quần áo bảo

hộ lao động, áo choàng, khẩu trang, mũ bảo vệ,....

Tủ cấy an toàn là phương tiện bắt buộc sử dụng để ngăn ngừa sự lây

nhiễm do đổ vỡ hoặc bụi, nhất là khi thực hành vi sinh vật. Có ba loại tủ

cấy an toàn sinh học, tủ cấy loại I và II đảm bảo an toàn sơ cấp cho cán bộ,

học sinh và sinh viên khi làm thí nghiệm, đồng thời bảo vệ mẫu vật thí

nghiệm (vi sinh vật, tế bào,...) tránh bị nhiễm khuẩn từ bên ngoài. Tủ cấy

an toàn sinh học III có cấu tạo đặc biệt đảm bảo mức độ an toàn cao nhất

cho cán bộ và sinh viên trong phòng thí nghiệm.

Thiết bị li tâm an toàn sử dụng ống li tâm có nắp đậy, tránh bụi nước

thoát ra ngoài khi li tâm gây hại cho con người và môi trường phòng thí

nghiệm.

Trong nhiều trường hợp không thể thực hiện thí nghiệm trong tủ cấy

an toàn sinh học thì thiết bị an toàn cá nhân là vật dụng tối cần thiết, hạn

chế rủi ro cho con người. Ví dụ, khi tiến hành mổ động vật, khi rửa và bảo

dưỡng các thiết bị thí nghiệm cần sử dụng đầy đủ dụng cụ bảo vệ cán

nhân.

- Phòng ngừa trong thiết kế và xây dựng các cơ sở làm việc đảm bảo

an toàn và vệ sinh lao động:

Phòng thí nghiệm được thiết kế đúng quy cách, có trang thiết bị tương

ứng với chức năng và cấp độ an toàn sinh học của phòng, đảm bảo an toàn

và vệ sinh lao động. Các phòng thí nghiệm có cấp độ an toàn sinh học I và

II cần được thiết kế tách riêng với lối đi công cộng, nơi tiêu độc và khu vệ

sinh.

2. Nguyên tắc phân loại tác nhân sinh học theo nhóm rủi ro và cấp độ

an toàn sinh học

Các tác nhân sinh học được phân loại theo nhóm và phân thành bốn

cấp độ khác nhau. Nguyên tắc phân loại tùy thuộc vào từng quốc gia các

các tổ chức quốc tế khác nhau như cấp độ an toàn sinh học của Liên minh

14

Châu Âu, cấp độ an toàn sinh học của viện Y học Quốc gia Mỹ,.... Sau đây

là ví dụ về phân loại nhóm rủi ro và cấp độ an toàn sinh học theo quy định

an toàn sinh học phòng thí nghiệm của WHO:

- Nhóm rủi ro loại 1 (RG1): gồm những sinh vật dường như không

gây rủi ro hoặc gây rủi ro thấp cho con người và động vật.

- Nhóm rủi ro loại 2 (RG2): gồm các sinh vật có khả năng gây bệnh

cho con người nhưng ở mức độ không nghiêm trọng. Có thể có khả năng

lây nhiễm bệnh từ phòng thí nghiệm nhưng đã có biện pháp phòng ngừa và

chữa trị, hạn chế được sự lan truyền bệnh.

- Nhóm rủi ro loại 3 (RG3): gồm các sinh vật có khả năng gây bệnh

cao cho con người, nhưng thông thường không lan truyền từ người này

sang người khác và đã có biện pháp phòng và chữa chạy hiệu quả.

- Nhóm rủi ro loại 4 (RG4): gồm các tác nhân gây rủi ro cao cho con

người và động vật, bệnh có thể lây truyền từ người này sang người khác và

chưa có biện pháp phòng và chữa trị.

Từ việc phân loại các nhóm rủi ro, người ta có thể xây dựng các tiêu

chuẩn cụ thể cho mỗi cấp độ an toàn sinh học.

3. Phòng bệnh nghề nghiệp và đề phòng tai nạn

Theo Tổ chức lao động Quốc tế (ILO), ước tính hằng năm có tới 120

triệu tổn thương trên thế giới do tai nạn lao động, 67-157 triệu trường hợp

mắc bệnh nghề nghiệp và khoảng 200.000 người tử vong khi làm việc. Ở

Việt Nam, ước tính năm 2000, có tới 4.081 người lao động phát hiện bệnh

nghề nghiệp, 3334 người bị tại nạn lao động, 941 người bị thương nặng,

331 người tử vong.

Trong môi trường lao động nói chung, môi trường học tập và nghiên

cứu sinh học trong phòng thí nghiệm sinh học nói riêng luôn tiềm ẩn khả

năng mắc phải nhiều bệnh tật. Khi môi trường bị ô nhiễm bởi các sinh vật

gây hại thì dễ dàng truyền bệnh cho con người. Nguyên tắc chung của

phòng bệnh lây truyền từ sinh vật là :

- Cách ly người có biểu hiện bệnh, theo dõi, báo cáo và xử lý bệnh.

15

- Ngăn cản sự phát tán mầm bệnh bằng các phương pháp tiệt trùng,

tiêu đốt, thực hiện vệ sinh phòng thí nghiệm.

- Sử dụng vắc xin và các thuốc cần thiết để phòng trừ.

- Những người có nguy cơ mắc bệnh do làm việc trong phòng thí

nghiệm sinh học cần được khám bệnh 6 tháng/ lần nhằm phát hiện các

bệnh phổ biến như : bệnh phổi (lao, bụi phổi,...), bệnh viêm gan, viêm loét

da, bệnh nấm, viêm phế quản nạm tính, hen phế quản....; Các chỉ tiêu xét

nghiệm cơ bản như : xét nghiệm máu với các chỉ số HbASg, SGOT,

SGPT,...; xét nghiệm nước tiểu với các chỉ số Albumin, sắc tố mật, muối

mật; siêu âm gan; chụp X quang phổi; tìm Bk trong đờm; phản ứng

Mantoux; tốc độ máu lắng,....

Hiện nay những nghiên cứu về bệnh nghề nghiệp trong dạy học còn

chưa nhiều, tuy vậy trong mỗi điều kiện cụ thể, chúng ta cần tìm ra các

phương pháp phòng trừ nhằm ngăn cản bệnh. Ví dụ như xây dựng tiêu

chuẩn về bàn và ghế trong phòng học phù hợp :

- Chiều cao ghế ngồi phải đảm bảo cho 2 bàn chân chạm đất, 2 ống

chân vuông góp với mặt đất. 2 đùi vuông góc với ống chân. Như vậy,

chiều cao ghế phải xấp xỉ với ống chân.

- Chiều rộng của mặt ghế không quá rộng hoặc quá hẹp, bằng 2/3 đến

¾ chiều dài đùi.

- Chiều cao của bàn thích hợp cho người ngồi viết được xác định là

bằng chiều cao ghế đến khuỷu tay khi ta ngồi ngay ngắn trên ghế, cánh tay

áp sát nách, ngón tay cái nằm theo trục dọc với cẳng tay, đầu ngón đặt vào

đuôi mắt cùng bên.

- Chiều rộng của bàn tối thiểu bằng chiều dài của tay.

Để ngăn ngừa bệnh về mắt cần phải tuân thủ:

- Phòng học có đủ ánh sáng, bảng không lóa.

- Khi đọc sách cần ngồi thẳng, khoảng cách thích hợp giữa mắt và

sách là khoảng 30-35 cm.

- Giữ mắt sạch sẽ, có thể vệ sinh mắt bằng các dung dịch chuyên

dụng.

16

- Cung cấp đủ vitamin cho cơ thể, nhất là vitamin A để tránh bệnh

quáng gà và bệnh khô mắt.

- Khám mắt định kì để khi cần thiết sử dụng kính đeo mắt phù hợp.

4. Khái niệm về an toàn sinh học

An toàn sinh học (Biosafety) là việc thực hiện các chính sách, cơ chế

quản lí về quy trình làm việc, thiết kế tiện nghi,… quy định sử dụng

những trang thiết bị an toàn để ngăn ngừa sự lan truyền các tác nhân sinh

học gây hại tới những người làm việc và học tập trong phòng thí nghiệm

sinh học, những người xung quanh và môi trường. An toàn sinh học bao

gồm :

- Các biện pháp quản lí an toàn trong các hoạt động nghiên cứu khoa

học, phát triển công nghệ và khảo nghiệm; sản xuất, kinh doanh và sử

dụng; nhập khẩu, xuất khẩu, lưu giữ và vận chuyển các sinh vật biến đổi

gen; sản phẩm, hàng hóa có nguồn gốc từ sinh vật biến đổi gen.

Hình 1. Kí hiệu cảnh báo nguy hiểm sinh học

- An toàn sinh học còn bao gồm các giải pháp thiết kế phòng thí

nghiệm, phòng học an toàn khi làm việc và tiếp xúc với sinh vật; quy định

việc cung cấp các thiết bị an toàn sinh học.

- Ngày nay an toàn sinh học còn bao gồm cả phạm trù an ninh sinh

học phòng thí nghiệm.

Tính cấp thiết của an toàn sinh học

Các phòng thí nghiệm sinh học, đặc biệt là phòng thí nghiệm vi sinh

vật học là môi trường đặc biệt luôn tiềm ẩn nguy cơ lây nhiễm bệnh cho

con người làm việc và học tập trong phòng thí nghiệm và cộng đồng dân

cư xung quanh. Trong những năm gần đây có nhiều trường hợp lây truyền

17

dịch bệnh từ phòng thí nghiệm sinh học và y sinh, như dịch bệnh thương

hàn, bệnh tả, bệnh uốn ván,... ở người, bệnh lở mồm long móng ở trâu bò .

Nguyên nhân của việc lan truyền bệnh có thể là do việc dùng thiết bị

thí nghiệm không phù hợp (như dùng mồm để hút pitet hoặc sử dụng kim

tiêm không đúng cách gây lan truyền bệnh AIDS,...), hoặc do thiết bị thí

nghiệm không đủ tiêu chuẩn, không đảm bảo tiêu chuẩn an toàn sinh học.

Công nghệ sinh học ngày càng phát triển có khả năng tạo ra nhiều

sinh vật biến đổi gen. Do vậy, nghiên cứu và sử dụng các sinh vật biến đổi

gen một cách an toàn cho con người, môi trường và đa dạng sinh học là hết

sức cần thiết.

5. Kỹ thuật phòng thí nghiệm và thiết bị an toàn

Mỗi phòng thí nghiệm cần được xây dựng đáp ứng các tiêu chuẩn về

an toàn sinh học. Nguyên tắc phòng ngừa cần được thể hiện trong những

công việc hằng ngày, trong các nội quy phòng thí nghiệm. Khi thực hành

trong phòng thí nghiệm không có khả năng kiểm soát triệt để các tác nhân

sinh học nguy hại, thì phải tìm các biện pháp bổ sung cần thiết khác, nhằm

hạn chế rủi ro của các tác nhân gây hại.

Thiết bị an toàn ngoài tủ cấy an toàn sinh học (BSC), dụng cụ an toàn

đựng các mẫu vật, vật dụng bảo vệ cá nhân (như đã đề cập trong bài 1),

còn có nhiều thiết bị khác, ví dụ như :

- Các thiết bị cách li bao film mềm áp suất âm, là thiết bị bảo vệ ban

đầu để ngăn chặn các vật liệu sinh học độc hại. Khí đi vào bên trong thiết

bị cách li này qua một bộ lọc HEPA và khí đi ra ngoài qua 2 bộ lọc HEPA,

vì vậy ngăn cản được sinh vật gây hại phát tán ra bên ngoài.

- Các thiết bị hỗ trợ dùng pipet góp phần hút dung dịch an toàn.

- Các thiết bị nghiền đồng thể, máy lắc, máy trộn và thiết bị dùng sóng

siêu âm được thiết kế trong các BSC hay được phủ kín trong quá trình sử

dụng, góp phần ngăn cản quá trình gây ra các sol khí độc hại.

- Que cấy đầu tròn dùng một lần, không cần khử trùng, dùng được

trong BSC và sử lí như rác thải nhiễm bẩn khi sau khi dùng.

18

- Que cấy vi sinh vật khử trùng bằng nhiệt có vỏ bọc bằng thủy tinh

Brosilicat hay sứ giúp khử trùng tiện lợi và hiệu quả.

- Các biện pháp bảo vệ thiết bị như bảo vệ ống tiêm, làm sạch các

thiết bị đựng mẫu vật; các biện pháp bảo quản mẫu máu, dịch cơ thể, mô

và các chất bài tiết. Các biện pháp phổ biến như:

+ Biện pháp thu thập, dán nhãn và vận chuyển mẫu vật. Các mẫu vật

nên được đặt trong dụng cụ đúng quy cách, ghi nhãn và quy định sử dụng

rõ ràng.

+ Cách mở ống đựng mẫu hoặc vật đựng lấy mẫu đứng quy cách, tốt

nhất nên mở trong BSC, cần đi găng tay, mặc tạp dề. Nút đậy dụng cụ cần

có miếng lót giấy hoặc gạc để tránh chất lỏng bắn ra.

+ Với các thiết bị thủy tinh cần cẩn thận tránh đổ vỡ, nếu có thể nên

thay bằng dụng cụ chất dẻo an toàn hơn.

+ Sử dụng các thiết bị tự động khi cần thiết nhằm tránh gây tràn dung

dịch hay gây sol khí. Các chất bị vung vãi cần được thu thập, đựng trong

dụng cụ có nắp, sau đó đem hấp áp lực hoặc xử lí như xử lí rác ô nhiễm.

+ Sử dụng các chất sát khuẩn cấp độ cao để làm sạch các dụng cụ thí

nghiệm. Ví dụ, các dụng dịch hyproclorit có lượng clo 1g/lL và 5g/l được

sử dụng làm sạch các thiết bị đựng máu, glutaraldehyt có thể sử dụng làm

sạch bề mặt dụng cụ.

6. Vi sinh vật và an toàn sinh học

Vi sinh vật nhỏ bé, trong đó đặc biệt là virut thường có tốc độ sinh

trưởng nhanh, khả năng hấp thu và chuyển hóa vật chất cao, thích ứng

nhanh với điều kiện môi trường và dễ phát sinh đột biến.

Nhiều vi sinh vật là tác nhân gây bệnh truyền nhiễm, chúng xâm nhập

vào cơ thể chủ yếu thông qua các con đường hô hấp (như bệnh lao, bạch

cầu, cúm), tiêu hóa (như các bệnh thương hàn, tả, lỵ,....), tiếp xúc qua da

hoặc niêm mạc (như bệnh giang mai, lậu, HIV,...). Nhìn chung, bệnh do vi

sinh vật lan truyền rất nhanh, khi xâm nhập vào cơ thể chúng gây rối loại

các quá trình trao đổi chất, phá hủy chức năng của tế bào, khi phát bệnh có

thể gây tử vong.

19

Vi sinh vật gây bệnh tùy theo đặc điểm sinh học và vị trí phân loại

được chia ra thành nhiều nhóm như nhóm vi khuẩn, virus, vi nấm. Ngoài

ra, tùy theo mức độ gây hại, vi sinh vật được phân chia theo nhóm rủi ro,

và cũng tùy cấp độ rủi ro mà yêu cầu xây dựng phòng thí nghiệm theo cấp

độ an toàn phù hợp:

- Vi sinh vật thuộc nhóm rủi ro 1 gồm các vi sinh vật gây rủi ro thấp,

không chắc gây bệnh cho người hoặc động vật khỏe mạnh. Ví dụ, các vi

khuẩn Escherichia coli, nấm men, nấm mốc sử dụng làm vật liệu nghiên

cứu trong phòng thí nghiệm.

- Vi sinh vật thuộc nhóm rủi ro 2 gồm các vi sinh vật gây rủi ro trung

bình cho người làm việc và học tập trong phòng thí nghiệm. Các vi sinh

vật thuộc nhóm rủi ro 2 ít khi gây nguy hiểm cho người khỏe mạnh, ít khi

gây bùng phát lây nhiễm nghiêm trọng khi đã có biện pháp phòng ngừa. Ví

dụ như vi khuẩn thương hàn (Salmonella enterica), virus gây viên gan A,

virus gây viêm gan B, virus cúm thường, virus sởi, virus quai bị,....

- Vi sinh vật thuộc nhóm rủi ro 3 gồm các vi sinh vật gây rủi ro cao

cho con người và động vật. Tuy nhiên bệnh không lan truyền từ người này

sang người khác hoặc có thể có thuốc điều trị. Ví dụ như vi khuẩn gây

bệnh than (Bacillus anthracis), vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis),

các vi rút sốt vàng, vius HIV,...

- Vi sinh vật thuộc nhóm rủi ro 4 gồm vi sinh vật gây rủi ro cao cho

con người và động vật. Các vi sinh vật gây bệnh truyền nhiễm nghiêm

trọng, bệnh có khả năng lây truyền từ người này sang người khác hoặc

không có khả năng chữa trị. Ví dụ như virus Lassa, virus Ebola, virus cum

A ở gia cầm. Theo quy định quốc tế, các vi sinh vật thuộc nhóm rủi ro 4

không được phép nghiên cứu tại phòng thí nghiệm của các trường đại học.

7. Công nghệ ADN và an toàn sinh học

- Công nghệ ADN (hay còn gọi là công nghệ gen, công nghệ sinh học

phân tử, kĩ thuật gen,...) là các kĩ thuật di truyền tạo nên các phân tử ADN

tái tổ hợp, nhằm tạo nên các gen mới mang thông tin di truyền mã hóa các

đặc điểm tốt mong muốn ở các tế bào hoặc cơ thể sống.

20

Những thành công của công nghệ ADN trong những năm gần đây là

tạo ra nhiều sinh vật biến đổi gen mang nhiều đặc điểm sinh học ưu thế. Ví

dụ như cà chua biến đổi gen không có hạt, thuốc lá và ngô năng suất cao,

lúa và ngô mang gen chịu được thuốc diệt cỏ,...; một số động vật biến đổi

gen như cừu, lợn, bò, dê,.... mang nhiều đặc điểm có lợi giúp con người

thu được các sản phẩm điều trị bệnh máu khó đông, điều trị vết thương,

chống nhiễm trùng, điều trị bệnh tắc nghẽn mạch máu,.... Sinh vật biến đổi

gen có nhiều ưu điểm rõ rệt nhằm tăng năng suất nông nghiệp và góp phần

xóa đói giảm nghèo trên toàn cầu.

Tuy nhiên, bên cạnh các lợi ích, sinh vật biến đổi gen có thể tiềm ẩn

một số rủi ro có hại cho sức khỏe con người và môi trường, nên an toàn

sinh học của sinh vật biến đổi gen đang được tranh luận ở nhiều quốc gia,

nhiều tổ chức trên thế giới. Việc sử dụng sinh vật biến đổi gen cần được

nghiên cứu kĩ lưỡng, chỉ sử dụng khi biết chắc an toàn và cần được cảnh

báo để người sử dụng cẩn thận hơn.

Một số rủi ro cần theo dõi đối với sinh vật biến đổi gen là:

- Khả năng sinh vật biến đổi gen và sản phẩm của chúng chứa các

protein mới, có thể gây độc hoặc dị ứng cho con người, ảnh hưởng tới sức

khỏe.

- Các sinh vật biến đổi gen thường chứa gen kháng chất kháng

sinh nên khi sử dụng có thể làm cho vi sinh vật kháng lại nhiều loại kháng

sinh, làm giảm khả năng ngăn cản một số bệnh ở người và sinh vật.

- Các sinh vật biến đổi gen có thể cạnh tranh và chiếm ưu thế đối

với nhiều loài trong tự nhiên, gây tác động xấu về mặt sinh thái học.

8. Quản lý an toàn sinh học ở Việt Nam

Hiện nay, nghiên cứu về công nghệ gen đang được quan tâm thực

hiện tại nhiều phòng thí nghiệm sinh học tại các viện nghiên cứu, các

trường đại học, đáp ứng yêu cầu cấp bách của phát triển công nghệ sinh

học phục vụ đời sống và khoa học.

Nhận thức được tầm quan trọng của an toàn sinh học trong đời sống,

Nhà nước ta đã rất quan tâm tới vấn đề an toàn sinh học. Ngay từ khi trở 21

thành thành viên tham gia Công ước Đa dạng sinh học và Nghị định thư

Cartagena, Chính phủ Việt Nam đã ban hành nhiều quyết định, quy chế,

chỉ thị,.... và hướng dẫn về an toàn sinh học. Ví dụ,

- Năm 1993, ban hành Pháp lệnh Bảo vệ và Kiểm dịch thực vật.

- Năm 1993, ban hành Pháp lệnh Thú y.

- Năm 1996, ban hành Nghị định về Quản lí giống cây trồng vật

nuôi.

- Năm 2004, nhà nước Việt Nam chính thức tham gia Nghị định

thư Cartagena về an toàn sinh học.

- Năm 2005, Chính phủ Việt Nam ban hành Quy chế Quản lý an

toàn sinh học đối với sinh vật biến đổi gen; sản phẩm, hàng hóa có nguồn

gốc từ sinh vật biến đổi gen.

- Năm 2008, Nhà nước Việt Nam đã ban hành luật Đa dạng sinh

học.

Chương 4 và các điều từ 57 tới điều 69 của luật Đa dạng sinh học của

Việt Nam đã đề cập tới các vấn đề về báo cáo đánh giá rủi ro về sinh vật

biến đổi gen; thẩm định báo cáo đánh giá rủi ro về sinh vật biến đổi gen;

quy định cấp giấy chứng nhận mức an toàn sinh học; quy định cung cấp

thông tin về an toàn sinh học của hàng hóa có chứa sinh vật biến đổi gen;

cung cấp, công khai thông tin về sinh vật biến đổi gen; nghiên cứu tạo ra

sinh vật biến đổi gen; khảo nghiệm sinh vật biến đổi gen; nhập khẩu, quá

cảnh sinh vật biến đổi gen; chế biến sản phẩm từ sinh vật biến đổi gen; tiếp

thị, quảng cáo, mua, bán, cho, tặng sinh vật biến đổi gen; vận chuyển, lưu

giữ, thải bỏ sinh vật biến đổi gen; và giải phóng sinh vật biến đổi gen ra

môi trường,

V. AN TOÀN TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM SINH HỌC

1.An toàn khi tiếp xúc với sinh vật trong phòng thí nghiệm

Khi làm việc trong phòng thí nghiệm sinh học có thể bị lây nhiễm

bệnh do tiếp xúc với sinh vật. Con đường lây truyền có thể qua da, qua

không khí hoặc do ăn uống của các tác nhân mới chưa được xác định an

toàn. 22

Tác nhân gây bệnh có thể là từ các mô, máu của sinh vật nghiên cứu;

từ đờm dãi của người bệnh; từ virus phát tán trong không khí,...

Gặp những trường hợp như vậy thì cần xác định rõ con đường lây

truyền, nguyên nhân và mức độ lây nhiễm. Bệnh có khả năng mắc phải

càng cao thì càng cần phải đánh giá nhanh chóng và thân trọng.

2. An toàn khi tiếp xúc với hoá chất trong các thí nghiệm sinh học

Giống như với an toàn sinh học, an toàn khi tiếp xúc với hóa chất đặt

nguyên tắc cơ bản là phòng ngừa lên trên hết. Bốn nguyên tắc cơ bản của

hoạt động kiểm soát hóa chất là :

- Quy định thay thế: Loại bỏ các chất hoặc các quá trình độc hại,

nguy hiểm hoặc thay thế chúng bằng thứ khác ít nguy hiểm hơn hoặc

không còn nguy hiểm nữa. Khi tiến hành các thí nghiệm trong quá trình

dạy học cố gắng lựa chọn các chất ít độc hại , ít gây nguy hiểm ví dụ thí

nghiệm brom tác dụng với nhôm có thể thay thế bằng thí nghiệm ít độc

hơn như iot tác dụng với nhôm. Hoặc loại bỏ các chất gây nguy hiểm thí

dụ thí nghiệm với thuỷ ngân hoặc asen.

- Quy định khoảng cách: hoặc che chắn giữa người lao động và

hóa chất nhằm ngăn cách mọi nguy cơ liên quan tới hóa chất đối với người

lao động. Trong dạy học các thí nghiệm độc hại hoặc dễ nổ gây nguy hiểm

phải được tiến hành trong tủ hốt hoặc có tấm kính mica che phía HS,

khoảng cách tiến hành các thí nghiệm không quá gần với HS.

- Quy định thông gió: sử dụng hệ thống thông gió thích hợp để di chuyển

hoặc làm giảm nồng độ độc hại trong không khí chẳng hạn như khói, khí,

bụi, mù. Phòng thí nghiệm, phòng kho hoá chất…cần phải thoáng, có hệ

thông hút gió, có nhiều cửa ra vào.

- Quy định về trang bị phương tiện bảo vệ cá nhân: cho người lao

động ( HS) nhằm ngăn ngừa việc hoá chất dây vào người như : áo blu,

kính bảo vệ mắt, găng tay, khẩu trang, ủng …

Tùy theo việc sử dụng từng hóa chất mà có các quy định cụ thể. Ví

dụ:

- Hóa chất dễ cháy nổ :

23

Trong phòng thí nghiệm có hóa chất dễ cháy nổ phải quy định chặt

chẽ chế độ dùng lửa, khu vực dùng lửa, có bảng chỉ dẫn bằng chữ và ký

hiệu cấm lửa để ở nơi dễ nhận thấy. Khi cần thiết phải sửa chữa cơ khí,

hàn điện hay hàn hơi phải có biện pháp làm việc an toàn. Tất cả các dụng

cụ điện và thiết bị điện đều phải là loại phòng chống cháy nổ. Việc dùng

điện chạy máy và điện thắp sáng ở những nơi có hóa chất dễ cháy nổ phải

đảm bảo các yêu cầu sau:

+ Không được đặt dây cáp điện trong cùng một đường rãnh có ống

dẫn khí hoặc hơi chất lỏng dễ cháy nổ, không được lợi dụng đường ống

này làm vật nối đất .

+ Khi sửa chữa, thay thế các thiết bị điện thuộc nhánh nào thì phải cắt

điện vào nhánh đó.

+ Thiết bị điện nếu không được bọc kín, an toàn về cháy nổ thì không

được đặt ở nơi có hóa chất dễ cháy nổ.

+ Cầu dao, cầu chì, ổ cắm điện phải đặt ngoài khu vực dễ cháy nổ. Bất

kỳ nhánh dây điện nào cũng phải có cầu chì hay thiết bị bảo vệ tương

đương.

Tất cả các chi tiết máy động hoặc dụng cụ làm việc đều phải làm bằng

vật liệu không được phát sinh tia lửa do ma sát hay va đập. Tất cả các trang

bị bằng kim loại đều phải tiếp đất., các bộ phận hay thiết bị cách điện đều

phải có cầu nối tiếp dẫn. Trước khi đưa vào đường ống hay thiết bị một

chất có khả năng gây cháy nổ, hoặc trước và sau khi sửa chữa đều phải

thực hiện nghiêm ngặt các quy định phòng chống cháy nổ.

Không dùng thiết bị, thùng chứa, chai, lọ hoặc đường ống bằng nhựa

không chịu được nhiệt chứa hóa chất dễ cháy nổ. Không để các hóa chất dễ

cháy nổ cùng chỗ với các hóa chất duy trì sự cháy. Khi đun nóng các chất

lỏng dễ cháy không dùng ngọn lửa trực tiếp, mức chất lỏng trong nồi phải

cao hơn mức hơi đốt bên ngoài.

Trong quá trình sản xuất, sử dụng hóa chất dễ cháy nổ phải bảo đảm

yêu cầu vệ sinh an toàn lao động. Phải có ống dẫn nước, hệ thống thoát

nước, tránh sự ứ đọng các loại hóa chất dễ cháy nổ...

24

- Hóa chất ăn mòn

Các thiết bị, đường ống chứa hóa chất dễ ăn mòn phải được làm bằng

vật liệu thích hợp, phải đảm bảo kín. Tại nơi làm việc có hóa chất ăn mòn

phải có vòi nước, bể chứa dung dịch natri bicacbonat (NaHCO3) nồng độ

0,3%, dung dịch axit axetic nồng độ 0,3% hoặc các chất khác có tác dụng

cấp cứu kịp thời tại chỗ khi xảy ra tai nạn. Tất cả các chất thải đều phải

được xử lý không còn tác dụng ăn mòn trước khi đưa ra ngoài v.v...

- Hóa chất độc

Khi tiếp xúc với hóa chất độc, phải có mặt nạ phòng độc tuân theo

những quy định sau: Phải chứa chất khử độc tương xứng; Chỉ được dùng

loại mặt nạ lọc khí độc khi nồng độ hơi khí không vượt quá 2% và nồng độ

ôxy không dưới 15%; Đối với cacbua oxit (CO) và những hỗn hợp có nồng

độ CO cao phải dùng loại mặt nạ lọc khí đặc biệt.

Tiếp xúc bụi độc phải mặc quần áo kín may bằng vải bông dày có

khẩu trang chống bụi, quần áo bảo vệ chống hơi, bụi chất lỏng độc cần

phải che kín cổ tay, chân, ngực. Khi làm việc với dung môi hữu cơ hòa tan

thì phải mang quần áo bảo vệ không thấm và mặt nạ cách ly.

Cấm hút dung dịch hóa chất độc bằng miệng. Không được cầm nắm

trực tiếp hóa chất độc. Các thiết bị chứa hóa chất độc dễ bay hơi, phải thật

kín và nếu không do quy trình sản xuất bắt buộc thì không được đặt cùng

chỗ với bộ phận khác không có hóa chất độc v.v..

3. Phòng chống cháy nổ

Phòng chống cháy nổ là yêu cầu của tất cả các phòng thí nghiệm.

Phòng thí nghiệm sinh học cần đáp ứng các điều kiện cụ thể sau :

- Có hệ thống báo động cháy, nổ và có thể tiếp cận hệ thống đó dễ dàng.

- Có cửa thoát hiểm được thiết kế đúng yêu cầu, có dấu báo hiệu đường

dẫn đến cửa thoát hiểm.

- Có hệ thống tự động báo cháy và hệ thống đó được kiểm tra khả năng

hoạt động thường xuyên.

- Có sẵn các thiết bị chống cháy nổ tại chỗ và các thiết bị đó được kiểm

tra thường xuyên và có thể tiếp cận dễ dàng.25

- Đồ đạc được sắp xếp gọn gàng, không cản trở lối thoát hiểm và chặn

đường tiếp cận các thiết bị chữa cháy.

- Các hóa chất và thiết bị dễ cháy cần để nơi an toàn, riêng ở một nơi và

xa nơi có thể phát nổ như nguồn điện, lửa,... Hóa chất cần được dán

nhãn cảnh báo đầy đủ. Phòng thí nghiệm có hóa chất dễ phát nổ cần

thoáng khí và không quá chật chội.

- Những bình khí nén và khí hóa lỏng được đánh dấu rõ ràng, các van

giảm áp được kiểm tra thường xuyên đảm bảo độ kín tuyệt đối. Các

bình đựng khí hóa lỏng được đặt cách xa nguồn điện, lửa,...

- Tất cả các thiết bị điện được bảo dưỡng thường xuyên, hệ thống điện

ba pha cần có dây tiếp đất. Các thiết bị ngắt điện luôn trong trạng thái

hoạt động tốt, đảm bảo ngắt điện ngay khi cần thiết. Mỗi ổ cắm chỉ nên

sử dụng cho một thiết bị điện, không nên dùng thiết bị nối.

Giáo viên và học sinh làm việc trong phòng thí nghiệm được thông

báo nguy cơ cháy nổ, và được thực tập phương án phản ứng đúng khi cháy

nổ xảy ra.

QUY TẮC LÀM VIỆC TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH

I. An toàn khi làm việc với axit và kiềm

1. An toàn khi làm việc với axit:

- Phải làm việc trong tủ hút bất cứ khi nào đun nóng axit hoặc

thực hiện phản ứng với các hơi axit tự do.

- Khi pha loãng, luôn phải cho axit vào nước trừ phi được dùng

trực tiếp.

- Giữ để axit không bắn vào da hoặc mắt bằng cách đeo khẩu

trang, găng tay và kính bảo vệ mắt. Nếu làm văng lên da, lập tức rửa ngay

bằng một lượng nước lớn.

- Luôn phải đọc kỹ nhãn của chai đựng và tính chất của chúng.

- H2SO4 : Luôn cho axit vào nước khi pha loãng, sử dụng khẩu

trang và găng tay để tránh phòng khi văng axit.

- Các axit dạng hơi (HCl) thao tác trong tủ hút và mang găng tay,

kính bảo hộ. 26

2. An toàn khi làm việc với kiềm

- Kiềm có thể làm cháy da, mắt gây hại nghiêm trọng cho hệ hô

hấp.

- Mang găng tay cao su, khẩu trang khi làm việc với dung dịch

kiềm đậm đặc.

- Thao tác trong tủ hút, mang mặt nạ chống độc để phòng ngừa

bụi và hơi kiềm.

- Amoniac: là một chất lỏng và khí rất ăn da, mang găng tay cao

su, khẩu trang, thiết bị bảo vệ hệ thống hô hấp. Hơi amoniac dễ cháy, phản

ứng mạnh với chất oxy hoá, halogen, axit mạnh.

- Amoni hydroxyt: chất lỏng ăn da, tạo hỗn hợp nỏ với nhiều kim

loại nặng: Ag, Pb, Zn ... và muối của chúng.

- Kim loại Na, K, Li, Ca: phản ứng cực mạnh với nước, ẩm, CO2,

halogen, axit mạnh, dẫn xuất clo của hydrocacbon. Tạo hơi ăn mòn khi

cháy. Cần mang dụng cụ bảo vệ da mắt. Chỉ sử dụng cồn khô khi tạo dung

dịch natri alcoholate, cho vào từ từ.

- Tránh tạo tinh thể cứng khi hoà tan. Tương tự khi hoà tan với

nước, đồng thời phải làm lạnh nhanh.

- Oxit canxi rất ăn da, phản ứng cực mạnh với nước, cần bảo vệ

da mắt, đường hô hấp do dễ nhiểm bụi oxit.

- Natri và kali hydroxyt: rất ăn da, phản ứng cực mạnh với nước.

Các biện pháp an toàn như trên, cho từng viên hoặc ít bột vào nước chứ

không được làm ngược lại.

II. Quy tắc làm việc với hóa chất thí nghiệm

1. Hoá chất thí nghiệm

Các hoá chất dùng để phân tích, làm tiêu bản, tiến hành phản ứng, ...

trong phòng thí nghiệm được gọi là hóa chất thí nghiệm. Hoá chất có thể ở

dạng rắn (Na, MgO, NaOH, KCl, (CH COO) ...; lỏng (H2SO4, aceton,

ethanon, chloroform, ...) hoặc khí (Cl2 , NH3 , N2 , C2H2 ...) và mức độ tinh

khiết khác nhau:

- Sạch kỹ thuật (P): độ sạch > 90%

27

- Sạch phân tích (PA): độ sạch < 99%

- Sạch hóa học (PC): độ sạch > 99%

Hóa chất có độ tinh khiết khác nhau được sử dụng phù hợp theo

những yêu cầu khác nhau và chỉ nên sử dụng hóa chất còn nhãn hiệu.

2. Nhãn hiệu hoá chất:

Hóa chất được bảo quản trong chai lọ thủy tinh hoặc nhựa đóng kín có

nhãn ghi tên hoá chất, công thức hóa học, mức độ sạch, tạp chất, khối

lượng tịnh, khối lượng phân tử, nơi sản xuất, điều kiện bảo quản.

3. Cách sử dụng và bảo quản hoá chất:

Khi làm việc với hóa chất, nhân viên phòng thí nghiệm cũng như sinh

viên cần hết sức cẩn thận, tránh gây những tai nạn đáng tiếc cho mình và

cho mọi người. Những điều cần nhớ khi sử dụng và bảo quản hóa chất

được tóm tắt như sau:

- Hóa chất phải được sắp xếp trong kho hay tủ theo từng loại (hữu

ơ, vô cơ, muối, acid, bazơ, kim loại, ...) hay theo một thứ tự a, b, c để khi

cần dễ tìm.

- Tất cả các chai lọ đều phải có nhãn ghi, phải đọc kỹ nhãn hiệu

hóa chất trước khi dùng, dùng xong phải trả đúng vị trí ban đầu.

- Chai lọ hóa chất phải có nắp. Trước khi mở chai hóa chất phải

lau sạch nắp, cổ chai, tránh bụi bẩn lọt vào làm hỏng hóa chất đựng trong

chai.

- Các loại hóa chất dễ bị thay đổi ngoài ánh sáng cần phải được

giữ trong chai lọ màu vàng hoặc nâu và bảo quản vào chổ tối.

- Dụng cụ dùng để lấy hóa chất phải thật sạch và dùng xong phải

rửa ngay, không dùng lẫn nắp đậy và dụng cụ lấy hóa chất.

- Khi làm việc với chất dễ nổ, dễ cháy không được để gần nơi dễ

bắt lửa. Khi cần sử dụng các hóa chất dễ bốc hơi, có mùi,... phải đưa vào tủ

hút, chú ý đậy kín nắp sau khi lấy hóa chất xong.

- Không hút bằng pipette khi chỉ còn ít hóa chất trong lọ, không

ngửi hay nếm thử hóa chất.

28

- Khi làm việc với axit hay bazơ mạnh: Bao giờ cũng đổ axit hay

bazơ vào nước khi pha loãng (không được đổ nước vào acid hay base);

Không hút axit hay bazơ bằng miệng mà phải dùng các dụng cụ riêng như

ống bóp cao su. Trường hợp bị bỏng với axit hay bazơ rửa ngay với nước

lạnh rồi bôi lên vết bỏng NaHCO3 1% (trường hợp bỏng acid) hoặc

CH3COOH 1% (nếu bỏng base). Nếu bị bắn vào mắt, dội mạnh với nước

lạnh hoặc NaCl 1%.

Trường hợp bị hóa chất vào miệng hay dạ dày, nếu là axit phải súc

miệng và uống nước lạnh có MgO, nếu là bazơ phải súc miệng và uống

nước lạnh có CH 3COOH 1%.

Lưu ý các kí hiệu cảnh báo nguy hiểm:

Chất dễ bắt lửa (Xi) và độc (Xn)

Chất ăn

mòn (C)Chất gây nguy hiểm với môi trường (N)

29

YÊU CẦU VỀ KĨ NĂNG THỰC HÀNH SINH HỌC(Trích từ yêu cầu về kĩ năng thực hành của IBO năm 2010)

Phần thực hành tập trung vào việc đánh giá năng lực giải quyết các

vấn đề sinh học của các học sinh. Để có được năng lực này các học sinh

cần được trang bị các kĩ năng sau:

I. Các kĩ năng khoa học (science process skills)

1. Quan sát (Observation).

2. Đo đạc (Measurement).

3. Phân loại hay phân nhóm (Grouping or classification).

4. Tìm kiếm mối quan hệ (Relationship finding).

5. Tính toán (Calculation).

6. Xử lí và trình bày các số liệu bao gồm vẽ đồ thị, lập các bảng

biểu, biểu đồ cột, sơ đồ, ảnh chụp.

7. Đưa ra các tiên đoán (Prediction/projection).

8. Hình thành giả thuyết khoa học (Hypothesis formulation).

9. Xây dựng khái niệm (Operational definition: scope, condition,

assumption).

10. Xác định các biến và đối chứng (Variable identification and

control).

11. Thực hiện thí nghiệm: thiết kế thí nghiệm, làm thực nghiệm, thu

thập số liệu và kết quả thí nghiệm, giải thích kết quả thí nghiệm và rút ra

các kết luận.

12. Biểu diễn kết quả thí nghiệm dưới dạng đồ thị ở mức chính xác

phù hợp (số thập phân).

II. Các kĩ năng sinh học cơ bản (Basic biological skills)

1. Quan sát các đối tương sinh học bằng kính lúp.

2. Biết sử dụng kính hiển vi (vật kính tối đa 45 X).

3. Biết sử dụng kính hiển vi soi nổi (stereo microscope).

4. Biết vẽ các ảnh quan sát được trên tiêu bản hiển vi (vẽ hình ảnh

từ kính hiển vi).

30

5. Biết mô tả chính xác các hình vẽ sinh học bằng cách sử dụng

bảng các thuật ngữ sinh học được đánh dấu bằng các mã số.

III. Các phương pháp sinh học (Biological methods)

A. Các phương pháp tế bào học (Cytological methods)

1. Các kĩ thuật ngâm và ép tiêu bản

2. Phương pháp làm tiêu bản vết bôi

3. Phương pháp nhuộm tế bào và tiêu bản hiển vi.

B. Các phương pháp nghiên cứu giải phẫu và sinh lý thực vật

1. Làm tiêu bản cắt ngang hoa và xác định công thức hoa.

2. Làm tiêu bản cắt ngang các bộ phận khác nhau của cây: rễ, thân,

lá và quả.

3. Dùng tay tách các phần của thân, rễ, lá.

4. Thuốc nhuộm (ví dụ thuốc nhuộm lignin) và nhuộm các tiêu bản

mô thực vật.

5. Đo các thông số cơ bản về quang hợp.

6. Đo các thông số cơ bản về hô hấp

C . Các phương pháp nghiên cứu giải phẫu và sinh lý động vật

1. Mổ các động vật không xương sống; Mổ các phần hoặc các cơ

quan của động vật có xương sống được nuôi cho tiêu dùng.

2. Làm tiêu bản cả con các động vật không xương sống loại nhỏ

(Whole - mount slide preparation of small invertebrates)

3. Đo các thông số cơ bản về hô hấp

D. Các phương pháp nghiên cứu tập tính học

    Nhận biết và giải thích các hành vi của động vật

E. Các phương pháp nghiên cứu môi trường và sinh thái học

1. Ước tính mật độ quần thể (Estimation of population density)

2. Ước tính sinh khối quần thể (Estimation of biomass )

3. Ước tính các thông số cơ bản của chất lượng nước (Elementary

estimation of water quality)

4. Ước tính các thông số cơ bản của chất lượng không khí

(Elementary estimation of air quality)

31

F . Các phương pháp phân loại (Taxonomic methods)

1. Sử dụng khoá lưỡng phân (Use of dichotomous keys )

2. Xây dựng khoá lưỡng phân đơn giản (Construction of simple

dichotomous keys)

3. Nhận biết được các họ thực vật có hoa phổ biến nhất

(Identification of the most common flowering-plant families)

4. Nhận biết được các bộ côn trùng (Identification of insect orders)

5. Nhận diện đến ngành và lớp các sinh vật khác (Identification of

phyla and classes of other organisms)

IV. Các phương pháp vật lý và hoá học (Physical and chemical

methods)

1. Các kĩ thuật tách chiết xuất: lọc và li tâm, sắc kí.

2. Các phép thử chuẩn nhận biết đường đơn, đường đa, lipit,

protein (Fehling, I2 in KI(aq), biuret )

3. Chuẩn độ (Titration)

4. Đo lường số lượng bằng phương pháp nhỏ giọt và dải

(Measuring quantities by drip and strip methods)

5. Các phương pháp pha loãng dung dịch.

6. Kỹ thuật sử dụng pipet, bao gồm cả sử dụng các micropipet.

7. Kính hiển vi, bao gồm cả sử dụng buồng đếm tế bào.

8. Đo mức độ hấp thụ ánh sáng.

9. Điện di trên gel (Gel electrophoresis )

V . Các phương pháp vi sinh vật (Microbiological Methods)

1. Chuẩn bị môi trường dinh dưỡng.

2. Các kĩ thuật vô trùng (vật liệu thủy tinh chịu nhiệt và chịu lửa)

3. Các kĩ thuật nuôi cấy vi sinh vật.

VI . Các phương pháp thống kê (Statistical methods)

1. Xác suất và phân bố xác suất

32

2. Biết cách tính và sử dụng các giá trị trung bình, trung vị, tỉ lệ %,

phương sai, độ lệch chuẩn, sai số chuẩn, T-test và phép thử Khi bình

phương.

VII . Sử dụng thiết bị (Handling equipment)

Do các đơn vị có thể có các thiết bị khác nhau nên các kĩ năng này chỉ

được đánh giá nếu các thí sinh đã được thông báo trước về thuật toán

(algorithm), cách sử dụng thiết bị, cách tiến hành thí nghiệm đặc biệt nào

đó ra sao vv...

33

Phần 2. 10 bài thí nghiệm thực hành môn Sinh học

Bài 1. Nhận biết một số thành phần hóa học của tế bào

I. MỤC TIÊU

1. Pha chế và sử dụng một số thuốc thử, hóa chất thông dụng trong

hóa sinh học: thuốc thử Lugol, Fehling.

2. Nhận biết protein, amino axit bằng một số thuốc thử đặc trưng

(ninhydrin, Biuret, HNO2), chứng minh một số tính chất của protein: phản

ứng màu với một số thuốc thử, kết tủa thuận nghịch và không thuận

nghịch.

3. Nhận biết tinh bột, saccharide, phân biệt đường no và đường không

no (đường còn và không còn tính khử).

4. Nhận biết lipid, chứng mình một số tính chất của triglyceride.

5. Rèn các kỹ năng thực hành:

- Kỹ năng thực hành thí nghiệm, đức tính kiên nhẫn, để đạt được

mục đích của mình.

- Kỹ năng quan sát, ghi chép kết quả thí nghiệm

- Kỹ năng thao tác thí nghiệm, bố trí thí nghiệm

- Kỹ năng phân tích kết quả thí nghiệm

- Kỹ năng báo cáo kết quả thực hành

II. CƠ SỞ KHOA HỌC

A. Nhận biết protein

Kết tủa protein bằng muối trung tính (kết tuả thuận nghịch)

+ (NH4)2SO4 là muối trung tính, vừa có tác dụng trung hòa điện (các

ion tác dụng tương hỗ với các nhóm tích điện trái dấu), vừa loại bỏ lớp vỏ

hydrat của phần tử keo protein, do đó làm kết tủa protein. Phản ứng kết tủa

này là kết tủa thuận nghịch, các protein khác nhau bị kết tủa ở các nồng độ

muối khác nhau.

+ So với albumin, globulin có độ tan kém hơn nên kết tủa trước, khi

hòa tan sẽ tan chậm hơn.

Kết tủa protein bằng axit hữu cơ (Kết tủa không thuận nghịch)

34

+ TCA (tricloacetic acid) là một muối hữu cơ có tác dụng làm biến

tính protein (thay đổi tính tan, hoạt tính sinh học, cấu trúc,...), khi đó

protein bị đông tụ lại thành dạng keo không hòa tan (kết tủa không thuận

nghịch). Các nhân tố khác cũng có thể gây biến tính protein như nhiệt độ

cao, axit vô cơ đặc, một số axit hữu cơ, kiềm đặc, muối kim loại nặng nồng

độ cao,...

+ Phản ứng này được sử dụng rộng rãi trong thực tế để phát hiện hoặc

loại bỏ protein khỏi dung dịch, phát hiện protein trong nước tiểu (độ nhạy

lên tới 0,0015%).

B. Nhận biết tinh bột, saccharid

Phản ứng màu của tinh bột với iod

+ Amilose trong tinh bột có khả năng tương tác tạo phức với tinh bột,

hình thành cấu trúc xoắn giữ các phân tử iod ở giữa (phức này có màu

xanh đặc trưng). Sự tương tác này dễ dàng bị phá vỡ khi đun nóng.

Phân biệt đường đơn (glucozơ) và đường đôi (sacarozơ )

+ Phản ứng với thuốc thử Fehling, Benedict hay tráng gương đều là

những phản ứng chứng minh glucose có tính khử, phân biệt glucose với

sucrose. Phản ứng Benedict và tráng gương có thể thực hiện dễ dàng, hóa

chất dễ chuẩn bị (chú ý tránh để AgNO3 dây ra tay). Thuốc thử Fehling

khó chuẩn bị (muối segnette). Khi thực hiện phản ứng tráng gương có thể

thực hiện thêm với sucrose.

Phản ứng với thuốc thử Fehling

+ Trong thuốc thử Fehling, muối tactrat có vai trò tạo phức với Cu2+

tạo ion phức [Cu(C4H4O6)2]2– (khiến Fehling có màu xanh lơ) nhằm ngăn

cản sự tạo thành kết tủa Cu(OH)2 trong thuốc thử.

+ Ống nghiệm I: khi tác dụng với glucose (HO–CH2–(CHOH)4–

CH=O, có chứa gốc andehyte) hoặc các chất chứa gốc andehyte, thuốc thử

này tạo kết tủa Cu2O đỏ. Phản ứng xảy ra khi đun nóng:

2Na2[Cu(C4H4O6)2] + NaOH + R–CHO + H2O

→ Cu2O + R–COONa + 2H2C4H4O6 + 2Na2C4H4O6

35

+ Ống nghiệm II: không tạo kết tủa vì sucrose (đường đôi) không có

tính khử nên không có phản ứng với Fehling.

Sucrose:

Phản ứng Benedict

+ Phản ứng xảy ra hoàn toàn tương tự như với thuốc thử Fehling.

+ Phản ứng này rất nhạy, chỉ cần sử dụng glucose 0,1% là đã tạo kết

tủa Cu2O đỏ gạch, tuy nhiên kết tủa lẫn với dung dịch màu xanh dương nên

dung dịch chuyển sang màu xanh đậm.

+ Nếu sử dụng glucose 1% thì lượng kết tủa sinh ra lớn, sẽ nhìn thấy

rõ kết tủa Cu2O (lẫn với màu xanh của dung dịch nên không thấy màu đỏ

gạch mà chuyển sang đỏ nâu, gần như đen).

Phản ứng tráng gương

+ Khi mới cho NH3 xảy ra phản ứng tạo và hòa tan kết tủa

AgNO3 + NH3 + H2O → AgOH↓ + NH4NO3

AgOH + 2NH3 → [Ag(NH3)2]OH

+ Khi cho glucose 5% vào và đun nóng:

HO – CH2 – (CHOH)4 – CH = O + 2[Ag(NH3)2]OH →

HO – CH2– (CHOH)4– COONH4 + 2Ag↓ + 3NH3↑ + H2O

C. Nhận biết lipid

Thí nghiệm về sự nhũ tương hóa

+ Bình thường mỡ không hòa tan trong nước.

+ Khi có chất tạo nhũ tương (axit mật, xà phòng,...), mỡ bị phân ra

thành các giọt nhỏ, gọi là hiện tượng nhũ tương hóa.

Thí nghiệm chứng minh mỡ chứa gốc glyceryl (trong triglycerid)

+ Khi đun nóng dầu với chất lấy nước, glyceryl tự do được giải

phóng, chất này mất nước tạo thành acrolein có mùi khét đặc biệt, dễ nhận

biết:

HO – CH2 – CHOH – CH2 – OH → CH2= CH–CH= O + H2O36

+ Khi cho giấy lọc tẩm AgNO3/NH3 vào miệng ống sẽ xảy ra phản

ứng tráng bạc:

CH2=CH–CH=O + 2AgNO3 + 3NH3 + H2O

→ CH2=CH–COONH4 + 2NH4NO3 + 2Ag↓

* Chú ý: Nếu thay dầu lạc bằng lipid không chứa glyceryl (như sáp)

thì sẽ không có phản ứng này.

Phản ứng xà phòng hóa

+ Dưới tác dụng của kiềm NaOH, triglycerid bị xà phòng hóa

+ Khi thêm CaCl2 vào sẽ tạo thành kết tủa canxi của muối hữu cơ.

Sự tạo thành axit béo tự do

+ Thêm H2SO4 vào dung dịch xà phòng, dung dịch trở nên đục do axit

béo được tạo thành.

2R – COONa + H2SO4 → 2R – COOH + Na2SO4

Khi đun nóng, axit béo nổi lên trên bề mặt dung dịch.

+ Khi thêm NaOH vào ống nghiệm chứa axit béo xảy ra phản ứng

trung hòa:

R – COOH + NaOH → R – COONa + H2O

+ Khi dư NaOH, dung dịch có môi trường bazơ làm phenol phtalein

không màu chuyển sang màu hồng.

+ Thêm dung dịch axit béo xảy ra phản ứng trung hòa NaOH dư làm

màu hồng nhạt dần, tiến tới không màu.

III. THIẾT BỊ – HÓA CHẤT- MẪU VẬT

1. Dụng cụ

+ Ống nghiệm, pipet, cốc đong, ống đong 50ml, bình nón 50ml, đũa

thủy tinh.

+ Giá đựng ống nghiệm, kẹp gỗ.

37

+ Bản sứ 6 giếng, cối chày sứ, chén thủy tinh, bình sắc ký.

+ Giấy lọc, giấy quỳ, giấy sắc ký, giấy thấm, bông.

+ Đèn cồn.

2. Thiết bị

+ Bếp điện, tủ ấm 370C, tủ lạnh, nồi cách thủy.

+ Máy đo pH, đồng hồ, cân hóa chất.

3. Nguyên liệu, hóa chất

+ Lòng trắng trứng, tinh bột, dầu lạc, mỡ động vật

+ Glucose, sucrose

+ Ethanol 96%, ether ethylic

+ Tricloacetic acid (CCl3–COOH), H2SO4 đặc

+ Tinh thể (NH4)2SO4, KI, I2, CuSO4.5H2O, muối Segnette (kali natri

tactrat,NaOOC–CHOH–CHOH–COOK.4H2O hay C4H4O6NaK.4H2O),

NaOH, KHSO4, CaCl2

+ Bột Na2CO3, natri citrat HOOC–CH2–C(OH)(COOH)–CH2–COONa

+ AgNO3/NH3, xà phòng

IV. TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM

1. Nhận biết protein

1.1.Kết tủa protein bằng muối trung tính (kết tuả thuận nghịch)

– Chuẩn bị:

+ Lòng trắng trứng pha loãng: Lấy lòng trắng của 01 quả trứng cho

vào 0,5 lít nước cất, cho thêm 3gram NaOH tinh khiết, khuấy đều.

+ Chuẩn bị dung dịch (NH4)2SO4 bão hòa: Cân 08 gram tinh thể

amoni sun-phát (NH4)2SO4, hòa tan từ từ trong 10ml nước cất cho tới khi

tinh thể không bị hòa tan. Lọc bằng giấy lọc.

+ Ống nghiệm, pipet, đũa thủy tinh, giấy lọc.

– Tiến hành:

+ Cho vào ống nghiệm: 10ml lòng trắng trứng pha loãng, 10ml dung

dịch (NH4)2SO4 bão hòa, lắc đều (có thể dùng đũa thủy tinh khuấy), thấy

xuất hiện kết tủa.

38

+ Để 5 phút, lọc thu riêng kết tủa ra 1 ống nghiệm, dịch thu được đưa

sang ống nghiệm khác (chú ý: trước khi lọc phải thấm ướt giấy lọc bằng

dung dịch (NH4)2SO4).

+ Cho vào dịch lọc 3g tinh thể (NH4)2SO4, thấy tiếp tục xuất hiện kết

tủa.

+ Lọc, thu lấy kết tủa vào 1 ống nghiệm khác.

+ Thêm vào mỗi ống nghiệm (chứa các kết tủa thu được) khoảng 3ml

nước cất, lắc đều, so sánh sự hòa tan kết tủa. (Chú ý: để khách quan, nên

lấy lượng kết tủa tương đối bằng nhau, do kết tủa globulin bao giờ cũng

nhiều hơn albumin).

1.2. Kết tủa protein bằng axit hữu cơ (Kết tủa không thuận nghịch)

– Chuẩn bị:

+ Dung dịch lòng trắng trứng 5%, tricloacetic acid (CCl3–COOH)

10%

+ Ống nghiệm, pipet

– Tiến hành:

+ Cho 1ml dung dịch lòng trắng trứng 5% vào ống nghiệm

+ Thêm 5–10 giọt dung dịch tricloacetic acid (TCA) 10%, lắc đều.

Quan sát hiện tượng.

– Kết quả: ?

– Giải thích:

2. Nhận biết tinh bột, saccharid

2.1. Phản ứng màu của tinh bột với iod

– Chuẩn bị:

+ Dung dịch tinh bột 5%: Hòa tan 0,5g tinh bột trong một ít nước cất,

thêm nước cất đang sôi vào, khuấy đều, tiếp tục đun đến sôi, để nguội, tiếp

tục thêm nước cất đến đủ 100ml.

+ Thuốc thử Lugol: Hòa tan 2,5g KI trong 20ml nước cất, thêm 1g

iod, lắc cho tan hết, thêm nước cất đến 100ml.

+ Ống nghiệm, pipet, đèn cồn.

– Tiến hành:

39

+ Lấy 2–3ml dung dịch tinh bột vào ống nghiệm.

+ Thêm vài giọt thuốc thử Lugol, quan sát màu.

+ Đun nóng ống nghiệm tới khi dung dịch vừa mất màu.

+ Làm lạnh ống nghiệm, quan sát hiện tượng.

+ Đun nóng ống nghiệm tới khi dung dịch mất màu thì đun tiếp

khoảng 30 giây.

+ Làm lạnh ống nghiệm trở lại, quan sát hiện tượng.

– Kết quả:?

– Giải thích:?

2.2.Phân biệt đường đơn (glucôse) và đường đôi (sucrôse)

2.2.1. Phản ứng với thuốc thử Fehling

– Chuẩn bị:

+ Dung dịch glucose 1%, sucrose 1%, NaOH, tinh thể CuSO4.5H2O,

muối segnette (kali natri tactrat, NaOOC–CHOH–CHOH–COOK.4H2O

hay C4H4O6NaK.4H2O).

+ Pha thuốc thử Fehling: Dung dịch Fehling A: hòa tan 0,4g

CuSO4.5H2O trong 10ml nước cất (nếu dung dịch đục thì cần lọc). Dung

dịch Fehling B: hòa tan 0,2g C4H4O6NaK.4H2O và 1,5g NaOH trong 10ml

nước cất. Thuốc thử Fehling (chỉ pha ngay trước khi sử dụng để hạn chế sự

tạo thành kết tủa Cu(OH)2): trộn 1 thể tích Fehling A và 1 thể tích Fehling

B, lắc đều, thu được dung dịch trong, xanh biếc.

+ Ống nghiệm, pipet, đèn cồn.

– Tiến hành:

+ Cho vào ống nghiệm A: 1ml glucose 1%, ống nghiệm B: 1ml

sucrose 1%

+ Thêm vào mỗi ống 1ml thuốc thử Fehling

+ Lắc đều các ống, đun đến khi bắt đầu sôi, quan sát hiện tượng.

– Kết quả:?

– Giải thích:?

40

2.2.2. Phản ứng Benedict

Phản ứng này rất đặc trưng và nhạy với đường khử hơn phản ứng với

thuốc thử Fehling.

– Chuẩn bị:

+ Dung dịch glucose 0,1%, CuSO4 17,3%, bột Na2CO3, bột natri citrat

HOOC–CH2–C(OH)(COOH)–CH2–COONa

+ Pha thuốc thử Benedict: hòa tan 17,3g natri citrat trong 70ml nước

cất đun sôi, thêm 10g Na2CO3 khan, làm lạnh, thêm từ từ 10ml dung dịch

CuSO4 17,3%, thêm nước đến đủ 100ml, dung dịch có màu xanh dương.

+ Ống nghiệm, pipet, nồi cách thủy 1000C

– Tiến hành:

+ Cho 5ml thuốc thử Benedict và 8 giọt dung dịch glucose 0,1% vào

ống nghiệm

+ Đặt ống nghiệm vào nồi cách thủy đang sôi trong 5 phút, quan sát

dung dịch.

– Kết quả:?

– Giải thích: ?

2.2.3.Phản ứng tráng gương

Chú ý: Khi tiến hành thí nghiệm cần cẩn thận, tránh để AgNO3 dây ra

tay.

– Chuẩn bị:

+ Dung dịch NH3, AgNO3, glucose 5%

+ Ống nghiệm, pipet, đèn cồn

– Tiến hành:

+ Cho vào ống nghiệm 1ml dung dịch AgNO3 5%

+ Thêm từng giọt NH3, tạo thành kết tủa

+ thêm NH3 đến khi kết tủa vừa tan

+ Thêm 3ml glucose 5% và đun, quan sát hiện tượng.

– Kết quả: ?

– Giải thích:?

41

3. Nhận biết lipid

3.1.Thí nghiệm về sự nhũ tương hóa

– Chuẩn bị:

+ Dầu lạc, dung dịch xà phòng loãng hoặc mật động vật

+ Ống nghiệm, pipet

– Tiến hành:

+ Lấy 2 ống nghiệm, cho vào mỗi ống 4ml nước cất

+ Thêm 3–5 giọt dầu lạc vào mỗi ống

+ Thêm 0,5ml dung dịch xà phòng loãng (hoặc vài giọt dịch mật) vào

ống B

+ Lắc đều cả 2 ống, quan sát hiện tượng.

– Kết quả: ?

– Giải thích:?

3.2.Thí nghiệm chứng minh mỡ chứa gốc glyceryl (trong triglycerid)

– Chuẩn bị:

+ Dầu lạc, tinh thể KHSO4, dung dịch AgNO3/NH3

+ Ống nghiệm, pipet, giấy lọc, ống nghiệm

– Tiến hành:

+ Cho vào ống nghiệm 2–3 giọt dầu lạc

+ Thêm một ít KHSO4 (khoảng 200mg)

+ Lắc đều, đun nóng mạnh tới khi có khói trắng thoát ra

+ Lấy giấy lọc tẩm AgNO3/NH3 hơ vào miệng ống nghiệm đang thoát

khói, quan sát hiện tượng.

– Kết quả:?

– Giải thích: ?

3.3.Phản ứng xà phòng hóa

– Chuẩn bị:

+ Dầu lạc, dung dịch NaOH 0,5M trong ethanol 50%, dung dịch

CaCl2 1%.

+ Ống nghiệm, pipet, bình nón 50ml, nồi cách thủy 1000C, bếp điện.

– Tiến hành:

42

+ Cho 0,5ml dầu lạc vào bình nón 50ml

+ Thêm 10ml dung dịch NaOH/C2H5OH

+ Khuấy đều và đun cách thủy 1 giờ, nếu chưa cạn thì lấy ra đun đến

khi cạn khô

+ Lấy sản phẩm ra, để nguội, thêm 20–30ml nước cất, lắc đều, quan

sát

+ Lấy 2–3ml dung dịch trên vào ống nghiệm, thêm 1ml CaCl2 1%, lắc

đều, quan sát hiện tượng.

– Kết quả: ?

– Giải thích: ?

3.4.Sự tạo thành axit béo tự do

– Chuẩn bị:

+ Dịch xà phòng trong bình nón 50ml còn thừa ở thí nghiệm trên,

H2SO4 đặc, ether ethylic, NaOH 0,01%.

+ Ống nghiệm, pipet, giấy quỳ, đèn cồn.

– Tiến hành:

+ Thêm vài giọt H2SO4 đặc vào dung dịch xà phòng trong bình nón

cho tới khi môi trường có pH axit (thử pH bằng giấy quỳ tím), quan sát

hiện tượng.

+ Đun hỗn hợp đến sôi, xuất hiện lớp chất lỏng nổi trên bề mặt.

+ Tách riêng lớp chất lỏng nổi đó, hòa tan trong 5ml ether ethylic.

+ Lấy 1ml dịch trên cho vào ống nghiệm, thêm vài giọt phenol

phtalein, thêm NaOH 0,01% tới khi dung dịch có màu hồng.

+ Thêm từ từ dung dịch hòa tan trong ether ở trên, quan sát sự đổi

màu dung dịch.

– Kết quả: ?

– Giải thích: ?

V. PHÂN TÍCH KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM VÀ VIẾT BÁO CÁO

1. Nhận biết protein

1.1.Kết tủa protein bằng muối trung tính (kết tuả thuận nghịch)

– Gợi ý phân tích kết quả:

43

+ Cả 2 lần thêm dung dịch (NH4)2SO4 bão hòa và tinh thể (NH4)2SO4

có thu được kết tủa hay không? Kết tủa ở lần nào nhiều hơn?

+ Khi lắc kết tủa với nước cất thì hiện tượng xảy ra là gì?

+ Kết tủa thu được ở lần nào tan dễ dàng hơn?

– Giải thích các kết quả thu được. Tại sao trước khi lọc phải thấm ướt

giấy lọc bằng dung dịch (NH4)2SO4?

– Kết luận rút ra là gì?

– Nếu trong thí nghiệm ta thay dung dịch (NH4)2SO4 bão hòa bằng

nước cất thì thu được kết quả thế nào? Ý nghĩa của thí nghiệm này là gì?

1.2.Kết tủa protein bằng axit hữu cơ

– Gợi ý phân tích kết quả: Xuất hiện kết tủa protein.

– Giải thích kết quả thu được.

– Kết luận rút ra là gì?

2. Nhận biết tinh bột, saccharid

2.1.Phản ứng màu của tinh bột với iod

– Gợi ý phân tích kết quả:

+ Khi thêm thuốc thử Lugol vào dung dịch hồ tinh bột, xuất hiện màu

gì?

+ Sự thay đổi màu như thế nào khi đun nóng; khi làm lạnh ống

nghiệm chứa dung dịch?

+ Nếu đun nhẹ rồi lại làm lạnh thì sự biến đổi màu diễn ra thế nào?

Thí nghiệm lặp lại đến khoảng lần thứ 7–10 thì kết quả có thay đổi không?

(Lưu ý: số lần có thể lặp lại phụ thuộc vào việc đun nhẹ nhàng hay không).

+ Khi đun nóng kĩ dung dịch, làm lạnh trở lại, dung dịch có còn màu

xanh không?

– Giải thích kết quả thu được.

– Kết luận rút ra là gì?

2.2. Phân biệt đường đơn (glucose) và đường đôi (sucrose)

– Gợi ý phân tích kết quả:

+ Ống nào (A hay B) xuất hiện kết tủa? Màu kết tủa là màu gì?

44

+ Theo lý thuyết thì màu kết tủa là màu gì? Tại sao thực tế màu kết tủa

lại khác?

– Giải thích kết quả thu được.

– Kết luận rút ra là gì?

2.3. Phản ứng Benedict

– Gợi ý phân tích kết quả: Dung dịch chuyển màu như thế nào? Nếu

sử dụng glucose 1% thì có thể thấy kết tủa màu gì?

– Giải thích kết quả thu được.

– Kết luận rút ra là gì?

(Lưu ý: Phản ứng này rất đặc trưng và nhạy với đường khử hơn phản

ứng với thuốc thử Fehling).

3. Nhận biết lipid

3.1.Thí nghiệm về tính tan của mỡ– Gợi ý phân tích kết quả:

Ốngnghiệm

Nguyên liệu, hóa chất Tính tan Kết quả thí nghiệm

Ống A 2ml nước cất + dầu lạc ? ?

Ống B 2ml ethanol + dầu lạc ? ?

Ống C 2ml benzen + dầu lạc ? ?

– Giải thích kết quả thu được.

– Kết luận rút ra là gì?

3.2. Thí nghiệm về sự nhũ tương hóa– Gợi ý phân tích kết quả:

Ốngnghiệm

Nguyên liệu, hóa chất Tính tan Màu của dung dịch

Ống A 4ml nước cất + 3 – 5 giọt dầu lạc

? ?

Ống B 4ml nước cất + 3 – 5 giọt dầu lạc + 0,5ml xà phòng 2%

? ?

45

– Giải thích kết quả thu được.

– Kết luận rút ra là gì?

3.3. Thí nghiệm chứng minh mỡ chứa gốc glyceryl (trong triglycerid)

– Gợi ý phân tích kết quả:

+ Khi đun nóng dầu với chất lấy nước, có mùi gì đặc biệt ? Tại sao có

khói trắng thoát ra?

+ Chú ý quan sát màu sắc trên tờ giấy lọc tẩm AgNO3/NH3 hơ vào

miệng ống nghiệm đang thoát khói.

+ Nếu thay dầu lạc bằng lipid không chứa glyceryl (như sáp) thì sẽ có

phản ứng này hay không? Tại sao?

– Giải thích kết quả thu được.

– Kết luận rút ra là gì?

3.4. Phản ứng xà phòng hóa

– Gợi ý phân tích kết quả:

+ Sau khi đun cạn khô bình nón, thêm nước cất vào lắc sẽ được dung

dịch có màu như thế nào? Có tạo bọt không? Đó là dung dịch gì?

+ Thêm CaCl2 vào dung dịch đó thì có tạo thành kết tủa hay không?

– Giải thích kết quả thu được.

– Kết luận rút ra là gì?

VI. CÂU HỎI ĐÁNH GIÁ VÀ MỞ RỘNG VẤN ĐỀ

1. Giải thích những hạn chế của thử nghiệm của Benedict trong việc

xác định có đường hoặc không có đường trong một một số sản phẩm thực

phẩm. Tại sao tất cả các monosacarit phản ứng với thuốc thử Benedict,

nhưng chỉ một số disaccharides phản ứng với thuốc thử Benedict? Cho

dung dịch saccarozơ vào ống nghiệm, cho thêm 2 giọt HCl đậm đặc và đun

sôi trong 10 phút. Sau dó, trung hoà bằng NaOH (dùng giấy quỳ để nhận

biết), nhỏ thêm 1ml dung dịch Benedict vào. Có phản ứng gì xảy ra? Giải

thích.

2. Điều gì đã làm bạn tìm hiểu về các đặc trưng của thuốc thử biuret?

Bạn học được gì về đặc tính của thuốc thử biuret? .

3. Trong phòng thí nghiệm, bạn sử dụng thuốc thử biuret để xác định

46

sự hiện diện của albumin (lòng trắng trứng) trong dung dịch. Tại sao bạn

không sử dụng thuốc thử ninhydrin? Dùng 3ml sữa cho vào 1 ống nghiệm

rồi cho thêm vài giọt CuSO4 1%, lắc đều. Giải thích hiện tượng xảy ra.

4. Lá của nhiều loài thực vật được phủ một chất sáp làm cho chúng

không đọng nước. Bạn mong chờ gì về chất này sẽ phản ứng như thế nào

trong thử nghiệm Sudan IV? Lấy lá cây mướp, hoặc cây ngô cho vào ống

nghiệm; cho rượu êtylic vào và đun sôi trên đèn cồn. Sau đó dùng kẹp cặp

và nhúng lá vào dung dịch kali iotat có nồng độ loãng. Mô lá sẽ có màu gì?

Tác dụng của rượu êtylic trong thí nghiệm này là gì? Tại sao phải đun sôi

trên đèn cồn?

5. Ninhydrin phản ứng với một hỗn hợp của các axit amin và cho màu

tím. Proline có phải là một trong những amino axit hay không? Làm thế

nào bạn có thể khẳng định một hỗn hợp có chứa proline hay không?

6. Một số hợp chất hữu cơ chưa được kiểm tra để xác định loại phân

tử có mặt. Hoàn thành bảng dưới đây, cho biết nguyên liệu từ 1 đến 5 là chất gì trong các

chất: protein, đường khử, tinh bột, chất béo, hoặc các axit amin tự do (+ = kết quả dương

tính).

Nguyên liệu

Thử nghiệm Benedict

Thử nghiệm Lugol

Thử nghiệm Biuret

Thử nghiệm Ninhydrin

Thử nghiệm Sudan IV

Trả lời

1. - - + - - ?

2. + - - - - ?

3. - + - - - ?

4. - - - + - ?

5. - - - - + ?

7. Hỗn hợp các chất chưa biết sẽ được kiểm tra với một số thuốc thử đo màu. Với các kết quả trong bảng, xác định trong bốn lựa chọn dưới đây, lựa chọn nào mô tả đung nhất các thành phần của từng ống.

(Cho biết: + = kết quả dương)

Ống nghiệm

Thử nghiệm

Thử nghiệm

Thử nghiệm

Thử nghiệm

Thử nghiệm

47

Benedict Lugol Biuret Ninhydrin Sudan IV1 - - + + -

2 + - + - +

3 + + - - +

a. Ống 1: đường khử và protein

Ống 2: lipid, axit amin tự do, và protein

Ống 3: tinh bột, đường khử, và lipid

b. Ống 1: protein và axit amin tự do

Ống 2: tinh bột, protein, và lipid

Ống 3: axit amin tự do, tinh bột và protein

c. Ống 1: protein và axit amin tự do

Ống 2: lipid, đường khử và protein

Ống 3: lipid, đường khử và tinh bột

d. Ống 1: axit amin tự do và chất béo

Ống 2: lipid, tinh bột, và axit amin tự do

Ống 3: tinh bột, axit amin tự do, và đường khử

8. Bạn kiểm tra 5 dung dịch và có được kết quả như sau:

Dung dịchKết quả củaLugol Test

Kết quả của Benedict Test

Kết quả của Ninhydrin Test

I

II

III

IV

V

Vàng

Vàng

Đen

Nâu

Vàng

Xanh dương

Da cam

Xanh dương

Xanh đen

Xanh dương

Tím

Không màu

Không màu

Vàng

Không màu

a. Dung dịch nào có chứa tinh bột?

b. Dung dịch nào rất có thể có đường?

c. Dung dịch nào có chứa một axit amin khác với proline?

9. Khi ăn thịt màu đỏ, bạn sẽ có được những chất dinh dưỡng nào (chỉ

xét đến phân tử hữu cơ)? Những nhà dinh dưỡng học khuyên chất béo nào

nên có trong chế độ ăn uống của bạn? Bạn sẽ sử dụng lời khuyên đó như

thế nào?48

10. Một số vitamin không nên dùng quá nhiều. Đó là vitamin

nào? Tại sao?

11. Một số axit amin được gọi là axit amin thiết yếu. Điều này có

nghĩa là gì? Axit béo với nhiều hơn một liên kết đôi được coi là các axit

béo cần thiết. Động vật không có thể tạo ra axit béo có nhiều hơn một liên

kết đôi. Các nguồn của các axit béo cần thiết là gì?

12. Nghiền nhỏ mẫu gan lợn hoặc gan gà trong cối sứ rồi lấy ra một ít

đặt lên lam kính. Cho thêm vào mẫu vài giọt dung dịch KI. Hãy dự đoán

kết quả xảy ra. Có thể rút ra kết luận gì từ thí nghiệm này?

13. Cắt nhỏ cùi dừa cho vào ống nghiệm và cho thêm vào vài ml cồn.

Lượng cồn trong ống nghiệm phải ngập hết cùi dừa, lắc đều trong ít phút.

Để cùi lắng xuống và dùng pipet hút phần dịch nổi cho vào một ống

nghiệm khác có đựng 3ml nước. Giải thích hiện tượng xảy ra.

14. Vào mùa đông, thực vật biến đổi các lipit bão hòa trong màng tế

bào của nó cho axit béo không no. Lipit không no là khung giữ

cho các màng tế bào lỏng nhiều hơn bởi vì chúng không thể được liên kết

với nhau chặt chẽ. Có phải lợi thế này sẽ giúp cho cây thân thảo sống

qua hết mùa đông? 

(Gợi ý: khi bạn đặt bát súp nấu với thịt xông khói trong tủ lạnh sẽ

thấy xuất hiện váng mỡ trên mặt bát súp. Tại sao vậy?)

49

Bài 2. Ảnh hưởng nhiệt độ, pH, các chất kìm hãm lên hoạt độ của enzyme - Xác định hoạt độ của một số enzyme

I. MỤC TIÊU

1. Tìm hiểu ảnh hưởng nhiệt độ, pH, các chất kìm hãm, các chất ức

chế,... lên hoạt độ của enzyme.

2. Sử dụng phương pháp chuẩn độ để xác định hoạt độ của một số

enzyme.

3. Rèn các kỹ năng thực hành:

- Kỹ năng quan sát

- Kỹ năng đo đếm thời gian cho các phản ứng xúc tác bởi enzyme

- Kỹ năng chuẩn độ

- Kỹ năng phân tích kết quả thí nghiệm

- Kỹ năng báo cáo kết quả thực hành

II. CƠ SỞ KHOA HỌC

A. Tính đặc hiệu của enzyme

+ Tính đặc hiệu của enzyme thể hiện ở chỗ mỗi enzyme chỉ tác dụng

lên một hoặc một số chất cùng kiểu cấu trúc và chuyển hóa cơ chất theo

một kiểu phản ứng nhất định.

Tính đặc hiệu của urease

+ Urease được xem là có tính đặc hiệu tuyệt đối: chỉ tác dụng lên

urea, ngoài ra hầu như không tác dụng lên các hợp chất khác.

Do tính đặc hiệu của urease chỉ xúc tác cho phản ứng thủy phân urea

nên ở ống A có xảy ra phản ứng tạo NH3, làm giấy quỳ chuyển sang xanh,

còn ống B không xảy ra phản ứng.

Tính đặc hiệu của α–amylase nước bọt và sucrase nấm men

+ Sucrase được xem là có tính đặc hiệu tương đối: nó không chỉ thủy

phân liên kết β–glycozit của sucrose mà còn thủy phân liên kết β–glycozit

của nhiều hợp chất khác như trong rafinose.

+ α–amylase chỉ thủy phân liên kết α–1,4-glycosid, trong khi sucrase

chỉ thủy phân liên kết α–1,2-glycosid của đường sucrose.

50

+ Ở tinh bột, liên kết giữa các phân tử glucose ở amylose (thành phần

tạo phản ứng màu với I2 trong thuốc thử Lugol) là α–1,4-glycosid, trong

khi ở amylopectin là α–1,4-glycosid (mạch thẳng) và α–1,6-glycosid (vị trí

phân nhánh).

+ Ống A và B: α–amylase nước bọt thủy phân liên kết α–1,4-glycosid

ở amylose của tinh bột thành các dextrin từ lớn đến nhỏ, cuối cùng là

glucose, trong khi sucrase không thủy phân được tinh bột, do đó ống A cho

màu vàng (hoặc đỏ vàng, đỏ nâu tùy độ mạnh của α–amylase) với thuốc

thử Lugol (âm tính), trong khi ống B cho màu xanh tím (dương tính).

+ Ống C và D: sucrase không thủy phân được tinh bột, nhưng thủy

phân liên kết α–1,2-glycosid của đường sucrose tạo thành đường glucose

có tính khử, do đó ống C âm tính với thuốc thử Fehling, còn ống D xuất

hiện kết tủa Cu2O đỏ gạch.

B. Ảnh hưởng nhiệt độ, pH, các chất kìm hãm lên hoạt độ của enzyme

Ảnh hưởng của nhiệt độ

+ Các enzyme tách từ cơ thể động vật máu nóng hoạt động mạnh nhất

ở 37–400C, ngoài giới hạn này hoạt độ đều giảm, đặc biệt khi đun nóng

trên 700C các enzyme đều bị bất hoạt hoàn toàn.

+ Do đó nếu tinh bột không bị thủy phân sẽ tạo phức màu xanh tím

với iod trong thuốc thử Lugol.

+ Nếu tinh bột bị thủy phân dần thành các dextrin từ lớn đến nhỏ, sẽ

không tạo thành phức màu tím với iod trong thuốc thử Lugol.

Ảnh hưởng của pH môi trường

+ Mỗi enzyme hoạt động mạnh nhất ở một pH nhất định, ở các pH

khác hoạt độ enzyme giảm.

+ pH thích hợp cho hoạt độ của enzyme α–amylase nước bọt ở vùng

trung tính (gần 7) do đó trong khoảng này (6,8–7,2), tinh bột bị thủy phân

sẽ cho phản ứng âm với thuốc thử Lugol.

Ảnh hưởng của các chất kích thích và kìm hãm

51

+ Các ion kim loại nặng, kim loại trung bình (như Cu2+) có tác dụng

kìm hãm hoạt độ của α–amylase nước bọt, trong khi các ion kim loại kiềm

(như Na+) có tác dụng kích thích hoạt độ α–amylase nước bọt.

C. Xác định hoạt độ của một số enzyme

Xác định hoạt độ của catalase

– Nguyên tắc:

+ Catalase là enzyme xúc tác cho phản ứng:

2H2O2 → O2 + 2H2O (1)

+ Ta định lượng catalase bằng KMnO4 để xác định lượng H2O2 trước

và sau khi enzyme tác dụng theo phương trình phản ứng:

5H2O2 + 2KMnO4 + 3H2SO4 → 2MnSO4 + K2SO4 + 5O2 + 8H2O (2)

+ Số mg H2O2 bị phân giải bởi enzyme trong 1g khoai tây (X):

Trong đó:

A, B – thể tích KMnO4 0,1N dùng để chuẩn độ H2O2 trong bình A, B.

V1, V2 – thể tích enzyme ban đầu và lấy để xác định.

a – Số gam nguyên liệu lấy nghiên cứu.

1,7 – Hệ số phản ứng tính theo H2O2 tính theo phản ứng (2)

+ Số đơn vị catalase trong 1g khoai tây trên 1 micromol H2O2 bị phân

giải sau 1 phút:

Trong đó:

30 – Thời gian enzyme tác dụng

0,034 – Khối lượng 1μmol H2O2

+ Trong thí nghiệm này sử dụng phương pháp chuẩn độ ngược, dùng

dung dịch KMnO4 0,1N để xác định lượng H2O2 trước và sau khi enzyme

tác dụng, từ đó tính được lượng H2O2 đã bị phân giải

5H2O2 + 2KMnO4 + 3H2SO4 → 2MnSO4 + K2SO4 + 5O2 + 8H2O

Chuẩn độ cho tới khi xuất hiện màu hồng bền chính là màu KMnO4 dư.

+ Bình thí nghiệm cho enzyme tác dụng, còn bình đối chứng với

enzyme bị bất hoạt, không xảy ra phản ứng phân giải H2O2

Xác định hoạt độ của urease

52

– Nguyên tắc: Dùng phương pháp chuẩn độ để xác định lượng NH3

được tạo thành từ urea dưới tác dụng của urease.

+ 1ml HCl 0,1N tương ứng với 1,4mg N2. Hoạt độ urease được giải

phóng từ urea dưới tác dụng của urea có trong lượng dung dịch enzyme đã

dùng trong 1 phút và được tính theo công thức:

Trong đó:

A, B – Thể tích HCl 0,1N đã dùng để chuẩn độ bình A, B

30 – Thời gian phản ứng (phút)

1,4 – Hệ số chuyển thành nitr

+ Hoạt độ của nguyên liệu ban đầu (trên 1g mẫu):

Trong đó:

V1, V2 – Thể tích dung dịch enzyme thu được và xác định hoạt độ.

m – Khối lượng bột chiết để tách enzyme

III. THIẾT BỊ – HÓA CHẤT- MẪU VẬT

1. Dụng cụ

+ Ống nghiệm, pipet, bình nón, buret, bình định mức, cốc đong, ống

đong, đũa thủy inh

+ Giá đựng ống nghiệm, kẹp gỗ, giá đỡ buret

+ Bản sứ 6 giếng, cối chày sứ

+ Giấy lọc, phễu lọc Buchner, giấy quỳ, giấy sắc ký, giấy thấm, bông

+ Đèn cồn

2. Thiết bị

+ Bếp điện, tủ ấm 370C, tủ lạnh, nồi cách thủy

+ Máy đo pH, đồng hồ, cân hóa chất, máy hút chân không, máy ly

tâm

3. Nguyên liệu, hóa chất, mẫu vật

+ Khoai tây, đậu tương, bột CaCO3

+ Dung dịch tinh bột, sacaroza, sacaroza nấm men

53

+ Dung dịch urea, Pb(CH3COO)2, KMnO4, H2O2 trong đệm

phosphate, NaCl, CuSO4, Na2HPO4, KH2PO4,

+ Dung dịch HCl đặc, H2SO4 đặc

+ Giấy quỳ tím, phenol phtalein, thuốc thử Lugol, thuốc thử Fehling

+ Acetamit.

IV. TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM

1. Tính đặc hiệu của enzyme

1.1.Tính đặc hiệu của urease

– Chuẩn bị:

+ Urease (bột đậu tương), dung dịch urea 5%, dung dịch acetamit 5%

+ Ống nghiệm, pipet, giấy quỳ, nút bấc ống nghiệm, tủ ấm 370C

– Tiến hành:

+ Lấy 2 ống nghiệm sạch, cho vào ống A: 4ml urea 5%, ống B: 4ml

acetamit 5%

+ Thêm vào mỗi ống 1g bột đậu tương, lắc đều.

+ Đặt trên miệng mỗi ống một mẩu giấy quỳ, đậy miệng 2 ống bằng

nút bấc

+ Có thể đặt cả 2 ống vào 370C trong 5 – 10 phút, quan sát hiện tượng.

– Kết quả:?

– Giải thích: ?

1.2.Tính đặc hiệu của α–amylase nước bọt và saccarozơ nấm men:

– Chuẩn bị:

+ Dung dịch α–amylase nước bọt, sucrase nấm men, tinh bột 1%,

saccarozơ 1%, thuốc thử Lugol, thuốc thử Fehling

+ Ống nghiệm,pipet, đèn cồn

– Tiến hành:

+ Lấy 4 ống nghiệm, cho vào ống A và B: 2ml dung dịch tinh

bột/ống; ống C và D: 2ml dung dịch saccarozơ/ống.

+ Thêm vào ống A và C: 0,5ml dung dịch nước bọt; ống B và D:

0,5ml dung dịch sucrase nấm men.

+ Lắc đều các ống, giữ ở 37–400C trong 10 phút.

54

+ Làm lạnh ống A và B, thêm vài giọt thuốc thử Lugol và quan sát

hiện tượng.

+ Thêm thuốc thử Fehling vào ống C và D, đun nóng và quan sát hiện

tượng.

– Kết quả: ?

– Giải thích: ?

2. Tính chất của enzyme

2.1.Ảnh hưởng của nhiệt độ

– Chuẩn bị:

+ Dung dịch nước bọt pha loãng 10 lần, dung dịch tinh bột 1%, thuốc

thử Lugol.

+ Ống nghiệm, pipet, nồi cách thủy 1000C, tủ ấm 370C, nước đá.

– Tiến hành:

+ Lấy 3 ống nghiệm, cho vào mỗi ống 2ml dung dịch tinh bột 1%.

+ Đặt ống A vào nồi cách thủy đang sôi, đặt ống B vào tủ ấm 370C,

đặt ống C lên nước đá, giữ các ống ở nhiệt độ tương ứng trong 15 phút.

+ Trong thời gian này lấy 3 ống nghiệm khác, cho 0,5ml dung dịch

nước bọt vào mỗi ống, đặt các ống vào nồi cách thủy đang sôi, tủ ấm 370C

và nước đá.

+ Sau 15 phút cho dịch nước bọt vào các ống A, B, C với nhiệt độ

tương ứng.

+ Sau 10 phút đưa các ống về nhiệt độ phòng, cho vào mỗi ống vài

giọt thuốc thử Lugol, quan sát.

– Kết quả:

Ống A và C có màu xanh tím, ống B màu vàng (hoặc đỏ vàng)

– Giải thích:

2.2.Ảnh hưởng của pH môi trường

– Chuẩn bị:

+ Dung dịch nước bọt pha loãng 20 lần, Na2HPO4 1/15M, KH2PO4

1/15M, dung dịch tinh bột 0,5% trong NaCl 0,1%, thuốc thử Lugol.

+ Ống nghiệm, pipet, bản sứ 6 giếng.

55

– Tiến hành:

+ Lấy 7 ống nghiệm sạch (ký hiệu từ A đến G), cho vào các ống thể

tích Na2HPO4 1/15M và KH2PO4 1/15M như ghi trong bảng, lắc đều.

Ống

nghiệm

Thể tích Na2HPO4 (ml)

Thể tích NaH2PO4 (ml)

pH

A 0,1 4,9 5,3

B 0,3 4,7 5,6

C 1,0 4,0 6,2

D 2,5 2,5 6,8

E 3,5 1,5 7,2

F 4,5 0,5 7,7

G 4,9 0,1 8,4

+ Cho vào mỗi ống 1ml dung dịch tinh bột 0,5%/NaCl 0,1%, lắc đều.

+ Thêm vào mỗi ống 1ml dung dịch nước bọt pha loãng 20 lần, lắc

đều.

+ Sau 3 phút lấy 0,2ml dung dịch mỗi ống cho lên bản sứ để thử phản

ứng màu với Lugol, cứ mỗi 5 phút thử 1 lần cho tới khi có 1 ống cho phản

ứng âm tính với Lugol thì cho vào mỗi ống 3 giọt thuốc thử Lugol, lắc đều.

– Kết quả: Sau 13 phút?

– Giải thích: ?

2.3.Ảnh hưởng của các chất kích thích và kìm hãm

– Chuẩn bị:

+ Dung dịch nước bọt pha loãng 20 lần, dung dịch tinh bột 0,5%,

NaCl 1%, CuSO4 1%, thuốc thử Lugol.

+ Ống nghiệm, pipet.

– Tiến hành:

+ Chuẩn bị 3 ống nghiệm, cho vào ống A: 1ml nước cất, ống B: 0,8ml

nước cất và 0,2ml NaCl 1%, ống C: 0,8ml nước cất và 0,2ml CuSO4 1%.

+ Thêm vào mỗi ống 1ml dung dịch nước bọt pha loãng 20 lần, 1ml

dung dịch tinh bột 0,5%, lắc đều.

+ Sau 10 phút, thêm vào mỗi ống vài giọt thuốc thử Lugol, quan sát.56

– Kết quả:?

– Giải thích: ?

3. Xác định hoạt độ của một số enzyme

3.1.Xác định hoạt độ của catalase

– Chuẩn bị:

+ Khoai tây, cát, bột CaCO3, KmnO4 0,1N, H2SO4 10%, H2O2 0,1%

trong đệm phosphate pH = 7,0.

+ Ống nghiệm, pipet, cối, chày sứ, buret 50ml, bình định mức 100ml,

bình nón 250ml, nồi cách thủy 1000C, buret 20ml.

+ Chuẩn bị dung dịch catalase: cân 2g khoai tây cho vào cối, nghiền

cùng cát, thêm từ từ 2–3ml nước và một ít CaCO3 để trung hòa dung dịch

chiết (đến khi ngừng tạo bọt CO2), chuyển toàn bộ mẫu đã nghiền vào bình

định mức, thêm nước cất đến 100ml, lắc đều, để lắng khoảng 30 phút, lọc

thu dịch trong.

– Tiến hành:

+ Cho vào 1 bình nón (bình A) 20ml dung dịch enzyme, thêm tiếp

25ml H2O2 0,1%, giữ ở 300C trong 30 phút, thêm 5ml H2SO4 10% và

chuẩn độ bằng KmnO4 0,1N đến khi xuất hiện màu hồng bền trong 1 phút.

+ Cho vào bình nón thứ hai (bình B) 20ml dung dịch enzyme, đặt vào

nồi cách thủy đang sôi trong 5 phút để bất hoạt enzyme, lấy ra để nguội,

thêm tiếp 25ml H2O2 0,1% và tiếp tục làm như bình A.

– Kết quả: ?

– Giải thích: ?

3.2.Xác định hoạt độ của urease

– Chuẩn bị:

+ Dung dịch urease, urea 2%, Pb(CH3COO)2 5%, HCl 0,1N, chỉ thị

hỗn hợp

+ Ống nghiệm, pipet, buret 20ml, bình nón 100ml, tủ ấm 300C, nồi

cách thủy 1000C

– Tiến hành:

+ Lấy hai bình nón 100ml, cho vào mỗi bình 10ml urease.

57

+ Giữ nguyên bình A, đun sôi bình B 2–3 phút rồi hạ xuống nhiệt độ

phòng.

+ Cho vào mỗi bình 10ml urea 2%, lắc đều.

+ Để vào tủ ấm 300C trong 30 phút.

+ Thêm vào mỗi bình 5ml Pb(CH3COO)2 5%, 3–5 giọt chỉ thị hỗn

hợp, lắc đều.

+ Chuẩn độ cả 2 bình đến khi dung dịch có màu tím nhạt.

– Kết quả: ?

– Giải thích: ?

V. PHÂN TÍCH KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM VÀ VIẾT BÁO CÁO

1. Nhận biết một số enzyme

Nhận biết amylase

– Gợi ý phân tích kết quả:

+ Khi thử bằng Lugol: quan sát sự biến đổi màu dần dần ở dãy giếng

trên bản sứ lấy hỗn hợp phản ứng từ ống A và dãy giếng trên bản sứ lấy

hỗn hợp phản ứng từ ống B rồi ghi kết quả vào bảng sau:

Ống nghiệm

01 phút

02 phút

04 phút

06 phút

08 phút

10 phút

Ống A ? ? ? ? ? ?

Ống B ? ? ? ? ? ?

So sánh kết quả ở các mẫu nước bọt khác nhau, cùng một thời gian

nhưng màu sắc có giống nhau không? Nguyên nhân của hiện tượng đó là

gì?

+ Thử bằng Fehling: ống nào xuất hiện kết tủa? Màu sắc kết tủa là

màu gì? Giải thích kết quả thu được.

– Kết luận rút ra là gì?

2. Tính đặc hiệu của enzyme

2.1. Tính đặc hiệu của urease

– Gợi ý phân tích kết quả:

Ống nghiệm Thí nghiệm

Hiện tượng

58

xảy ra

Ống A

4ml urea 5% + 1g bột đậu tương, lắc

đều. Đặt trên miệng ống một mẩu giấy

quỳ, đậy miệng ống bằng nút bấc. Đặt

ống vào 370C trong 5–10 phút.

?

Ống B

4ml acetamit 5% + 1g bột đậu tương,

lắc đều. Đặt trên miệng ống một mẩu

giấy quỳ, đậy miệng ống bằng nút bấc.

Đặt ống vào 370C trong 5–10 phút.

?

– Giải thích kết quả thu được.

– Kết luận rút ra là gì?

2.2.Tính đặc hiệu của α–amylase nước bọt và sucrase nấm men

– Gợi ý phân tích kết quả:

Ống nghiệm Thí nghiệm

Hiện tượng xảy ra

Ống A

2ml dung dịch tinh bột + 0,5ml dung

dịch nước bọt. Lắc đều, giữ ở 37 – 400C

trong 10 phút. Làm lạnh. Thêm vài giọt

thuốc thử Lugol.

?

Ống B

2ml dung dịch tinh bột + 0,5ml dung

dịch sacaroza nấm men. Lắc đều, giữ ở

37 – 400C trong 10 phút. Làm lạnh.

Thêm vài giọt thuốc thử Lugol.

?

Ống C

2ml dung dịch sacaroza + 0,5ml dung

dịch nước bọt. Lắc đều, giữ ở 37 – 400C

trong 10 phút. Thêm thuốc thử Fehling.

Đun nóng.

?

Ống D

2ml dung dịch sacaroza +0,5ml dung

dịch sacaroza nấm men. Lắc đều, giữ ở

37 – 400C trong 10 phút. Thêm thuốc

thử Fehling. Đun nóng.

?

59

– Giải thích kết quả thu được.

– Kết luận rút ra là gì?

2.3. Tính chất của enzyme

2.3.1.Ảnh hưởng của nhiệt độ

– Gợi ý phân tích kết quả:

Ống nghiệm

Thí nghiệm Hiện tượng

xảy ra

Ống A

2ml dung dịch tinh bột 1% . Đặt ống

A vào nồi cách thủy đang sôi, giữ ống

ở nhiệt độ tương ứng trong 15 phút.

?

Ống B

2ml dung dịch tinh bột 1% . Đặt ống

B vào tủ ấm 370C, giữ ống ở nhiệt độ

tương ứng trong 15 phút.

?

Ống C

2ml dung dịch tinh bột 1% . Đặt ống

C lên nước đá, giữ ống ở nhiệt độ

tương ứng trong 15 phút.

?

– Giải thích kết quả thu được.

– Kết luận rút ra là gì?

2.3.2.Ảnh hưởng của pH môi trường

– Gợi ý phân tích kết quả:

Ống nghiệm

Thể tích Na2HPO4

(ml)

Thể tích NaH2PO4

(ml)pH

Màu với thuốc thử Lugol sau

3 phútA 0,1 4,9 5,3 ?

B 0,3 4,7 5,6 ?

C 1,0 4,0 6,2 ?

D 2,5 2,5 6,8 ?

E 3,5 1,5 7,2 ?

F 4,5 0,5 7,7 ?

G 4,9 0,1 8,4 ?

60

– Sau 3 phút lấy 0,2ml dung dịch mỗi ống cho lên bản sứ để thử phản

ứng màu với Lugol thì thu được kết quả như thế nào? Cứ mỗi 5 phút thử 1

lần thì ống nào cho phản ứng âm tính với Lugol? Khi cho vào mỗi ống 3

giọt thuốc thử Lugol, lắc đều sau 13 phút thu được kết quả như thế nào?

– Giải thích kết quả thu được.

– Kết luận rút ra là gì?

2.3.3.Ảnh hưởng của các chất kích thích và kìm hãm

– Gợi ý phân tích kết quả:

Ống nghiệm Thí nghiệm

Hiện tượng xảy ra

A

1ml nước cất + 1ml dung dịch nước

bọt pha loãng 20 lần + 1ml dung dịch

tinh bột 0,5%, lắc đều. Sau 10 phút,

thêm vào vài giọt thuốc thử Lugol.

?

B

0,8ml nước cất và 0,2ml NaCl 1%+

1ml dung dịch nước bọt pha loãng 20

lần + 1ml dung dịch tinh bột 0,5%, lắc

đều. Sau 10 phút, thêm vào vài giọt

thuốc thử Lugol.

?

C

0,8nl nước cất và 0,2ml CuSO4 1% +

1ml dung dịch nước bọt pha loãng 20

lần + 1ml dung dịch tinh bột 0,5%, lắc

đều. Sau 10 phút, thêm vào vài giọt

thuốc thử Lugol.

?

– Giải thích kết quả thu được.

– Kết luận rút ra là gì?

61

VI. CÂU HỎI ĐÁNH GIÁ VÀ MỞ RỘNG VẤN ĐỀ

1. Phản ứng enzim chịu ảnh hưởng những nhân tố nào? Em hãy đưa ra

phương án thí nghiệm chứng minh.

2.Các enzyme hoạt động tốt nhất ở các giá trị pH cụ thể. Trong dạ

dày của người bình thường, độ pH = 2,0 - 3,0 là môi trường cần thiết cho

các hoạt động bình thường của các enzym tiêu hóa ở đó. Các loại thuốc:

Aspirin, Sodium bicarbonate - (NaHCO3), Maalox, hydroxyt magie -

[Mg(OH)2] thường được sử dụng để điều trị "chứng khó tiêu axit" của dạ

dày, một điều kiện trong đó việc giảm độ pH gây trở ngại cho enzyme tiêu

hóa hoạt động hiệu quả.

a. Làm thế nào bạn có thể giải thích tác động của những loại thuốc

này tốt nhất ở pH nào?

b. Điều gì có thể xảy ra nếu dư thừa của những loại thuốc này khi đã

được sử dụng?

3. Tính pH của các dung dịch được liệt kê.

Dung dịch pH

Maalox [H+] = 3,1 x 10-9 M ?

Nước bọt [H+] = 1,95 x 10-7 M ?

Dấm [OH-] = 2,4 x 10-12M ?

4. Tính nồng độ H+ và OH- trong những dung dịch được liệt kê.

Dung dịch pH [H+]M [OH-]M

Nước cà chua 4.2 ? ?

Máu huyết 7.4 ? ?

Nước biển 8.2 ? ?

5. Bạn có bốn ống nghiệm 1000 ml đầy bốn dung dịch khác nhau

rõ ràng: 0.1 M NaH2PO4; 0.1 M Na2HPO4; 0,1 M phosphate buffer, pH 7,2

và nước cất. Rất tiếc! Bạn quên dán nhãn ống nghiệm và tất cả 4 ống

nghiệm đều giống nhau. Bạn nhận được các màu đỏ và thymolph-thalein

từ các phòng thí nghiệm và thử nghiệm một mẫu của mỗi dung dịch, ghi

nhãn các ống nghiệm ngẫu nhiên như A, B, C, và D. Bạn sử dụng congo

62

đỏ khi HCl được thêm vào mẫu, và thymolphthalein khi NaOH được thêm

vào. Bạn nhận được các kết quả sau:

Ống nghiệm

Màu sắc trước khi bổ sung

Thêm Màu sắc sau khi bổ sung

AA

ĐỏKhông màu

HClNaOH

ĐỏXanh dương

BB

ĐỏKhông màu

HClNaOH

Xanh dươngXanh dương

CC

ĐỏKhông màu

HClNaOH

ĐỏKhông màu

DD

ĐỏKhông màu

HClNaOH

Xanh dươngKhông màu

Bản chất của các dung dịch A, B, C, và D là gì?

6. Bạn có bộ đệm của pH 2, 4, 6, 8, và 10, nhưng bạn cần một bộ đệm

pH 7 cho thử nghiệm. Mô tả cách thức bạn sẽ làm cho các bộ đệm pH 7.

7. Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng ban đầu (khởi đầu) vào nồng độ

cơ chất đối với 3 enzim khác nhau ( X,Y và Z) được trình bày trong bảng:

Nồng độ cơ chất (đơn vị tuỳ ý)

Tốc độ khởi đầu (đơn vị tuỳ ý)

X Y Z1 0,92 0,91 0,0322 1,67 1,67 0,1764 2,85 2,68 0,9196 3,75 3,75 2,1808 4,40 4,44 3,64010 4,90 5,00 5,00015 5,80 6,00 7,33720 6,23 6,67 8,49830 6,80 7,50 9,39750 6,00 8,33 9,824100 4,20 9,09 9,968

a. Vẽ đồ thị nêu mối quan hệ giữa tốc độ khởi đầu và nồng độ cơ chất.

b. Enzim nào (X ,Y, hoặc Z) là enzim điều hoà theo kiểu cùng hợp tác?

c. Enzim nào (X, Y hoặc Z) bị ức chế bởi cơ chất của chính nó?

Bài 3. Quan sát tế bào dưới kính hiển vi Thí nghiệm co và phản co nguyên sinh

63

I. MỤC TIÊU

1- Học sinh biết cách làm tiêu bản tạm thời của tế bào thực vật để

quan sát hình dạng tế bào.

2- Học sinh có thể quan sát được các thành phần chính của tế bào,

hiện tượng co nguyên sinh và phản co nguyên sinh củng cố kiến thức về sự

trao đổi chất qua màng tế bào.

3- Học sinh có thể làm được thí nghiệm quan sát hiện tượng co và

phản co nguyên sinh ở tế bào thực vật, củng cố kiến thức về sự trao đổi

chất qua màng tế bào.

4- Rèn luyện kĩ năng sử dụng kính hiển vi quang học.

5- Rèn cho học sinh tính cẩn thận, tỉ mỉ trong thao tác thí nghiệm.

II. CƠ SỞ KHOA HỌC

1. Thẩm thấu là cách vận chuyển nước thụ động, đó là sự khuếch tán

của các phân tử nước qua màng bán thấm chọn lọc.

2. Mỗi tế bào đều chứa dung dịch nội bào có áp suất thẩm thấu nhất

định và màng tế bào chất có tính thấm nước nên các phân tử nước có thể đi

vào hay đi ra khỏi tế bào

- Tính trương của dung dịch là khả năng dung dịch làm cho tế bào lấy

thêm hoặc mất nước. Tính trương của dung dịch một phần phụ thuộc vào

nồng độ các chất tan không thể đi qua màng tế bào của nó so với nồng độ

các chất đó bên trong tế bào.

- Dung dịch ưu trương là dung dịch có nồng độ chất tan cao hơn so

với dịch nội bào nên áp suất thẩm thấu cao hơn và có sức hút dung môi

nước lớn hơn.

- Dung dịch nhược trương là dung dịch có nồng độ các chất tan thấp

hơn nên áp suất thẩm thấu thấp hơn và sức hút nước kém hơn

- Dung dịch đẳng trương là dung dịch có nồng độ chất tan bằng với

dung dịch trong tế bào nên áp suất thẩm thấu bằng nhau và do đó sức hút

nước cân bằng với dung dịch tế bào

3. Hiện tượng co nguyên sinh và phản co nguyên sinh phản ánh sự cân

bằng nước ở tế bào thực vật (tế bào có thành tế bào)64

- Co nguyên sinh là khi đặt tế bào thực vật trong dung dịch ưu trương

thì tế bào bị mất nước và khối tế bào chất bị co lại, nhăn nhúm và tách ra

khỏi thành tế bào.

- Khi đặt tế bào trong dung dịch nhược trương thì do nồng độ dịch

bào cao hơn nên đã hút nước từ ngoài vào làm nguyên sinh chất trương

phồng trở lại như lúc đầu, đó là hiện tượng phản co nguyên sinh.

III. THIẾT BỊ – HÓA CHẤT- MẪU VẬT

1. Thiết bị:

Kính hiển vi với các vật kính 10X, 40X, lam kính, lamen, kim mũi

mác, đèn cồn, cốc thủy tinh, đĩa đồng hồ, giấy thấm.

2. Hoá chất:

Nước cất, dung dịch NaCl 1% và 0,9%.

Nếu chuẩn bị các dung dịch ưu trương khác (KNO3 hoặc đường) thì

không nên để nồng độ quá cao sẽ làm co nguyên sinh quá nhanh không kịp

quan sát

3. Mẫu vật:

Củ hành tươi (hoặc lá thài lài tía).

IV. TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM

1. Qui trình sử dụng và bảo quản kính hiển vi.

- Kỹ thuật lấy ánh sáng: Nếu là kính hiển vi dùng nguồn sáng ngoài

thì cần điều chỉnh gương chiếu sáng; nếu là kính hiển vi dùng điện thì

hướng dẫn các em vị trí công tắc và nút điều chỉnh cường độ ánh sáng

- Đặt và cố định tiêu bản trên bàn kính sao cho mẫu vật nằm đúng

trung tâm, dùng kẹp giữ tiêu bản.

- Quan sát: mắt nhìn vào thị kính (nếu là kính 2 mắt thì cần phải quan

sát bằng cả 2 mắt), dùng tay điều chỉnh ốc sơ cấp (ốc to) sao cho quan sát

thấy rõ vật cần quan sát. Lưu ý, không để cho tiêu bản chạm vào vật kính

(có thể dùng ốc hãm, hoặc chỉnh ốc sơ cấp cho vật kính xuống gần chạm

vào tiêu bản thì dừng lại rồi bắt đầu vừa quan sát vừa chỉnh vật kính lên

65

cho tới khi quan sát rõ mẫu vật). Dể nhìn rõ nhất hình ảnh của mẫu vật co

thể điều chỉnh ốc vi cấp (ốc nhỏ).

- Nghiêm cấm học sinh không được sờ tay vào vật kính và thị kính,

không được để bộ phận này tiếp xúc với nước hay hóa chất hoặc bất cứ thứ

gì để tránh làm hư hỏng các bộ phận này.

- Sau khi sử dụng cần lau kính bằng khăn sạch rồi chụp bao nilon hay

cho vào hộp bảo quản. Luôn bê kính bằng 2 tay (một tay cầm, một tay đỡ

phía dưới)

2. Cách làm tiêu bản tế bào thực vật

- Dùng kim mũi mác bóc một lớp tế bào biểu bì hành. Để thí nghiệm

quan sát được rõ cần tách lớp biểu bì càng mỏng càng tốt, nếu không tách

được mỏng thì các lớp tế bào chồng lên nhau rất khó quan sát.

- Đặt miếng biểu bì trên lam kính đã nhỏ sẵn một giọt nước, đậy

lamen và quan sát cấu trúc tế bào. Lưu ý học sinh kỹ thuật đậy lamen để

tiêu bản không bị lẫn nhiều bọt khí và vị trí của mẫu ở vị trí trung tâm của

lam kính

3. Quan sát hiện tượng co nguyên sinh và phản co nguyên sinh

- Nhỏ vào mép lamen một giọt nước muối NaCl 1%. Giữ nguyên

tiêu bản ở vị trí này, dùng ống hút nhỏ một giọt nước ở mép lamen, đồng

thời dùng miếng giấy thấm đặt ở phía bên kia lamen để hút hết phần nước

cho đến khi dung dịch muối thay thế hoàn toàn. Sau 1 – 2 phút ta thấy

màng tế bào tách khỏi lớp vỏ xenlulozơ thể tích tế bào chất bị thu hẹp

lại. Đó là hiện tượng co sinh chất.

- Giữ nguyên tiêu bản ở vị trí này, dùng ống hút nhỏ một vài giọt

nước ở một mép lamen và ở mép lamen phía đối diện, dùng giấy thấm hút

hết dung dịch muối ra, quan sát sẽ thấy hiện tượng ngược lại với co nguyên

sinh chất: Thể tích của tế bào chất và các không bào dần dần mở rộng trở

về vị trí ban đầu do nước được hút ngược trở lại. Đó là hiện tượng phản co

nguyên sinh.

4. Thí nghiệm đối chứng

Giết chết tế bào bằng cách hơ lam kính trên ngọn lửa đèn cồn và lặp

66

lại thí nghiệm, sau đó quan sát, nhận xét hiện tượng.

Cũng cách làm tương tự trên, ta cho tế bào trong dung dịch NaCl

0,9%. Quan sát hiện tượng xảy ra và giải thích.

V. PHÂN TÍCH KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM VÀ VIẾT BÁO CÁO

1. Học sinh vừa quan sát và vẽ

- Hình dạng tế bào và chú thích các thành phần cấu trúc chính của tế

bào

- Hình dạng của tế bào khi xảy ra hiện tượng co nguyên sinh và phản

co nguyên sinh

2. So sánh kết quả thí nghiệm trong 2 trường hợp mẫu không xử lý

nhiệt và đã qua xử lý nhiệt.

Từ kết quả so sánh ở phần trên yêu cầu học sinh rút ra kết luận về đặc

điểm sống của tế bào.

VI. CÂU HỎI ĐÁNH GIÁ VÀ MỞ RỘNG VẤN ĐỀ

1. Tại sao không nên dùng dung dịch ưu trương có nồng độ quá cao?

2. Hiện tượng co nguyên sinh và phản co nguyên sinh có xảy ra ở tế

bào động vật không? Giải thích.

3. Khi trồng cây thì môi trường đất phù hợp nhất là loại môi trường

dung dịch đất có tính trương như thế nào?

4. Khi tế bào co nguyên sinh, khoảng trống giữa chất nguyên sinh và

thành tế bào là gì?

5. Một học sinh đã làm thí nghiệm:

– Cắt một đoạn thân hành (phần thân màu trắng). Dùng lưỡi lam bổ

dọc thành hai, sau đó bóc tách các lá.

– Bóc lớp biểu bì trong của lá hành giữa và đặt lên lam kính.

– Dùng 2 lamen đặt hai bên miếng biểu bì hành và nhỏ vào giữa một

giọt dung dịch đường 20%, dùng lamen thứ 3 đậy lên mẫu.

Quan sát dưới kính ở 3 thời điểm: sau khi nhỏ đung dịch đường, sau

10 phút và sau 20 phút.

Theo em bạn học sinh đó quan sát thấy hiện tượng gì? Giải thích.

67

6. Một học sinh đã làm thí nghiệm:

– Nhỏ một giọt máu người (hoặc máu ếch) lên lam kính, đậy lamen,

quan sát dưới kính hiển vi ở bội giác 10X rồi chuyển sang bội giác 40X.

– Nhỏ vào mép lamen một giọt NaCl 0,6%, quan sát ở bội giác 40X.

– Lấy một giọt máu khác, đậy lamen, nhỏ một giọt NaCl 10% vào

mép lamen, quan sát ở bội giác 40X.

Cho biết hiện tượng gì đã xảy ra và giải thích nguyên nhân?

Điền vào các ô trống trắng và ô trống có dấu chấm hỏi câu trả lời

thích hợp?

68

? ? ?

?

?

?

?

Bài 4. Lên men etilic

I. MỤC TIÊU

1- Học sinh hiểu rõ hơn bản chất của quá trình lên men.

2- Giúp học sinh rèn kỹ năng sắp xếp và bố trí thí nghiệm, tiến hành

được các bước của thí nghiệm.

II. CƠ SỞ KHOA HỌC

1. Lên men bao gồm đường phân và các phản ứng tái sinh NAD+ nhờ

chuyển electron từ NADH đến pyruvat hoặc các dẫn xuất của pyruvat. Sau

đó NAD+ có thể dùng lại để oxi hóa đường nhờ đường phân từ đó sinh 2

ATP theo con đường phophorin hóa mức cơ chất. Có nhiều kiểu lên men,

chỉ khác nhau ở sản phẩm cuối cùng, hai kiểu phổ biến là lên men etilic

(lên men rượu) và lên men lactic.

2. Lên men là kiểu hô hấp khác với các kiểu hô hấp khác là sản phẩm

tạo ra là các hợp chất hữu cơ và năng lượng tạo ra rất ít.

3. Trong quá trình lên men etilic, pyruvat bị biến đổi thành ethanol

theo hai bước. Bước đầu là giải phóng CO2 từ pyruvat và pyruvat bị biến

đổi thành hợp chất có 2-cacbon acetaldehyt, ethanol.

4. Nhiều vi khuẩn tiến hành lên men rượu trong điều kiện kị khí và

nấm men rượu cũng lên men rượu.

III. THIẾT BỊ – HÓA CHẤT- MẪU VẬT

Cho 1 nhóm thí nghiệm:

- Bình thủy tinh 500 – 1000 ml

- 3 ống nghiệm, có đánh số

- Bánh men được giã nhỏ là lấy phần bột mịn (2 – 3g)

- Dung dịch đường kính (sacaroz) 10%

- 200 ml nước lã đun sôi để nguội

IV. TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM

1. Yêu cầu học sinh pha 200 – 500 ml dung dịch đường 8% - 10%

chuẩn bị vào bình thủy tinh hình trụ.

69

2. Giáo viên cần chuẩn bị một bộ thí nghiệm gồm 3 ống nghiệm để

làm mẫu trước khi cho học sinh thí nghiệm khoảng 4 h trước theo trình tự:

- Cho vào đáy mỗi ống nghiệm số 2 và số 3 khoảng 1g bột bánh men

- Đổ nhẹ theo thành ống 10 ml dung dịch đường vào mỗi ống 1 và 2

- Đổ nhẹ theo thành ống 10 ml nước sôi để nguội vào ống nghiệm 3

- Dùng giấy mềm hoặc nilon buộc kín miệng các ống nghiệm.

3. Giáo viên cho học sinh quan sát bộ thí nghiệm đã chuẩn bị trước và

yêu cầu học sinh quan sát hiện tượng xảy ra.

4. Giới thiệu các dụng cụ thí nghiệm và yêu cầu học sinh bố trí thí

nghiệm từ các dụng cụ và nguyên vật liệu trên nhằm mục đích quan sát các

hiện tượng của quá trình lên men etilic như đã quan sát.

5. Học sinh làm thí nghiệm.

V. PHÂN TÍCH KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM VÀ VIẾT BÁO CÁO

1. Viết phương trình lên men etilic

2. Quan sát thí nghiệm và điền các nhận xét vào bảng (có +; không có -)

Nhận xét ống nghiệm 1 ống nghiệm 2 ống nghiệm 3

Có bọt khí ? ? ?

Có mùi rượu ? ? ?

Có mùi bánh men ? ? ?

Có vị đường ? ? ?

3. Yêu cầu học sinh kết luận về các điều kiện của quá trình lên men và nêu nguyên liệu và sản phẩm của quá trình lên men etilic.

VI. CÂU HỎI ĐÁNH GIÁ VÀ MỞ RỘNG VẤN ĐỀ1. Nếu ống nghiệm 2 là dung dịch đường 5 - 6 % và có bổ sung thêm

dịch nước ép hoa quả đã thanh trùng thì số lượng bọt khí có thể xuất hiện nhanh và nhiều hơn. Giải thích.

2. Vi sinh vật được sử dụng trong thí nghiệm trên là nấm men. Ở điều kiện hiếu khí nấm men hô hấp hiếu khí nhưng khi không có O2 nấm men chuyển sang lên men

a. Giải thích hiện tượng trên.b. So sánh hô hấp hiếu khí và lên men.

70

3.Viết sơ đồ các bước chính và so sánh:a. Len men rượu etylic do Sac. Cerevisiae.b. Len men lactic do Streptococcus lactis.4. Để định lượng một dung dịch piridoxin chiết từ hạt ngô đang nảy

mầm, người ta chuẩn bị một môi trường dinh dưỡng lỏng chứa tất cả các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng của chủng Streptococcus faecalis, trừ piridoxin. Phân phối môi trường này vào 8 ống nghiệm khác nhau, đánh số từ 1 đến 8, sau đó tiến hành:

– Bổ sung vào các ống nghiệm từ 2 đến 6 những thể tích nhất định của một dung dịch mẹ chứa 2mg/ ml piridoxin chuẩn.

– Bổ sung vào các ống 7 và 8 những thể tích nhất định một dung dịch được chuẩn bị từ hạt ngô nảy mầm.

– Bổ sung nước cất vào tất cả các ống nghiệm để chúng đạt cùng một thể tích.

– Sau khi cấy vi khuẩn để đạt nồng độ tế bào ban đầu là 105 tế bào /ml, tất cả các ống ngiệm được giữ trong tủ ấm 370C trong 24 giờ trên máy lắc. Đo sự sinh trưởng bằng cách đếm khuẩn lạc trên mặt thạch của khay petri, kết quả trong bảng sau:

Ống nghiệm số 1 2 3 4 5 6 7 8

Môi trường dinh dưỡng (ml)

5 5 5 5 5 5 5 5

Dung dịch piridoxin chuẩn (ml)

0 0,5 1 1,5 2 2,5 0 0

Dung dịch ngô nảy mầm (ml)

0 0 0 0 0 0 2,5 5

Nước cất (ml) 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2,5 0

Sinh trưởng của vi sinh vật logN

5 5,12 5,24 5,36 5,39 5,40 5,12 5,24

a. Có thể thay thế chủng vi khuẩn Streptococcus faecalis trong thí

nghiệm trên bằng bất kì chủng vi khuẩn nào khác được không? Vì sao?

b. Ống nghiệm 1 có cần thiết không?

c. Các ống nghiệm từ 2 đến 6 có tác dụng gì?

5. Người ta nuôi vi khuẩn vi khuẩn giấm (Acetobacter suboxydans)

trên môi trường lỏng chứa các chất dinh dưỡng phù hợp, trong bình A

không có axit para–aminobenzoic (PAB) và trong bình B có hợp chất này. Ở từng thời 71

điểm người ta tính sự sinh trưởng của vi khuẩn giấm theo lnN = f(t), kết quả ghi trong bảng

sau; biết rằng chỉ có vi khuẩn phát triển trong môi trường B.

t (giờ) lnN t (giờ) lnN

0 11,50 9 15,75

1 11,50 10 16,55

2 11,50 11 17,05

3 11,50 12 17,40

4 11,85 13 17,55

5 12,45 14 17,65

6 13,25 15 17,70

7 14,10 16 17,75

8 14,90 17 17,75

a. Hợp chất PAB là loại hợp chất gì và có vai trò như thế nào đối với

vi khuẩn giấm này?

b. Hãy kẻ đồ thị sinh trưởng của vi khuẩn theo hàm số lnN = f(t).

c. Xác định các pha sinh trưởng và ý nghĩa sinh lí của từng pha.

d. Nêu mối liên hệ giữa 2 đại lượng lnNt (logarit N ở thời điểm t) và

lnNt + g (logarit N ở thời điểm t+g). Biết rằng g là thời gian một thế hệ

tế bào; t và t+g đều nằm trong pha log (pha cấp số mũ).

e. Hãy tính hằng số tốc độ sinh trưởng riêng và thời gian một thế hệ

của vi khuẩn này (lấy ln2 = 0,7).

72