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Tierärztliche Hochschule Hannover
Untersuchungen zur Eignung der interkalierenden Sub stanzen
Ethidiummonoazid und Propidiummonoazid für eine qua ntitative
Bestimmung lebender Campylobacter-Zellen aus
Lebensmittelproben und Wasser mittels real-time PCR
INAUGURAL - DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Diana Seinige
Hannover
Hannover 2014
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. med. vet. Corinna Kehrenberg, PhD Institut für Lebensmittelqualität und –sicherheit
Univ. Prof. Dr. med. vet. Günter Klein
Institut für Lebensmittelqualität und –sicherheit
1. Gutachter/ in: Prof. Dr. med. vet. Corinna Kehrenberg, PhD
Institut für Lebensmittelqualität und –sicherheit
Univ. Prof. Dr. med. vet. Günter Klein
Institut für Lebensmittelqualität und –sicherheit
2. Gutachter: Prof. Dr. Waldemar Ternes
Institut für Lebensmitteltoxikologie und
Chemische Analytik
Tag der mündlichen Prüfung: 17.11.2014
Teile dieser Arbeit wurden durch Mittel des Sanitätsamt der Bundeswehr (Grant M /
SAB X / 9A006) gefördert. Die Standardisierung der Methode wurde durch das
Bundesministerium für Wirtschaft und Technologie (BMWi) (Fkz-01FS10019)
finanziell gefördert.
I
Publikationsverzeichnis
Die vorliegende Dissertation basiert in überwiegenden Teilen auf den folgenden Publikationen: Publikation 1:
SEINIGE, D., C. KRISCHEK, G. KLEIN and C. KEHRENBERG (2014): Comparative Analysis and Limitations of Ethidium Monoazide and Propidium Monoazide Treatment for the Differentiation of Viable and Nonviable Campylobacter Cells. Appl. Environ. Microbiol. 80 (7), 2186-92. doi: 10.1128/AEM.03962-13.
Publikation 2:
SEINIGE, D., M. VON KÖCKRITZ-BLICKWEDE, C. KRISCHEK, G. KLEIN and C. KEHRENBERG (2014): Influencing Factors and Applicability of the Viability EMA-qPCR for a Detection and Quantification of Campylobacter Cells from Water Samples. PLoS One. 9 (11):e113812. doi: 10.1371/journal.pone.0113812.
Weitere Aspekte der Dissertation wurden in Form von Artikeln, Vorträgen oder Postern präsentiert: Zeitschriftenartikel:
SEINIGE, D., C. KEHRENBERG, C., KRISCHEK, A. BINDER u. G. KLEIN (2012): „Nachweis und Unterscheidung von lebenden und toten Bakterien mit der PCR am Beispiel von Campylobacter spp.“ Wehrmedizinische Monatsschrift 56. Jahrgang. Heft 8-9. August-September 2012, 198-200
Vorträge:
SEINIGE, D., G. KLEIN u. C. KEHRENBERG (2010): „Quantifizierung und Unterscheidung von lebenden und toten Lebensmittelinfektionserregern mittels PCR im Einsatz“. 1. Zwischenbericht, Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, Hannover, 02.12.2010
II
SEINIGE, D., G. KLEIN, C. KRISCHEK u. C. KEHRENBERG (2011): „Untersuchungen zur Quantifizierung und Unterscheidung von lebenden und toten Campylobacter spp. mittels real-time PCR“. 52. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes Lebensmittelhygiene der DVG, Garmisch, 27.09.-30.09.2011, Amtstierärztlicher Dienst und Lebensmittelkontrolle S.45 SEINIGE, D., G. KLEIN, C. KRISCHEK u. C. KEHRENBERG (2011): „Quantifizierung und Unterscheidung von lebenden und toten Lebensmittelinfektionserregern mittels PCR im Einsatz“. 2. Zwischenbericht, Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, Hannover, 16.11.2011
SEINIGE, D., G. KLEIN, C. KRISCHEK u. C. KEHRENBERG (2011): „Quantifizierung und Unterscheidung von lebenden und toten Lebensmittelinfektionserregern mittels PCR im Einsatz“. Vortrag im Rahmen des Kolloquium für Tiergesundheit und Lebensmittelqualität an der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, 02.12.2011 SEINIGE, D., G. KLEIN, C. KRISCHEK u. C. KEHRENBERG (2012): „Quantifizierung und Unterscheidung von lebenden und toten Lebensmittelinfektionserregern mittels PCR im Einsatz“. Vortrag im Rahmen des Workshop I „Workshop Normung von PCR-Verfahren 2012“ des Instituts für Lebensmittelqualität und -sicherheit der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, Hannover, 14.02.2012
SEINIGE, D., G. KLEIN, M. VON KÖCKRITZ-BLICKWEDE u. C. KEHRENBERG (2013): Nachweis von Campylobacter spp. aus Wasserproben. Eignet sich die EMA-real-time PCR? Vortrag im Rahmen des Workshop II „Neue Entwicklungen zu Nachweismethoden und zur Epidemiologie von Campylobacter spp.“ des Instituts für Lebensmittelqualität und -sicherheit der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, Hannover, 12.03.2013
SEINIGE, D., M. VON KÖCKRITZ-BLICKWEDE, G. KLEIN u. C. KEHRENBERG (2013): Untersuchungen zur Membranintegrität und zum quantitativen Nachweis von Campylobacter aus Wasserproben mittels qPCR unter Anwendung interkalierender Substanzen. 54. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes Lebensmittelhygiene der DVG, Garmisch, 24.09.-27.09.2013, Amtstierärztlicher Dienst und Lebensmittelkontrolle S. 62
III
Poster: KEHRENBERG, C., A. ABDULMAWJOOD, G. KLEIN u. D. SEINIGE (2011): „Quantifizierung lebender Campylobacter spp. aus Wasserproben: Eine
Evaluierungsstudie mittels EMA-real-time PCR“. 52. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes Lebensmittelhygiene der DVG, Garmisch, 27.09.-30.09.2011, Amtstierärztlicher Dienst und Lebensmittelkontrolle S.170 SEINIGE, D., G. KLEIN, C. KRISCHEK u. C. KEHRENBERG (2011): „Eignung der Real-time PCR unter Zusatz von interkalierenden Substanzen zur Quantifizierung und Lebend/Tot-Unterscheidung von Campylobacter spp.“. Tagung der DVG-Fachgruppe „Bakteriologie und Mykologie“, Leipzig, 27.06.-29.06.2012, Tagungsband S.217 SEINIGE, D., G. KLEIN, C. KRISCHEK u. C. KEHRENBERG (2012): „Eignung der EMA real-time PCR Methode zur Detektion lebender Campylobacter auf Geflügelfleisch“. 53. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes Lebensmittelhygiene der DVG, Garmisch, 25.09.-28.09.2012, Amtstierärztlicher Dienst und Lebensmittelkontrolle S.184 SEINIGE, D., M. VON KÖCKRITZ-BLICKWEDE, G. KLEIN and C. KEHRENBERG (2013): Applicability of a qPCR method combined with an intercalating dye for detection and differentiation of viable Campylobacter cells from water samples. FEMS 2013 5th Congress of European Microbiologists, Leipzig, Germany, 21.07.-25.07.2013 Congress Book S. 229 (Nr. 559) SEINIGE, D., C. KRISCHEK, G. KLEIN u. C. KEHRENBERG (2014): Bestimmung der Signalreduktion toter Campylobacter-Zellen mittels qPCR unter Anwendung der Differenzierungsmittel EMA und PMA. 55. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes Lebensmittelhygiene der DVG, Garmisch, 23.09.-26.09.2014, Amtstierärztlicher Dienst und Lebensmittelkontrolle S.188 SEINIGE, D., C. KRISCHEK, G. KLEIN and C. KEHRENBERG (2014): A Comparative Study of the Applicability and Limitations of Ethidium Monoazide and Propidium Monoazide Treatments for a Selective Detection of Viable Campylobacter Cells by qPCR. 3rd EAVLD Congress der European Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, 12 to 15 October, 2014, Pisa, Italy. Abstract Book S. 215 (Nr. 121)
V
Inhaltsverzeichnis
Publikationsverzeichnis ............................................................................................... I
Inhaltsverzeichnis ....................................................................................................... V
Abkürzungsverzeichnis ............................................................................................... X
Tabellenverzeichnis .................................................................................................. XII
Abbildungsverzeichnis .............................................................................................. XII
1. Einleitung ......................................................................................................... 1
2. Literaturübersicht ............................................................................................. 3
2.1. Bakterien des Genus Campylobacter .............................................................. 3
2.1.1. Historie .................................................................................................. 3
2.1.2. Taxonomie und Merkmale ..................................................................... 4
2.1.3. Zoonoseerreger Campylobacter: Infektion und Erkrankungen .............. 5
2.1.4. Vorkommen von Campylobacter spp. in Geflügelfleisch ....................... 6
2.1.5. Wasser-assoziierte Campylobacter Ausbrüche ..................................... 7
2.1.6. Vorkommen von Campylobacter spp. in Wasser .................................. 8
2.1.7. Verfahren zum Nachweis und zur Charakterisierung von Campylobacter
spp. ........................................................................................................ 9
2.2. Kriterien zur Differenzierung von lebenden und toten Bakterien .................... 11
2.2.1. Kultivierbarkeit von Bakterien .............................................................. 11
2.2.2. Nachweis von mRNA und rRNA .......................................................... 14
2.2.3. Bestimmung der Membranintegrität von Bakterien .............................. 15
2.2.4. Bestimmung der metabolischen Aktivität der Zelle .............................. 17
2.3. Rechtliche Regelungen zum Nachweis von darmpathogenen Campylobacter
spp. ................................................................................................................ 19
2.3.1. Problematik beim Nachweis von Campylobacter in Lebensmitteln unter
Verwendung der amtlichen Verfahren ................................................. 21
2.4. Nachweis von Campylobacter spp. mittels PCR und real-time PCR .............. 23
2.4.1. PCR Nachweise für Campylobacter spp. ............................................ 23
2.4.2. Real-time PCR Nachweise für Campylobacter spp. ............................ 25
VI
2.4.3. Anwendung der real-time PCR zum Nachweis von Campylobacter spp.
in Geflügelfleischproben und Wasserproben ....................................... 26
2.4.4. Einsatz von interkalierenden Substanzen für real-time PCR
Anwendungen ..................................................................................... 27
2.4.5. Nachteile bei der Anwendung interkalierender Substanzen ................ 29
2.5. Zielstellung der Studie.................................................................................... 31
3. Material und Methoden .................................................................................. 33
3.1. Bakterien Stämme und Spezies-Bestimmung ................................................ 33
3.2. Inaktivierung von Campylobacter spp. und Keimzahlbestimmung mittels
kultureller Keimzählung .................................................................................. 34
3.3. EMA- und PMA- Behandlung der Bakterienproben ........................................ 35
3.4. DNA Isolierung und qPCR Experimente ........................................................ 35
3.5. Ermittlung der Signalreduktion in der qPCR bei Verwendung von
hitzeinaktivierten Campylobacter-Zellen ........................................................ 36
3.6. Testung der EMA-qPCR Methode zum Nachweis lebender Campylobacter-
Zellen auf Geflügelfleischproben .................................................................... 37
3.7. Isolierung von Campylobacter-Zellen aus Wasserproben .............................. 37
3.8. Testung von Oberflächenwasser-, Leitungswasser-, Mineralwasser- und
Regenwasserproben ...................................................................................... 38
3.9. Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen ................................................ 39
3.10. Statistische Auswertungen ............................................................................. 39
4. Zusammenfassung der Ergebnisse ............................................................... 41
4.1. Kapitel I – Resultate der Methodenentwicklung ............................................. 41
4.1.1. Untersuchungen zur Quantifizierung von Campylobacter spp. mittels
einer qPCR-Methode ........................................................................... 41
4.1.2. Bestimmung des Einflusses von EMA und PMA auf die Ergebnisse der
qPCR ................................................................................................... 42
4.1.3. Nachweis lebender Campylobacter-Zellen in Gemischen aus lebenden
und hitzeinaktivierten Zellen ................................................................ 44
4.1.4. Limitierungen von EMA und PMA bei Verwendung von hitzeinaktivierten
Campylobacter-Zellen in der qPCR ..................................................... 46
VII
4.1.5. Erstellung von Standardkurven mit Zugabe von EMA und PMA ......... 46
4.1.6. Methodenvergleichsuntersuchung zwischen den Ergebnissen aus der
EMA-qPCR und der mikrobiologischen Referenzmethode .................. 48
4.2. Kapitel II – Resultate der Anwendung der Methode an Lebensmitteln ........... 49
4.2.1. Anwendung der EMA-qPCR zum Nachweis lebender Campylobacter-
Zellen auf gespikten Hühnerfleischproben .......................................... 49
4.2.2. Vergleichende Untersuchung der Membranfiltrations- und
Zentrifugations-methode zur Isolierung von Campylobacter-Zellen aus
Wasser ................................................................................................ 51
4.2.3. Fluoreszenzmikroskopische Bestimmung der prozentualen Anteile
lebender und toter Campylobacter-Zellen bei Verwendung der
Zentrifugations- und Membranfiltrationsmethode ................................ 51
4.2.4. Ergebnisse der qPCR mit und ohne EMA bei Verwendung der
Zentrifugations- und Membranfiltrationsmethode ................................ 52
4.2.5. Fluoreszenzmikroskopische Bestimmung der prozentualen Anteile von
lebenden und toten Bakterienzellen in Leitungswasser- und
Oberflächenwasserproben .................................................................. 54
4.2.6. Ergebnisse der qPCR und EMA-qPCR zum Nachweis von
Campylobacter-Zellen aus unterschiedlichen Wasserproben .............. 55
4.2.7. Nachweis von lebenden Campylobacter-Zellen in unterschiedlichen
Gemischen aus lebenden und toten Zellen bei Verwendung von
Leitungswasserproben ........................................................................ 57
5. Publikationen ................................................................................................. 59
5.1. Comparative Analysis and Limitations of Ethidium Monoazide and Propidium
Monoazide Treatment for the Differentiation of Viable and Nonviable
Campylobacter Cells ...................................................................................... 59
5.2. Influencing Factors and Applicability of the Viability EMA-qPCR for a Detection
and Quantification of Campylobacter Cells from Water Samples ................... 61
6. Diskussion ...................................................................................................... 63
6.1. I. Abschnitt - Methodenentwicklung ............................................................... 64
VIII
6.1.1. Einfluss von EMA und PMA auf die Resultate der real-time PCR bei
Verwendung von lebenden Zellen ....................................................... 64
6.1.2. Erklärungsmodelle für Ct-Wert-Verschiebungen in qPCR-Experimenten
nach Einsatz von Differenzierungsmitteln ............................................ 66
6.1.3. Standardkurven zur Bestimmung der Keimkonzentration von
Campylobacter spp. ............................................................................. 68
6.1.4. Effektivität von EMA und PMA zur Differenzierung von lebenden und
toten Zellen .......................................................................................... 69
6.1.5. Limitierungen bei Verwendung von Differenzierungsmitteln zur
Detektion lebender Campylobacter spp. mittels qPCR ........................ 70
6.1.6. Ansätze zur Verbesserung der qPCR-Resultate unter Verwendung von
Differenzierungsmitteln ........................................................................ 72
6.1.6.1. Verbesserung der qPCR-Resultate bei Versuchsansätzen, bei denen
eine Vorbehandlung mit EMA durchgeführt wurde .......................... 72
6.1.6.2. Verbesserung der qPCR-Resultate bei Versuchsansätzen, bei denen
eine Vorbehandlung mit PMA durchgeführt wurde .......................... 74
6.1.7. Zusammenhang zwischen dem Inaktivierungsverfahren der Bakterien
und den Ergebnissen der qPCR .......................................................... 75
6.2. II. Abschnitt - Testung der etablierten EMA-qPCR an Lebensmittelproben ... 78
6.2.1. Geflügel ............................................................................................... 78
6.2.1.1. Möglichkeit der Anwendung der EMA-qPCR Methode bei natürlich
kontaminiertem Geflügelfleisch ....................................................... 78
6.2.1.2. Einfluss der Lebensmittelmatrix Geflügelfleisch auf die Resultate der
qPCR ............................................................................................... 80
6.2.1.3. Status der Zellintegrität von Campylobacter spp. auf Geflügelfleisch .
................................................................................................... 80
6.2.2. Wasser ................................................................................................ 83
6.2.2.1. Detektion von lebenden Campylobacter-Zellen aus Wasserproben
mittels qPCR-Verfahren .................................................................. 83
6.2.2.2. Einfluss der Isolierungsmethode auf Campylobacter-Zellen aus
Wasserproben sowie auf die Ergebnisse der qPCR ....................... 84
IX
6.2.2.3. Einfluss der verwendeten Wasserart für einen Nachweis lebender
Campylobacter-Zellen aus Wasserproben ...................................... 87
6.2.2.4. Limitierungen bei Verwendung von Oberflächenwasser ................. 87
6.2.2.5. Testung von Leitungswasser, Mineralwasser und Regenwasser .... 90
6.3. Schlussfolgerung ........................................................................................... 92
7. Zusammenfassung......................................................................................... 93
8. Summary ........................................................................................................ 97
9. Literaturverzeichnis ...................................................................................... 101
Danksagung ........................................................................................................... 129
X
Abkürzungsverzeichnis
ANOVA Varianzanalyse (engl.: analysis of variance)
BfR Bundesinstitut für Risikobewertung
bp Basenpaare (engl.: base pairs)
C. Campylobacter
CCDA Kohle Cefoperazon Desoxycholat Agar (engl.: Charcoal cefoperazone desoxycholate agar)
Ct Schwellenwert-Zyklus (engl.: threshold cycle)
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure (engl.: desoxyribonucleic acid)
DSMZ Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen
EFSA Europäische Behörde für Lebenmsittelsicherheit (engl.: European food safety authority
EMA Ethidiummonoazid
g Erdbeschleunigung
KbE Kolonie-bildende Einheiten
l Liter
log10 Dekadischer Logarithmus
LPSN List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature
ml Milliliter
MLST Multilocus sequence typing
mRNA messenger RNA
µg Mikrogramm
µm Mikrometer
XI
µmol Mikromol
NaCl Natriumchlorid
NTU Nephelometrischer Trübungswert (engl.: nephelometric turbidity unit)
p Signifikanz
PCR Polymerase Kettenreaktion (engl.: polymerase chain reaction)
PMA Propidiummonoazid
qPCR Quantitative real-time PCR
RFLP Restriction fragment length polymorphism
RKI Robert-Koch-Institut
RNA Ribonukleinsäure (engl.: ribonucleic acid)
rpm Umdrehungen pro Minute (engl.: revolutions per minute)
rRNA Ribosomale RNA
SD Standardabweichung (engl.: standard deviation)
spp. Spezies
UV Ultraviolett
VBNC Lebend, aber nicht kultivierbar (engl.: viable but non culturable)
W Watt
XII
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Verfahren zur Differenzierung von lebenden und toten Bakterien ........... 18
Tabelle 2: Zielgene zum Nachweis von Campylobacter spp. mittels PCR ............... 25
Tabelle 3: Signalreduktion in der qPCR bei Verwendung der Differenzierungsmittel
EMA und PMA oder dem Lösungsmittel DMSO (2%) .............................. 44
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Standardkurve, erstellt aus seriellen Verdünnungsreihen von C. jejuni
DSM 4688 in drei unabhängigen Wiederholungen .............................. 42
Einleitung 1
1. Einleitung
Bakterien der Gattung Campylobacter (C.) sind in Europa die häufigsten bakteriellen
Lebensmittelinfektionserreger und Verursacher der Campylobacteriose beim
Menschen (EFSA 2013). Seit mehreren Jahren stehen sie an Platz eins der nach § 7
des Infektionsschutzgesetzes dem Robert-Koch-Institut gemeldeten bakteriellen
Durchfallerreger noch vor den Salmonellen-Erkrankungen. Allein im Jahr 2012
wurden 62.880 Erkrankungsfälle in Deutschland gemeldet (RKI 2013), die Zahl an
nicht gemeldeten Krankheitsfällen ist vermutlich jedoch noch deutlich höher (EFSA
2011). Die Übertragung des Zoonoseerregers auf den Menschen erfolgt primär durch
den Verzehr von schlecht gegartem, kontaminiertem Geflügelfleisch und
Kreuzkontaminationen während der Lebensmittelzubereitung. Neben Geflügelfleisch
und Geflügelfleischprodukten zählen auch Oberflächengewässer und verunreinigtes
Trinkwasser zu den Infektionsquellen (KOENRAAD et al. 1997, SCHÖNBERG-
NORIO et al. 2004). Handlungsoptionen zur Reduktion von Campylobacter spp. in
der Lebensmittelkette werden in den letzten Jahren europaweit diskutiert (EFSA
2011). Bislang sind jedoch geeignete Minimierungsstrategien sowie Grenzwerte zum
Keimgehalt in Lebensmitteln noch nicht in die Gesetzgebung integriert (EFSA 2011,
VO EG 2073/2005). Zur Implementierung effektiver Kontrollsysteme und für eine
quantitative Risikoanalyse ist es notwendig, geeignete sensitive Detektionsmethoden
zur Verfügung zu haben. Diese sollten als Schnellmethode einen quantitativen
Erregernachweis ermöglichen und vor allem auch zeitnahe Ergebnisse erzielen, um
einen direkten Eingriff in die Lebensmittelsicherheit gewährleisten zu können
(BOTTELDOORN et al. 2008).
Ein solcher quantitativer Erregernachweis von Campylobacter spp. wäre hierbei ein
wichtiger Schritt zur Prüfung des von einer bakteriellen Kontamination ausgehenden
Gesundheitsrisikos von Lebensmitteln. Mit herkömmlichen mikrobiologischen
Methoden ist der Erregernachweis jedoch zeitaufwändig und aufgrund der oft nicht
einheitlichen Koloniemorphologie sowie des physiologisch anspruchsvollen
2 Einleitung
Wachstums des Genus Campylobacter zudem stark erschwert (HELLEIN et al.
2012).
Molekularbiologische Nachweismethoden wie die real-time PCR bieten neben hoher
Sensitivität und Spezifität den Vorteil schneller Resultate (BEST et al. 2003). In
Kombination mit dem Einsatz eines Differenzierungsmittels ist es mit dieser Methode
zudem möglich, lebende und somit infektiöse Zellstadien von toten Zellen zu
unterscheiden (RUDI et al. 2005). Für viele Bakterienspezies - wie Legionella spp.,
Helicobacter pylori und Pseudomonas aeruginosa - wurde die Methode bereits
erfolgreich getestet (CHANG et al. 2010, AGUSTÍ et al. 2010, HELLEIN et al. 2012).
Der Einsatz der Methode zum Nachweis und zur Quantifizierung von Campylobacter
wurde in ersten Studien durchgeführt, die Ergebnisse wurden jedoch sehr kontrovers
diskutiert (FLEKNA et al. 2007, RUDI et al. 2005). Ziel der eigenen Arbeit war es
daher, basierend auf diesen Vorstudien eine geeignete quantitative
Bestimmungsmethode für die Bakterienspezies C. jejuni und C. coli zu entwickeln,
die es ermöglicht, den Keimgehalt lebender Campylobacter-Zellen von den
Lebensmittelmatrices Geflügelfleisch und Wasser nachzuweisen. Die Entwicklung
einer quantitativen Schnellmethode zum Erregernachweis und zur Quantifizierung
stellt daher einen wichtigen Beitrag dar, um zu einer Reduktion von thermotoleranten
Campylobacter spp. in der Lebensmittelkette zu kommen. Dieses ist ein wichtiger
Schritt für die Lebensmittelsicherheit und den gesundheitlichen Verbraucherschutz.
Literaturübersicht 3
2. Literaturübersicht
2.1. Bakterien des Genus Campylobacter
2.1.1. Historie
Erstmalig isolierte der Kinderarzt Theodor Escherich im Jahre 1886 bislang
unbekannte spiralig gewundene Stäbchenbakterien aus dem Darminhalt von an
Diarrhoe erkrankten Kindern im Säuglingsalter. Zwei Jahre später gelang ihm dies
auch bei erkrankten Katzenwelpen (ESCHERICH 1886). Er benannte diese
Bakterien zunächst aufgrund ihrer gewundenen Form und Beweglichkeit als
„Vibrionen“ und bezeichnete sie mit dem Namen Vibrio felinus. Nachfolgend wurden
auch von MC FADYEAN und STOCKMAN (1913) aus Abortmaterial von Schafen
und von SMITH und TAYLOR (1919) aus abortierten Rinderfeten und Plazentateilen
spiralförmige Bakterien isoliert, die den Namen Vibrio fetus erhielten. JONES et al.
(1931) fanden Vibrionen bei an Winterdysenterie erkrankten Kälbern und DOYLE
(1948) im Colon von erkrankten Schweinen. Sie bezeichneten die Bakterien nach
ihrem Fundort entsprechend als Vibrio jejuni bzw. Vibrio coli. Beim Menschen gelang
die Isolierung von Vibrionen-ähnlichen Bakterien erstmals durch KING im Jahre 1957
aus Blutkulturen von an hämorrhagischer Enteritis erkrankten Patienten. Dieser
Vibrio fetus-ähnliche Stamm hatte jedoch ein Wachstumsoptimum bei 42 °C (anstatt
25 °C) und wurde somit als „Vibrio-like“ bezeichnet. SEBALD und VERON (1963)
stellten fest, dass sich der Guanin- und Cytosingehalt der DNA dieses Stammes von
der Gattung Vibrio unterschied und benannten diese dann mit dem neuen
Gattungsnamen „Campylobacter“, abgeleitet aus dem griechischen Wort für
„gebogener Stab“. Jedoch erst Anfang der 70er Jahre mit der Entwicklung von
antibiotikahaltigen Selektivmedien (DEKEYSER et al. 1972, SKIRROW 1977)
wurden Bakterien des Genus Campylobacter als Enteritiserreger beim Menschen
4 Literaturübersicht
anerkannt und eine Routinediagnostik der Campylobacteriose ermöglicht (KIST
2002, BUTZLER 2004).
2.1.2. Taxonomie und Merkmale
Bakterien der Gattung Campylobacter sind spiralig bis korkenzieherförmige,
gramnegative, sporenlose Bakterien aus der Klasse der Epsilonproteobacteria
welche zur Ordnung der Campylobacterales in der Familie der Campylobacteraceae
gehören. Die Gattung Campylobacter beinhaltet derzeit 32 Spezies und 13
Subspezies (LPSN), wobei die drei humanpathogenen Spezies C. jejuni, C. coli und
C. lari die größte humanmedizinische Bedeutung haben (MAN 2011, RKI 2013).
Campylobacter spp. besitzen eine Länge von 0,5 - 8,0 µm und weisen einen
Durchmesser von 0,2 - 0,5 µm auf (VANDAMME et al. 2000). Ihre Beweglichkeit
wird mit Hilfe der monotrichen, bi- oder unipolaren Begeißelung ermöglicht (URSING
et al. 1994). Campylobacter haben komplexe nutritive Ansprüche. Sie sind
chemoorganotroph und können somit keinen Sauerstoff verstoffwechseln, sondern
benötigen Nitrat als Oxidans für ihren Energiestoffwechsel (VANDAMME et al. 1991).
Optimale Anzuchtbedingungen herrschen daher bei einer mikroaeroben Atmosphäre
von 5 % O2, 10 % CO2 und 85 % N2 (CORRY et al. 1995, GHARST et al. 2013).
Aufgrund der geringen Sauerstoff- und Sauerstoffradikal-Toleranz werden zur
Anzucht von Campylobacter spp. Medien verwendet, die Schutzstoffe gegen
Sauerstoffradikale beinhalten, wie zum Beispiel Blut, Eisen oder Pyruvat (SILVA et
al. 2011). Sie wachsen auf Blut- oder Selektivnährböden, wie z.B. Karmali-Agar oder
modifiziertem Charcoal Cefoperazon Desoxycholat Agar (mCCD-Agar) bei
Temperaturen von 35,5 °C - 45,0 °C (SIMBERT 1978, SKIRROW und BENJAMIN
1980, SKIRROW 1994). Das physiologische Habitat der Campylobacter- Spezies
C. jejuni, C. coli, C. lari und C. upsaliensis ist der Darmtrakt von warmblütigen Tieren,
insbesondere Vögeln (KETLEY 1997, ABULREESH et al. 2006). Angepasst an die
Körpertemperatur dieser Spezies wachsen die thermotoleranten Arten bei einem
Temperaturoptimum von 41,5 °C (VANDAMME et al. 2000, ALLOS 2001). Außerhalb
des intestinalen Traktes ist die Tenazität jedoch limitiert, so dass eine Vermehrung
Literaturübersicht 5
der Bakterien auf Lebensmitteln nicht möglich ist (RKI 2011). Das Überleben von
Bakterien des Genus Campylobacter bei Kühltemperaturen ist jedoch gut, und ihre
Stoffwechselaktivität bleibt bei Temperaturen um 4 °C erhalten (MAZIERO und
OLIVEIRA 2010). Obwohl keine Kälteschockproteine synthetisiert werden, können
Campylobacter spp. zum Teil auch Tiefkühltemperaturen überleben (SAMPERS et
al. 2009).
2.1.3. Zoonoseerreger Campylobacter: Infektion und Erkrankungen
Beim Geflügel zählen Campylobacter spp. zu den Kommensalen des
Intestinaltraktes und persistieren dort überwiegend symptomlos (BERRY et al. 1988,
WILLIAMS et al. 2013). Sie besiedeln vor allem den Blinddarm der Tiere und werden
von dort aus durch Kontaminationen während des Schlachtprozesses auf die
Tierkörperoberfläche verbracht (ELLERBROEK et al. 2010). Die Übertragung des
Erregers auf den Menschen erfolgt primär durch den Verzehr von schlecht gegartem,
kontaminiertem Geflügelfleisch als auch durch Kreuzkontaminationen bei der
Lebensmittelzubereitung sowie über direkten und indirekten Kontakt mit infiziertem
Geflügel (EFSA 2010). Weitere Infektionsquellen sind Rohmilch, kontaminiertes,
nicht aufbereitetes Trinkwasser sowie rohes Hackfleisch. Auch kolonisierte
Heimtiere, insbesondere durchfallerkrankte Katzen und Hundewelpen, können den
Erreger übertragen (EFSA 2005, RKI 2013). Zudem sind Infektionen durch
kontaminierte Oberflächengewässer und Trinkwasser möglich (BLACKBURN et al.
2004, SMITH et al. 2006, PITKÄNEN 2013). Hauptsächliche Verursacher der
Campylobacteriose sind die Spezies C. jejuni und C. coli und bei einigen wenigen
Fällen wurde C. lari identifiziert (RKI 2013). Überwiegende Symptome dieser
Zoonose sind gastrointestinale Beschwerden mit wässrig-blutigen Durchfällen, die in
der Regel nach einigen Tagen selbstlimitierend sind. Antibiotikatherapien sind nur in
Ausnahmefällen bei schweren Erkrankungen, Bakteriämien oder bei
immunsupprimierten Patienten angezeigt (RKI 2011). In seltenen Fällen können
neben Enteritiden jedoch schwerwiegendere Langzeitfolgen wie das Guillain-Barré-
Syndrom - eine polyneuropathische Erkrankung des Nervensystems - sowie die
6 Literaturübersicht
reaktive Arthritis auftreten (NACHAMKIN et al. 1998). Die Inkubationszeit beträgt
zwischen 1 - 7 Tagen mit einer durchschnittlichen Krankheitsdauer von ca. einer
Woche. Eine Erregerausscheidung nach überstandener Erkrankung ist jedoch noch
lange möglich und kann bis zu 3 - 4 Wochen andauern (EFSA 2014). Die
Infektionsdosis von thermotoleranten Campylobacter wird als sehr gering
angenommen und wurde in einer Studie mit 500 Keimen angegeben (ROBINSON
1981, WALLIS 1994). In einer weiteren Studie an freiwilligen Testpersonen wurden
von BLACK et al. (1988) eine Dosis von 104 KbE/ml für eine Infektion ermittelt. Die
Infektionsdosis ist jedoch abhängig von der Virulenz des Stammes, der
Immunitätslage des Menschen sowie von auf die Bakterien einwirkenden
Umweltfaktoren (BfR 2007).
2.1.4. Vorkommen von Campylobacter spp. in Geflügelfleisch
Campylobacter spp. kommen bei vielen Haus- und Nutztieren vor, überwiegend
jedoch beim Geflügel (NACHAMKIN 2001, HUMPHREY et al. 2007, EFSA 2011).
Zwischen 20 % und 30 % der Campylobacteriosen werden durch den Konsum oder
die Verarbeitung von Hühnerfleisch und dadurch ausgelöste Kreuzkontaminationen
verursacht (EFSA 2011). Die Nachweisraten von Campylobacter auf Geflügelfleisch
im Einzelhandel sind in einer Studie von MADDEN et al. (1998) mit 38 % angegeben
worden. Dabei wurden 120 Verbraucherpackungen von Hühnerteilstücken
untersucht. ATANASSOVA und RING (1999) wiesen in einer Studie, bei der 509
Proben ausgewertet wurden, in 45,9 % der Broilerkarkassen Campylobacter spp.
nach. ALTER et al. (2004) konnten sogar bis zu 60 % Campylobacter spp. positive
Proben auf Geflügelfleischproben im Einzelhandel nachweisen. In einer Studie von
KLEIN et al. (2007), bei der 99 Hühnerkarkassen an einem Schlachthof in
Deutschland beprobt wurden, waren 51,5 % der Karkassen mit bis zu 6,5 log10 KbE
belastet. Die Mehrzahl der Keime befanden sich hierbei nach Studien von
CHANTARAPANONT et al. auf der Oberfläche des Geflügelschlachtkörpers
(CHANTARAPANONT et al. 2003, CHANTARAPANONT et al. 2004). So wurde auch
in einer vergleichenden Studie der Keimzahlbelastung der Oberfläche von
Literaturübersicht 7
Hühnerfleisch im Vergleich zum Inneren der Produkte eine deutlich höhere Belastung
der Oberfläche ermittelt, wobei 2,4 log10 KbE/g nachgewiesen wurden.
Demgegenüber war die Keimbelastung im Inneren der Produkte vernachlässigbar
gering, mit Werten um die Nachweisgrenze (SCHERER et al. 2006). Vermutlich
spielt somit die Übertragung des Erregers auf den Menschen durch
Kreuzkontaminationen oder kontaminierte Oberflächen der Lebensmittel eine
größere Rolle als der Verzehr von ungenügend gegartem Geflügelfleisch (SCHERER
et al. 2006, BfR 2007).
2.1.5. Wasser-assoziierte Campylobacter Ausbrüche
Neben Geflügelfleisch zählt auch kontaminiertes Wasser zu den Ausbruchsquellen
humaner Campylobacteriosen (HÄNNINEN et al. 2003, GUBBELS et al. 2012). Die
Kontamination von Wasser kann dabei durch einen Eintrag von Fäzes von
Wassergeflügel, Wild- oder Nutztieren und über Kontaminationen von nicht
geklärtem Abwasser in Trink- und Oberflächenwasser erfolgen (KOENRAAD et al.
1994, MERRITT et al. 1999, ABULREESH et al. 2006, HELLEIN et al. 2011). Auch
starke Regenfälle und damit einhergehende Abschwemmungen von gedüngten
Agrarflächen stellen ein Kontaminationsrisiko dar (CLARK et al. 2003, MELBY et al.
1991, RICHARDSON et al. 2007). Im Jahr 1978 wurde erstmalig von einem wasser-
bedingten Campylobacter Ausbruch in Vermont, USA, berichtet (HALEY et al. 1980,
VOGT et al. 1982). In den darauffolgenden Jahren wurde eine Vielzahl an weiteren
Campylobacteriose-Fällen, ausgelöst durch kontaminiertes Trink- und
Oberflächengewässer, beschrieben (SACKS et al. 1986, HÄNNINEN et al. 2003,
PITKÄNEN 2013). Campylobacter jejuni war in diesen Fällen die am häufigsten
nachgewiesene Spezies (GALLAY et al. 2006, SAID et al. 2003, SCHUSTER et al.
2005). Die meisten dieser Ausbrüche wurden in nordeuropäischen Ländern gemeldet
(PITKÄNEN 2013). Aufgrund mangelnder oder ungeeigneter Detektionssysteme oder
fehlender Testungen kommen in vielen Ländern Campylobacter-Ausbrüche vor,
vermutlich jedoch häufiger als bislang beschrieben (PITKÄNEN 2013).
8 Literaturübersicht
2.1.6. Vorkommen von Campylobacter spp. in Wasser
Neben Geflügelfleisch sind kontaminiertes Trinkwasser oder mit Spülwasser
verunreinigte Lebensmittel bedeutend bei der Erregerübertragung (THOMAS et al.
1998). Zudem stellen auch kontaminierte Oberflächengewässer und Badeseen eine
mögliche Infektionsquelle dar (KOENRAAD et al. 1997, SCHÖNBERG-NORIO et al.
2004). Viele Studien zur Keimbelastung von Wasser mit Campylobacter sind
qualitativer Natur, einige wenige haben jedoch auch quantitative Ergebnisse erzielt
(EDGE et al. 2013, HOKAJÄRVI et al. 2013, PITKÄNEN 2013). Im Allgemeinen war
bei diesen Studien eine geringe Keimkonzentration zu detektieren. So haben
HELLEIN et al. (2012) in einer Studie mittels quantitativer real-time PCR Keimzahlen
von 0,14 - 4,6 x 103 Zellen pro ml in Oberflächenwasser nachgewiesen. In anderen
Studien wurden Campylobacter Keimkonzentrationen von unterhalb der
Nachweisgrenze liegend bis zu 1,0 x 102 Zellen/ml Oberflächenwasser mit der
mikrobiologischen Keimzählung bestimmt (RECHENBURG und KISTEMANN 2009,
HOKAJÄRVI et al. 2013). In einer vergleichenden Studie von OBIRI-DANSO et al.
(2001) an verschiedenen Campylobacter Spezies wurde berichtet, dass C. lari in
Wasser länger überleben kann als C. jejuni oder C. coli. KORHONEN und
MARTIKAINEN (1991) bestätigten jedoch für C. jejuni eine längere Überlebensdauer
in der kultivierbaren Form in Teichwasser als für C. coli. Die Mechanismen zum
Überleben von Campylobacter spp. im Wassermilieu sind bislang wenig bekannt
(GONZÁLES und HÄNNINEN 2012). Einflussfaktoren der Überlebensrate in
Gewässern sind zum Beispiel die Temperatur, das Sonnenlicht, die Kompetition mit
anderen Mikroorganismen sowie der Gehalt an Nähr- und Sauerstoff (THOMAS et al.
1999). Bei niedrigen Temperaturen, wenig Sonneneinstrahlung und geringen
Mengen an kompetetiver Begleitflora wird ein Überleben von Bakterien des Genus
Campylobacter begünstigt (SVENSSON et al. 2008). In einer irischen und
schwedischen Studie wurde zudem berichtet, dass auch das Vorhandensein von
Biofilmen oder in Wasser lebenden Protozoen-Arten, wie Arcanthamoeba polyphaga,
in denen die Bakterien intrazellulär überleben, das Fortbestehen in der Umwelt
sichern können (SNELLING et al. 2005, AXELSSON-OLSSON et al. 2005).
Literaturübersicht 9
2.1.7. Verfahren zum Nachweis und zur Charakterisie rung von
Campylobacter spp.
Der Nachweis und die Differenzierung von Bakterien innerhalb des Genus
Campylobacter sind häufig mit Schwierigkeiten verbunden. Aufgrund des langsamen,
kulturell anspruchsvollen Wachstums und der oft nicht einheitlichen
Koloniemorphologie des Erregers ist der kulturelle Nachweis alleine oft nicht möglich
(HELLEIN et al. 2012). Die biochemische Speziesbestimmung lässt sich aufgrund
der eingeschränkten biochemischen Aktivität von Campylobacter spp. nicht immer
eindeutig erbringen, so dass die Reproduzierbarkeit und Standardisierung dieser
Methoden schwierig ist (EBERLE und KIESS 2012).
Die Spezies-Bestimmung von Campylobacter kann auf phänotypischen oder
genotypischen Merkmalen beruhen (NACHAMKIN et al. 2008). Im Allgemeinen
haben genotypische Methoden jedoch eine höhere Differenzierungskraft als
phänotypische Methoden und werden aufgrund dessen in zunehmendem Maße
eingesetzt.
Bei der phänotypischen Speziesbestimmung werden phänotypisch erkennbare
Charakteristika eines Erregers, wie morphologische Merkmale, das Verhalten in der
Gramfärbung oder biochemische Reaktionen bestimmt. Mit der biochemischen
Differenzierung erfolgt eine Spezieseinteilung der Isolate durch die Analyse ihrer
Stoffwechselaktivität (EBERLE und KIESS 2012). Aufgrund der eingeschränkten
biochemischen Aktivität von Bakterien des Genus Campylobacter ist diese Methode
jedoch nicht immer alleinig für eine Speziesbestimmung aussagekräftig. Typische
biochemische Reaktionen zum Nachweis thermotoleranter Campylobacter spp. sind
die Oxidase- und Katalase-Reaktion. Eine Möglichkeit zur Differenzierung von
Campylobacter coli und C. jejuni kann mittels Hippurat-Hydrolyse erfolgen, dies führt
jedoch nicht immer zum sicheren Erfolg (SKIRROW und BENJAMIN 1980).
Die genotypische Speziesbestimmung ist im Allgemeinen verlässlicher und leichter
durchführbar als die phänotypische Bestimmung und beruht auf dem Nachweis von
speziesspezifischen genomischen DNA-Abschnitten (NIELSEN et al. 2000,
10 Literaturübersicht
WASSENAAR und NEWELL 2000). PCR-basierte Verfahren zum Nachweis und zur
Speziesdifferenzierung von Campylobacter-Isolaten werden aufgrund der hohen
Sensitivität und Spezifität sowie der hohen Verlässlichkeit häufig verwendet.
Zur Feindifferenzierung verschiedener Campylobacter-Isolate sind unterschiedliche
Typisierungsmethoden etabliert. Bei der Feindifferenzierung, z.B. in
epidemiologischen Studien, ist es sinnvoll, mehrere Methoden miteinander zu
kombinieren, zum Beispiel die Serotypisierung mit einer genotypischen Methode
oder aber zwei unabhängige genotypische Methoden im Vergleich zueinander
(WASSENAAR und NEWELL 2000). Bei der serologischen Typisierung mittels
„Enzyme-linked immunosorbend assay“ (ELISA) oder mittels
Agglutinationsreaktionen werden mit Hilfe mono- oder polyklonaler Antikörper
hitzestabile O-Oberflächenantigene (Methode nach Penner) oder hitzelabile H-
Oberflächenantigene (Methode nach Lior) bestimmt (PENNER und HENNESSY
1980, LIOR et al. 1982). Spezies, die zu demselben Serotyp gehören, sind jedoch
nicht immer auch genetisch gleich und umgekehrt (WASSENAAR und NEWELL
2000). Zudem können Kreuzreaktionen auftreten (PRESTON und PENNER 1989),
so dass die Serotypisierung nicht immer als alleinige Methode zum Erfolg führt. Zur
Typisierung von Campylobacter-Isolaten mittels Bakteriophagen kann aufgrund der
unterschiedlichen Empfindlichkeit von Isolaten gegenüber Bakteriophagen bzw.
Phagensätzen eine Auswertung von Lysemustern und somit eine Phagen-
Typisierung erfolgen (FROST et al. 1999).
Als genotypische Methoden zur Feindifferenzierung haben sich die Makrorestriktion
mit anschließender Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE), das „fla typing“ und die
Analyse von „amplified fragment length polymorphism“ (AFLP) als geeignet
erwiesen. Aufgrund einer genetischen Variabilität (intra- und inter-genetische
Rekombinationsereignisse, natürliche Transformation) von Campylobacter spp. in
Kombination mit Umweltstressoren (WASSENAAR et al. 1998, WASSENAAR und
NEWELL 2000) sind für tiefergreifende epidemiologische Studien sequenzbasierte
Methoden wie die „single nucleotide polymorphism“ (SNP)-Analyse, die Auswertung
von „restriction fragment length polymorphisms“ (RFLP) oder das „multi locus
Literaturübersicht 11
sequence typing“ (MLST) sicherere Methoden zur Charakterisierung von
Campylobacter spp. (FUJIMOTO et al. 1997, WASSENAAR und NEWELL 2000).
2.2. Kriterien zur Differenzierung von lebenden und toten Bakterien
Die Lebensfähigkeit von Bakterien umspannt einen Gradienten, welcher auf der
einen Seite aus sich aktiv vermehrenden Zellen besteht und auf der anderen Seite
bis hin zu komplett toten Zellen mit Verlust aller Vitalfunktionen reicht (CARON et al.
1998, RUDI et al. 2005). Die direkte Abgrenzung eines exakten Zeitpunktes des
Übergangs von lebenden Zellstadien zu toten Keimen ist jedoch oft nur schwer zu
definieren (RUDI et al. 2005).
2.2.1. Kultivierbarkeit von Bakterien
Die Kultivierbarkeit und Vermehrungsfähigkeit der Bakterien auf mikrobiologischen
Nährmedien wurde lange Zeit als klassisches Kriterium der Lebensfähigkeit
herangezogen (KEER und BIRCH 2003). Mit dieser Methode kann die Anzahl
lebensfähiger Bakterien jedoch stark unterschätzt werden, da subletal geschädigte
Zellen (BLACKBURN und MCCARTHY 2000), physiologisch anspruchsvoll
wachsende Bakterien (WARD et al. 1990) und lebende, jedoch nicht kultivierbare
Bakterienstadien (VBNC) hierbei nicht immer detektiert werden (KEER und BIRCH
2003). Zudem ist die Wiederfindungsrate der Bakterien abhängig vom gewählten
Nährmedium und eine Bestimmung der Konzentration an toten Zellen in der Probe ist
hiermit nicht möglich (RUDI et al. 2005).
Zur Differenzierung lebender und toter Zellstadien sind daher alternative Methoden
entwickelt worden, die auf der Detektion unterschiedlicher Vitalparameter der Zelle
beruhen. Hierzu zählen die zelluläre Integrität, der Energiestatus, die Persistenz von
Nukleinsäuren sowie Parameter der metabolischen Aktivität der Zelle (KEER und
BIRCH 2003, FITTIPALDI et al. 2012).
12 Literaturübersicht
Lange Zeit galten Bakterien als tot, wenn es nicht mehr möglich war, sie auf
herkömmlichen mikrobiologischen Medien zu kultivieren. Erstmalig beschrieben XU
et al. (1982) ein Stadium, das als „viable but nonculturable“ (VBNC) bezeichnet
wurde, in dem die Bakterien zwar kulturell nicht mehr anzuzüchten sind, sie aber
aufgrund von vorhandener metabolischer Aktivität noch lebensfähig sind und somit
auch für den Menschen als potentiell infektiös gelten (OLIVER 2005, FAKRUDDIN et
al. 2013). Zellen treten in dieses Stadium über, wenn sie subletalen
Umweltstressoren ausgesetzt sind, wie zum Beispiel einem erhöhtem
Sauerstoffgehalt, Nährstoffmangel, suboptimalen Temperaturen, weißem Licht oder
osmotischem Stress (OLIVER 2005), um somit einem möglichen Zelltod zu
umgehen. Neuere Studien vermuten, dass die Bildung von VBNC-Stadien ein Teil
des komplexen „cold shock response“ der Bakterien ist und die fehlende
Kultivierbarkeit als ein Nebeneffekt der gesteigerten Sensitivität gegenüber toxischen
Peroxiden in herkömmlichen Kulturmedien auftritt (PHADTARE 2004). Neben dem
Genus Campylobacter sind bislang über 61 weitere, teils humanpathogene,
Bakterienspezies beschrieben worden, die dieses Zellstadium eingehen können, wie
zum Beispiel Escherichia coli, Helicobacter pylori, Listeria monocytogenes oder
einige Salmonella-Spezies (OLIVER 2005, OLIVER 2010, AGUSTÍ et al. 2010). Bei
allen beschriebenen Spezies handelt sich um nicht sporenbildende Bakterien, die in
Form des VBNC-Stadiums eine Möglichkeit des Überlebens unter schlechten
Umweltbedingungen gefunden haben. Die Zellen zeigen in diesem Stadium
morphologische Veränderungen wie eine geschrumpfte, kokkoide Form. Die
Integrität der Zellmembran scheint jedoch nicht verändert. Sie besitzen ein hohes
Membranpotential (SIGNORETTO et al. 2000), eine herabgesetzte
Stoffwechselaktivität, jedoch einen gesteigerten ATP-Gehalt, der in toten und
geschädigten Zellen rasch absinkt (SIGNORETTO et al. 2002, OLIVER 2005,
OLIVER 2010, FAKRUDDIN et al. 2013). Die Genexpression ist ungestört und somit
ist eine Reaktion auf externe Stimuli möglich (KELL et al. 1998, MAALEJ et al. 2004).
Die Zellwand dieser Stadien weist Veränderungen auf. Sie besitzt höhere
Querverbindungen der Peptidoglykane, vermehrte Muropeptide, die kovalent
gebundene Lipoproteine beinhalten und ein verändertes Protein-Profil der äußeren
Literaturübersicht 13
Zellmembran (SIGNORETTO et al. 2002, MUELA et al. 2008). VBNC-Zellen haben
zudem eine höhere autolytische Aktivität und können eine gesteigerte
Antibiotikaresistenz aufweisen, vermutlich resultierend aus der herabgesetzten
metabolischen Aktivität der Zelle (OLIVER 2010). Die Integrität der Zellmembran von
VBNC-Stadien ist ein bislang wenig erforschtes Thema. Einige Autoren wie ZHENG
et al. (1999) und WILLÉN et al. (2000) beschrieben jedoch kokkoide VBNC-
Zellformen der Gattung Helicobacter pylori, die in elektronenmikroskopischen
Studien eine intakte Bakterien-Doppelmembran aufweisen.
Die Fähigkeit zur Regeneration der VBNC-Zellen mit erneuter Kultivierbarkeit ist
nach Bereitstellung optimaler Wachstumsbedingungen möglich (OLIVER 1995,
WHITESIDES und OLIVER 1997, OLIVER 2010). Die Virulenz der VBNC-Stadien
wird in der Literatur jedoch kontrovers diskutiert und ist am besten für die Gattung
Vibrio belegt. Einige Autoren bescheinigen eine Pathogenität der regenerierten
VBNC-Zellen im Tiermodell nach Erlangung der vollen Stoffwechselaktivität der
Zelle. OLIVER und BOCKIAN (1995) injizierten Mäusen VBNC-Zellen von Vibrio
vulnificus, die daraufhin an der Infektion starben. SUN et al. (2008) bestätigten die
Virulenz für Vibrio harveyi. Auch für die Bakterien des Genus Campylobacter ist ein
infektiöses Potential bescheinigt. Eine Kolonisierung durch VBNC Stadien von
Campylobacter spp. ist im Mausmodell (BAFFONE et al. 2006), im bebrüteten
Hühnerei (CAPPELIER et al. 1999) sowie im Huhn (STERN et al. 1994) belegt
worden. Beim Menschen gelang zudem eine in vitro Infektion humaner Caco-2 Zellen
mit VBNC-Stadien des Genus Campylobacter (CHAISOWWONG et al. 2012).
In einer neuen Studie von PATRONE et al. (2013) wurde mittels einer dreiwöchigen
Inkubationsperiode von C. jejuni-Zellen in Frischwasser bei einer Temperatur von
4 °C das VBNC-Stadium der Zellen induziert. Es konnte anschließend gezeigt
werden, dass die Zellen die Fähigkeit zur Adhäsion an intestinale Epithelzellen
beibehalten. Aus diesen Resultaten wurde vermutet, dass die VBNC-Zellen ihre
Infektiösität wiedererlangt haben (PATRONE et al. 2013).
14 Literaturübersicht
VBNC-Zellen stellen somit ein Reservoir an potentiell infektiösen Bakterienstadien in
der Umwelt dar und sind eine nicht zu unterschätzende Gefahr für die humane
Bevölkerung (FAKRUDDIN et al. 2013).
2.2.2. Nachweis von mRNA und rRNA
Methoden zum Nachweis des Vitalitätsstatus der Zelle werden oftmals mittels
Färbung von Nukleinsäuren oder der Hybridisierung geführt (CENCIARINI-BORDE et
al. 2009). Die Amplifizierung von DNA mittels PCR ist allerdings kein geeigneter
Indikator zur Detektion der Lebensfähigkeit einer Zelle, da die DNA nach dem Tod
der Zelle noch für längere Zeit persistiert (MASTERS et al. 1994). Alternativ kann
jedoch hierfür der Nachweis von RNA anstatt von genomischer DNA erfolgen, denn
im Gegensatz zu letzterer werden RNA Moleküle nach dem Zelltod rasch abgebaut
(ALIFANO et al. 1994, FITTIPALDI et al. 2012). Der Fokus des RNA-Nachweises
wird dabei auf den Nachweis von mRNA gelegt, da es sich hierbei um hoch labile
Moleküle mit einer sehr geringen Halbwertszeit von einigen Sekunden handelt,
welche ausschließlich von metabolisch aktiven Zellen synthetisiert werden (BLEVE et
al. 2003, KEER und BIRCH 2003, MORIN et al. 2004). Somit ist eine Unterscheidung
lebender, metabolisch aktiver Zellen mittels mRNA Molekülen dem reinen Nachweis
der stabileren DNA Moleküle überlegen (FITTIPALDI et al. 2012). Ein Nachteil bei
der Arbeit mit mRNA ist jedoch die Schwierigkeit bei der Bearbeitung und dem
Umgang mit der mRNA. Durch die hohe Labilität der Moleküle, kann es häufiger zu
Degradierungen durch unzureichende Lagerung oder Bearbeitung oder durch die
Kontamination mit RNA-abbauenden Enzymen kommen, so dass der Umgang mit
den Proben erschwert werden kann. Die Expression von mRNA ist zudem abhängig
vom physiologischen Status der Zelle. Bei langsam wachsenden Bakterien oder
metabolisch inaktiveren Zellstadien kann die mRNA Konzentration unterhalb der
Detektionsgrenze der „Reverse Transkriptase“ (RT)-PCR liegen und somit falsch
negative Resultate erzeugen (FITTIPALDI et al. 2012). Außerdem können in Proben
mit hohen Konzentrationen an toten Zellen (>104 Zellen/ml) falsch positive
Literaturübersicht 15
Ergebnisse durch Reste von übriggebliebenen mRNA-Transkripten entstehen
(SHERIDAN et al. 1998, VAITILINGOM et al. 1998, FITTIPALDI et al. 2012).
Neben mRNA ist auch der Nachweis von ribosomaler RNA als Indikator für lebende
Zellstadien verwendet worden (KEER und BIRCH 2003). Ein Vorteil gegenüber der
mRNA ist das Vorliegen einer hohen Kopienzahl in der Zelle, so dass eine hohe
Sensitivität des Assays erzielt werden kann.
Zum Nachweis und zur Quantifizierung von RNA wurden die Reverse Transkriptase
PCR (RT-PCR) sowie die „nucleic acid sequence based amplification“ (NASBA) in
verschiedenen Studien eingesetzt (UYTTENDAELE et al. 1997, MCKILLIP et al.
1998, DREIER et al. 2004, CHURRUCA et al. 2007, CENCIARINI-BORDE et al.
2009). Der rRNA-Nachweis unter Verwendung dieser Methoden war in einigen
Studien allerdings nur erfolgreich bei extremen Abtötungsmethoden, wie dem
Autoklavieren oder bei Einsatz von antimikrobiellen Chemotherapeutika (MCKILLIP
et al. 1998, SHERIDAN et al. 1998, YARON und MATTHEWS 2002, CENCIARINI-
BORDE et al. 2009). Das Detektionslimit für den Nachweis der RNA mittels RT-PCR
wurde in einer Studie von Rudi et al. (2005) mit 3 log10 Zellen/g angegeben. Die
Primerauswahl sowie die Targetlänge bei der RT-PCR sind weitere Einflussfaktoren,
die beim Nachweis der rRNA die Resultate stark beeinträchtigen können (VAN DER
VLIET et al. 1994, VILLARINO et al. 2000, YARON und MATTHEWS 2002,
CENCIARINI-BORDE et al. 2009). Längere Amlikons zeigten sich dabei in Studien
von MCCARTY und ATLAS (1993) als besser geeignet zur Bestimmung des
Vitalitätsstatus der mit Chlor behandelten Zellen als die Verwendung kurzer
Amplifikate.
2.2.3. Bestimmung der Membranintegrität von Bakteri en
Methoden zur Bestimmung der Membranintegrität der Zellen sind häufig verwendete
Verfahren zum Nachweis der Lebensfähigkeit von Bakterien (FITTIPALDI et al. 2012,
NOCKER et al. 2006, RUDI et al. 2005, CENCIARINI-BORDE et al. 2009). Aufgrund
der hydrophoben Eigenschaften der Phospholipidschicht von Zellmembranen ist es
16 Literaturübersicht
geladenen oder polaren Molekülen daher nur möglich sie zu passieren, wenn sie
eine delokalisierte Ladung besitzen (CAO-HOANG et al. 2008). Die Penetration
ionisierter Substanzen, wie EMA und PMA, durch die Zellmembran kann somit ein
Indikator für den Verlust der zellulären Membranintegrität sein (Farbstoff-Exklusions-
Methode) (CAO-HOANG et al. 2008). Fluorophore Farbstoffe wie Propidiumiodid
(PI), TO-PRO-3, Hexidiumiodid, SYTOX green oder 4′,6-Diamidin-2-phenylindol
(DAPI) werden eingesetzt, um die Membranintegrität der Zelle darzustellen (LLOYD
und HAYES 1995, NOVO et al. 2000, VIVES-REGO et al. 2000). Ein häufig
verwendetes Kit für die Differenzierung lebender und toter Zellen („Live/Dead
BacLight Bacterial Viability Kit“) mittels Fluoreszenzmikroskopie beinhaltet die
Farbstoffe Propidiumiodid und SYTO9, welches eine Kombination aus den beiden
Farbstoffen SYTOX green und SYTO59 ist (ROTH et al. 1997, CAO-HOANG et al.
2008). Der DNA-Farbstoff SYTO9 färbt dabei alle Zellen in der Probe grün an,
wohingegen Propidiumiodid selektiv in membrangeschädigte, tote Zellen eindringt
und diese rot anfärbt. Für die Auswertung der Ergebnisse dieses Assays ist ein
Fluoreszenzmikroskop mit zwei optischen Detektionskanälen nötig. Das
Detektionslimit diese Verfahrens wird mit 3 log10 Zellen/g angegeben (RUDI et al.
2005). Dieses lebend-/tot-Kit ermöglicht jedoch keine Unterscheidung zwischen
Bakterien unterschiedlicher Spezies und ist somit nicht alleinig für einen Einsatz in
der Routinediagnostik an Lebensmittelproben geeignet (RUDI et al. 2005).
Um eine Differenzierung lebender und toter Zellen in Kombination mit der
Anwendung der real-time PCR zu erzielen, wurden im Jahr 2003 von NOGVA et al.
DNA interkalierende Farbstoffe wie Ethidiummonoazid (EMA) erstmalig verwendet.
Drei Jahre später erfolgte die Anwendung des weiter entwickelten Moleküls
Propidiummonoazid (PMA) von NOCKER et al. (2006). Die Unterscheidung zwischen
lebenden und toten Zellen mit Hilfe dieser Farbstoffe basiert auf der
Membranpermeabilität der Zellen (FITTIPALDI et al. 2012). Bei ihrer Anwendung
werden die Substanzen der Zellsuspension vor der PCR zugesetzt und binden nach
Photoaktivierung selektiv und irreversibel an die DNA membrangeschädigter, toter
Zellen. Die Membranen intakter, lebender Zellen bilden eine Barriere und werden
nicht durchdrungen. Ist eine Bindung der Substanz an DNA erfolgt, kann diese in der
Literaturübersicht 17
darauffolgenden PCR nicht mehr amplifiziert werden. Somit erfolgt ein Nachweis
ausschließlich von DNA von vormals membranintakten, lebenden Zellen (RUDI et al.
2005, CENCIARINI-BORDE et al. 2009, FITTIPALDI et al. 2012).
In einer Studie von RUDI et al. (2005) zur Differenzierung lebender und toter
Campylobacter jejuni lag die Nachweisgrenze der EMA-qPCR im Vergleich zur RNA
Bestimmung sowie dem „BacLight-Kit“ bei 2 log10 Zellen/g und war somit sensitiver
als die letztgenannten Methoden.
2.2.4. Bestimmung der metabolischen Aktivität der Z elle
Direkte Indikatoren zur Beurteilung der Vitalität einer Zelle sind die Detektion der
respiratorischen Aktivität mittels Hydrolyse von 5-Cyano-2,3-ditotyltetrazoliumchlorid
(CTC) unter Verwendung der Fluoreszenzmikroskopie oder der Durchflusszytometrie
sowie die Bestimmung der Resonanzfähigkeit der Zelle auf Umwelt- und
Substratfaktoren mittels „direct viable count-assay“ (DVC-Assay) (NWOGUH et al.
1995, KEER und BIRCH 2003, RUDI et al. 2005, NOCKER und CAMPER 2009). Bei
diesem DVC-Verfahren wird mit einem Revitalisierungschritt gearbeitet, bei dem den
Zellen ein DNA-Gyrasehemmer, wie z.B. Nalidixinsäure zugegeben wird. Dieser führt
in der angewendeten Konzentration zur Inhibition der Zellteilung und dadurch zur
Elongation der Zellen, ohne jedoch die metabolische Aktivität der Zelle zu
beeinflussen (KOGURE et al. 1979, BESNARD et al. 2000, CENCIARINI-BORDE et
al. 2009). Durch das Wachstum der lebenden Zellen mit daraus resultierender Zell-
Elongation können sie morphologisch von nichtbeeinflussten, toten Zellen
unterschieden werden (NOCKER und CAMPER 2009). In Kombination dieser
Technik mit der Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH)-16S rRNA Detektion war
es einigen Autoren möglich, lebende, kulturfähige Zellen von lebenden, aber nicht
kultivierbaren Zellen (VBNC) zu unterscheiden (BAUDART et al. 2002, REGNAULT
et al. 2000, ARMISEN et al. 2004, CENCIARINI-BORDE 2009). Die verschiedenen
Methoden zur Differenzierung lebender und toter Bakterien sind in Tabelle 1
aufgeführt.
18 Literaturübersicht
Tabelle 1: Verfahren zur Differenzierung von lebenden und toten Bakterien
Literaturübersicht 19
2.3. Rechtliche Regelungen zum Nachweis von darmpat hogenen
Campylobacter spp.
Die EFSA dokumentierte im Jahr 2012 europaweit über 200.000 Fälle von
Campylobakteriose beim Menschen (EFSA 2014 b). Die Zahl an Krankheitsfällen, die
nicht den zuständigen Behörden gemeldet wurden, ist vermutlich jedoch noch
wesentlich höher. Schätzungen zufolge beträgt demnach die Gesamtzahl der
Erkrankungen in der EU etwa 9 Mio. Fälle pro Jahr (EFSA 2011). Die aus diesen
Erkrankungsfällen resultierenden Kosten für das europäische Gesundheitssystem
sind beträchtlich und werden auf etwa 2,4 Milliarden Euro geschätzt (EFSA 2011,
EFSA 2014 a, EFSA 2014 b). Für die Überwachung und Prävention dieser
Infektionskrankheit ist daher in Deutschland seit dem Jahr 2001 der Nachweis von
darmpathogenen Campylobacter-Spezies nach § 7 des Infektionsschutzgesetzes
(IfSG) meldepflichtig, sofern eine akute Infektion anzunehmen ist (IfSG 2013).
Gesonderte Regelungen bestehen darüber hinaus für Mitarbeiter der
Lebensmittelproduzierenden und -verarbeitenden Betriebe. Für diese sind der
alleinige Krankheitsverdacht sowie die Erkrankung gemäß § 6 IfSG meldepflichtig,
wenn die betreffende Person eine Tätigkeit in einem Lebensmittelbetrieb nach § 42
IfSG ausübt (IfSG 2013). Weiterhin gilt ein Tätigkeitsverbot im Falle eines
Krankheitsverdachts oder bei bestehender Campylobacter-Infektion (§ 42 IfSG
2013).
Da die Infektion des Menschen mit Bakterien des Genus Campylobacter größtenteils
über kontaminierte Lebensmittel erfolgt, sind der Erregernachweis und die
Quantifizierung im Lebensmittel-, Bedarfsgegenstände- und Futtermittelgesetzbuch
(LFGB) rechtlich geregelt. Hierzu sind in der amtlichen Sammlung von
Untersuchungsverfahren nach § 64 LFGB zwei verschiedene Methoden
beschrieben. Ein mikrobiologischer qualitativer und quantitativer Nachweis des
Erregers sowie ein molekularbiologischer, qualitativer Nachweis von spezifischen
Genabschnitten des Erregers. Das mikrobiologische Nachweisverfahren wird als ein
„horizontales Verfahren zum Nachweis und zur Zählung von Campylobacter spp. in
20 Literaturübersicht
Lebensmitteln“ bezeichnet und basiert auf einem Anreicherungsschritt mit
nachfolgender Erregeridentifizierung und –bestätigung (§ 64 LFGB). Mit diesem
Nachweisverfahren erfolgte die Übernahme der gleichnamigen DIN EN ISO
10272:2006 in die amtliche Methodensammlung nach § 64 LFGB. Das
molekularbiologische, PCR-basierte Nachweisverfahren beschreibt einen
„Qualitativen Nachweis von Campylobacter jejuni und Campylobacter coli in
Lebensmitteln - durch Amplifizierung spezifischer Gensequenzen mit der PCR“ (§ 64
LFGB). Hierbei wird eine 450 bp große Region des flaA-Gens amplifiziert, wobei
jedoch nicht die nahe verwandten Bakterienspezies C. lari, C. upsaliensis, C. butzleri
sowie Helicobacter pylori und Escherichia coli mit detektiert werden (OYOFO et al.
1992).
Da Infektionen des Menschen mit Campylobacter spp. auch über kontaminiertes
Wasser hervorgerufen werden können, gelten für das Lebensmittel Trinkwasser die
rechtlichen Regelungen der Trinkwasserverordnung (TrinkwV 2001). Hierbei sind in
§ 5 TrinkwV die mikrobiologischen Anforderungen beschrieben. Nach § 5 Nr.1 dürfen
Krankheitserreger nicht in Konzentrationen vorhanden sein, die eine Schädigung der
Gesundheit des Menschen hervorrufen können. Der Grenzwert für die
Gesamtkeimzahl in Trinkwasser liegt bei 100 Kolonie-bildenden Einheiten (KbE) pro
ml Wasser. Für einige Indikatorkeime wie Escherichia coli, Enterokokken und
coliforme Bakterien sind zusätzlich dazu gesonderte Grenzwerte aufgeführt. Diese
dürfen in 100 ml Wasser nach Anreicherung der Proben nicht nachweisbar sein. Für
den Keimgehalt von Campylobacter in Trinkwasser liegen jedoch derzeit keine
gesonderten Grenzwerte vor.
Für die mikrobiologische Qualitätskontrolle von Wasserproben beschreibt die
international gültige ISO Norm 17995:2005 den Nachweis und die Zählung von
thermotoleranten Campylobacter spp. Bei diesem kulturellen Verfahren zur
Bestimmung der Keimkonzentration werden Wasservolumina von 1000 ml, 100 ml,
und 10 ml beprobt, um eine semiquantitative Bestimmung mittels „most probable
number“ (MPN)-Verfahren zu erzielen. Eine Aufkonzentrierung der Keime in Wasser
erfolgt hierbei mittels Membranfiltration. Anschließend wird eine Anreicherung in
Literaturübersicht 21
hoch selektivem Preston-Medium sowie weniger selektiver Bolton-Bouillon parallel
durchgeführt. Nach Inkubation bei 37 °C für 48 Stunden werden die Keime auf
modifiziertem Charcoal Cefoperazon Desoxycholat-Agar (mCCD-Agar) ausplattiert
und für weitere 48 Stunden bei 41,5 °C bebrütet. Ein negatives Ergebnis kann somit
erst innerhalb von 4 Tagen erzielt werden. Bei positivem Erregernachweis schließen
sich weitere Bestätigungsschritte an, die die Untersuchungszeit noch um einige Tage
verlängern können (ISO 17995:2005, PITKÄNEN 2013).
Trotz der weltweit hohen Zahlen an Campylobacteriose-Fällen sind bislang auch
noch keine spezifischen Grenzwerte für Campylobacter-Keimzahlen in Lebensmitteln
tierischen Ursprungs verfügbar. Auf europäischer Ebene wurden jedoch im Jahr
2011 von dem Gremium für biologische Gefahren der EFSA „Empfehlungen zur
Reduktion von Campylobacter in Hühnerfleisch“ herausgegeben (EFSA 2011). Diese
beinhalten Maßnahmen in der Primärproduktion zur Erregerminimierung vor der
Schlachtung (z.B. Biosecurity, Fliegengitter, Herabsetzen des Mastalters) und
während der Fleischproduktion (z.B. Hygiene, Desinfektion, logistisches Schlachten,
Prävention fäkaler Verunreinigungen, Oberflächendekontamination der
Schlachtkörper), sowie Einschätzungen zur Wirksamkeit dieser Maßnahmen für den
Endverbraucher (EFSA 2011). Anhand dieser Minimierungsstrategien wird eine
Reduktion der Erregerhäufigkeit zwischen 50 % und 90 % angestrebt. Ansatzpunkt
ist hierbei ein mikrobiologischer Grenzwert von 1000 oder 500 KbE pro Gramm
Hautprobe der Karkassen am Schlachthof, wobei bislang 15 % bzw. 45 % der
getesteten Chargen in Deutschland (2008) diesen Kriterien nicht entsprechen (EFSA
2011).
2.3.1. Problematik beim Nachweis von Campylobacter in Lebensmitteln
unter Verwendung der amtlichen Verfahren
Campylobacter sind kulturell anspruchsvoll wachsende Bakterien und der
mikrobiologische Erregernachweis ist daher oft mit Schwierigkeiten verbunden
(SOLOMON und HOOVER 1999, BOTTELDOORN et al. 2008). Auch VBNC-Stadien
22 Literaturübersicht
können bei Verwendung des mikrobiologischen Verfahrens nicht nachgewiesen
werden. Zudem benötigt die nach § 64 LFBG vorgeschriebene mikrobiologische
Nachweismethode von der Anreicherung bis zum Bestätigungsschritt bis zu 6 - 7
Tage und ist somit sehr zeitaufwändig (JOSEFSEN et al. 2010). Auch das
mikrobiologische Nachweisverfahren für die Detektion von Campylobacter spp. aus
Wasserproben ist sehr arbeits- und materialaufwändig und zudem auch zeitintensiv
(STELMA und WYMER 2012), vor allem wenn quantitative Ergebnisse erzielt werden
sollen (PITKÄNEN 2013). Dadurch können Untersuchungsergebnisse von
Lebensmittelproben nicht zeitnah ermittelt werden und ein direkter Eingriff in die
Lebensmittelsicherheit ist kaum möglich. Das amtlich beschriebene PCR-basierte
Verfahren hat zwar den Vorteil einer Zeitersparnis, so dass schnelle Resultate
innerhalb von 3 - 4 Stunden erzielt werden können (RUDI et al. 2005, JOSEFSEN et
al. 2010), mit dieser Methode ist jedoch eine Unterscheidung zwischen lebenden und
somit infektiösen Bakterienstadien und toten Keimen nicht möglich. Rückschlüsse
auf die Infektiösität der Lebensmittelprobe für den Konsumenten können mit diesem
Verfahren daher nicht geschlossen werden.
Ähnliche Probleme beim kulturellen Nachweisverfahren von Campylobacter spp. aus
Wasserproben nach der ISO 17995:2005 Methode haben auch andere Autoren
festgestellt. Bei der Detektion von Campylobacter spp. aus Wasser ist die Art der
Wasserprobe von zentraler Bedeutung, vor allem wenn eine hohe Konzentration an
fäkaler Begleitflora, wie bei Oberflächenwasser oder Abwasserproben, vorhanden
sein kann (PITKÄNEN 2013). Diese Begleitflora könnte während der Anreicherung
oder direkten Ausplattierung der Proben zu einer kompetetiven Hemmung der
Campylobacter-Zellen führen (ABULREESH et al. 2005). Aufgrund dieser
Problematik wurde eine Modifikation der ISO 17995:2005 Methode vorgenommen.
Bei Proben mit einer hohen Begleitflora kann zum Beispiel ein höheres
Filtrationsvolumen, die Verwendung größerer Filter oder eine Modifikation der
Inkubationszeiten einen positiven Erregernachweis erbringen (HIJNEN et al. 2000,
HUNT et al. 2001, HÄNNINEN et al. 2003, PITKÄNEN et al. 2009). Diese
Methodenanpassungen sollten jedoch für jede Wasserart differenziert etabliert
Literaturübersicht 23
werden, da sie die Wiederfindungsrate der Bakterien beeinflussen können (KHAN et
al. 2009, PITKÄNEN et al. 2009).
Andere Autoren schlugen die Kombination aus der mikrobiologischen
Voranreicherung mit einer anschließenden Bestätigung der Isolate mittels PCR-
Verfahren vor. Hierbei wurde jedoch keine Quantifizierung der Bakterien
durchgeführt. Zur Bestätigung präsumtiver Campylobacter Isolate ist der Einsatz der
PCR Methode alternativ zu herkömmlichen Bestätigungsverfahren möglich
(PITKÄNEN 2013). Vorteil der Anwendung von PCR-Verfahren zur Bestätigung von
Campylobacter spp. ist, dass hierbei keine Reinkulturen der Isolate benötigt werden
(PITKÄNEN et al. 2009). Ein weiterer Vorteil beim Einsatz von PCR Verfahren nach
selektiver Voranreicherung ist eine Verkürzung der Nachweiszeit der Erreger von
mehreren Tagen auf bis zu 5 Stunden (PITKÄNEN 2013). Die Anwendung der PCR
Methoden nach Anreicherung der Bakterien kann zudem das Risiko falsch positiver
Resultate minimieren, wenn speziesfremde Begleitkeime das Wachstum von
Campylobacter spp. auf festen Nährböden verdrängen (PITKÄNEN 2013).
2.4. Nachweis von Campylobacter spp. mittels PCR und real-time PCR
Seit Entwicklung der ersten PCR-basierten Methode zum Nachweis von
Campylobacter spp. vor über 20 Jahren (OYOFO et al. 1992) finden PCR Methoden
in jüngster Zeit immer häufiger Anwendung (GHARST et al. 2013). Herkömmlichen
mikrobiologischen Methoden sind sie aufgrund der zeiteffizienten Durchführung und
der Möglichkeit zur Detektion von VBNC-Zellen überlegen (ABULREESH et al.
2006).
2.4.1. PCR Nachweise für Campylobacter spp.
Häufig verwendete PCR-basierte Methoden zum spezifischen Nachweis des Genus
Campylobacter amplifizieren Zielsequenzen des DNA-Abschnitts, welcher die 16S
rRNA kodiert (JOSEFSEN et al. 2004, PERELLE et al. 2004 und HELLEIN et al.
24 Literaturübersicht
2012), der 23S rRNA (500bp) (ENGVALL et al. 2002) und der 16S-23S rDNA
„internal transcribed spacer region“ (ITS) (KHAN und EDGE 2007). Für den Spezies-
spezifischen Nachweis von C. jejuni wird in einigen Studien das Hippurikase-Gen
hipO detektiert (DINGLE et al. 2005, PERSSON und OLSEN 2005). DENIS et al.
1999 beschreiben zudem das „membrane-associated protein“-Gen mapA als
erfolgreich zum Nachweis von C. jejuni. Zur Identifizierung von C. coli sind
Zielsequenzen des ceuE-Gens (Enterocholin-uptake-periplasmic-binding-protein) als
erfolgreich dargestellt (SAILS et al. 2003).
„Multiplex“-basierte Nachweisverfahren von WAAGE et al. (1999) und MOORE et al.
(2001) beschreiben die Flaggelin-Gene flaA und flaB als geeignete Zielsequenzen für
PCR-Nachweise von C. jejuni, C. coli und C. lari. Eine weitere molekularbiologische
Studie von JENSEN et al. (2005) beschreibt das glyA-Gen, welches die Serin
Hydroxymethyltransferase codiert, als geeignetes Target zum speziesspezifischen
Nachweis von Campylobacter. Vorteil ist hierbei, dass das Gen hoch konserviert ist,
jedoch genug Sequenzvariationen für die speziesspezifische Differenzierung von
C. jejuni, C. coli, C. lari und C. upsaliensis zeigt (JENSEN et al. 2005). DENIS et al.
(1999) etablierten ein „multiplex“-basiertes Verfahren, welches die Zielgene 16 rDNA
(gattungsspezifisch), mapA (C. jejuni) und ceuE (C. coli) zum Nachweis von
Campylobacter aus verschiedenen Lebensmitteln amplifiziert. NAYAK et al. (2005)
sowie HELLEIN et al. (2011) etablierten eine „multiplex“ PCR zur Differenzierung von
C. jejuni und C. coli. Dabei wurde das cadF-Gen zur genusspezifischen Detektion
amplifiziert. Für die speziesspezifische Differenzierung wurde das ceuE-Gen (C. coli)
verwendet sowie ein bislang undefiniertes Gen, das eine Sequenz-Übereinstimmung
von 67 % mit einem Gen zeigt, welches für eine Oxidoreduktase-Untereinheit von C.
jejuni codiert (C. jejuni). Weitere Autoren beschrieben die ORF-C Sequenz (115 bp)
(SAILS et al. 2003) sowie das cpn60-Gen (1512 bp) (BANIHASHEMI et al. 2012) als
erfolgreiche PCR Targetgene zum Nachweis von Campylobacter spp. in
Lebensmittel- und Wasserproben. Die Zielgene zum Nachweis von Campylobacter
spp. sind in Tabelle 2 zusammengefasst.
Literaturübersicht 25
Tabelle 2: Zielgene zum Nachweis von Campylobacter spp. mittels PCR
2.4.2. Real-time PCR Nachweise für Campylobacter spp.
Im Gegensatz zur herkömmlichen PCR Methode, welche in der Regel eine
Amplifikation der Ziel-DNA in einem PCR-Thermocycler und eine anschließende
Gelelektrophorese und Anfärbung des Amplifikates umfasst, stellt die quantitative
real-time PCR (qPCR) eine Weiterentwicklung der Methodik dar. Mit diesem
Verfahren ist eine Möglichkeit geschaffen, Campylobacter spp. nicht nur qualitativ
nachzuweisen, sondern auch eine quantitative Aussage treffen zu können. Hierbei
erfolgt die PCR-Reaktion sowie die Detektion des PCR-Produktes, je nach
verwendetem Sondensystem, in einem zeitnahen oder zeitgleichen Schritt, so dass
eine aufwändige Auftrennung und Färbung des PCR-Produktes wie bei der
konventionellen PCR entfällt. Dabei wird mittels fluoreszenzmarkierter Farbstoffe
26 Literaturübersicht
oder -Sondensysteme das PCR-Produkt „sichtbar“ gemacht. Hierbei steigt das
Fluoreszenzsignal proportional zur Produktmenge, so dass eine quantitative
Bestimmung erreicht werden kann (CAO-HOANG et al. 2008).
Die Eignung der real-time PCR ist für verschiedene Matrices erfolgreich getestet
worden. Zur Quantifizierung von Campylobacter spp. aus Kotproben ist in Studien
von LUND et al. (2004) und RUDI et al. (2004) die qPCR Methode erfolgreich
eingesetzt worden. Auch für Geflügelfleisch (YANG et al. 2003, WOLFFS et al. 2005,
BOTTELDOORN et al. 2008), Milch (YANG et al. 2003, SOEJIMA et al. 2011b) und
Wasser (YANG et al. 2003, TISSIER et al. 2012) wurden qPCR Methoden zur
Detektion von Campylobacter spp. von verschiedenen Autoren beschrieben
(BOTTELDOORN et al. 2008).
2.4.3. Anwendung der real-time PCR zum Nachweis von Campylobacter
spp. in Geflügelfleischproben und Wasserproben
Erste Anwendungen der real-time PCR bei Geflügelfleisch zeigten eine gute Eignung
der Methode zum Nachweis von Campylobacter spp. (RUDI et al. 2005, JOSEFSEN
et al. 2010). JOSEFSEN et al. (2010) gelang der Nachweis von lebenden
Campylobacter spp. auf Geflügelfleisch mit einer hohen Korrelation zur
herkömmlichen mikrobiologischen Keimzählung. Eine weitere real-time PCR basierte
Methode wurde von BOTTELDOORN et al. (2008) publiziert, um eine Quantifizierung
von Bakterien des Genus Campylobacter auf Hühnerkarkassen zu ermöglichen. In
dieser Studie wurde jedoch keine Unterscheidung von lebenden und toten Zellen
getroffen.
Die direkte Quantifizierung von Bakterien des Genus Campylobacter aus
Wasserproben mittels real-time PCR ist in vielen Studien bereits erfolgreich
eingesetzt worden, zunächst jedoch ohne eine Differenzierung von lebenden und
toten Zellstadien zu erzielen (NOGVA et al. 2000, YANG et al. 2003, NAM et al.
2005, VAN DYKE et al. 2010, CLARK et al. 2011, PARK et al. 2011, PITKÄNEN
2013). Demgegenüber ist für den quantitativen Nachweis lebender Campylobacter-
Literaturübersicht 27
Zellen aus Wasserproben in der Literatur bislang wenig bekannt (BAE und WUERTZ
2012, BANIHASHEMI et al. 2012). In zwei initialen Studien wurde die Eignung der
interkalierenden Substanzen nicht geprüft und zudem kein Vergleich verschiedener
Aufkonzentrierungsverfahren oder Wasserarten durchgeführt. Diese Studien dienten
lediglich dem Zweck, die Überlebensrate der Bakterien in Wasser zu bestimmen oder
waren primär dazu bestimmt eine geeignete Targetlänge für die qPCR zu ermitteln
(BAE und WUERTZ 2012, BANIHASHEMI et al. 2012).
Dagegen wurden für andere Erreger bereits quantitative Nachweise lebender Zellen
mittels real-time PCR aus Wasserproben geführt. So wurde für den Nachweis von
Pseudomonas aeruginosa eine Filter basierte Propidiummonoazid (PMA)-qPCR
Methode für künstlich infiziertes Wasser eingesetzt (HELLEIN et al. 2012). Auch für
Escherichia coli ist eine qPCR Methode beschrieben, bei welcher PMA anstatt EMA
bei ultraschallgereinigtem Gemüsewaschwasser verwendet wurde (ELIZAQUÍVEL et
al. 2012). INOUE et al. (2008) beschrieben eine EMA-qPCR basierte Methode, für
den Nachweis lebender Escherichia coli aus Teichwasser.
Zum quantitativen Nachweis von Bakterien des Genus Campylobacter aus Wasser
wurde in einer neueren Studie von TISSIER et al. (2012) eine Methode als
erfolgreich dargestellt, in der aus 20 Liter Wasserproben C. jejuni und C. coli mittels
Membranfiltration isoliert wurden und deren Keimgehalt mittels qPCR bestimmt
wurde. Eine Berücksichtigung des Vitalitätsstatus der Zellen wurde hierbei jedoch
nicht getroffen. Für den quantitativen Nachweis von lebenden Campylobacter spp.
aus Wasserproben mittels qPCR ist in der Literatur bislang jedoch wenig bekannt
(BAE und WUERTZ 2012, BANIHASHEMI et al. 2012).
2.4.4. Einsatz von interkalierenden Substanzen für real-time PCR
Anwendungen
Ein Vorteil der real-time PCR gegenüber der herkömmlichen PCR Methodik ist zwar
die Möglichkeit, eine Quantifizierung (z.B. über die Anzahl von Genomkopien)
vornehmen zu können, jedoch behebt auch diese PCR-Technik nicht das Problem,
28 Literaturübersicht
dass sowohl DNA von vormals lebenden als auch von vormals toten Zellen
nachgewiesen wird (PITKÄNEN 2013). Eine Differenzierung von lebenden und damit
infektiösen Bakterien und toten Keimen ist somit nicht möglich. Deshalb wurden in
den letzten Jahren verstärkt DNA interkalierende Substanzen, wie Ethidiummonoazid
(EMA) und Propidiummonoazid (PMA) eingesetzt, die der zu untersuchenden Probe
vor der qPCR Durchführung zugesetzt werden (NOCKER et al. 2006, RUDI et al.
2005, JOSEFSEN et al. 2010, AGUSTÍ et al. 2010). Diese Substanzen dringen in
membrangeschädigte, tote Zellen ein oder lagern sich an freie DNA an und binden
nach einer Belichtung kovalent und damit irreversibel an die DNA (RUDI et al. 2005).
Die DNA lebender Zellen, an welche keine Substanz gebunden ist, wird in der
anschließenden qPCR amplifiziert, während die DNA vormals membrangeschädigter
Zellen mit gebundener interkalierender Substanz nicht mehr amplifiziert werden kann
(CENCIARINI-BORDE et al. 2009). In sich anschließenden Studien wurde zudem
berichtet, dass schon bei der Isolierung der genomischen DNA große Teile der mit
interkalierenden Substanzen gebundenen und somit unlöslich gewordenen DNA
zusammen mit dem Zellüberstand verworfen werden (NOCKER und CAMPER
2006). Beim Einsatz einer Kombination aus DNA interkalierenden Substanzen und
der real-time PCR Methodik ist somit ein quantitativer Nachweis an lebenden und
damit potentiell infektiösen Bakterien in der Probe möglich. Die Eignung der
kombinierten Methode aus qPCR und interkalierenden Substanzen ist jedoch stark
spezies- und matrixabhängig (CENCIARINI-BORDE et al. 2009, NOCKER und
CAMPER 2009), so dass die Eignung dieses methodischen Ansatzes für eine
quantitative Keimzahlbestimmung bei verschiedenen Bakterienspezies in der
Literatur unterschiedlich bewertet wird. FLEKNA et al. (2007) stuften EMA als nicht
geeignet für Listeria monocytogenes ein, wohingegen WANG und MUSTAPHA
(2010) für Salmonella enterica eine sehr gute Eignung zur quantitativen
Keimzahlbestimmung lebender Zellen bestätigten.
Für einen Nachweis von Bakterien des Genus Campylobacter wurde der Einsatz der
EMA-qPCR kontrovers diskutiert. In Studien von RUDI et al. (2005) wurde die
Differenzierungssubstanz EMA erfolgreich für den quantitativen Nachweis von
lebenden Campylobacter spp. eingesetzt. Eine Studie von FLEKNA et al. (2007)
Literaturübersicht 29
widersprach diesen Ergebnissen jedoch und stufte EMA als nicht geeignet zum
Nachweis von lebenden Listeria monocytogenes und Campylobacter spp. ein. In
dieser Studie wurde jedoch nur der Typstamm C. jejuni DSM 4688T getestet und
keine weiteren Untersuchungen mit Feldstämmen durchgeführt. Auch der Einsatz
von PMA wurde hierbei nicht überprüft, dem von einigen Autoren eine höhere
Effektivität sowie eine Spezies- und Matrix-unabhängigere Anwendung bescheinigt
wird (CENCIARINI-BORDE et al. 2009, NOCKER und CAMPER 2009). Vermutlich ist
dies bedingt durch die erweiterte Molekülstruktur der Substanz, die im Vergleich zu
EMA eine zusätzliche positive Ladung besitzt und somit eine reduzierte
Penetrationsfähigkeit von lebenden, membranintakten Zellen aufweist (NOCKER et
al. 2006). Die Effektivität der Differenzierungskraft von PMA konnte für einige
Bakterienspezies, wie Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Salmonella
enterica subsp. enterica serovar Typhimurium oder Serratia marcescens belegt
werden (NOCKER et al. 2007, PAN und BREIDT 2007). Diese bessere Eignung
konnte jedoch nicht für alle Anwendungen und Erreger bestätigt werden (LEE und
LEVIN 2009).
2.4.5. Nachteile bei der Anwendung interkalierender Substanzen
Wichtig ist, ob der Einsatz einer Differenzierungssubstanz die Ergebnisse der real-
time PCR beeinträchtigt. Dies wurde bislang in der Literatur kontrovers gesehen.
Auch wenn nicht bei allen Autoren eine Ct-Wert Verschiebung beobachtet wurde,
konnten FLEKNA et al. (2007) und HEIN et al. (2007) in ihren Studien einen Einfluss
der Differenzierungssubstanz EMA auf das qPCR Signal feststellen, indem es zu
einer Verschiebung der Ct-Werte im Vergleich zu unbehandelten Zellen kam. Andere
Autoren erzielten gegensätzliche Ergebnisse (RUDI et al. 2005, WANG und
MUSTAPHA 2010) und konnten bei Einsatz der EMA-qPCR keine Verschiebung der
Ct-Werte bei lebenden Bakterien beobachten. Bei diesen Studien wurde jedoch nicht
bewertet, ob sich eine Verschiebung der Amplifikationskurve in der qPCR wirkstoff-
und konzentrationsabhängig darstellt.
30 Literaturübersicht
Da die Differenzierung von lebenden und toten Zellen bei Verwendung von DNA
interkalierenden Substanzen, wie EMA und PMA, auf dem Kriterium der
Membranintegrität der Zellen beruht, können bei Inaktivierungsverfahren von
Bakterien, die nicht zu einer Schädigung der zellulären Membran führen,
gegensätzliche Ergebnisse auftreten. Ein Beispiel hierfür ist die Abtötung von
Bakterien mittels UV-Strahlung. Bei diesem Inaktivierungsverfahren wird die DNA der
Zelle geschädigt, die Integrität der Zellmembran jedoch primär nicht beeinflusst
(SINHA und HADER 2002, CENCIARINI-BORDE et al. 2009). Somit ist eine
Differenzierung lebender und toter Zellen mit membranundurchlässigen
Differenzierungsmitteln, wie EMA und PMA, bei diesem Verfahren schwer möglich.
Ein weiterer Nachteil beim Umgang mit DNA interkalierenden Substanzen, wie EMA
und PMA, ist die Toxizität der Stoffe. Für EMA und PMA liegen bislang noch keine
substanzspezifischen Toxizitätstestungen vor, aufgrund ihrer strukturellen
Verwandtschaft zu den Derivaten Ethidiumbromid bzw. Propidiumiodid und einem
ähnlichen Reaktionsmechanismus sollte jedoch von einem ähnlichen
Gefährdungspotential im Umgang mit diesen Stoffen ausgegangen werden. Die
Senatskommision der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) zur Prüfung
gesundheitsschädlicher Arbeitsstoffe hat Ethidiumbromid als kanzerogen deklariert
und stuft die mutagene Wirkung der Substanz als „begründet“ ein (DFG 2005).
Dementsprechend sollte auch bei den DNA interkalierenden Substanzen EMA und
PMA ein ähnliches Gefährdungspotential angenommen werden. Entsprechende
Schutzkleidung, wie Nitrilhandschuhe, und ein ordnungsgemäßer Umgang mit diesen
Substanzen sind hierbei unerlässlich. Zur Entsorgung ethidiumbromidhaltiger Abfälle
bestehen darüber hinaus gesonderte Regelungen nach der EU-Richtlinie
91/689/EWG für gefährliche Abfälle, die zum Beispiel eine Inaktivierung der
Substanzen in flüssiger Lösung durch Absorption an einen Aktivkohlefilter vorsieht.
Dieser Aktivkohlefilter ist anschließend als fester Sonderabfall zu entsorgen.
Aufgrund der strukturellen Verwandtschaft zu Ethidiumbromid ist bei der Entsorgung
der Substanzen EMA und PMA eine ähnliche Verfahrensweise zu empfehlen.
Literaturübersicht 31
2.5. Zielstellung der Studie
Ein amtliches Verfahren zur schnellen und quantitativen Bestimmung von
Campylobacter spp. aus Lebensmittelmatrices ist derzeit nicht verfügbar. Zur
Etablierung von Minimierungsstrategien, welche zu einer Reduktion von
Campylobacter spp. in der Lebensmittelkette führen sollen, ist es jedoch notwendig,
geeignete sensitive und spezifische quantitative Nachweisverfahren zur Verfügung
zu haben.
Daher war es Ziel dieser Studie, die Eignung von interkalierenden Substanzen in
Kombination mit einer real-time PCR zu testen und somit eine „viability“-qPCR zu
etablieren, die eine schnelle Quantifizierung lebender Campylobacter-Zellen
ermöglicht. Als DNA-interkalierende Substanzen sollten EMA und PMA in
unterschiedlichen Konzentrationen verwendet werden, ihre Eignung zur
Unterscheidung von lebenden und toten Campylobacter vergleichend getestet
werden und Nachteile, die durch die Anwendung der Substanzen resultieren,
ermittelt werden. Die Methode sollte zunächst an Typstämmen von Campylobacter
etabliert sowie anschließend an verschiedenen Feldisolaten getestet werden.
Weiterhin war es Ziel der Untersuchungen, die Methodik für die Analyse von Proben
der Lebensmittelmatrix Geflügel anzupassen und zu klären, ob das
Methodenprotokoll auch für den Nachweis und die Quantifizierung von lebenden
Campylobacter spp. aus Wasserproben geeignet ist. Hierbei sollten zunächst
geeignete Bedingungen für die Isolierung der Keime aus Wasserproben ermittelt
werden, um eine anschließende “viability“-qPCR durchführen zu können.
Material und Methoden 33
3. Material und Methoden
3.1. Bakterien Stämme und Spezies-Bestimmung
Für die Versuche wurde der Typstamm C. jejuni DSM 4688T (Leibniz-Institut,
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig,
Deutschland) verwendet. Zur Testung der Methode an Feldisolaten wurden 16
C. jejuni- und C. coli-Feldisolate vom Geflügel aus der Institutssammlung des
Instituts für Lebensmittelqualtität und –sicherheit der Stiftung Tierärztliche
Hochschule Hannover eingesetzt. Die Bakterienstämme wurden als Kryokulturen bei
-80 °C gelagert. Die Anzucht der Isolate erfolgte auf „modified charcoal cefoperazone
desoxycholate agar“ (CCDA)-Platten (Oxoid, Wesel, Deutschland) für 24 Stunden
unter mikroaerober Atmosphäre (5 % O2, 10 % CO2, 85 % N2). Die Bebrütungs-
temperatur wurde dabei auf 41,5 ± 1,0 °C festgelegt. Für eine kulturelle Keimzählung
wurde eine Bebrütungszeit von 48 Stunden verwendet. Zur Spezies-Bestimmung
wurde ein multiplex PCR-Nachweis durchgeführt, der eine Zielsequenz der 16S
rDNA zum Nachweis des Genus Campylobacter sowie Sequenzabschnitte des mapA
oder ceuE Genes zum Nachweis der Spezies C. jejuni oder C. coli amplifiziert
(Amtliche Methodensammlung des Friedrich-Loeffler-Institut 2014). Dabei wurde ein
Probenvolumen von 45 µl verwendet, welches 35,8 µl steriles Wasser, 5 µl PCR-
Pufferlösung (c=15mmol/l MgCl2), 2 µl Desoxynukleosidtriphosphat-Mix, 1 µl Primer
MD 16S1/S2, 1 µl Primer MD mapA1/A2, MD COL2/COL3 und 0,2 µl Taq-DNA-
Polymerase beinhaltete. Für die PCR wurde eine initiale Denaturierung für 60 sec.
bei 95 °C mit anschließenden 35 Zyklen der Denaturierung bei 95 °C für 30 sec.,
einem Annealingschritt bei 59 °C für 90 sec. und einer Elongationsphase bei 72 °C
für 60 sec. durchgeführt. Die abschließende Elongation wurde bei 72 °C für 5 min.
vorgenommen. Die PCR-Produkte wurden anschließend auf ein 1,5 %iges Agarose-
Gel aufgetragen. Der Genus-spezifische Nachweis erfolgt mit einem Amplifikat von
857 bp, das Spezies-spezifische Amplifikat für C. jejuni wird bei 589 bp und für
34 Material und Methoden
C. coli bei 462 bp detektiert (Amtliche Methodensammlung des Friedrich-Loeffler-
Institut 2014).
3.2. Inaktivierung von Campylobacter spp. und Keimzahlbestimmung
mittels kultureller Keimzählung
Zur Bestimmung der optimalen Abtötungstemperatur wurden Campylobacter-Zellen
(ca. 106 KbE/ml) verwendet, welche über 24 Stunden auf CCD-Agarplatten bebrütet
wurden. Diese werden im Folgenden als lebende Zellen bezeichnet. Nach
Resuspension der Zellen in 0,9 % NaCl wurden die Keimsuspensionen bei 60 °C,
65 °C, 70 °C und 75 °C in einem Wasserbad (GFL, Burgwedel, Deutschland) für 15
oder 20 min. inkubiert. Ein anschließendes Ausplattieren der Bakteriensuspensionen
auf Agarplatten diente zur Überprüfung auf vorhandenes bakterielles Wachstum.
Dafür wurden für jede Verdünnungsstufe jeweils 100 µl der Bakteriensuspension auf
10 CCD-Agarplatten ausplattiert und für 48 Stunden inkubiert. Das vollständige
Fehlen des Wachstums auf der Agarplatte wurde als erfolgreiche Abtötung der Zellen
gewertet. Die optimale Abtötungsmethode für Campylobacter spp. stellte sich bei
70 °C für 15 min. dar und wurde somit für die folgenden Versuche verwendet. Für die
Herstellung von Gemischen aus über 24 Stunden kultivierten (lebenden) und
hitzeinaktivierten Zellen wurden die Zellen im Verhältnis 1:1, 1:10, 1:100 und 1:1000
(lebend:tot) gemischt. Für die Einstellung der Keimkonzentration wurden 4 - 5
Campylobacter-Kolonien von einer 24 Stunden bebrüteten Agarplatte in 0,9 % NaCl
gelöst und auf einen McFarland Standard von 0,5 eingestellt. Für die kulturelle
Keimzählung und zur Bestätigung der eingestellten Keimkonzentrationen wurden
serielle Verdünnungsreihen der Bakterienkultur in Verdünnungen von 10-1 bis 10-6
hergestellt und 100 µl der Keimsuspension auf jeweils 10 CCD-Agarplatten
ausgespatelt. Anschließend wurden die Agarplatten für 48 Stunden bei 41,5 ± 1,0 °C
in mikroaerober Atmosphäre bebrütet. Die Keimkonzentration wurde aus dem
gewichteten Mittelwert von Agarplatten mit 100-300 auszählbaren
Kolonien/Agarplatte bestimmt.
Material und Methoden 35
3.3. EMA- und PMA- Behandlung der Bakterienproben
Die lyophilisierten EMA (Invitrogen, Darmstadt, Deutschland) und PMA (VWR,
Darmstadt, Deutschland) Feststoffe wurden in 20 % Dimethyl Sulfoxid (DMSO)
gelöst und bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C gelagert. Sie wurden der
bakteriellen Suspension in Endkonzentrationen von 10 µg/ml (23,81 µmol/l) EMA
sowie 100 µg/ml (238,10 µmol/l) EMA oder 25,55 µg/ml (50 µmol/l) PMA und 51,10
µmol/l (100 µmol/l) PMA zugegeben. Die Proben wurden anschließend für 15 min. im
Dunkeln bei einer Temperatur von 22 ± 1 °C unter mehrmaligem Schwenken
inkubiert und für weitere 15 min. mit einer 500 W Halogenlampe (Düwi Typ R7s, REV
Ritter, Mömbris, Deutschland) belichtet, um die photoinduzierte Bindung der
Substanzen an die DNA zu aktivieren. Dazu wurde die Halogenlampe in einem
Abstand von 20 cm zu den Proben platziert. Zur Verhinderung übermäßiger
Erhitzung wurden die Proben während der Belichtung in einem eisgekühlten
Probenständer gelagert. Um den Lichteinfall nicht zu behindern, wurden dabei die
Deckel der Probengefäße geöffnet.
3.4. DNA Isolierung und qPCR Experimente
Zur Isolierung genomischer DNA wurde das DNeasy blood and tissue kit (QIAGEN,
Hilden, Deutschland) eingesetzt und die Isolierung nach Herstellerangaben
durchgeführt. Für die quantitative real-time PCR zum Nachweis von Campylobacter
spp. wurde das SureFood® PATHOGEN Campylobacter PLUS LC Kit (Congen,
Berlin, Deutschland) verwendet, welches die drei Spezies Campylobacter jejuni,
C. coli und C. lari detektiert. Hierbei wird ein 287-bp großes Amplikat des Zielgens
der 16S rRNA amplifiziert. Die Detektionsgrenze dieses Kits ist vom Hersteller mit ≤ 5
Kopien/Probe angegeben. Das 25 µl PCR-Probenvolumen beinhaltete 18,6 µl
Campylobacter Plus LC reaction mix, 1,1 µl fluorescence detection setup (FDE),
0,3 µl Taq-Polymerase und 5 µl template DNA. Die PCR-Reaktion wurde bei 95 °C
für 60 sec. mit anschließenden 45 Zyklen bei 95 °C für 10 sec. und 60 °C für 15 sec.
36 Material und Methoden
durchgeführt. Bei jedem Reaktionsansatz wurden Postiv-, Negativ- und
Extraktionskontrollen, ein DNA-Standard mit bekannter Konzentration sowie eine
interne Amplifikationskontrolle mitgeführt. Die qPCR Experimente wurden mit einem
LightCycler 480 II Gerät (Roche, Diagnostics, Mannheim, Deutschland) durchgeführt.
Die Gerätesoftware wurde verwendet, um den „Threshold cycle“ (Ct-Wert) mittels der
„Second Derivate Maximum“-Methode zu bestimmen. Zur Berechnung der Anzahl
lebender Campylobacter-Zellen in der Probe wurde ein interner DNA-Standard aus
EMA behandelten Zellen verwendet und zusammen mit einer EMA-Standardkurve
für die Berechnungen genutzt, um die Verschiebung der Ct-Werte durch die
Verwendung des Differenzierungsmittels auszugleichen. Die Berechnung der
Keimkonzentration aus den ermittelten Ct-Werten unter Verwendung der
Standardkurve erfolgte mittels der Gerätesoftware. Jeder Versuch wurde in drei
unabhängigen Wiederholungen getestet.
3.5. Ermittlung der Signalreduktion in der qPCR bei Verwendung von
hitzeinaktivierten Campylobacter-Zellen
Zur Bestimmung der Signalreduktion unter Verwendung der interkalierenden
Substanzen (Differenzierungsmittel) bei hitzeinaktivierten Campylobacter-Zellen
wurden serielle Verdünnungsreihen von C. jejuni DSM 4688 (mit einem
Ausgangskeimgehalt von 2,34 x 107 - 2,99 x 107) hergestellt und mit den
Differenzierungsmitteln EMA oder PMA versetzt. Dabei wurden die
Differenzierungsmittel in Konzentrationen von 10 µg/ml EMA und 100 µg/ml EMA
sowie 25,55 µg/ml PMA und 51,10 µg/ml PMA eingesetzt und die Proben, wie in
Abschnitt 3.3. beschrieben, weiter bearbeitet. Nach Isolierung der genomischen DNA
wurden die Keimgehalte mittels qPCR und EMA-qPCR bestimmt. Zudem wurden die
hitzeinaktivierten Zellen einer EMA-Doppelbehandlung unterzogen. Dabei wurden die
Proben mit 10 µg/ml EMA versetzt und nach Inkubation im Dunkeln einer Belichtung
unterzogen, um eine Bindung von EMA an die DNA zu induzieren. Bei diesem
Belichtungsschritt wurden zudem überschüssige, ungebundene EMA-Moleküle in der
Lösung inaktiviert. Direkt im Anschluss daran wurde eine zweite Behandlung der
Material und Methoden 37
Bakteriensuspension mit EMA in Endkonzentrationen von 10 µg/ml durchgeführt. Die
weitere Bearbeitung der Proben erfolgte wie beschrieben. In allen Versuchsansätzen
wurden Kontrollproben von unbehandelten, hitzeinaktivierten Campylobacter-Zellen
mitgeführt. Die Versuche wurden in drei unabhängigen Wiederholungen getestet.
3.6. Testung der EMA-qPCR Methode zum Nachweis lebe nder
Campylobacter-Zellen auf Geflügelfleischproben
Für die Testung der EMA-qPCR Methode an der Lebensmittelmatrix Geflügelfleisch
wurden tiefgekühlte Hühnerschenkel mit Rückenstück aus dem Einzelhandel
verwendet und bei -20 °C bis zur weiteren Probenbearbeitung gelagert. Nach dem
Auftauen der Hühnerschenkel für 14 Stunden bei 21 ± 1 °C wurden die Proben mit
unterschiedlichen Konzentrationen (KbE/ml) an lebenden, hitzeinaktivierten oder
Gemischen aus lebenden und hitzeinaktivierten Campylobacter-Zellen (1:10, 1:100
und 1:1000 lebenden zu toten Zellen) versetzt. Anschließend erfolgte eine Inkubation
der Proben für 20 min. bei einer Temperatur von 21 ± 1 °C. Zur Reisolierung der
Keime wurden die Hühnerschenkel in sterile Stomacherbeutel verbracht und mit
100 ml NaCl (0,9 %) für 2 min. geschüttelt. Der Keimgehalt in der NaCl-Suspension
wurde mittels qPCR und EMA-qPCR bestimmt und nach serieller Verdünnung der
Bakteriensuspension mit den Ergebnissen der mikrobiologischen Keimzählung
verglichen.
3.7. Isolierung von Campylobacter-Zellen aus Wasserproben
Um eine geeignete Methode zur Aufkonzentrierung von Campylobacter spp. aus
Wasserproben zu ermitteln, wurden die Membranfiltrationsmethode und die
Zentrifugationsmethode vergleichend untersucht. Dafür wurden serielle
Verdünnungsreihen von Campylobacter jejuni DSM 4688 in NaCl (0,9 %) hergestellt.
Bei diesen Versuchsreihen wurde NaCl verwendet, um einen Einfluss des
osmotischen Drucks auf die Zellen auszuschließen.
38 Material und Methoden
Bei der Filtrationsmethode wurden 10 ml von jeder Keimverdünnung durch einen
Zellulose Ester Membranfilter (Biosart 100 Monitore, 0,45 µm Porengröße, Sartorius,
Göttingen, Deutschland) mittels einer Vakuumpumpe (Typ MP 1 Pfeiffer, Asslar,
Deutschland) filtriert. Anschließend wurden die Filter mit 10 ml NaCl (0,9 %)
nachgespült, um an der Gefäßwand anhaftende Bakterien zu entfernen. Mit einer
sterilen Pinzette wurde der Membranfilter in einen Erlenmeyerkolben mit 10 ml NaCl
(0,9 %) überführt und zur Reisolierung der Keime von der Filtermembran für 2 min.
gevortext.
Für die Zentrifugationsmethode wurde von jeder seriellen Verdünnungsstufe der
Keime in NaCl ein Probenvolumen von 100 ml verwendet und die Keimsuspensionen
für 15 min. bei 5141 x g zentrifugiert. Der Zentrifugationsüberstand wurde
anschließend abgesaugt und das Bakterienpellet in 1 ml 0,9 % NaCl resuspendiert.
Die Keimgehalte wurden mittels der qPCR, der EMA-qPCR und der
mikrobiologischen Keimzählung in drei unabhängigen Wiederholungen bestimmt.
3.8. Testung von Oberflächenwasser-, Leitungswasser -, Mineralwasser-
und Regenwasserproben
Zur Testung des Einflusses von verschiedenen Wasserarten auf die Ergebnisse der
EMA-qPCR Methode wurden Oberflächenwasser- und Leitungswasserproben
untersucht und mit den Ergebnissen einer mit Campylobacter spp.-gespikten
Kontrolle aus 0,9 % NaCl verglichen. Das Oberflächenwasser wurde von einem
Teich aus Isernhagen, Deutschland, entnommen. Die Leitungswasserproben wurden
aus der öffentlichen Trinkwasserversorgung (Hannover, Deutschland) gezogen. Die
Wasserproben wurden mit verschiedenen Konzentrationen an lebenden C. jejuni und
C. coli oder Gemischen aus lebenden und toten Zellen (1:10, 1:100 lebend zu tot)
versetzt und der Keimgehalt mit der qPCR Methode, der EMA-qPCR Methode und
der mikrobiologischen Keimzählung bestimmt. Um die EMA-qPCR Methode an
weiteren Wasserarten zu testen wurden Regenwasser- und Mineralwasserproben
untersucht. Das Regenwasser wurde in Hannover, Deutschland, gesammelt und das
Material und Methoden 39
Mineralwasser ohne Kohlensäure (EDEKA, Hamburg, Deutschland) aus dem
Einzelhandel bezogen. Die Keimkonzentrationen wurden in jeweils drei
unabhängigen Wiederholungen ermittelt.
3.9. Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen
Die fluoreszenzmikroskopische Methode wurde eingesetzt, um Veränderungen der
Integrität der bakteriellen Zellmembran, welche durch die
Aufkonzentrierungsmethoden oder durch die verschiedenen Wasserarten
hervorgerufen wurden, zu ermitteln. Dafür wurden die DNA-interkalierenden
Farbstoffe Propidiumiodid (rot) zur Färbung der membrangeschädigten Zellen und
SYTO® 9 (grün) zur Färbung membranintakter Zellen verwendet (im Verhältnis 1:1).
Die Farbstoffe wurden einem Probenvolumen von 1 ml zugesetzt (LIVE/DEAD®
BacLight™ Bacterial Viability Kit, Invitrogen, Darmstadt, Deutschland). Die Proben
wurden für 10 min. im Dunkeln inkubiert und anschließend bei 3000 rpm für 5 min.
zentrifugiert, um die Zellen zur mikroskopischen Auswertung auf den Boden der
Mikrotiterplatte abzusenken. Die mikroskopische Auswertung wurde mit einem Leica
Konfokalmikroskop DMI6000CS durchgeführt (Leica Microsystems, Wetzlar,
Germany) und dabei ein HCX PL APO lambda blue 63.0 x 1.40 Öl UV-Objektiv
verwendet. Für jede Probe wurden mindestens sechs fluoreszenzmikroskopische
Bilder in die Auswertung einbezogen, um den Mittelwert der prozentualen Anteile
gefärbter Zellen zu berechnen. Dabei stellten sich lebende Zellen rot dar, tote Zellen
waren grün und intermediäre Zellen orange gefärbt. Alle Versuche wurden in drei
unabhängigen Wiederholungen durchgeführt.
3.10. Statistische Auswertungen
Für die Berechnung der Keimkonzentration einer Probe mittels der erstellten
Standardkurve wurde die LightCycler Software (Roche) verwendet. Die Berechnung
der PCR-Effizienz erfolgte mittels der Formel E = 10(-1/S) – 1. Dafür wurde die
Steigung (S) der Standardkurve aus seriellen Verdünnungen von C. jejuni DSM 4688
40 Material und Methoden
(KbE/ml) in Abhängigkeit von den ermittelten Ct-Werten der qPCR berechnet. Die
statistischen Auswertungen wurden mittels der GraphPad Prism 6® Software
(GraphPad Software, San Diego, CA, USA) durchgeführt. Zum Vergleich der
mathematisch berechneten Werte mit den experimentell erzielten Resultaten einer
Signalreduktion bei Anwendung von EMA und PMA, wurde die two-way ANOVA
Analyse mit einem „Sidak´s multiple comparison“ post-hoc Test verwendet. Die
statistische Signifikanz aus den Ergebnissen der mikrobiologischen Keimzählung und
den Ergebnissen der qPCR oder der fluoreszenzmikroskopischen Auswertung wurde
mittels one-way ANOVA Analyse, mit sich anschließendem „Dunett`s multiple
comparison test“ für nicht wiederholte Messungen oder „Tukey´s multiple comparison
test“ für wiederholte Messungen, ermittelt. Das Signifikanzniveau wurde dabei auf
0,05 festgelegt. Um einen Vergleich zwischen den Ergebnissen der
mikrobiologischen Keimzählung und den Ergebnissen der qPCR zu erlangen, wurde
die Pearson-Regressionsanalyse eingesetzt. Dafür wurde die Microsoft Excel
Software verwendet. Zusätzlich dazu wurde die Bland-Altman Analyse nach
GROUVEN et al. (2007) eingesetzt, um einen Vergleich der Ergebnisse aus beiden
Methoden zu erzielen.
Zusammenfassung der Ergebnisse 41
4. Zusammenfassung der Ergebnisse
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit wurden in zwei Kapitel untergliedert. Im
ersten Abschnitt werden die Ergebnisse der Analysen zur Austestung der Eignung
einer qPCR-Methode zum Nachweis lebender Campylobacter-Zellen beschrieben.
Im zweiten Abschnitt erfolgte die Anwendung der etablierten Methode an der
Lebensmittelmatrix Geflügelfleisch und die Testung der qPCR-Methode für den
Nachweis von Campylobacter spp. aus Wasserproben.
4.1. Kapitel I – Resultate der Methodenentwicklung
4.1.1. Untersuchungen zur Quantifizierung von Campylobacter spp. mittels
einer qPCR-Methode
Um mit einer qPCR-Analyse eine Quantifizierung von Campylobacter-Zellen in einer
Probe durchführen zu können, wurde zunächst eine Standardkurve unter
Verwendung serieller Verdünnungen von bekannten Keimkonzentrationen an
C. jejuni DSM 4688 erstellt. Die Keimkonzentrationen von C. jejuni wurden zuvor mit
der mikrobiologischen Keimzählung bestimmt. Anschließend wurde mittels der
Gerätesoftware eine Gerade erstellt, bei der die in der qPCR erhaltenen Ct-Werte auf
der X-Achse und die durch die Standardmethode (mikrobiologische Keimzählung)
erhaltenen Keimkonzentrationen auf der Y-Achse aufgetragen wurden (s. Abbildung
1). Die so erstellte Standardkurve zeigte einen linearen Verlauf im Bereich von 1,85 x
102 bis 1,85 x 108 KbE/ml. In diesem Bereich kann die Standardkurve somit zur
Detektion von Campylobacter spp. genutzt werden, wobei 102 KbE/ml als
Detektionsgrenze definiert wurde. Die Steigung dieser Standardkurve war mit -3,34
sehr nah an dem idealen Wert von 3,32 Ct-Werten pro Zunahme der
Keimkonzentration um eine log10-Stufe. Zur Berechnung der PCR-Effizienz (E)
42 Zusammenfassung der Ergebnisse
wurde die Formel E = 10(-1/S) - 1 verwendet. Mittels dieser Formel konnte eine hohe
PCR-Effizienz von 98,9 % errechnet werden.
Später wurde ein interner DNA-Standard mit bekannter Keimkonzentration von
C. jejuni DSM 4688 hergestellt und zusammen mit der erstellten Standardkurve zur
Berechnung der Keimkonzentration in einer Probe mit unbekannter
Keimkonzentration verwendet. Zur Charakterisierung der qPCR wurde ein Vergleich
der Ergebnisse aus der qPCR (aus den Ct-Werten berechnete Keimkonzentrationen)
und der mikrobiologischen Keimzählung durchgeführt. Die Korrelation der Methoden
wurde mittels Pearson-Regressionsanalyse dargestellt und dabei konnte ein hoher
Korrelationskoeffizient von R2=0,997 errechnet werden, so dass hierbei eine gute
Übereinstimmung der Ergebnisse aus beiden Detektionsmethoden ermittelt werden
konnte.
Abbildung 1: Standardkurve, erstellt aus seriellen Verdünnungsreihen von C. jejuni
DSM 4688 in drei unabhängigen Wiederholungen
4.1.2. Bestimmung des Einflusses von EMA und PMA au f die Ergebnisse
der qPCR
In einem nächsten Schritt wurde getestet, ob durch den Einsatz der
Differenzierungsmittel EMA und PMA die Ergebnisse der qPCR beeinträchtigt
werden. Dafür wurden 24 Stunden auf Agarplatten bebrütete C. jejuni DSM 4688-
Zellen (welche im Folgenden als lebende Zellen bezeichnet werden) mit
unterschiedlichen Konzentrationen der beiden Differenzierungsmittel versetzt
Zusammenfassung der Ergebnisse 43
(10 µg/ml EMA und 100 µg/ml EMA; 25,55 µg/ml PMA und 51,10 µg/ml PMA) und im
Vergleich zu unbehandelten Zellen untersucht. Zur Kontrolle, ob das Lösungsmittel
DMSO (2 %) die Ergebnisse beeinträchtigt, wurde eine Kontrollprobe mit dem
Lösungsmittel DMSO (2 %) mitgeführt.
Bei Verwendung der Differenzierungsmittel EMA und PMA oder dem Lösungsmittel
DMSO kam es zu einer Verschiebung der Ct-Werte in der qPCR im Vergleich zu den
unbehandelten Zellen. Die Verschiebung der Ct-Werte zeigte sich bei EMA deutlicher
als bei Verwendung von PMA und stellte sich zudem konzentrationsabhängig dar.
Eine signifikante Erhöhung der Ct-Werte bei Verwendung lebender Campylobacter-
Zellen konnte bei Einsatz von EMA 10 µg/ml und EMA 100 µg/ml sowie bei PMA in
der Konzentration von 51,10 µg/ml beobachtet werden (s. Tabelle 3). Bei
Verwendung von EMA 100 µg/ml war diese Verschiebung am deutlichsten
ausgeprägt und betrug im Mittelwert 11,84 ± 3,70 SD Ct-Werte. Aufgrund dieser
hohen Ct-Verschiebung wurde EMA in der Konzentration von 100 µg/ml für die
weiteren Versuche nicht mehr verwendet. Eine graphische Darstellung der
Ergebnisse ist in Abbildung 1 der Publikation 1 aufgeführt.
44 Zusammenfassung der Ergebnisse
Tabelle 3: Signalreduktion in der qPCR bei Verwendung der Differenzierungsmittel
EMA und PMA oder dem Lösungsmittel DMSO (2%)
4.1.3. Nachweis lebender Campylobacter-Zellen in Gemischen aus
lebenden und hitzeinaktivierten Zellen
Um die Differenzierungskraft von EMA und PMA in Gemischen aus lebenden und
toten Zellen zu bestimmen, wurden Keimsuspensionen mit unterschiedlichen
Konzentrationen an lebenden und toten Zellen hergestellt (100 %, 50 %, 10 %, 1 %
oder 0,1 % lebende Zellen). Die Differenzierungsmittel EMA und PMA wurden
anschließend in unterschiedlichen Konzentrationen zugesetzt (10 µg/ml EMA, 51,10
µg/ml PMA und 25,55 µg/ml PMA) und der Keimgehalt der Proben mittels qPCR
bestimmt. Die durch membrangeschädigte, tote Zellen resultierende Erhöhung der
Ct-Werte in der qPCR wurde gemäß NOCKER et al. (2007) als Signalreduktion
definiert. Zur Ermittlung der Signalreduktion in der qPCR wurde die Differenz der Ct-
Werte aus den mit Differenzierungsmittel behandelten Zellen und den unbehandelten
Zellen berechnet.
Zusammenfassung der Ergebnisse 45
Bei Verwendung der Differenzierungssubstanzen konnte in allen getesteten
Konzentrationen von EMA und PMA eine Zunahme der Signalreduktion bei
steigender Konzentration an toten Zellen erzielt werden. Eine Ausnahme bildete
hierbei PMA in der Konzentration von 25,55 µg/ml, bei deren Einsatz keine weitere
Signalreduktion erreicht wurde, wenn weniger als 10 % lebende Zellen in der Probe
enthalten waren. Diese Ergebnisse sind in der Publikation 1 in Abbildung 2
dargestellt.
Um nun die Differenzierungskraft von EMA und PMA zu bestimmen, wurde die in den
Versuchen experimentell erzielte Signalreduktion mit dem jeweiligen theoretisch zu
erwarteten Wert verglichen. Als theoretisch erwarteter Wert wird eine Reduktion um
3,32 Ct-Werte in der qPCR erwartet, wenn die Keimkonzentration lebender Zellen um
eine log10-Stufe abnimmt. Bei einem Auftragen der erzielten Ct-Werte in der qPCR
gegen die eingesetzte Keimkonzentration lebender Zellen (durch mikrobiologische
Keimzählung bestimmt) kann die Signalreduktion in Form der Steigung einer
Geraden, welche durch die Messwerte gelegt wurde, abgelesen werden. Bei
Verwendung von EMA 10 µg/ml in den Versuchsreihen wurde eine Steigung von
-3,27 berechnet, welches einer Signalreduktion von -3,27 Ct-Werten pro log10-
Abnahme lebender Zellen entspricht. Auch bei Verwendung von PMA 51,10 µg/ml
konnte eine noch relativ nahe am theoretischen Wert liegende Signalreduktion von
-2,97 Ct-Werten pro log10-Abnahme lebender Zellen in Gemischen aus lebenden und
toten Zellen erzielt werden. Ausnahme bildete hierbei PMA in der Konzentration von
25,55 µg/ml, bei dessen Einsatz eine signifikante Abweichung (Steigung -1,24) im
Vergleich zum mathematisch erwarteten Wert der Regressionssteigung von -3,32 zu
verzeichnen war. Somit zeigte sich PMA 25,55 µg/ml als nicht ausreichend zur
Differenzierung lebender Zellen in Gemischen aus lebenden und toten Zellen.
46 Zusammenfassung der Ergebnisse
4.1.4. Limitierungen von EMA und PMA bei Verwendung von
hitzeinaktivierten Campylobacter-Zellen in der qPCR
Um zu prüfen, ob EMA und PMA zu einer kompletten Signalreduktion in der qPCR
bei Verwendung ausschließlich toter Campylobacter-Zellen in der Probe führen,
wurden hitzeinaktivierte Zellen in Keimkonzentrationen von 107 - 102 KbE/ml
eingesetzt. Diese wurden mit beiden Differenzierungsmitteln in unterschiedlichen
Konzentrationen (10 µg/ml EMA, 51,10 µg/ml PMA und 25,55 µg/ml PMA) behandelt
und anschließend in die qPCR eingesetzt. Bei Verwendung von bis zu 104 KbE/ml
toten Zellen konnte mit beiden Differenzierungsmitteln in allen getesteten
Konzentrationen eine vollständige Signalreduktion (definiert als Ct-Wert >35) erzielt
werden. Wurden Konzentrationen toter Zellen von 105 KbE/ml eingesetzt, konnte nur
mit dem Differenzierungsmittel PMA eine vollständige Signalreduktion erreicht
werden. Bei Verwendung höherer Keimkonzentrationen (>106 KbE/ml) in den
untersuchten Proben vermochten beide Differenzierungsmittel EMA und PMA keine
vollständige Signalreduktion erbringen. Dennoch konnte bei allen getesteten,
hitzeinaktivierten Proben eine signifikante Signalreduktion (5,51 bis 9,85 Ct-Werte) im
Vergleich zu den unbehandelten Zellen erreicht werden. Eine Doppelbehandlung der
Zellen mit 10 µg/ml EMA konnte die Ergebnisse deutlich verbessern, so dass bei
Keimkonzentrationen bis zu 106 KbE/ml Ct-Werte von >35 in der qPCR erzielt
wurden. Eine graphische Darstellung der Ergebnisse befindet sich in der Abbildung 3
der Publikation 1.
4.1.5. Erstellung von Standardkurven mit Zugabe von EMA und PMA
Da sich EMA 10 µg/ml und PMA 51,10 µg/ml als geeignet zur Differenzierung
lebender und toter Campylobacter-Zellen erwiesen haben, wurden in einem nächsten
Schritt die Standardkurven, welche zur Berechnung der Keimkonzentration an
lebenden Zellen in einer Probe benötigt werden, unter Verwendung von EMA und
PMA erstellt. Dieser Schritt erschien notwendig, da die Standardkurven prinzipiell auf
Zusammenfassung der Ergebnisse 47
die Versuchsbedingungen angepasst werden müssen. Diese beiden Standardkurven
wurden in drei unabhängigen Wiederholungen erstellt, um die Konstanz und
Linearität der Ct-Wert-Verschiebung bei Einsatz der Differenzierungsmittel zu testen.
Anschließend wurden die mit EMA und PMA erstellten Standardkurven mit der
unbehandelten Standardkurve (Kontrolle) vergleichend untersucht. Der Einsatz
beider Differenzierungsmittel resultierte dabei in einer Verschiebung der
Standardkurve im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. Diese Verschiebung war
bei Verwendung von EMA konstant und unabhängig von der eingesetzten
Keimkonzentration, so dass eine gute Übereinstimmung der Steigung beider
Geraden erzielt werden konnte (-3,346 bei einer Vorbehandlung mit EMA 10 µg/ml
und -3,349 bei der unbehandelten Kontrolle). Bei Verwendung von PMA 51,10 µg/ml
wurden jedoch andere Ergebnisse erzielt. Hierbei stellte sich die Verschiebung der
Standardkurve nicht parallel zu der unbehandelten Kontrolle dar, sondern die
Verschiebung zeigte sich abhängig von der eingesetzten Keimkonzentration. Dabei
wurden bei steigenden Keimkonzentrationen im Verhältnis niedrigere Ct-Werte in der
qPCR ermittelt. Demzufolge war eine Abweichung der Steigung der Geraden im
Vergleich zu den unbehandelten Kontrollzellen festzustellen (-3,603). Um einen
Vergleich der Korrelationskoeffizienten mit und ohne Zugabe der
Differenzierungsmittel zu erzielen, wurde die Pearson-Regressionsanalyse
verwendet. Bei Verwendung von EMA sowie der unbehandelten Kontrolle konnten
hohe Korrelationskoeffizienten erzielt werden (R2=0,977). Obwohl auch bei Einsatz
von PMA ein hoher Korrelationskoeffizient ermittelt werden konnte (R2=0,989), zeigte
die Standardkurve mit Zugabe von PMA eine Verschiebung im Vergleich zu der
unbehandelten Kontrollkurve, welches in Abbildung 4 der Publikation 1 gezeigt ist.
Anhand der besseren Resultate bei Verwendung von EMA wurde daraufhin EMA in
der Konzentration von 10 µg/ml für die weiteren Untersuchungen ausgewählt und für
alle folgenden Versuche verwendet.
Aufgrund einer Verschiebung der Ct-Werte bei Einsatz des Differenzierungsmittels
EMA wurde ein interner DNA-Standard aus EMA behandelten Zellen verwendet und
bei allen weiteren Untersuchungen mitgeführt. Nur so konnte die Keimkonzentration
an lebenden Campylobacter-Zellen in der Probe korrekt bestimmt werden. Dieser
48 Zusammenfassung der Ergebnisse
DNA-Standard wurde zusammen mit der EMA-Standardkurve für alle folgenden
Versuche verwendet.
4.1.6. Methodenvergleichsuntersuchung zwischen den Ergebnissen aus
der EMA-qPCR und der mikrobiologischen Referenzmeth ode
Um einen Vergleich der Ergebnisse aus der EMA-qPCR und der klassisch-
mikrobiologischen Keimzählung zu ermöglichen, wurde die Pearson-
Regressionsanalyse und die Bland-Altman Analyse eingesetzt. Die Pearson-
Regressionsanalyse diente zur Darstellung der Korrelation zwischen der klassisch-
mikrobiologischen Keimzählung und den Ergebnissen der berechneten
Keimkonzentrationen aus der qPCR. Die Bland-Altman Analyse wurde zur
Berechnung der Übereinstimmung der beiden Detektionsmethoden eingesetzt. Für
diese Vergleichsuntersuchungen wurden die Keimkonzentrationen von 16
Feldisolaten sowie den Typstämmen C. jejuni DSM 4688 und C. coli DSM 4689,
welche mit der EMA-qPCR berechnet und parallel dazu mit der mikrobiologischen
Keimzählung ermittelt wurden, vergleichend untersucht. Bei Verwendung von
lebenden Campylobacter-Zellen konnte mittels Pearson-Regressionsanalyse ein
hoher Korrelationskoeffizient von R2=0,947 mit einer Steigung der Geraden von
1,029 erzielt werden. Auch bei einer Methodenvergleichsuntersuchung mittels der
Bland-Altman Analyse konnte eine gute Übereinstimmung der Methoden erzielt
werden, hierbei wurde eine mittlere Differenz der Resultate im Vergleich der
Methoden von -0,047 mit einer Standardabweichung von 0,461 errechnet. Die 95 %
Grenzen der Übereinstimmung betrugen 0,856 (obere Grenze) und -0,951 (untere
Grenze), so dass eine hohe Übereinstimmung der beiden Detektionsverfahren erzielt
werden konnte.
In einem nächsten Schritt wurde die Methodenvergleichsuntersuchung auch mit
Gemischen aus lebenden und toten (bis zu 1:1000 lebenden zu toten Zellen)
Campylobacter-Zellen durchgeführt. Ebenso wie bei Verwendung der lebenden
Zellen wurde auch bei den Versuchsreihen mit Gemischen aus lebenden und toten
Zusammenfassung der Ergebnisse 49
Zellen eine hohe Übereinstimmung der Messwerte aus beiden Detektionsmethoden
erzielt. Dabei wurde ein hoher Korrelationskoeffizient von R2=0,99 mit einer Steigung
der Geraden von 1,022 errechnet. Die gute Übereinstimmung der beiden Methoden
wurde zudem mit einer Bland-Altman Analyse bestätigt, in welcher ein Mittelwert der
Differenzen von -0,136 ± 0,175 SD log10 KbE und 95 % Übereinstimmungsgrenzen
von 0,479 und -0,207 log10 KbE ermittelt werden konnten. Somit ist es mit der EMA-
qPCR Methode möglich, äquivalente Ergebnisse zur mikrobiologischen
Referenzmethode zu erzielen.
4.2. Kapitel II – Resultate der Anwendung der Metho de an Lebensmitteln
Nach Etablierung der EMA-qPCR Methode für den Nachweis von lebenden
Campylobacter-Zellen wurde die Methode in einem nächsten Schritt an
unterschiedlichen Lebensmittelmatrices wie bei Geflügelfleisch und Wasserproben
getestet.
4.2.1. Anwendung der EMA-qPCR zum Nachweis lebender Campylobacter-
Zellen auf gespikten Hühnerfleischproben
Da kontaminiertes Geflügelfleisch die Hauptquelle humaner Campylobacteriosen
darstellt, wurde die EMA-qPCR Methode für den Nachweis und die Differenzierung
lebender Campylobacter auf Geflügelfleisch getestet. Dafür wurden der Typstamm
C. jejuni DSM 4688 sowie verschiedene Feldisolate von C. jejuni (n=7) und C. coli
(n=9) in unterschiedlichen Konzentrationen (bis zu 106 KbE/ml) auf
Hühnerschenkelproben mit Rückenstück aufgebracht. Die Keime wurden
anschließend reisoliert und die Keimkonzentrationen der Bakterien vergleichend
mittels der qPCR, der EMA-qPCR Methode sowie mit der mikrobiologischen
Keimzählung bestimmt. Die in dieser Studie verwendeten Geflügelfleischproben aus
dem Einzelhandel zeigten hierbei bereits eine natürliche Kontamination mit
Campylobacter spp., welche trotz Tiefkühlung der Geflügelstücke mittels
50 Zusammenfassung der Ergebnisse
mikrobiologischer Keimzählung detektiert werden konnten. Die Keimkonzentrationen
lagen dabei zwischen 102-103 KbE/ml pro verwendetem Hühnerteilstück.
Bei den mit lebenden Campylobacter-Zellen versetzten Geflügelfleischproben konnte
eine hohe Übereinstimmung der Resultate aus der EMA-qPCR im Vergleich zur
mikrobiologischen Referenzmethode erzielt werden. Die Korrelation der Ergebnisse
ließ sich durch einen hohen Korrelationskoeffizienten von R2=0,95 mit einer Steigung
der Geraden von 1,221 berechnen. Zudem konnte die gute Übereinstimmung der
beiden Methoden mittels einer Bland-Altman Analyse verifiziert werden (mittlere
Differenz von -0,648 ± 0,564 (SD) log10 KbE mit einem 95 % Limit der
Übereinstimmung von 0,458 und -1,754 log10 KbE).
In einem nächsten Schritt wurden die Geflügelfleischproben mit unterschiedlichen
Gemischen aus lebenden und hitzeinaktivierten C. jejuni DSM 4688 versetzt. Die
Keimkonzentration auf den Geflügelteilstücken wurde dann mittels EMA-qPCR und
mikrobiologischer Referenzmethode vergleichend bestimmt. Während bei der
Keimkonzentrationsbestimmung mittels qPCR ohne vorherige Zugabe von EMA eine
konstante Keimzahl von 5,160 ± 0,117 (SD) log10 KbE unabhängig von der
Konzentration lebender Zellen auf den Hühnerfleischproben ermittelt wurde, konnte
unter Verwendung von EMA die Überlegenheit der EMA-qPCR Methode dargestellt
werden. Dabei konnten im Gegensatz zu den Resultaten ohne Einsatz von EMA in
der qPCR mit Zugabe von EMA steigende Ct-Werte bei steigenden Konzentrationen
an toten Zellen errechnet werden. In Analogie zu den Ergebnissen der lebenden
Campylobacter-Zellen konnte auch bei Gemischen aus lebenden und toten Zellen
auf Geflügelfleisch ein hoher Korrelationskoeffizient (R2=0,840; Steigung der
Geraden von 0,966) aus den Ergebnissen der EMA-qPCR und der mikrobiologischen
Referenzmethode erzielt werden. Die graphische Darstellung der Ergebnisse ist in
der Publikation 1 in Abbildung 6 ersichtlich. Darüber hinaus konnte die
Übereinstimmung der Methoden mittels Bland-Altman Analyse bestätigt werden, bei
der eine mittlere Differenz der beiden Methoden von 0,214 ± 0,462 (SD) log10 KbE
sowie unteren und oberen 95 % Übereinstimmungsgrenzen von -0,691 und 1,119
errechnet wurden.
Zusammenfassung der Ergebnisse 51
4.2.2. Vergleichende Untersuchung der Membranfiltra tions- und
Zentrifugations-methode zur Isolierung von Campylobacter-Zellen
aus Wasser
Da bei der bakteriellen Untersuchung von Wasserproben in der Regel ein
Aufkonzentrierungsschritt nötig ist, wurden die beiden häufig verwendeten
Aufkonzentrierungsmethoden der Zentrifugation und der Membranfiltration zur
Isolierung von C. jejuni DSM 4688 aus Wasserproben vergleichend getestet. Dafür
wurden serielle Verdünnungsreihen von lebenden C. jejuni (von 107 - 101 KbE/ml) in
NaCl (0,9 %) hergestellt. Die physiologische Kochsalzlösung wurde verwendet, um
einen schädigenden Effekt des Wassers auf die Zellen durch den osmotischen Druck
zu verhindern. Die Keimkonzentrationen wurden vor und nach der Zentrifugation und
Filtration der Proben mit der mikrobiologischen Keimzählung bestimmt. Alle
Versuche wurden in drei unabhängigen Wiederholungen durchgeführt, um den
Mittelwert des Zellverlustes zu ermitteln. Bei Verwendung von beiden
Aufkonzentrierungsmethoden zeigte sich ein Verlust an Campylobacter-Zellen. Im
Vergleich der beiden Methoden konnte bei der Zentrifugationsmethode ein signifikant
(p<0,05) höherer Zellverlust als bei der Filtrationsmethode detektiert werden. Bei der
Zentrifugationsmethode betrug der Zellverlust 1,08 ± 0,021 SD log10 KbE/ml, bei der
Filtrationsmethode war der Zellverlust mit 0,73 ± 0,161 SD log10 KbE/ml etwas
geringer (p<0,05). Dieser Zellverlust zeigte sich jedoch unabhängig von der
Keimkonzentration der Campylobacter-Zellen in der gespikten Probe.
4.2.3. Fluoreszenzmikroskopische Bestimmung der pro zentualen Anteile
lebender und toter Campylobacter-Zellen bei Verwendung der
Zentrifugations- und Membranfiltrationsmethode
Um zu ermitteln, ob durch die Verwendung der Zentrifugations- und
Membranfiltrationsmethode die prozentualen Anteile lebender und toter
Campylobacter-Zellen beeinflusst werden, wurde die Fluoreszenzmikroskopie
eingesetzt. Dafür wurden mit Campylobacter-Zellen (zwischen 3,0 x 105 - 1,5 x 106
52 Zusammenfassung der Ergebnisse
KbE/ml C. jejuni DSM 4688) gespikte 0,9 % NaCl-Proben (Suspensionen)
verwendet. Die prozentualen Anteile von lebenden und toten Zellen wurden nach der
Zentrifugation und Membranfiltration im Vergleich zu den unbehandelten Proben
bestimmt. Von jeweils drei Replikaten pro Probe wurden mindestens sechs
fluoreszenzmikroskopische Bilder in die Auswertungen einbezogen, um den
Mittelwert der Ergebnisse zu bestimmen. Bei beiden Methoden zeigte sich eine
Verschiebung der prozentualen Anteile lebender und toter Zellen. Dabei konnten
signifikant (p<0,05) höhere prozentuale Anteile an lebenden Zellen (grün) nach
Zentrifugation (76,95 %) und Filtration (79,55 %) im Vergleich zu der unbehandelten
Probe (61,08 %) detektiert werden. Demgegenüber befanden sich 23,05 % (nach
Zentrifugation), 20,45 % (nach Filtration) und 38,92 % (ohne Aufkonzentrierungs-
schritt) tote Zellen (rot) in der Probe. Intermediäre Zellen (orange) wurden nicht
nachgewiesen. Im Vergleich der beiden Aufkonzentrierungsmethoden bestand kein
signifikanter Unterschied der prozentualen Anteile von lebenden und toten Zellen.
Diese Ergebnisse sind in der Abbildung 1 der Publikation 2 dargestellt.
4.2.4. Ergebnisse der qPCR mit und ohne EMA bei Ver wendung der
Zentrifugations- und Membranfiltrationsmethode
Um den Einfluss der Aufkonzentrierungsmethoden auf die Ergebnisse der qPCR zu
testen, wurden serielle Verdünnungsreihen von C. jejuni DSM 4688 in NaCl (0,9 %)
hergestellt. Der Keimgehalt wurde nach Zentrifugation oder Membranfiltration mittels
qPCR, EMA-qPCR und der mikrobiologischen Keimzählung vergleichend bestimmt.
Nach Zentrifugation der Proben zeigten die Ergebnisse der qPCR ohne EMA
signifikant (p<0,05) höhere Keimkonzentrationen (0,78 ± 0,184 SD log10 KbE/ml) im
Vergleich zur mikrobiologischen Referenzmethode. Bei einer grafischen Auftragung
der ermittelten Keimkonzentrationen aus der qPCR und der mikrobiologischen
Keimzählung zeigte sich dabei eine Verschiebung der Detektionsgeraden aus den
Ergebnissen der qPCR ohne EMA im Vergleich zur mikrobiologischen
Referenzmethode. Dagegen konnte mittels EMA-qPCR eine hohe Übereinstimmung
der Ergebnisse zu den Ergebnissen der Referenzmethode erzielt werden, so dass
Zusammenfassung der Ergebnisse 53
kein signifikanter Unterschied (p>0,05) zwischen den Methoden zu verzeichnen war.
Eine graphische Darstellung der Ergebnisse ist in der Abbildung 2A der Publikation 2
ersichtlich.
Um eine Korrelation zwischen den Ergebnissen der qPCR mit und ohne EMA und
der mikrobiologischen Referenzmethode darzustellen, wurde die Pearson-
Regressionsanalyse verwendet. Dabei konnte bei Zentrifugation der Proben mit der
EMA-qPCR eine hohe Korrelation der ermittelten Keimkonzentrationen (R2=0,866;
mit einer Steigung der Geraden von 0,815) zu der mikrobiologischen
Referenzmethode ermittelt werden. Trotz der Verschiebung der Detektionsgeraden
bei Verwendung der qPCR ohne Zugabe von EMA wurde eine hohe Korrelation
(R2=0,925) zu den mittels mikrobiologischer Keimzählung erzielten
Keimkonzentrationen errechnet.
Im Gegensatz dazu konnte bei Filtration der Proben sowohl bei den Ergebnissen der
qPCR als auch bei der EMA-qPCR eine hohe Übereinstimmung im Vergleich zur
mikrobiologischen Keimzählung erzielt werden (diese Ergebnisse sind in der
Abbildung 2B der Publikation 2 dargestellt). Signifikante Unterschiede zwischen den
Methoden ließen sich nicht feststellen (p>0,05). Mittels Pearson-Regressionsanalyse
ließ sich die Übereinstimmung der Messwerte darstellen und hohe
Korrelationskoeffizienten berechnen (ohne EMA: R2=0,942; Steigung=1,001 und mit
EMA: R2=0,893; Steigung=0,954).
Nach diesen Ergebnissen zeigte sich die Filtrationsmethode als besser geeignet zur
Isolierung von Campylobacter-Zellen aus Wasserproben, so dass diese Methode für
die folgenden Versuche verwendet wurde.
54 Zusammenfassung der Ergebnisse
4.2.5. Fluoreszenzmikroskopische Bestimmung der pro zentualen Anteile
von lebenden und toten Bakterienzellen in Leitungsw asser- und
Oberflächenwasserproben
Um den Einfluss verschiedener Wasserarten auf Campylobacter-Zellen zu ermitteln,
wurden gespikete Oberflächenwasser- und Leitungswasserproben mit der
fluoreszenzmikroskopischen Methode vergleichend untersucht Dafür wurden die
Wasserproben sowie eine NaCl-Kontrollprobe mit 5,0 x 105 KbE/ml C. jejuni DSM
4688 versetzt und für 45 min. bei Raumtemperatur inkubiert. Die prozentualen
Anteile lebender und toter Zellen wurden anschließend mittels
fluoreszenzmikroskopischer Auswertung bestimmt und mit den Ergebnissen der
NaCl-Kontrollprobe verglichen.
Bei den Leitungswasserproben stimmten die prozentualen Anteile von lebenden und
toten Zellen (Mittelwert von: 50,18 % lebenden, 46,73 % toten und 3,09 %
intermediären Zellen) mit den Ergebnissen der NaCl-Kontrollprobe überein
(Mittelwert von: 56,87 % lebenden, 41,10 % toten und 2,03 % intermediären Zellen),
und es konnte kein signifikanter Unterschied (p>0,05) zwischen den beiden Medien
ermittelt werden.
Im Gegensatz dazu wurde bei den Oberflächenwasserproben ein hoher prozentualer
Anteil an toten Zellen in den Proben detektiert (Mittelwert von: 13,82 % lebenden,
81,59 % toten und 4,59 % intermediären Zellen), so dass ein signifikanter
Unterschied (p<0,05) im Vergleich zu den Ergebnissen der NaCl-Kontrollprobe
ermittelt werden konnte. Eine grafische Darstellung der Ergebnisse zeigen die
Abbildungen 3A, B und C der Publikation 2.
Zusammenfassung der Ergebnisse 55
4.2.6. Ergebnisse der qPCR und EMA-qPCR zum Nachwei s von
Campylobacter-Zellen aus unterschiedlichen Wasserproben
Die Wasserproben wurden mit 1,5 x 107 - 2,3 x 102 KbE/ml des Typstamms C. jejuni
DSM 4688 versetzt. Nach Filtration der Proben wurden die Keimkonzentrationen mit
der qPCR und der EMA-qPCR bestimmt und mit den Ergebnissen der
mikrobiologischen Referenzmethode verglichen. Obwohl bei den
Leitungswasserproben die qPCR ohne EMA etwas höhere Keimzahlen detektierte
als die mikrobiologische Referenzmethode (s. Abbildung 4 der Publikation 2), konnte
ein hoher Korrelationskoeffizient (R2=0,921; Steigung der Gerade=0,864) zur
kulturellen Nachweismethode erzielt werden. Bei Verwendung der EMA-qPCR zeigte
sich ebenfalls eine hohe Übereinstimmung der Messwerte zur mikrobiologischen
Keimzählung (R2=0,863; Steigung=0,939). Dies konnte auch mit einer Bland-Altman
Analyse bestätigt werden, welche zum Vergleich zweier Methoden eingesetzt wird.
Dabei zeigten die Ergebnisse der EMA-qPCR und der mikrobiologischen
Referenzmethode eine Differenz der detektierten Keimkonzentrationen von 0,189
± 0,579 log10 KbE/ml mit unteren und oberen 95 % Grenzen der Übereinstimmung
von -0,946 und 1,323 (Abbildung 5B der Publikation 2). Auch mit der qPCR ohne
EMA konnte eine gute Übereinstimmung zur Referenzmethode ermittelt werden. Hier
zeigten sich eine Differenz des ermittelten Keimgehaltes von -0,099 ± 0,442 SD log10
KbE/ml und Übereinstimmungsgrenzen von -0,965 und 0,766 (Abbildung 5A der
Publikation 2).
Da die EMA-qPCR Methode eine gute Eignung zum Nachweis und zur
Quantifizierung lebender Campylobacter-Zellen in Leitungswasserproben zeigte,
wurde die Methode auch an Mineralwasser- und Regenwasserproben getestet. In
Analogie zu den Ergebnissen bei Verwendung von Leitungswasser konnten auch bei
Mineralwasser- und Regenwasserproben hohe Korrelationen zwischen den
Ergebnissen der EMA-qPCR und der mikrobiologischen Referenzmethode erzielt
werden (R2=0,989; Steigung=1,013 bei Mineralwasser und R2=0,929;
Steigung=0,951 bei Regenwasser). Die Methodenvergleichsuntersuchungen mittels
56 Zusammenfassung der Ergebnisse
Bland-Altman Analyse zeigten sowohl bei Mineralwasser als auch bei Regenwasser
eine hohe Übereinstimmung der beiden Detektionsmethoden (Mineralwasser:
Differenz des ermittelten Keimgehaltes von 0,153 ± 0,171 SD log10 KbE/ml und
Übereinstimmungsgrenzen von -0,183 und 0,488; Regenwasser: Mittlere Differenz
der beiden Methoden von 0,138 ± 0,439 SD log10 KbE sowie unteren und oberen
95 % Übereinstimmungsgrenzen von -0,722 und 0,998).
In einem weiteren Schritt dieser Versuchsreihe wurde die EMA-qPCR auch zur
Detektion von Campylobacter in Oberflächenwasser getestet. Bei Verwendung von
Oberflächenwasser konnte jedoch keine Übereinstimmung der EMA-qPCR zur
mikrobiologischen Referenzmethode erzielt werden (R2=0,0005, Steigung=0,0143).
Die geringe Übereinstimmung der Methoden wurde mittels einer Bland-Altman
Analyse bestätigt, bei welcher eine Differenz der Ergebnisse von 1,119 ± 1,166 SD
log10 KbE/ml mit 95 % Übereinstimmungsgrenzen von -1,166 und 3,405 ermittelt
wurden.
Abschließend war es wichtig, die Eignung der Methode auch unter Verwendung
unterschiedlicher Feldisolate zu überprüfen. Dazu wurden insgesamt 13 Feldisolate
der Spezies C. jejuni (n=7) und C. coli (n=6) aus Leitungswasserproben mittels der
Filtrationsmethode isoliert und mit der EMA-qPCR im Vergleich zur
mikrobiologischen Referenzmethode untersucht. Bei zwei Isolaten war eine
Keimkonzentrationsbestimmung mittels EMA-qPCR möglich, diese gelang jedoch
nicht mit der mikrobiologischen Keimzählung. Diese zwei Isolate wurden folglich von
einer Berechnung mittels der Pearson–Regressionsanalyse ausgeschlossen. Für die
verbleibenden 11Isolate konnte jedoch ein hoher Korrelationskoeffizient im Vergleich
der Resultate aus der EMA-qPCR und der mikrobiologischen Keimzahlbestimmung
erzielt werden (R2=0,936; Steigung=0,928). Diese Ergebnisse sind in der Abbildung 6
der Publikation 2 graphisch dargestellt.
Zusammenfassung der Ergebnisse 57
4.2.7. Nachweis von lebenden Campylobacter-Zellen in unterschiedlichen
Gemischen aus lebenden und toten Zellen bei Verwend ung von
Leitungswasserproben
Diese Versuchsreihe diente dazu, die Eignung der entwickelten EMA-qPCR Methode
zur Detektion von lebenden Campylobacter-Zellen aus Leitungswasser zu testen,
auch wenn tote Zellen in der Wasserprobe vorhanden sind. Hierbei wurden
Gemische aus lebenden und toten C. jejuni DSM 4688 (1:10 und 1:100 lebende zu
toten Zellen) hergestellt, das Leitungswasser mit diesen Gemischen versetzt und als
Proben eingesetzt. Die Keimkonzentrationen wurden parallel mittels der qPCR, der
EMA-qPCR und der mikrobiologischen Keimzählung bestimmt. Mittels einer
vergleichenden Bland-Altman Analyse wurde in der qPCR ohne Einsatz von EMA
eine geringe Übereinstimmung der Ergebnisse im Vergleich zur mikrobiologischen
Keimzählung ermittelt. Dabei wurde eine Differenz der Keimkonzentration zur
mikrobiologischen Referenzmethode von -2,247 ± 0,778 SD log10 KbE/ml und
Übereinstimmungsgrenzen von -0,721 und 3,773 errechnet. Im Gegensatz dazu
konnte bei Einsatz der EMA-qPCR Methode eine generelle Übereinstimmung zur
mikrobiologischen Referenzmethode erzielt werden. Die Differenz der Ergebnisse
aus einer vergleichenden Bland-Altman Analyse betrug 0,017 ± 0,7151 SD log10
KbE/ml mit unteren und oberen Übereinstimmungsgrenzen von -1,385 und 1,419.
Somit konnte in diesen Versuchsreihen eine Überlegenheit der EMA-qPCR zur
Quantifizierung von Campylobacter spp. in Gemischen aus lebenden und toten
Zellen im Vergleich zu den Ergebnissen ohne Verwendung von EMA dargestellt
werden.
Publikationen 59
5. Publikationen
5.1. Comparative Analysis and Limitations of Ethidi um Monoazide and
Propidium Monoazide Treatment for the Differentiati on of Viable and
Nonviable Campylobacter Cells
Published in Applied and Environmental Microbiology , Vol. 80 , No. 7, 2014,
Pages 2186-2192. doi: 10.1128/AEM.03962-13.
DIANA SEINIGE, CARSTEN KRISCHEK, GUENTER KLEIN,
and CORINNA KEHRENBERG *
Institute for Food Quality and Food Safety, University of Veterinary Medicine Hannover,
Foundation, Hannover, Germany
Running title: Comparing EMA and PMA pretreatments of Campylobacter
Link: http://aem.asm.org/content/80/7/2186.long
* Corresponding author: Mailing address: Institute for Food Quality and Food Safety,
University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation, Bischofsholer Damm 15, 30173
Hannover, Germany; Phone: +49-511-856-7554. Fax: +49-511-856-7694. Electronic mail
address: [email protected]
• Planung der Experimente: D. Seinige, G. Klein, C. Kehrenberg • Durchführung der Experimente: D. Seinige • Auswertung der Ergebnisse: D. Seinige, C. Krischek, C. Kehrenberg • Verfassen oder kritische Durchsicht
des Manuskriptes: D. Seinige, C. Krischek, G. Klein, C. Kehrenberg
60 Publikationen
ABSTRACT
The lack of differentiation between viable and nonv iable bacterial cells limits
the implementation of PCR-based methods for routine diagnostic approaches.
Recently, the combination of a quantitative real-ti me PCR (qPCR) and ethidium
monoazide (EMA) or propidium monoazide (PMA) pretre atment has been
described to circumvent this disadvantage. In regar d to the suitability of this
approach for Campylobacter spp ., conflicting results have been reported.
Thus, we compared the suitabilities of EMA and PMA in various concentrations
for a Campylobacter viability qPCR method. The presence of either
intercalating dye, EMA or PMA, leads to concentrati on-dependent shifts toward
higher threshold cycle (C t) values, especially after EMA treatment. However,
regression analysis resulted in high correlation co efficient ( R2) values of 0.99
(EMA) and 0.98 (PMA) between Campylobacter counts determined by qPCR
and culture-based enumeration. EMA (10 µg/ml) and P MA (51.10 µg/ml)
removed DNA selectively from nonviable cells in mix ed samples at
viable/nonviable ratios of up to 1:1,000. The optim ized EMA protocol was
successfully applied to 16 Campylobacter jejuni and Campylobacter coli field
isolates from poultry and indicated the applicabili ty for field isolates as well.
EMA-qPCR and culture-based enumeration of Campylobacter spiked chicken
leg quarters resulted in comparable bacterial cell counts. The correlation
coefficient between the two analytical methods was 0.95. Nevertheless, larger
amounts of nonviable cells (>10 4) resulted in an incomplete qPCR signal
reduction, representing a serious methodological li mitation, but double
staining with EMA considerably improved the signal inhibition. Hence, the
proposed Campylobacter viability EMA-qPCR provides a promising rapid
method for diagnostic applications, but further res earch is needed to
circumvent the limitation.
Publikationen 61
5.2. Influencing Factors and Applicability of the V iability EMA-qPCR for a
Detection and Quantification of Campylobacter Cells from Water
Samples
Published in PLoS One, 2014, accepted,
PLoS One. 9 (11):e113812. doi: 10.1371/journal.pone .0113812.
DIANA SEINIGE1, MAREN VON KÖCKRITZ-BLICKWEDE2, CARSTEN KRISCHEK1,
GÜNTER KLEIN1, and CORINNA KEHRENBERG1 *
1Institute of Food Quality and Food Safety, 2Institute for Physiological Chemistry,
University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation, Hannover, Germany
Short title: Detection of viable Campylobacter in water samples
Keywords: Campylobacter, quantification, water samples, viability, fluorescence
microscopy, qPCR, EMA-qPCR
Link: http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0113812
* Corresponding author: Mailing address: Institute of Food Quality and Food Safety,
University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation, Bischofsholer Damm 15, D-
30173 Hannover, Germany; Phone: +49-511-856-7554. Fax: +49-511-856-7694.
Electronic mail address: [email protected]
• Planung der Experimente: D. Seinige, G. Klein, C. Kehrenberg • Durchführung der Experimente: D. Seinige • Auswertung der Ergebnisse: D. Seinige, M. von Köckritz-Blickwede,
C. Krischek, C. Kehrenberg • Verfassen oder kritische Durchsicht
des Manuskriptes: D. Seinige, M. von Köckritz-Blickwede, C. Krischek, G. Klein, C. Kehrenberg
62 Publikationen
ABSTRACT
In recent years, increasing numbers of human campyl obacteriosis cases
caused by contaminated water have been reported. As the culture-based
detection of Campylobacter is time consuming and can yield false-negative
results, the suitability of a quantitative real-tim e PCR method in combination
with an ethidium monoazide pretreatment of samples (EMA-qPCR) for the
rapid, quantitative detection of viable Campylobacter cells from water samples
was investigated. EMA-qPCR has been shown to be a p romising rapid method
for the detection of viable Campylobacter spp. from food samples. Application
of membrane filtration and centrifugation, two meth ods frequently used for the
isolation of bacteria from water, revealed a mean l oss of up to 1.08 log 10
cells/ml from spiked samples. Both methods used alo ne lead to a loss of dead
bacteria and accumulation of viable bacteria in the sample as shown by
fluorescence microscopy. After filtration of sample s, no significant differences
could be detected in subsequent qPCR experiments wi th and without EMA
pretreatment compared to culture-based enumeration. High correlations
(R2=0.942 without EMA, R 2=0.893 with EMA) were obtained. After centrifugatio n
of samples, qPCR results overestimated Campylobacter counts, whereas
results from both EMA-qPCR and the reference method were comparable. As
up to 81.59% of nonviable cells were detected in po nd water, EMA-qPCR failed
to detect correct quantities of viable cells. Howev er, analyses of spiked tap
water samples revealed a high correlation (R 2=0.863) between results from
EMA-qPCR and the reference method. After membrane f iltration, EMA-qPCR
was successfully applied to Campylobacter field isolates, and results indicated
an advantage over qPCR by analysing defined mixture s of viable and nonviable
cells. In conclusion, EMA-qPCR is a suitable method to detect viable
Campylobacter from water samples, but the isolation technique an d the
type/quality of the water sample impact the results .
Diskussion 63
6. Diskussion
Der quantitative Nachweis von Campylobacter spp. ist von Bedeutung, um
insbesondere bei Geflügelfleischprodukten aber auch bei Wasserproben die
lebensmittelhygienische Qualität beurteilen zu können (KEER und BIRCH 2003,
PITKÄNEN 2013, KRÜGER et al. 2014). Mit der Entwicklung einer Schnellmethode
zur Quantifizierung der Bakterien, welche nur lebende Campylobacter-Zellen
detektiert, wäre es möglich, Keimzahlen auf oder in kontaminierten Lebensmitteln zu
ermitteln und durch entsprechende Massnahmen das Infektionsrisiko für den
Konsumenten zu minimieren. Somit könnte mittels dieser Methode ein wichtiger
Schritt zur Senkung der Anzahl humaner Campylobacteriose-Fälle erreicht werden.
Das amtliche, kulturelle „Horizontale Verfahren zum Nachweis und zur Zählung von
Campylobacter spp.“ nach § 64 des LFGB, sowie die DIN EN ISO 10272-1:2006,
nutzen das kulturelle Anzuchtverfahren der Bakterien auf Agarplatten, um die Anzahl
Kolonie-bildender Einheiten (KbE) zu bestimmen (§ 64 LFGB, DIN EN ISO 10272-
1:2006).
Die quantitative Keimzahlbestimmung mittels dieses mikrobiologischen
Keimzählverfahrens ist jedoch abhängig von vielen Faktoren, wie dem gewählten
Anzuchtmedium, der Probenmatrix sowie dem metabolischen Status und der
Zellintegrität der Bakterien (RUDI et al. 2005). Zudem ist der kulturelle
Erregernachweis bei langsam wachsenden Bakterienspezies und physiologisch
anspruchsvollen Keimen wie Campylobacter stark erschwert (SOLOMON und
HOOVER 1999, BOTTELDOORN et al. 2008, STINGL et al. 2012). Aufgrund dieser
Nachteile sowie der langen Zeitdauer bis zur Erlangung von
Untersuchungsresultaten, welche nach der amtlichen Nachweismethode nach § 64
LFGB bis zu 6 - 7 Tage beträgt, ist kein zeitnaher Eingriff in die
Lebensmittelsicherheit mehr möglich. Auch Steuerungsfunktionen, welche die
Ausbreitung von Erregern verhindern sollen, können somit nicht zeitnah umgesetzt
werden. Demzufolge ist die Entwicklung von kulturunabhängigen, quantitativen
Schnellmethoden zum Nachweis von Campylobacter spp. für eine Einschätzung des
64 Diskussion
Gesundheitsrisikos von Lebensmitteln von entscheidender Bedeutung (KRÜGER et
al. 2014).
Mit der Entwicklung von PCR und real-time PCR Verfahren für den Nachweis von
Campylobacter spp. stehen Schnellmethoden zur Verfügung, die eine zeitnahe
Untersuchung von Proben ermöglichen (RUDI et al. 2005). Unter Verwendung von
EMA oder PMA in Kombination mit quantitativen real-time PCR (qPCR) Verfahren
könnten zudem lebende und somit potentiell infektiöse Bakterienstadien von toten
Zellen differenziert werden (CAWTHORN und WITTHUHN 2008, CHANG et al. 2010,
HELLEIN et al. 2012).
6.1. I. Abschnitt - Methodenentwicklung
Im ersten Abschnitt dieser Arbeit wurde eine geeignete Methode entwickelt, die einen
Nachweis lebender Campylobacter-Zellen mittels der qPCR Methode ermöglicht.
Dabei wurden Faktoren, die zu einer Beeinflussung der Ergebnisse der qPCR führen
können, wie unterschiedliche interkalierende Substanzen (Differenzierungsmittel)
und verschiedene Arbeitskonzentrationen der Differenzierungsmittel, vergleichend
untersucht. Die Ergebnisse werden in den folgenden Abschnitten diskutiert.
6.1.1. Einfluss von EMA und PMA auf die Resultate d er real-time PCR bei
Verwendung von lebenden Zellen
Da anzunehmen war, dass die eingesetzten Differenzierungsmittel zu einer
Beeinflussung von qPCR Ergebnissen führen, wurden EMA und PMA in
unterschiedlichen Konzentrationen eingesetzt und die Ct-Werte (als Ergebnisse der
qPCR-Analysen) mit den Resultaten der unbehandelten Zellen verglichen. Dabei
zeigten beide Differenzierungsmittel eine Erhöhung der Ct-Werte in der qPCR im
Vergleich zu den unbehandelten Zellen. Vermutlich resultierte die Ct-Verschiebung
aus dem partiellen Eindringen der Differenzierungsmittel in lebende Zellen, deren
DNA dann in einer folgenden qPCR nicht mehr amplifiziert werden konnte welches
Diskussion 65
somit zu höheren Ct-Werten im Vergleich zur unbehandelten Kontrollprobe führte.
Zum anderen war aus den Ergebnissen zu erkennen, dass die Ct-Wert Verschiebung
abhängig von dem verwendeten Differenzierungsmittel ist, denn sie zeigte sich bei
EMA deutlicher als bei einem Einsatz von PMA. Die unterschiedliche Ausprägung
der Ct-Werte-Verschiebung der getesteten Differenzierungsmittel EMA und PMA ist
vermutlich bedingt durch die unterschiedliche Ladung der beiden Substanzen. Da die
hydrophobe Phospholipidschicht der bakteriellen Zellmembran nur für ungeladene
Moleküle oder Substanzen mit einer dezentralisierten Ladung passierbar ist (CAO-
HOANG et al. 2008), resultiert die unterschiedliche Ausprägung der Penetration bei
lebenden Zellen mit intakter Zellmembran darauf, dass PMA im Gegensatz zu EMA
eine weitere positive Ladung besitzt. Dadurch wird die Penetration durch die
bakterielle Zellmembran lebender Zellen bei PMA selektiver verhindert, so dass die
Erhöhung der Ct-Werte in der qPCR bei einem Einsatz von PMA geringer ausgeprägt
ist (NOCKER et al. 2006, CAWTHORN und WITTHUHN 2008). Der Effekt einer
Erhöhung der Ct-Werte beim Einsatz der Substanz EMA wurde auch zuvor in Studien
anderer Autoren an Bakterienspezies wie Salmonella enterica, Enterobacter
sakazakii, Staphylococcus aureus und Escherichia coli beschrieben (NOCKER et al.
2006, NOCKER und CAMPER 2006, CAWTHORN und WITTHUHN 2008,
KOBAYASHI et al. 2009). Auch für Campylobacter spp. konnte eine Beeinflussung
der Ct-Werte bei Verwendung von EMA von anderen Autoren beobachtet werden
(FLEKNA et al. 2007, KRÜGER et al. 2014).
Bei der Verwendung von PMA wurde in der vorliegenden Studie ebenfalls eine Ct-
Wert Verschiebung bei lebenden Zellen beobachtet. Dieses lässt vermuten, dass
auch das Differenzierungsmittel PMA die Bakterienmembran lebender Zellen partiell
durchdringen kann. In der Literatur wird der Einfluss von PMA auf lebende Zellen
kontrovers gesehen. So konnte in weiteren Studien zur Detektion und Quantifizierung
der Bakterienspezies Mycobakterium avium subsp. paratuberculosis, Salmonella
enterica und Legionella pneumophila bei Verwendung von PMA ebenfalls eine
Erhöhung der Ct-Werte lebender Zellen in der qPCR beobachtet werden (KRALIK et
al. 2010, LIANG et al. 2011, LOOZEN et al. 2011, YÁÑEZ et al. 2011). Andere
Autoren erzielten jedoch gegensätzliche Ergebnisse und konnten bei Verwendung
66 Diskussion
von PMA keine Signalreduktion lebender Zellen bei der Detektion von Enterobacter
sakazakii, Staphylococcus aureus, Listeria monozytogenes, Escherichia coli, C.
jejuni und C. coli beobachten (CAWTHORN und WITTHUHN 2008, NOCKER et al.
2006, KRÜGER et al. 2014). In diesen Studien wurde jedoch eine geringere
Konzentration an PMA als in der vorliegenden Arbeit verwendet oder es wurde nur
eine Beurteilung über die Intensität von Agarosegelbanden durchgeführt. So
applizierten KRÜGER et al. (2014) eine geringere PMA Konzentration von 20 µmol/l.
Die niedrigste getestete PMA-Konzentration in der vorliegenden Studie betrug jedoch
50 µmol/l (25,55 µg/ml) und dabei konnte eine Konzentrationsabhängigkeit der Ct-
Wert Verschiebung dargestellt werden. Bei dem Einsatz von geringeren
Konzentrationen des Differenzierungsmittels wurden auch geringere Verschiebungen
der Ct-Werte beobachtet. Diese Resultate lassen vermuten, dass bei steigender
Konzentration der Differenzierungssubstanz eine höhere Penetration der Substanz
durch intakte Zellmembranen erfolgt. Die Konzentration von 50 µmol/l PMA stellte
sich jedoch in den weiteren Versuchen als nicht ausreichend dar, um eine
Differenzierung zwischen lebenden und toten Campylobacter-Zellen zu ermöglichen.
In der Literatur gibt es für die Verschiebung der Ct-Werte in der qPCR bei
Verwendung von Differenzierungsmitteln neben der oben erwähnten Erklärung noch
weitere Erklärungsmodelle, die im nächsten Kapitel detailliert beschrieben werden.
6.1.2. Erklärungsmodelle für C t-Wert-Verschiebungen in qPCR-
Experimenten nach Einsatz von Differenzierungsmitte ln
Neben dem partiellen Eindringen der Substanzen in lebende Zellen basiert ein
weiteres Erklärungsmodell für die Ct-Wert-Verschiebungen auf dem Vorhandensein
von membrangeschädigten Zellfraktionen, die zum Teil auch in 24 Stunden
angezüchteten Bakterienkulturen zu finden sind (YÁÑEZ et al. 2011). Dabei ist
bekannt, dass Bakterienkulturen sowohl in flüssigen als auch in festen Nährmedien
einen Anteil an membrangeschädigten Zellen beinhalten können. Frisch
angezüchtete Bakterienkulturen werden aber häufig mit dem Anteil an lebenden
(oder membranintakten) Zellen gleichgesetzt. Da das Prinzip der
Diskussion 67
Differenzierungsmittel auf der Membranpermeabilität der Zellen beruht, können aber
membrangeschädigte oder tote Zellen, welche sich in diesen frischen Kulturen
befinden, durch die aufgenommenen Differenzierungsmittel zu einer Ct-Wert
Verschiebung in der qPCR führen. Zudem ist eine Änderung der
Membranpermeabilität im Verlauf der Wachstumsphase der Bakterien möglich
(FITTIPALDI et al. 2012). GEDALANGA und OLSON (2009) beobachteten in ihrer
Studie an Escherichia coli in unterschiedlichen Wachstumsphasen, dass EMA
überwiegend bei sich schnell teilenden sowie älteren Bakterien in die Zellen
eindringen konnte und folgerten daraus, dass die Membranpermeabilität der
Bakterien im Verlaufe des Wachstums Veränderungen unterworfen ist. Bei Bakterien
in unterschiedlichen Wachstumsphasen könne somit auch eine unterschiedliche
Effektivität bei der Aufnahme von EMA in die Zelle erfolgen und somit zu einer
Verschiebung der Ct-Werte in der qPCR führen (GEDALANGA und OLSON 2009).
Eine weitere Erklärung kann der toxische Effekt der Substanzen auf lebende Zellen
sein. Zur Testung des Effektes der Substanz EMA auf die Zellen führten RUECKERT
et al. (2005) einen Zytotoxizitätstest ein. Dabei wurden flüssige Bakterienkulturen von
Anoxybacillus flavithermus mit dem Differenzierungsmittel EMA versetzt und
anschließend das Koloniewachstum auf einer Agarplatte beurteilt. Die Autoren
folgerten daraus, dass die Reduktion des Koloniewachstums um so höher ist, je
höher der zytotoxische Effekt der Substanz auf die Zellen ausgeprägt ist. Aus diesen
Ergebnissen zogen sie die Schlussfolgerung, dass der zytotoxische Effekt auf
lebende Zellen mit der Fähigkeit zur Penetration intakter Zellmembranen verglichen
werden kann. Somit ist bei einer hohen Zytotoxizität der Substanz auch ein
vermehrtes Eindringen in lebende und membranintakte Zellen möglich (RUECKERT
et al. 2005). In mehreren Studien an unterschiedlichen Bakterienspezies stellte sich
die Zytotoxizität von EMA konzentrationsabhängig dar und nahm bei steigenden
Konzentrationen an EMA zu, bis hin zu einer vollständigen Unterdrückung des
Koloniewachstums (RUECKERT et al. 2005, FLEKNA et al. 2007, SOEJIMA et al.
2007). Eine konzentrationsabhängige Zytotoxizität konnte auch bei PMA beobachtet
werden, welche dazu führte, dass höhere Konzentrationen der Substanz zu einer
gesteigerten Wachstumsreduktion führten (YÁÑEZ et al. 2011, GENSBERGER et al.
68 Diskussion
2013). Diese Wachstumsreduktion war aber nicht so deutlich ausgeprägt als bei
Verwendung von EMA.
Die Verschiebung der Ct-Werte in der qPCR kann somit durch mehrere Faktoren
bedingt sein: 1) die Differenzierungsmittel können teilweise auch in lebende Zellen
eindringen, 2) es befanden sich membrangeschädigte Zellfraktionen in der Probe, 3)
Zellen in unterschiedlichen Wachstumsphasen zeigten eine differenzierte Aufnahme
der Substanzen und 4) die Differenzierungsmittel übten einen zytotoxischen Effekt
auf lebende Zellen aus. Welcher dieser Faktoren den größten Einfluss bei dem
Bakteriengenus Campylobacter hat, ist bislang nicht geklärt. Durch die Ergebnisse
dieser Arbeit ließ sich aber zeigen, dass eine konzentrationsabhängige Ct-Wert
Verschiebung bei Verwendung beider Differenzierungsmittel vorliegt, welche bei den
Resultaten der qPCR berücksichtigt werden muss.
6.1.3. Standardkurven zur Bestimmung der Keimkonzen tration von
Campylobacter spp.
Die für eine qPCR erforderlichen Standardkurven wurden unter Zugabe von EMA
oder PMA zu Proben mit bekannter Keimkonzentration ermittelt. Dieses erschien
erforderlich, um die durch interkalierende Substanzen bedingte Ct-Wert
Verschiebung ausgleichen zu können. Bei der Erstellung von Standardkurven ist eine
Anpassung auf die Versuchsbedingungen prinzipiell notwendig (TAKAHASHI et al.
2005, KÖPPEL et al. 2012). Dieses Anpassung wurde in anderen Studien zur
Quantifizierung lebender Campylobacter-Zellen jedoch nicht durchgeführt, welches
einen Unterschied der hier entwickelten Methode darstellt (RUDI et al. 2005,
JOSEFSEN et al. 2010, BAE und WUERTZ 2012, HELLEIN 2012). Dabei ist zu
bedenken, dass die Standardkurve unter Verwendung von 24 Stunden auf
Agarplatten kultivierten Campylobacter-Zellen erstellt wurde. Eine Verwendung von
gestressten oder in anderen Medien kultivierten Zellen könnte demzufolge zu
divergierenden Ergebnissen führen. Jedoch ist eine Testung der Methode unter
Verwendung der Vielzahl an möglichen Stressfaktoren auf die Zellen sowie von
Diskussion 69
unterschiedlichen Anzuchtmedien oder Isolierungsmatrices aufgrund der zeit- und
arbeitsintensiven Versuchsdurchführung und der finanziellen Grenzen nicht möglich.
Unter Verwendung der angepassten Standardkurve konnten mittels EMA-qPCR in
mehreren Versuchsreihen vergleichbare Resultate zu der mikrobiologischen
Referenzmethode erzielt werden. Dieses zeigte sich in einer hohen Korrelation
(R2=0,947) zwischen den beiden Methoden und ließ sich durch eine
Methodenvergleichsuntersuchung mittels Bland-Altman Testung bestätigen.
6.1.4. Effektivität von EMA und PMA zur Differenzie rung von lebenden und
toten Zellen
Die Effektivität der Differenzierungsmittel zur Unterscheidung lebender und toter
Zellen bestimmt die Effizienz, falsch-positive Signale in den Ergebnissen der qPCR
auszuschließen (FITTIPALDI et al. 2012). Daher wurde die Eignung einer
Vorbehandlung mit beiden Differenzierungsmitteln untersucht, um lebende
Campylobacter-Zellen aus Gemischen an lebenden und toten Zellen (bis zu 1:1000)
zu detektieren. Dabei zeigte sich, dass sowohl eine Vorbehandlung von
Campylobacter-Zellen mit EMA (10 µg/ml) als auch mit PMA (51,10 µg/ml) geeignet
ist, um lebende Zellen mittels qPCR in den Gemischen zu detektieren. Dies ließ sich
in einer hohen Korrelation zur mikrobiologischen Referenzmethode auch bei der
Auswertung dieser Versuchsreihen darstellen. Demgegenüber vermochte PMA in der
Konzentration von 25,55 µg/ml keine ausreichende Differenzierung zu erbringen.
Eine schlechtere Differenzierung zwischen lebenden und toten Zellen bei
Verwendung von PMA wurde auch von anderen Autoren beschrieben. So
beschrieben LØVDAL et al. (2011), dass die PMA-qPCR unter Verwendung einer
Konzentration von 50 µmol/l PMA ungeeignet zur Diskriminierung lebender und toter
Zellen von Listeria innocua ist. Auch BAE und WUERTZ (2009) erzielten in ihrer
Studie an Bacteroides fragilis keine ausreichende Differenzierung lebender und toter
Zellen in gemischten Proben bei Verwendung von PMA 100 µmol/l. Die
Überlebensrate der Bakterien in Proben mit gemischter bakterieller Flora, wie bei
Fischfilets, wurde von LEE und LEVIN (2009a) bestimmt. Dabei wurden bei
70 Diskussion
hitzebehandelten Proben nach Zugabe von PMA mittels qPCR höhere Keimzahlen
detektiert als bei Verwendung von EMA oder bei der vergleichenden
Keimkonzentrationsbestimmung mittels mikrobiologischer Zellzählung. Die Autoren
folgerten daraus, dass EMA effektiver bei der Membranpenetration
temperaturgeschädigter Zellen ist als PMA. Auch CHEN und CHANG (2010) kamen
bei ihren Untersuchungen an Legionella pneumophila zu der gleichen
Schlussfolgerung. Bei inaktivierten Legionella pneumophila benötigten CHANG et al.
(2010) für eine Differenzierung lebender und toter Zellen bis zu 4-fach höhere
Konzentrationen an PMA als an EMA. Auch in der vorliegenden Arbeit wurde eine
über 5-fach höhere Konzentration an PMA im Vergleich zu EMA benötigt, um eine
effektive Reduktion der toten Zellen bei gemischten Proben an lebenden und toten
Zellen in den getesteten Keimkonzentrationen zu erzielen.
Die gleichen Faktoren, die eine Aufnahme von PMA bei lebenden, membranintakten
Zellen verhindern, scheinen auch die Aufnahme der Substanz in
membrangeschädigte Zellen zu reduzieren. Somit kehrt sich der vermeintliche
Nachteil des verwendeten Differenzierungsmittels EMA, lebende Zellen in stärkerem
Maße zu durchdringen, bei Verwendung von Bakteriensuspensionen mit Gemischen
an lebenden und toten Zellen in einen Vorteil um (FITTIPALDI et al. 2012).
6.1.5. Limitierungen bei Verwendung von Differenzie rungsmitteln zur
Detektion lebender Campylobacter spp. mittels qPCR
Die optimale qPCR Methode zur Bestimmung der Keimkonzentration in bakteriellen
Gemischen aus lebenden und toten Zellen würde idealerweise das Signal aller toten
Zellen vollständig unterbinden und dabei gleichzeitig die Amplifikation lebender
Zellen nicht beeinträchtigen (FITTIPALDI et al. 2012). Bei Verwendung höherer
Keimzahlen hitzeinaktivierter Zellen (>105 KbE/ml) ließen sich in dieser Studie die
qPCR Signale durch keines der Differenzierungsmittel vollständig unterdrücken.
Auch von anderen Autoren wurde beobachtet, dass sehr hohe Anzahlen toter Zellen
zu einer ungenügenden Unterdrückung von PCR-Signalen führen. So beschrieben
Diskussion 71
PACHOLEWICZ et al. (2013) in ihrer Studie an Broilerkarkassen eine unvollständige
Reduktion des Signals toter Campylobacter-Zellen in einer PMA-qPCR bei
Verwendung von über 104 KbE/ml in der Probe. Diese Ergebnisse wurden auch von
anderen Autoren bestätigt, die über eine unvollständige Reduktion des qPCR
Signals toter Bakterien bei Keimgehalten über 104 - 105 KbE/ml bei Bakterienspezies
wie Listeria pneumophila, Listeria monocytogenes und Listeria innocua berichteten
(PAN und BREIDT 2007, LØVDAL et al. 2011). Wichtig ist zu bemerken, dass in
Studien, bei denen tote Zellen keine falsch positiven Signale erbrachten, die
Differenz zwischen lebenden und toten Zellen häufig Konzentrationen von 103
KbE/ml nicht überschritten (WANG und LEVIN 2006, CHEN und CHANG 2010).
Somit wurde das Detektionslimit der Keimkonzentrationen toter Zellen nicht erreicht.
In anderen Studien wurde die Untersuchung sehr hoher Konzentrationen an toten
Zellen gar nicht durchgeführt, so dass diese methodische Limitierung nicht erkennbar
war.
Der Grund für die Relevanz der Keimkonzentration an toten Zellen bei der qPCR für
die Differenzierungsfähigkeit lebender Keime mittels DNA interkalierenden
Substanzen ist bislang noch nicht ausreichend geklärt. Möglich wäre jedoch, dass
eine hohe Keimkonzentration an toten Zellen durch eine vermehrte Aufnahme der
Substanzen die zur Verfügung stehende absolute Konzentration an
Differenzierungsmittel pro Zelle in der Probe reduziert. Somit könnte die Amplifikation
der membrangeschädigten Zellen in der qPCR nicht ausreichend unterdrückt werden
(FITTIPALDI et al. 2012). Diese Hypothese vermuteten auch VARMA et al. (2009) in
ihrer Studie an Abwasserproben, die eine hohe bakterielle Begleitflora beinhaltete. In
dieser Studie war die Effektivität von PMA mit steigenden Keimkonzentrationen an
toten Zellen in der Probe negativ korreliert.
72 Diskussion
6.1.6. Ansätze zur Verbesserung der qPCR-Resultate unter Verwendung
von Differenzierungsmitteln
Da in der vorliegenden Studie beide Differenzierungsmittel, EMA und PMA, tote
Zellen in Keimkonzentrationen von über 105 KbE/ml in der qPCR nicht vollständig
unterdrücken konnten, war es ein nächstes Ziel der Arbeit, erste Ansätze zu finden,
um die Signalreduktion toter Zellen zu verbessern. Dazu wurde eine
Doppelbehandlung der hitzeinaktivierten Zellen mit EMA in der Konzentration von 10
µg/ml durchgeführt. Diese Doppelbehandlung führte zu einer deutlichen Steigerung
der Signalreduktion von toten Zellen (bis zu 106 KbE/ml), welche auch die
Signalreduktion bei Verwendung von PMA übertraf. Eine ähnliche Methodik haben
MINAMI et al. (2010) in ihrer Studie an Enterobacter sakazakii getestet. Auch hier
konnten gute Ergebnisse mit einer EMA-Doppelbehandlung zur Signalreduktion von
hohen Konzentrationen an toten Zellen (bis zu 107 Zellen/ml) erzielt werden. Dabei
ist zu bedenken, dass die Doppelbehandlung mit EMA lediglich einen Ausblick für
eine zukünftige Weiterentwicklung darstellen sollte, um die Limitierung der Methode
zu umgehen. Dabei müssten jedoch noch andere Effekte, wie die Verschiebung der
Ct-Werte in der qPCR oder die Korrelation der Ergebnisse aus der qPCR nach einer
EMA-Doppelbehandlung zu der mikrobiologischen Referenzmethode, geprüft
werden.
Auch in der Literatur wurden Entwicklungen dargestellt, um die Signalreduktion toter
Zellen zu verbessern und gleichzeitig die Aufnahme der Differenzierungsmittel in
lebende Zellen zu reduzieren. Dieses wird in den folgenden Kapiteln diskutiert.
6.1.6.1. Verbesserung der qPCR-Resultate bei Versuc hsansätzen, bei denen
eine Vorbehandlung mit EMA durchgeführt wurde
Bei Verwendung von EMA ist ein möglicher Ansatz, die Konzentration der Substanz
zu senken, so dass weniger EMA-Moleküle in die Zellen eindringen können (CHEN
und CHANG 2010, MINAMI et al. 2010, SHI et al. 2011). Dafür wurde von
Diskussion 73
verschiedenen Autoren die vormals üblicherweise recht hohe verwendete
Konzentration von um 100 µg/ml (INGLIS et al. 2010, FLEKNA et al. 2007, NOCKER
und CAMPER 2006, RUDI et al. 2005) in neueren Studien deutlich gesenkt und
häufig 10 µg/ml verwendet (MINAMI et al. 2010, SHI et al. 2011, SOEJIMA et al.
2011a, WANG et al. 2009). Dieser Ansatz wurde in der vorliegenden Arbeit
aufgegriffen und die deutlich niedrigere Konzentration von 10 µg/ml EMA erfolgreich
eingesetzt. Dieses war möglich, da EMA auch in geringen Konzentrationen die
Effizienz besitzt, membrangeschädigte Zellen zu durchdringen (FITTIPALDI et al.
2012). Sogar noch deutlich geringere Konzentrationen von EMA zwischen 2,5 µg/ml
und 1 µg/ml wurden in einigen anderen Studien an Bakterienspezies wie Vibrio
vulnificus, Legionella, Bifidobacterium als ausreichend erachtet, um das Signal toter
Zellen zu unterdrücken (WANG und LEVIN 2006, CHEN und CHANG 2010, MENG
et al. 2010, LEE und LEVIN 2009a). Da in diesen Studien jedoch häufig sehr
unterschiedliche Versuchsbedingungen verwendet wurden, wie die
Abtötungsmethode, die Inkubationszeit, die Belichtungsquelle und die Dichte der
Bakteriensuspension, sind diese Ergebnisse nicht immer vollständig miteinander
vergleichbar (FITTIPALDI et al. 2012).
Ein anderer Ansatz, welcher beschrieben wurde um die Aufnahme von EMA in
lebende Zellen zu minimieren, ist eine Inkubation der mit EMA behandelten Proben
auf Eis oder bei Temperaturen um 4°C vorzunehmen (LØVDAL et al. 2011).
Während in vielen Studien die Inkubation bei Raumtemperatur durchgeführt wurde
(RUDI et al. 2005, JOSEFSEN et al. 2010) konnte in Studien an Listeria
pneumophila, Listeria monocytogenes, Enterobacteriaceae und Enterobacter
sakazakii bei einer Inkubationstemperatur von 4°C unter Verwendung von 10 - 20
µg/ml EMA keine oder nur eine marginale Signalreduktion lebender Zellen
beschrieben werden (CHANG et al. 2009, SOEJIMA et al. 2008, MINAMI et al.
2010). In der vorliegenden Studie wurde die Belichtung der Proben zur
photoaktivierten Bindung von EMA an die DNA auf Eis durchgeführt, um eine
übermäßige Erwärmung der Proben durch die eingesetzte Halogenlampe zu
verhindern. Da bekannt ist, dass bei geringeren Temperaturen die
74 Diskussion
Membranpermeabilität der Zellen abnimmt, sollte somit eine verminderte Aufnahme
der Substanz in lebende Zellen erzielt werden (VAN DE VOSSENBERG et al. 1995).
6.1.6.2. Verbesserung der qPCR-Resultate bei Versuc hsansätzen, bei denen
eine Vorbehandlung mit PMA durchgeführt wurde
Zur Verbesserung der Resultate bei einem Einsatz von PMA für die Differenzierung
lebender Campylobacter-Zellen von membrangeschädigten Zellen wurden von
BANIHASHEMI et al. (2012) die Verwendung von längeren Amplifikaten in der qPCR
als hilfreich beschrieben. In dieser Studie wurden verschiedene Amplikonlängen von
147 bp, 899 bp und 1512 bp bei Amplifikation eines internen Fragmentes des cpn60-
Gens für einen PMA PCR-Nachweis von C. jejuni vergleichend untersucht. Die
Amplifikationssignale von hitzeinaktivierten Zellen (1 x 107 KbE/ml) konnten bei PCR-
Assays mit dem Ziel der Amplifikation des 1512 bp Fragmentes vollständig inhibiert
werden, wohingegen dies bei den kürzeren Fragmenten nicht vollständig gelang.
Als zugrunde liegendes Prinzip wurde dabei vermutet, dass sich DNA interkalierende
Substanzen in einer bestimmen stöchiometrischen Häufigkeit an die DNA binden und
damit die Amplifikation in der qPCR inhibieren (BARNI et al. 1981, MARX et al.
1997). Eine strukturelle DNA-Veränderung durch diese Bindung würde dabei
theoretisch ausreichen, um die DNA Polymerase bei der Amplifikation zu behindern.
Dies führt bei Verwendung längerer Targetsequenzen zu einer höheren
Wahrscheinlichkeit, dass die darin gebundenen interkalierenden Substanzen die
Amplifikation der Polymerase behindern und somit das Amplifikationssignal
membrangeschädigter Zellen stärker inhibieren (SOEJIMA et al. 2008, CONTRERAS
et al. 2011, SOEJIMA et al. 2011b).
Eine Verlängerung des PCR-Amplikons könnte auch bei der in der vorliegenden
Arbeit verwendeten EMA-qPCR eine interessante Alternative zur Umgehung der
Limitierung darstellen. Da jedoch ein validiertes Detektionssystem für Campylobacter
spp. ein wichtiges Auswahlkriterium darstellte, wurde mit einem validierten
Diskussion 75
Nachweiskit gearbeitet, welches ein kürzeres DNA-Fragment von 287 bp als PCR-
Amplifikat nachweist.
6.1.7. Zusammenhang zwischen dem Inaktivierungsverf ahren der Bakterien
und den Ergebnissen der qPCR
Die in der vorliegenden Arbeit verwendete Differenzierung lebender und toter Zellen
mittels DNA-interkalierender Substanzen beruht auf dem Kriterium der
Membranintegrität der Bakterien („dye exclusion method“) (CAO-HOANG et al.
2008). Ein Bakterium kann mit dieser Methode somit nur als tot erkannt werden,
wenn eine Membranschädigung der Zelle vorliegt (RUDI et al. 2005, NOCKER et al.
2007, CENCIARINI-BORDE et al. 2009). In der vorliegenden Studie wurde für die
Inaktivierung von C. jejuni und C. coli eine Hitzebehandlung bei einer Temperatur
von 70 °C verwendet. Mittels dieses Verfahrens war es problemlos möglich, lebend-
tot Gemische aus hitzeinaktivierten Zellen bis zu einem Verhältnis von 1:1000
lebenden zu toten Zellen unter Verwendung der EMA-qPCR zu differenzieren.
Darüber hinaus wurde die Kultivierbarkeit der Bakterien als vergleichende
Referenzmethode zur Erfassung lebender Zellstadien verwendet. Werden andere
Kriterien einer lebend-tot Unterscheidung (siehe Kapitel 2.2.) zu Grunde gelegt, wie
die eintretende RNA Degradation, die Abnahme metabolischer Aktivität und der
Verlust des Energiestatus, kann es zu divergierenden Ergebnissen kommen. Auch
andere Inaktivierungsverfahren können zu abweichenden Ergebnissen führen
(NOCKER et al. 2006, NOCKER und CAMPER 2006, NOCKER et al. 2007,
CENCIARINI-BORDE et al. 2009). Limitierungen können immer dann auftreten,
wenn die Abtötungsmethode zu keiner Membranschädigung führt. Ein typisches
Beispiel hierfür ist die Inaktivierung von Bakterien mittels UV-Licht. Dieses Verfahren
führt zu einer Degradierung der bakteriellen DNA, ohne die Permeabilität der
Zellmembran direkt zu beeinflussen (SINHA und HADER 2002, CENCIARINI-
BORDE et al. 2009). Bei diesem Abtötungsverfahren hat sich somit in Studien von
NOCKER et al. (2007) sowie BANIHASHEMI et al. (2012) die Anwendung der PMA-
qPCR Methode bei verschiedenen Bakterienspezies wie C. jejuni, Salmonella
76 Diskussion
enterica und E. coli O157:H7 als nicht geeignet erwiesen, um die Amplifikation toter
Zellen zu unterdrücken. Die EMA-qPCR wurde für die Anwendung bei UV-
inaktivierten Zellen bislang noch nicht getestet, es kann jedoch aufgrund des
gleichen Reaktionsmechanismus vermutet werden, dass hierbei ähnliche Ergebnisse
erzielt werden (CENCIARINI-BORDE et al. 2009).
Zwar wurde in der vorliegenden Studie die Hitzeinaktivierung zur Abtötung der
Campylobacter-Zellen gewählt, aber die Ergebnisse früherer Studien lassen die
Schlussfolgerung zu, dass bei weiteren Abtötungsmethoden, welche zu einer
Schädigung der Zellmembran führen (Desinfektionsmittel, Antibiotika), ebenfalls eine
lebend-tot Differenzierung mit interkalierenden Substanzen durchgeführt werden
kann. Das ermöglicht zum Beispiel die Kontrolle von Desinfektionsmaßnahmen
mittels EMA-qPCR.
Bei Verwendung von Desinfektionsmitteln, welche zu einer Schädigung der
bakteriellen Zellmembran führen, wie Alkohol, Hypochlorid, Benzalkoniumchlorid,
Glutaraldehyd oder Wasserstoffperoxid, konnte in Studien anderer Autoren -wie zu
erwarten- mit EMA und PMA eine Differenzierung lebender und toter Bakterien erzielt
werden (RUDI et al. 2005, NOCKER et al. 2007, DELGADO-VISCOGLIOSI et al.
2009, KRÜGER et al. 2014). Zu bedenken ist, dass sich die Ergebnisse bei
Verwendung dieser Desinfektionsmittel konzentrationsabhängig darstellten. Ein
Beispiel zeigte, dass steigende Konzentrationen der quaternären
Ammoniumverbindung Benzalkoniumchlorid (15-60 ppm) in einer Studie von
NOCKER et al. (2007) zu steigenden Signalreduktionen in der PCR (bis zu 17 Ct-
Werte bei 60 ppm) bei mit PMA behandelten Zellen führten. In einer Studie an
Listeria innocua wurde PMA keine ausreichende Signalreduktion bei mit Isopropanol
behandelten Zellen bescheinigt (LØVDAL et al. 2011). In dieser Studie wurde jedoch
mit einer hohen Konzentration an toten Zellen (9 x 107 KbE/ml) gearbeitet, so dass
PMA vermutlich die Amplifikation aller membrangeschädigten Zellen nicht vollständig
unterdrücken konnte. Zudem wurde ein sehr kurzes PCR Produkt von 101 bp
verwendet, welches zu keiner ausreichenden Signalreduktion führte (SOEJIMA et al.
2008, LØVDAL et al. 2011).
Diskussion 77
Bei der Inaktivierung von Bakterien mittels Hitzebehandlung berichteten LEE und
LEVIN (2009a), dass die bakterielle Zellmembran erst einen gewissen Grad der
Schädigung aufweisen muss, damit EMA und PMA in die Zelle aufgenommen
werden können. Dieser Effekt wurde bei einer nicht weiter differenzierten bakteriellen
Mischflora auf Fischfilets erst bei Temperaturen von 60 °C oder höher erreicht, bei
welcher eine signifikante Aufnahme der Differenzierungsmittel erfolgte (CENCIARINI-
BORDE et al. 2009, LEE und LEVIN 2009a). Auch NOCKER et al. (2007) konnten
zwischen 60 °C und 70 °C die stärksten Signalreduktionen bei Mycobacterium avium
subsp. avium erzielen. Temperaturen über 70 °C erbrachten dabei keine weitere
Signalreduktion. Die Verwendung von Antibiotika wie Gentamicin und Vancomycin
führten bei C. jejuni und Stapylococcus spp. zu einer signifikanten Signalreduktion in
der EMA-qPCR sowie der PMA-qPCR (RUDI et al. 2005, KOBAYASHI et al. 2010).
KOBAYASHI et al. (2010) beobachteten in ihrer vergleichenden Studie mit
Vancomycin und Gentamicin, dass die Stärke der Signalreduktion von dem
Wirkmechanismus der Antibiotika auf die Bakterien abhängig ist. Da Vancomycin
einen direkten Effekt auf die bakterielle Zellmembran ausübt (Behinderung der
Quervernetzungen der Peptidoglycan-Schicht), konnte hierbei eine deutlichere
Signalreduktion in der PMA-qPCR beobachtet werden als bei Gentamicin
(KOBAYASHI et al. 2010). Im Gegensatz dazu führt das Aminoglycosid-Antibiotikum
Gentamicin vermutlich zu einer indirekten Schädigung der bakteriellen Zellmembran
durch eine Hemmung der Zellmembranbildung und deren Integrität (Hemmung der
Proteinsynthese, durch Bindung an die 30S Untereinheit der Ribosomen). Somit
wurde bei Einsatz von Gentamicin eine geringere Signalreduktion der toten Zellen in
der PMA-qPCR ermittelt (KOBAYASHI et al. 2010). Auch für weitere Anwendungen
nach einer Abtötung von Campylobacter-Zellen mittels Desinfektionsmitteln oder
Antibiotika, welche eine Schädigung der bakteriellen Zellmembran verursachen,
scheint somit die Anwendung der EMA-qPCR Methode zur Differenzierung lebender
und toter Zellen möglich zu sein.
78 Diskussion
6.2. II. Abschnitt - Testung der etablierten EMA-qP CR an
Lebensmittelproben
Im zweiten Abschnitt der vorliegenden Arbeit wurde die EMA-qPCR Methode an den
Lebensmittelmatrices Geflügelfleisch und Wasserproben getestet. Dabei wurden
verschiedene Einflussfaktoren wie der Matrixeffekt, das Reisolierungsverfahren und
verschiedene Wasserarten untersucht. Die Ergebnisse dieser Versuche werden in
den folgenden Kapiteln diskutiert.
6.2.1. Geflügel
6.2.1.1. Möglichkeit der Anwendung der EMA-qPCR Met hode bei natürlich
kontaminiertem Geflügelfleisch
Zur Bestimmung des Keimgehaltes von Campylobacter spp. in den Proben wurde die
mikrobiologische Keimzählung als Referenzmethode verwendet und die Ergebnisse
der qPCR mit dieser Referenzmethode verglichen. Zwar ist diese mikrobiologische
Methode zum Nachweis von Campylobacter spp. nicht immer erfolgreich (STINGL et
al. 2012), sie stellt jedoch das amtlich beschriebene Nachweisverfahren nach § 64
LFGB dar. Zu bedenken ist ferner, dass mit der qPCR-Methode Genomkopien
detektiert werden, welches einen Vergleich mit der Referenzmethode (KbE/ml)
erschwert. Durch eine Abstimmung der Standardkurve auf die Kolonie-bildenden
Einheiten von Campylobacter spp. wurde versucht, diese Problematik zu
berücksichtigen.
Der Anwendungsbereich der in der vorliegenden Arbeit verwendeten qPCR Methode
wurde auf 102 - 108 KbE/ml festgelegt. Der Keimgehalt von Campylobacter spp. auf
natürlich kontaminierten Geflügelkarkassen ist in verschiedenen Studien
unterschiedlich angegeben. Er variiert je nach Hygienemanagement in der
Primärproduktion, dem Transport und auf dem Schlachthof sowie in Studien
Diskussion 79
unterschiedlicher Länder (SPROSTON et al. 2014). Während in den USA die
Wasserkühlung unter Zugabe von Chlor eine gängige Methode ist, konnten hierbei
überwiegend Keimkonzentrationen von unter 102 KbE/g Karkasse detektiert werden
(HABIB et al. 2008). Ähnliche Ergebnisse wurden in einer kanadischen Studie erzielt,
in welcher zwischen 0 und 102 KbE/ml Spülprobe der Karkassen ermittelt wurden
(SPROSTON et al. 2014). Da diese Methode der Chlordesinfektion bislang nicht in
Europa verwendet wird (STERN und PRETANIK 2006), konnten in europäischen
Studien in der Mehrzahl der Fälle Keimgehalte bis zu 104 KbE/ml Spülprobe
detektiert werden, nur wenige Schlachtkörper zeigten einen höheren Keimgehalt
(JOSEFSEN et al. 2010, PACHOLEWICZ et al. 2013). Damit liegen die Keimgehalte
bei natürlich kontaminierten Hühnerkarkassen im Anwendungsbereich der qPCR
Methode, so dass ein Nachweis von Campylobacter mittels dieser Methode bei
natürlich kontaminiertem Geflügelfleisch möglich zu sein scheint.
Um den Anteil an toten Campylobacter-Zellen bei natürlich kontaminierten
Geflügelkarkassen zu ermitteln, wurde in einer Studie von PACHOLEWICZ et al.
(2013) der Gehalt an Campylobacter spp. bei Hühnerkarkassen am Schlachthof
mittels qPCR (ohne Differenzierungsmittel) und mikrobiologischer Keimzählung
vergleichend untersucht. Die Differenz aus den ermittelten Genomkopien und den
Kolonie-bildenden Einheiten betrug weniger als 3 log10/Probe. Daraus lässt sich
schließen, dass der Anteil von toten oder membrangeschädigten Campylobacter-
Zellen auf frischen Hühnerkarkassen relativ gering war. Somit scheint die EMA-
qPCR Methode für die Anwendung bei natürlich kontaminierten Hühnerkarkassen
geeignet zu sein. Zu bedenken ist, dass bei höheren Konzentrationen an toten Zellen
(>104 KbE), wie zum Beispiel nach Desinfektionsmaßnahmen oder bei längerer
Lagerung, die Limitierung der Methode (nicht ausreichende Signalreduktion) zum
Tragen kommen kann. In diesem Fall könnte eine Doppelbehandlung mit EMA, wie
in dieser Arbeit beschrieben, oder die Verwendung längerer Targetsequenzen
(BANIHASHEMI et al. 2012) eine Verbesserung der Resultate erzielen.
80 Diskussion
6.2.1.2. Einfluss der Lebensmittelmatrix Geflügelfl eisch auf die Resultate
der qPCR
Für eine Quantifizierung von Bakterien ist es wichtig, den Einfluss der Probenmatrix
auf die Ergebnisse der qPCR zu kennen, um aussagekräftige Ergebnisse zu
erlangen (JOSEFSEN et al. 2010). Um den Einfluss der Lebensmittelmatrix
Geflügelfleisch auf die Ergebnisse der EMA-qPCR zu testen, wurden
unterschiedliche Hühnerkarkassen mit der gleichen Menge an C. jejuni und C. coli
versetzt. Diese Untersuchungen wurden unter Verwendung von geringen, mittleren
und hohen Keimkonzentrationen durchgeführt. Bei der anschließenden
Keimdetektion konnte eine hohe Korrelation zwischen den Ergebnissen der EMA-
qPCR Methode und der mikrobiologischen Keimzählung erzielt werden (R2=0,953).
Die Standardabweichungen der mittels EMA-qPCR detektierten
Keimkonzentrationen bei den unterschiedlichen Karkassen, die mit der gleichen
Keimkonzentration versetzt wurden, betrugen zwischen 0,67 - 0,81 SD log10 KbE/ml
SD. Daraus lässt sich schließen, dass die Lebensmittelmatrix Geflügelfleisch die
Ergebnisse der EMA-qPCR nicht beeinträchtigt. Ähnliche Resultate erzielten
JOSEFSEN et al. (2010) in ihrer Studie, in welcher jeweils drei Spülproben von
Hühnerkarkassen mit der gleichen Keimkonzentration versetzt wurden und dabei
keine signifikanten Abweichungen in den Ergebnissen der PMA-qPCR ermittelt
wurden.
6.2.1.3. Status der Zellintegrität von Campylobacter spp. auf Geflügelfleisch
Zur Etablierung der EMA-qPCR Methode für eine Anwendung bei Geflügelfleisch-
Proben wurde tiefgekühltes Hühnerfleisch aus dem Einzelhandel verwendet. Einige
dieser Hühnerteilstücke zeigten bereits eine natürliche Kontamination mit
Campylobacter spp. Bei diesen kontaminierten Teilstücken wurden
Keimkonzentrationen zwischen 102 und 103 KbE/ml Spülprobe ermittelt, welche trotz
Tiefkühlung der Proben mittels mikrobiologischer Keimzählung detektiert werden
konnten. Somit waren lebende und vermutlich temperatur- und O2-gestresste
Diskussion 81
Campylobacter-Zellen bereits auf den Hühnerteilstücken nachzuweisen. Diese
ermittelten Keimkonzentrationen stimmen nahezu mit den Resultaten von MAZIERO
et al. (2010) überein, die in ihrer Studie nach Tiefkühlung von Geflügelfleisch bei
-20 °C für 28 Tage eine Campylobacter-Keimkonzentration von ungefähr 101 KbE/g
Fleisch mittels direkter mikrobiologischer Keimzählung nachweisen konnten.
Aufgrund der in der vorliegenden Arbeit bereits bestehenden Kontamination der
Geflügelfleischproben mit Campylobacter spp. und der aus der Lagerung der Proben
resultierenden Einwirkungen von Stressfaktoren auf die Zellen, wie zum Beispiel die
niedrigen Temperaturen, die Sauerstoffexposition und die Austrocknung, kann ein
breites Spektrum an vorhandenen Zellschädigungen der Keime auf den
Hühnerfleischproben angenommen werden, welches zur Beeinflussung der
Ergebnisse führen kann.
Wenngleich bekannt ist, dass gestresste oder ältere Zellen die Ergebnisse der qPCR
beeinträchtigen können (KRÜGER et al. 2014), konnte bei natürlich kontaminiertem
Hühnerfleisch, welches durch die Lagerung und Tiefkühlung ältere und gestresste
Zellen inbegriffen hatte, eine hohe Korrelation zwischen den Ergebnissen der EMA-
qPCR und der mikrobiologischen Keimzählung ermittelt werden. Die
Übereinstimmung der beiden Methoden wurde mittels Bland-Altman Analyse
bestätigt. Somit konnte eine prinzipielle Eignung der EMA-qPCR für die Anwendung
bei Lebensmittelproben nachgewiesen werden. Dies war nicht nur mit dem C. jejuni
Typstamm DSM 4688 möglich, sondern auch mit unterschiedlichen Feldisolaten
sowie definierten Gemischen an lebenden und toten Zellen.
Auch HE und CHEN (2010) testeten eine EMA-qPCR an gestressten C. jejuni-Zellen.
Hierbei wurden die Zellen einer verlängerten Inkubationszeit von einer Woche mit
niedrigen Kultivierungstemperaturen bei 25 °C, einer Inkubation unter Sauerstoff
sowie einer Nährstoffmangelsituation ausgesetzt. Unter diesen Bedingungen zeigten
99 % der Zellen morphologische Veränderung von kokkoider Form sowie fehlendes
kulturelles Bakterienwachstum. Bei 96 % dieser Zellen konnte jedoch eine intakte
bakterielle Zellmembran mittels fluoreszenzmikroskopischer Auswertung sowie der
EMA real-time PCR ermittelt werden. Die Autoren schlussfolgerten daraus, dass eine
82 Diskussion
qPCR mit EMA auch für gestresste und ältere Campylobacter-Zellen geeignet ist (HE
und CHEN 2010). Eine Eignung der EMA-qPCR selbst nach Einwirkung von
Stressfaktoren auf die Zellen (durch niedrige Temperaturen oder Sauerstoffzufuhr)
wurde auch in der vorliegenden Arbeit festgestellt und bestätigte somit die
Ergebnisse von HE und CHEN (2010).
LEE und LEVIN (2009b) bescheinigten der EMA-qPCR zur Detektion von Vibrio
vulnificus, welche zuvor für bis zu 72 Stunden einer Kühl- und
Tiefkühltemperaturbehandlung (4 °C, -20 °C) ausgesetzt waren, eine gute Eignung
zur Differenzierung lebender und toter Zellen. Allerdings setzten die Autoren eine
Vorbehandlung der Zellen mit Natriumdeoxycholat ein. Diese Substanz führt zu einer
erhöhten Durchlässigkeit von Membranproteinen und bewirkt somit eine erleichterte
Aufnahme von EMA in die Zellen (LEE und LEVIN 2009b). Bei diesem
Versuchsansatz konnten die Autoren eine hohe Korrelation zwischen der EMA-qPCR
und der mikrobiologischen Keimzählung (KbE) unter Verwendung von
Natriumdeoxycholat erzielen.
Da bekannt ist, dass Campylobacter-Zellen unter Stressbedingungen in das VBNC-
Stadium übergehen können (OLIVER et al. 2005), ist ein Vorkommen dieser
Zellstadien auf dem in der vorliegenden Arbeit verwendeten Geflügelfleisch zu
vermuten. Die Integrität der bakteriellen Zellmembran der VBNC-Zellstadien ist
bislang wenig erforscht. ZHENG et al. (1999) und WILLÉN et al. (2000) beschrieben
jedoch bei Bakterienspezies wie Helicobacter pylori VBNC-Zellformen mit einer
intakten Bakterien-Doppelmembran. Bei einer intakten Bakterienmembran ist
demnach vermutlich ein Nachweis von VBNC-Campylobacter spp. mit der in dieser
Arbeit beschriebenen Methode möglich. Für andere Bakterienspezies wurde dies
bereits erfolgreich getestet. So konnten GEDALANGA und OLSON (2009) in ihrer
Studie an Escherichia coli mittels EMA-qPCR einen Nachweis dieser VBNC-
Bakterienstadien erzielen. Aus diesen Resultaten lässt sich somit vermuten, dass
Campylobacter VBNC-Zellen, bei einer intakten Zellmembran, mit der in der
vorliegenden Studie verwendeten EMA-qPCR Methode detektiert werden können.
Diskussion 83
6.2.2. Wasser
6.2.2.1. Detektion von lebenden Campylobacter-Zellen aus Wasserproben
mittels qPCR-Verfahren
Nicht nur der Konsum von kontaminiertem Geflügelfleisch, sondern auch
kontaminiertes Wasser ist eine häufig berichtete Quelle humaner
Campylobacteriose-Fälle (THOMAS et al. 1998, JACOBS-REITSMA et al. 2008), so
dass es in den letzten Jahren zu zahlreichen Berichten über gastrointestinale
Infektionen durch die Aufnahme kontaminierten Wassers gekommen ist (KUUSI et
al. 2005, VAN DYKE et al. 2010, PITKÄNEN 2013). Der Nachweis von
Campylobacter spp. aus Wasserproben ist jedoch oftmals mit Schwierigkeiten
verbunden. So erschweren eine geringe Keimkonzentration, geschädigte Zellen
sowie das physiologisch anspruchsvolle Wachstum von Campylobacter den
mikrobiologischen Nachweis und können demzufolge zu falsch negativen Resultaten
führen (PITKÄNEN 2013). Das konventionelle mikrobiologische Nachweisverfahren
von Campylobacter aus Wasserproben nach DIN EN ISO 17995:2005 ist sehr
zeitaufwändig und es ermöglicht ausschließlich eine semiquantitative Bestimmung
der Keimkonzentration nach Voranreicherung der Zellen durch Berechnung der
„most probable number“ (MPN). Eine standardisierte Nachweismethode zur
Quantifizierung von lebenden Campylobacter-Zellen aus Wasserproben mittels eines
PCR-Schnellverfahrens ist derzeit nicht verfügbar. Daher wurden in den letzten
Jahren PCR-basierte Methoden entwickelt, um Campylobacter Zielsequenzen in
Wasserproben nachweisen zu können (KHAN et al. 2009, EDGE et al. 2013,
TISSIER et al. 2012). Für eine Differenzierung lebender Campylobacter-Zellen aus
Wasserproben unter Verwendung von DNA-interkalierenden Substanzen ist jedoch
bislang sehr wenig in der Literatur bekannt (BAE und WUERTZ 2012,
BANIHASHEMI et al. 2012, PITKÄNEN 2013).
Demzufolge war es ein weiteres Ziel dieser Arbeit, die Eignung der EMA-qPCR für
den Nachweis lebender Campylobacter-Zellen aus Wasserproben zu testen. Dazu
84 Diskussion
wurden verschiedene Faktoren, die eine Verwendung interkalierender Substanzen
beeinflussen können, wie die Wahl der Isolierungsmethode oder der Einfluss von
verschiedenen Wasserarten, untersucht.
6.2.2.2. Einfluss der Isolierungsmethode auf Campylobacter-Zellen aus
Wasserproben sowie auf die Ergebnisse der qPCR
Zum Nachweis der üblicherweise geringen Konzentrationen von Campylobacter spp.
in Wasser sind Verfahren zur Aufkonzentrierung der Zellen in Wasserproben
notwendig (PITKÄNEN 2013). Die Standardmethode zum Nachweis thermotoleranter
Campylobacter spp. nach DIN EN ISO 17995:2005 basiert auf einem
Aufkonzentrierungsschritt mittels Membranfiltration. Auch in anderen Studien wurde
die Membranfiltration zum Nachweis der Zellen in Wasser verwendet (KHAN et al.
2009, BAE und WUERTZ 2012, TISSIER et al. 2012, DELGADO-VISCOGLIOSI et
al. 2009). Alternativ dazu wurde von KHAN et al. (2009) ein Zentrifugationsverfahren
beschrieben, welches von den Autoren der Studie parallel zur
Membranfiltrationsmethode für den Nachweis von C. jejuni und C. coli aus 699
Wasserproben von landwirtschaftlichen Nutzflächen vergleichend eingesetzt wurde.
Eine hohe Detektionsrate von C. jejuni konnte dabei mit beiden Methoden erzielt
werden. Dagegen war für den Nachweis von C. coli die Zentrifugationsmethode dem
Filtrationsverfahren überlegen. Jedoch wurde in diesen Studien die
Membranintegrität der Zellen nicht berücksichtigt, sondern eine semiquantitative
Bestimmung nach Voranreicherung der Proben vorgenommen. Auch von EDGE et
al. (2013), sowie BANIHASHEMI et al. (2012) wurden Zentrifugationsmethoden zur
Aufkonzentrierung der Zellen aus Wasserproben verwendet.
Da unbekannt war, ob diese Aufkonzentrierungsverfahren die Ergebnisse der EMA-
qPCR beeinträchtigen können, wurde in der vorliegenden Arbeit zunächst ein
geeignetes Verfahren zur Isolierung von Campylobacter spp. aus Wasserproben
ermittelt. Dazu wurden die Zentrifugations- und Membranfiltrationsmethode
vergleichend untersucht. Sowohl die getestete Zentrifugationsmethode als auch die
Diskussion 85
Filtrationsmethode führten zu einem Keimverlust in der mikrobiologischen
Keimzählung bis zu 1,08 log10 KbE/ml. Dieser Zellverlust war vermutlich durch die
Anwendung der Methoden bedingt. Aufgrund des schmalen Durchmessers der
Campylobacter-Zellen könnte bei der Filtrationsmethode eine Retention der Keime
auf der Filtermembran oder in dessen Poren ein ursächlicher Faktor sein (THOMAS
et al. 1999, TISSIER et al. 2012), welches zu einer inkompletten Reisolierung der
Keime von der Filtermembran führte. Bei der Zentrifugationsmethode wäre ein
Verlust der Zellen durch das Absaugen des flüssigen Überstandes möglich, da
hierbei nur das Bakterienpellet weiter verwendet wurde (KHAN et al. 2009). Zudem
könnte eine Schädigung der Zellen durch die Zentrifugalkraft hervorgerufen worden
sein, welche zu einer Abtötung der Campylobacter-Zellen führen kann. Da in der
vorliegenden Arbeit bei der Zentrifugationsmethode eine geringere
Rotationsgeschwindigkeit als in anderen Studien verwendet wurde, war hierbei mit
geringeren Einflüssen auf die Zellen zu rechnen (KHAN et al. 2009, BANIHASHEMI
et al. 2012, EDGE et al. 2013). Da sich ein Membranfilter mit einem
Porendurchmesser von 0,45 µm als besonders geeignet zur Isolierung von
Campylobacter spp. aus Wasserproben dargestellt hat, (DIN EN ISO 17995:2005,
DELGADO-VISCOGLIOSI et al. 2009, KHAN et al. 2009, BAE und WUERTZ 2012),
ist dieser Porendurchmesser auch in der vorliegenden Arbeit eingesetzt worden.
Zwar berichteten TISSIER et al. 2012 von Membranfiltern mit geringerem
Porendurchmesser (0,2 µm), die eine Verbesserung der Resultate erzielen können.
Die Autoren bemängelten hierbei jedoch, dass die Filtermembran schneller verstopft
und bei Anlegen eines höheren Vakuums zur Überwindung dieses Hindernisses die
Zellen vermehrt geschädigt würden. Diese vermehrte Zellschädigung könnte
allerdings die Ergebnisse einer lebend-tot Differenzierung beeinflussen. Von den
Autoren wurde zudem zur Verbesserung der Isolierungsrate die Verwendung eines
alkalischen Elutionspuffers (pH 9) mit 3 % Fleischextrakt postuliert. Dieser Puffer
verschiebt die Ladung der Filtermembran in das Negative, so dass ein
Abstoßungseffekt mit der negativ geladenen Bakterienmembran erfolgen soll. Dieser
Effekt konnte eine verbesserte Ablösung der Zellen von der Filtermembran bewirken
(TISSIER et al. 2012). Zu beachten ist jedoch bei Verwendung dieses Puffers, dass
86 Diskussion
ein Verfahren zur lebend-tot Differenzierung der Zellen im Anschluss nicht
durchgeführt werden kann, da die Überlebensrate der Campylobacter-Zellen bei
diesen Umweltbedingungen sehr schnell absinkt (TISSIER et al. 2012). Diese stark
reduzierte Überlebensrate stellte den Grund dar, dass der modifizierte Elutionspuffer
in der vorliegenden Arbeit nicht eingesetzt wurde.
Die Resultate der fluoreszenzmikroskopischen Analysen zeigten eine Erhöhung der
prozentualen Anteile lebender Zellen im Vergleich zu der unbehandelten
Kontrollprobe sowohl nach Anwendung der Filtrations- als auch der
Zentrifugationsmethode. Ein signifikanter Unterschied zwischen den beiden
Aufkonzentrierungsmethoden bestand nicht. Dies lässt auf einen Verlust von
überwiegend toten Zellen oder freier DNA schließen, welche die Filterporen passiert
haben (Membranfiltration) oder zusammen mit dem Zentrifugationsüberstand
abgesaugt wurden (Zentrifugationsmethode).
Nach einer Zentrifugation der Proben zeigten die qPCR-Ergebnisse ohne vorherige
Zugabe von EMA zu den Zellen signifikant höhere Keimkonzentrationen im Vergleich
zur mikrobiologischen Keimzählung. Bei Einsatz von EMA hingegen war kein
signifikanter Unterschied zur mikrobiologischen Referenzmethode zu ermitteln.
Dieses Ergebnis lässt eine unvollständige Entfernung von membrangeschädigten
Zellen oder freier DNA mit dem Zentrifugationsüberstand vermuten. Im Gegensatz
dazu konnte bei der Filtrationsmethode eine hohe Übereinstimmung der qPCR mit
und ohne EMA im Vergleich zur mikrobiologischen Keimzählung erzielt werden.
Obwohl ähnliche prozentuale Anteile lebender und toter Zellen in der
fluoreszenzmikroskopischen Auswertung nach Anwendung beider
Isolierungsverfahren (Filtration und Zentrifugation) ermittelt wurden, fiel ein
Unterschied der qPCR-Ergebnisse mit und ohne EMA nur nach Zentrifugation der
Proben auf. Diese zunächst widersprüchlich erscheinenden Ergebnisse könnten aus
einem unterschiedlichen Anfärbeverhalten der verwendeten Farbstoffe, nicht visuell
erkennbare Veränderungen in der Fluoreszenz oder kleinen Bruchstücke der DNA
bzw. einzelsträngige DNA in der Probe, die sich in der Fluoreszenzmikroskopie nicht
Diskussion 87
anfärben lassen, resultieren. Dies müsste in weiterführenden Untersuchungen
geklärt werden.
Wie bereits oben erwähnt, konnte nach Isolierung der Keime mittels
Membranfiltration eine gute Übereinstimmung der qPCR-Ergebnisse mit und ohne
EMA-Vorbehandlung der Zellen erzielt werden. Daraus lässt sich vermuten, dass bei
der Filtration der Proben überwiegend membrangeschädigte Zellen oder freie DNA
die Filterporen passieren, welches auch in einer Studie von CLARK et al. (2011)
beobachtet wurde. Dies kann als ein Vorteil der Filtrationsmethode gegenüber der
Zentrifugationsmethode für die Anwendung der EMA-qPCR zur Detektion lebender
Zellen angesehen werden, da die Effektivität der EMA-qPCR durch den reduzierten
Anteil toter Zellen oder freier DNA wahrscheinlich gesteigert werden kann.
6.2.2.3. Einfluss der verwendeten Wasserart für ein en Nachweis lebender
Campylobacter-Zellen aus Wasserproben
In einem nächsten Schritt wurde der Einfluss verschiedener Wasserarten auf die
Membranintegrität der Zellen und auf die Ergebnisse der qPCR getestet. Dafür
wurden Oberflächenwasser und Leitungswasser mit Campylobacter spp. versetzt
und im Vergleich zur NaCl-Probe (0,9 %) untersucht, die als Kontrollprobe mitgeführt
wurde.
6.2.2.4. Limitierungen bei Verwendung von Oberfläch enwasser
Bei der fluoreszenzmikroskopischen Untersuchung von Oberflächenwasser wurde im
Vergleich zur NaCl-Probe ein höherer Prozentsatz toter Zellen in der Probe detektiert
(bis zu 81,59 %), welcher sich signifikant von den Ergebnissen bei Verwendung von
NaCl unterschied (41,10 %). Vermutlich ist dies durch eine starke bakterielle
Hintergrundflora bedingt (ABULREESH et al. 2005), da mit dem
fluoreszenzmikroskopischen Verfahren keine Unterscheidung zwischen
unterschiedlichen Bakterienspezies erfolgen kann. Tatsächlich werden mit dem
88 Diskussion
Verfahren alle Bakterien in der Probe sowie freie DNA angefärbt. Eine Erklärung für
die hohe Anzahl toter Zellen in der Probe kann dabei der Zeitpunkt der Probenahme
sein. Diese wurde zwischen Oktober und Dezember 2012 durchgeführt, welches eine
geringe Temperatur sowie einen geringen Nähr- und Sauerstoffgehalt in der
Wasserprobe bedingt und somit die Überlebensrate der Bakterien in
Oberflächenwasser reduziert (OBIRI-DANSO et al. 2001).
Die Ergebnisse der EMA-qPCR bei Testung von Oberflächenwasser zeigten
signifikant höhere Keimkonzentrationen im Vergleich zur mikrobiologischen
Referenzmethode. Dies ist vermutlich bedingt durch die hohe bakterielle
Hintergrundflora an membrangeschädigten, toten Zellen in der Probe. Die Anzahl der
toten Zellen war vermutlich zu hoch, als dass diese vollständig die Filterporen
passieren und somit verloren gehen können. Da interkalierende Substanzen wie
EMA eine Differenzierung lebender und toter Zellen aufgrund der
Membranpermeabilität ermöglichen, jedoch hierbei keine Unterscheidung
verschiedener Bakterienspezies erzielen können, bindet vermutlich ein Teil der
interkalierenden Substanz an die DNA der membrangeschädigten Bakterien aus der
Hintergrundflora. Folglich stehen nicht genug freie EMA-Moleküle zur Verfügung, um
tote Campylobacter-Zellen in der Probe zu hemmen. Demzufolge konnte bei dem
verwendeten Oberflächenwasser mittels der EMA-qPCR keine ausreichende
Differenzierung lebender Zellen erbracht werden. Eine schlechte Differenzierung
mittels interkalierender Substanzen bei Verwendung von Oberflächenwasser mit
einer hohen bakteriellen Hintergrundflora konnte auch in Studien anderer Autoren
beobachtet werden (WAGNER et al. 2008, BAE und WUERTZ 2009, GEDALANGA
und OLSON 2009). Neben der Reduzierung der effektiven Substanzkonzentration
von EMA durch Bindung an DNA von Zellen aus der Hintergrundflora können zudem
organische und anorganische Komponenten in der Wasserprobe den
Photoaktivierungsprozess von EMA behindern (FITTIPALDI et al. 2011). Bei Proben
mit hoher Partikeldichte, wie bei einer starken Hintergrundflora oder bei hohen
Anteilen von organischen und anorganischen Komponenten, kann die daraus
resultierende Absorption von Licht während der Photoaktivierung zu einer
Diskussion 89
reduzierten Bindung der EMA-Moleküle an die DNA führen und somit die Effizienz
der EMA-qPCR reduzieren (RUDI et al. 2005).
Die Effektivität der Licht-induzierten Photoaktivierung ist zum einen für die Bindung
der interkalierenden Substanzen an die DNA wichtig und zum anderen für die
hydrolytische Inaktivierung überschüssiger, freier Substanz in der Probe, die nicht in
membrangeschädigte Zellen eindringen konnte (CENCIARINI-BORDE et al. 2009).
PISZ et al. (2007) vermuteten zudem in ihrer Studie zum Nachweis von Escherichia
coli in Wasserbiofilmen, dass organisches Material Kationen binden kann und somit
die verfügbare Konzentration von EMA reduzieren kann. In Studien von WAGNER et
al. (2008) an Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes und Salmonella
enterica sowie von BAE und WUERTZ (2009) an Bacteroides fragilis konnten bei
Wasserproben mit hohen Anteilen an Schwebstoffen [1000 mg/l „total suspended
solids“ (TSS)] mittels EMA und PMA-qPCR keine ausreichende Differenzierung
lebender und toter Zellen erreicht werden. LUO et al. (2010) postulierten in ihrer
Studie an Wasserproben mit Schlammbestandteilen und Sedimenten, dass eine
maximale Trübung von 10 Nephelometrischen Trübungswerten (NTU) nicht
überschritten werden sollte, um einen nachteiligen Effekt auf die PMA
Photoaktivierung zu vermeiden. Diese Ergebnisse wurden von GEDALANGA und
OLSON (2009) bestätigt, welche bei Abwasserproben mit Trübungsgraden von über
10 NTU falsch positive Resultate beim Nachweis lebender Escherichia coli erzielten.
Zur Verbesserung der Resultate verdünnten sie die Proben auf 1 - 2 NTU bevor eine
EMA Behandlung durchgeführt wurde. Die Autoren schlussfolgerten daraus eine gute
Eignung dieses Verdünnungsverfahrens bei hohen bakteriellen Konzentrationen in
der Probe, wiesen jedoch darauf hin, dass bei geringen Keimkonzentrationen der
relative Überschuss von EMA zu falsch negativen Resultaten führen könne
(GEDALANGA und OLSON 2009). Für die Gattung Campylobacter lagen bislang in
der Literatur noch keine Untersuchungen vor.
Für eine zukünftige Verbesserung der Methode bei Verwendung von
Oberflächenwasser sind verschiedene Ansätze denkbar. HELLEIN et al. 2012
berichteten, dass die Filterart die Isolierungsrate der Bakterien beeinflussen könne.
90 Diskussion
Bei Umweltwasserproben mit einer hohen Hintergrundflora seien dabei
Polyethersulfon-Filter besser geeignet als Polycarbonat-Filter, um eine Verstopfung
der Filtermembran zu vermeiden (HELLEIN et al. 2012).
Ein weiterer Ansatz zur Verbesserung der EMA-qPCR Resultate bei Verwendung
von Oberflächenwasser mit hoher bakterieller Hintergrundflora könnte eine
Doppelbehandlung der Proben mit EMA sein, welche in der vorliegenden Arbeit
beschrieben wurde. Mit dieser Methode war eine signifikante Reduktion der
Amplifikationssignale toter Campylobacter-Zellen mittels qPCR im Vergleich zu einer
einmaligen EMA-Behandlung zu erzielen. Eine weitere Möglichkeit zur Steigerung
der Signalreduktion von membrangeschädigten Zellen bei Wasserproben mit einer
hohen bakteriellen Hintergrundflora kann die Amplifikation längerer Zielsequenzen in
der qPCR darstellen, welche in Kapitel 6.1.6.2. beschrieben wurde.
6.2.2.5. Testung von Leitungswasser, Mineralwasser und Regenwasser
Im Gegensatz zu den Ergebnissen von Oberflächenwasser ließen die Resultate bei
Verwendung von Leitungswasserproben auf eine Eignung der Methode schließen.
Die fluoreszenzmikroskopischen Auswertungen von mit Campylobacter spp.
versetzten Leitungswasserproben zeigten vergleichbare prozentuale Anteile lebender
und toter Zellen im Vergleich zur NaCl-Kontrollprobe. Aus diesen Ergebnissen lässt
sich vermuten, dass die Integrität der bakteriellen Zellmembran durch Verwendung
von Leitungswasser nicht beeinträchtigt wurde. Demzufolge zeigten die Ergebnisse
der qPCR mit und ohne EMA-Zugabe bei lebenden Campylobacter-Zellen nach
Membranfiltration der Proben eine gute Übereinstimmung zu den Ergebnissen der
mikrobiologischen Referenzmethode. Dieses zeigte sich in einer hohen Korrelation in
der Pearson-Regressionsanalyse und ließ sich auch mittels einer Bland-Altman
Analyse bestätigen. Auch die Testung weiterer Wasserarten wie Mineralwasser und
Regenwasser ließ auf eine gute Eignung der EMA-qPCR Methode zum Nachweis
lebender Campylobacter schließen. In Analogie zu den Ergebnissen bei Verwendung
von Leitungswasser konnten auch bei den Mineralwasser- und Regenwasserproben
Diskussion 91
hohe Korrelationen zwischen den Ergebnissen der EMA-qPCR und der
mikrobiologischen Keimzählung erzielt werden. Die Methoden-
vergleichsuntersuchung mittels Bland-Altman Analyse zeigte bei diesen Wasserarten
ebenfalls eine hohe Übereinstimmung der beiden Detektionsmethoden.
Die Überlegenheit der EMA-qPCR Methode konnte anschließend bei Verwendung
von Gemischen aus lebenden und toten Campylobacter-Zellen (bis zu 1:100 lebende
zu toten Zellen) gezeigt werden, mit denen die Leitungswasserproben versetzt
wurden. Dabei konnte eine hohe Übereinstimmung der EMA-qPCR Methode mit der
mikrobiologischen Referenzmethode in einer vergleichenden Bland-Altman Analyse
erzielt werden. Vergleichbare Ergebnisse wurden in Studien anderer Autoren erzielt,
in denen mit Verwendung von interkalierenden Substanzen die bakteriellen Spezies
Pseudomonas aeruginosa, Legionella pneumophila und Escherichia coli aus
Wasserproben mittels der Membranfiltration detektiert und quantifiziert werden
konnten (GEDALANGA und OLSON 2009, YÁÑEZ et al. 2011, HELLEIN et al. 2012).
In der DIN EN ISO 17995:2005 Methode zum „Nachweis und Zählung von
wärmebeständigen Campylobacter“ werden zur Bestimmung der „most probable
number“ (MPN) Wasserproben mit Volumina von 10 ml, 100 ml und 1000 ml
verwendet. Damit wird in der ISO-Methode teilweise ein höheres Probenvolumen als
in der vorliegenden Studie verwendet. In dieser Studie wurden kleine Volumina (10
ml) eingesetzt, um die Handhabung der Proben zu erleichtern und um die prinzipielle
Eignung einer qPCR zur Differenzierung lebender und toter Campylobacter-Zellen
mittels EMA für den Einsatz bei Wasserproben zu testen. Eine Anwendung höherer
Probenvolumina sollte dennoch ohne Schwierigkeiten möglich sein, da sich die
Membranfiltrationsmethode in Studien anderer Autoren, welche Wasserproben von
bis zu 100 Litern verwendet haben, als geeignete Methode zur Isolierung von
Keimen dargestellt hat (HIJNEN et al. 2000, HELLEIN et al. 2012, ABULREESH et
al. 2005, KHAN et al. 2009).
92 Diskussion
6.3. Schlussfolgerung
In der vorliegenden Arbeit wurde erstmalig ein Vergleich der beiden
Differenzierungsmittel EMA und PMA für den Nachweis und die Quantifizierung von
lebenden Campylobacter spp. mittels qPCR durchgeführt. Dabei zeigten beide
Substanzen eine sehr gute Eignung zur Differenzierung von lebenden und toten
Campylobacter-Zellen. Unterschiedliche Vor- und Nachteile sowie methodische
Limitierungen bei der Verwendung von EMA oder PMA wurden dabei aufgezeigt.
Anschließend wurde ein Methodenprotokoll unter Verwendung von EMA erfolgreich
etabliert. Bei der Testung der entwickelten Methode an Lebensmittelproben konnte
an der Matrix Geflügelfleisch eine gute prinzipielle Eignung der EMA-qPCR Methode
zur Quantifizierung und zur Differenzierung von lebenden und toten Campylobacter
spp. Zellen gezeigt werden. Bei der Testung der Methode an Wasserproben zeigten
Faktoren wie die Isolierungsmethode oder die Art der Wasserprobe einen Einfluss
auf die qPCR Resultate. Für einen Nachweis lebender Campylobacter spp. aus
Leitungswasser-, Regenwasser- und Mineralwasserproben stellte sich die EMA-
qPCR als vielversprechende Methode dar. Eine Weiterentwicklung dieser
vielversprechenden Methode ist aber zu empfehlen, um die dargestellten
Limitierungen zu umgehen.
Zusammenfassung 93
7. Zusammenfassung
Diana Seinige
Untersuchungen zur Eignung der interkalierenden Sub stanzen
Ethidiummonoazid und Propidiummonoazid für eine qua ntitative Bestimmung
lebender Campylobacter-Zellen aus Lebensmittelproben und Wasser mittels
real-time PCR
Campylobacter (C.) spp. sind europaweit die häufigsten bakteriellen Lebensmittel-
infektionserreger und verursachen gastrointestinale Infektionen beim Menschen.
Dabei werden jährlich steigende Fallzahlen berichtet. Als überwiegende
Infektionsquelle gilt kontaminiertes Geflügelfleisch, aber auch kontaminiertes Trink-
und Oberflächenwasser stellen eine zunehmend wichtige Quelle für humane
Infektionen mit Campylobacter spp. dar. Daher ist eine schnelle und zuverlässige
Diagnostikmethode zur Detektion von Campylobacter spp. dringend erforderlich. Die
fehlende Differenzierung von lebenden und somit potentiell infektiösen Zellen von
toten Zellen limitiert aber die Anwendung der quantitativen real-time PCR (qPCR) in
der Routinediagnostik an Lebensmittelproben. In jüngster Zeit wurde deshalb die
qPCR in Kombination mit DNA-interkalierenden Substanzen, wie Ethidiummonoazid
(EMA) und Propidiummonoazid (PMA), eingesetzt, um eine Unterscheidung
zwischen lebenden und toten Zellen zu ermöglichen. Diese Substanzen dringen in
membrangeschädigte Zellen ein und verhindern durch ihre Bindung an die zelluläre
DNA eine Amplifikation dieser DNA in der anschließenden PCR.
Ziel der vorliegenden Studie war es, ein qPCR-basiertes Nachweisverfahren in
Kombination mit einer interkalierenden Substanz für thermotolerante Campylobacter
spp. zu etablieren, welches einen schnellen quantitativen Erregernachweis
ermöglicht. Zudem sollte die Eignung der Methode an Proben verschiedener
Lebensmittelmatrices, wie Geflügelfleisch und Wasser, getestet werden.
94 Zusammenfassung
In den ersten Versuchsreihen wurde eine qPCR Methode zum Nachweis
thermotoleranter Campylobacter-Zellen etabliert. Dafür wurde eine Standardkurve
zur Berechnung der Keimkonzentration in einer Probe erstellt. Bei dieser
Standardkurve konnte eine hohe Korrelation zwischen den aus Ct-Werten der qPCR
errechneten Keimgehalten und den eingesetzten Keimkonzentrationen ermittelt
werden. Zudem wurde eine hohe PCR-Effizienz von 98,9% errechnet. In einem
nächsten Schritt wurde der Einfluss der interkalierenden Substanzen EMA und PMA
in unterschiedlichen Konzentrationen getestet. Dabei konnte sowohl bei Verwendung
von EMA als auch von PMA eine konzentrationsabhängige Verschiebung der
Detektionskurve mit höheren Ct-Werten in der qPCR beobachtet werden. Aufgrund
dieser Verschiebung wurde die Standardkurve auf die Versuchsbedingungen
angepasst und mittels einer Vorbehandlung der Zellen mit EMA oder PMA erstellt.
Diese neu erstellte Standardkurve wurde erstmalig zusammen mit einem internen
DNA-Standard für die Berechnung der Keimkonzentrationen verwendet. Dabei
konnten hohe Korrelationen zur mikrobiologischen Referenzmethode erzielt werden.
Anschließend wurde die Differenzierungskraft der interkalierenden Substanzen bei
Gemischen aus lebenden und toten Zellen getestet. In diesen Versuchsreihen
zeigten EMA (10 µg/ml) und PMA (51,10 µg/ml) eine gute Eignung zur
Differenzierung lebender von toten Zellen bei bis zu 1:1000 lebenden zu toten Zellen
in den Gemischen. In weiteren Versuchsreihen wurde die Signalreduktion in der
qPCR bei einer Vorbehandlung von hitzeinaktivierten Zellen mit den interkalierenden
Substanzen untersucht. Bei einer hohen Konzentration an toten Zellen (>104 KbE/ml)
war eine unvollständige Signalreduktion zu beobachten. Um diese Limitierung zu
umgehen wurde erstmalig eine Doppelbehandlung der Campylobacter spp.-Zellen
mit EMA (10 µg/ml) durchgeführt. Dabei konnten die Resultate deutlich verbessert
werden, so dass eine ausreichende Signalreduktion bei bis zu 106 KbE/ml an toten
Zellen erzielt wurde. Das erstellte EMA-qPCR Protokoll wurde in weiteren
Versuchsreihen an C. jejuni- und C. coli-Feldisolaten erfolgreich getestet. Dabei
konnte eine hohe Korrelation zwischen den Resultaten der qPCR und der
mikrobiologischen Referenzmethode ermittelt werden. Die etablierte EMA-qPCR
Methode wurde nachfolgend für die Anwendung an Proben der Lebensmittelmatrix
Zusammenfassung 95
Geflügelfleisch getestet. Dafür wurden verschiedene Versuchsreihen mit gespikten
Hühnerfleischproben angeschlossen, bei welchen die EMA-qPCR Methode eine sehr
gute Eignung zur Detektion lebender Campylobacter-Zellen zeigte. Dabei konnte
eine hohe Übereinstimmung der Ergebnisse aus der EMA-qPCR und der
mikrobiologischen Keimzählung ermittelt und durch eine
Methodenvergleichsuntersuchung mittels einer Bland-Altman Analyse bestätigt
werden. Zur Testung der Methode bei Wasserproben wurden in einem ersten Schritt
zwei Reisolierungsmethoden vergleichend untersucht (Membranfiltration,
Zentrifugation). Bei beiden Methoden kam es zu einem Keimverlust nach der
Zentrifugation oder der Membranfiltration und die prozentualen Anteile lebender und
toter Zellen verschoben sich zugunsten der lebenden Zellen. In weiteren
Versuchsreihen wurden die Reisolierungsmethoden in Kombination mit der qPCR
Methode getestet. Bei Filtration der Proben konnte eine hohe Übereinstimmung
zwischen den Ergebnissen der qPCR und der EMA-qPCR im Vergleich zur
kulturellen Keimzählung ermittelt werden. Im Gegensatz dazu war bei der
Zentrifugation ein höherer Keimgehalt in der qPCR ohne EMA zu detektieren. Der
Einfluss von verschiedenen Wasserarten auf die Ergebnisse der qPCR wurde in
anschließenden Versuchen ermittelt. Dabei wurde in Oberflächenwasser eine hohe
Anzahl an toten Zellen detektiert, so dass mittels der EMA-qPCR keine korrekte
Bestimmung lebender Zellen möglich war. Bei Verwendung von Leitungswasser,
Regenwasser oder Mineralwasser konnten hohe Korrelationskoeffizienten zwischen
den Ergebnissen der EMA-qPCR und der mikrobiologischen Keimzählung ermittelt
werden. Die Eignung der Methode für diese Wasserarten wurde in einer
Methodenvergleichsuntersuchung mittels Bland-Altman Analyse bestätigt. Die
Anwendung der Methode bei Campylobacter-Feldisolaten erzielte eine hohe
Übereinstimmung zur mikrobiologisch ermittelten Keimkonzentration. Die
Überlegenheit der EMA-qPCR Methode konnte zudem an definierten Gemischen aus
lebenden und toten Zellen bestätigt werden.
Sowohl bei Geflügelfleisch als auch bei Wasserproben zeigte sich die EMA-qPCR
Methode als vielversprechend zur Detektion lebender Campylobacter-Zellen.
96 Zusammenfassung
Aufgrund der aufgezeigten Limitierungen sollte eine weitere Validierung der Methode
durchgeführt werden.
Summary 97
8. Summary
Diana Seinige
Investigation of the suitability of the intercalati ng dyes ethidium monoazide
and propidium monoazide for a quantitative detectio n of viable Campylobacter-
cells in food samples and water by real-time PCR
In Europe, Campylobacter (C.) spp. are the most common bacterial food-borne
pathogens. Campylobacter spp. are the causative agents of gastrointestinal
infections in humans and increasing annual numbers of cases are reported. The
predominant source of infection is poultry meat, however contaminated drinking- and
surface water are also important sources of human infections with Campylobacter
spp. Hence, a fast and reliable diagnostic method for the detection of Campylobacter
spp. is urgently required. The lack of differentiation between viable and potentially
infectious cells from nonviable cells limits the implementation of quantitative real-time
PCR (qPCR) methods in routine diagnostic analysis of food samples. Recently,
combinations of qPCR assays and ethidium monoazide (EMA) or propidium
monoazide (PMA) pretreatments of cells have been proposed to achieve a
differentiation between viable and nonviable cells. EMA and PMA penetrate
membrane damaged cells and bind to cellular DNA, preventing the amplification of
DNA in subsequent qPCR experiments.
The aim of the present study was to develop a qPCR based detection method in
combination with the use of an intercalating dye for a rapid quantitative detection of
thermotolerant Campylobacter spp. In addition, the applicability of the method for
different food matrices, such as poultry meat and water was determined.
In the first series of experiments, a qPCR method for the detection of thermotolerant
Campylobacter was used. For this, a standard curve was generated for calculating
the quantities of CFU in a sample. By using this standard curve a high correlation
98 Summary
between the amount of Campylobacter spp. calculated from qPCR results and
microbiological cell enumeration was determined. The PCR efficiency corresponded
to 98.9%. In a subsequent step, the influence of the intercalating dyes EMA and PMA
on qPCR results was determined. For this, EMA and PMA were tested at different
concentrations. Results from qPCR experiments revealed concentration dependent
shifts towards higher Ct-values after application of the intercalating dyes EMA and
PMA. Therefore, the standard curve was adapted to the experimental conditions and
Campylobacter-cells were pretreated with PMA or EMA. This adapted standard curve
was used together with an internal DNA standard for quantifying Campylobacter from
food samples. A high correlation coefficient value was achieved from a plot of log10
cell counts determined by qPCR and culture enumeration. In a subsequent step, the
suitability of the intercalating dyes for differentiating between viable and nonviable
cells was tested in mixtures of live and heat-killed cells. EMA (10 µg/ml) and PMA
(51.10 µg/ml) removed DNA selectively from nonviable cells in mixed samples.
Furthermore, heat-killed cells were pretreated with the intercalating dyes and the
signal reduction in qPCR experiments was determined. At high concentrations of
dead cells (>104 CFU/ml), an incomplete signal reduction was observed. To
circumvent this limitation, a double staining of EMA (10 µg/ml) was performed and
clearly improved the signal reduction of nonviable Campylobacter-cells, if a limit of
106 CFU/ml was not exceeded. In further experiments the EMA-qPCR protocol was
successfully applied to C. jejuni and C. coli field isolates. A high correlation
coefficient value between the results of qPCR and the microbiological reference
method was calculated. The suitability of the EMA-qPCR method was subsequently
tested by using chicken meat samples. For this, chicken meat samples were spiked
with different quantities of Campylobacter. There was a linear relationship between
results from EMA-qPCR and the microbiological reference method and a method
comparison by Bland-Altman analysis showed a low variation between the methods.
In further experiments the suitability of the method was tested for water samples. For
this, two methods frequently used for the isolation of bacteria were comparatively
analyzed (membrane filtration, centrifugation). The application of both methods
Summary 99
resulted in a loss of Campylobacter-cells and an accumulation of viable cells in the
samples. After recovery of cells by membrane filtration and centrifugation, the qPCR
method with and without EMA was used. After filtration of samples, a high agreement
between results of qPCR, EMA-qPCR and the microbiological enumeration was
achieved. In contrast, after centrifugation of samples, qPCR without EMA
overestimated the quantities of Campylobacter CFU/ml. In subsequent experiments,
the influence of different types of water on the results of qPCR was determined. A
high percentage of dead cells was detected in surface water by fluorescence
microscopy, resulting in an incorrect determination of viable cells by EMA-qPCR. In
contrast, results from tap water, rain water or mineral water samples revealed high
correlation coefficient values between results from EMA-qPCR and the
microbiological cell enumeration. The suitability of EMA-qPCR for analysis of these
types of water samples was confirmed by Bland-Altman analysis. In addition, field
isolates were subjected to EMA-qPCR quantification and a high correlation
coefficient value between results from EMA-qPCR and culture enumeration was
achieved. However, when defined mixtures of viable and nonviable cells were used,
an advantage of the EMA-qPCR method over qPCR without EMA pretreatment was
detected.
In conclusion, EMA-qPCR seems to be a promising method for the detection of
viable Campylobacter-cells from chicken meat and water samples but further studies
are needed to overcome the limitations.
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Danksagung 129
Danksagung
Mein besonderer Dank gilt meinen beiden Betreuern Frau Prof. Dr. med. vet. Corinna Kehrenberg, PhD und Herrn Univ. Prof. Dr. med. vet. Günter Klein für die Überlassung dieses interessanten Themas und die Möglichkeit diese Arbeit im Institut für Lebensmittelqualität und –sicherheit anfertigen zu können. Besonders danken möchte ich an dieser Stelle Frau Prof. Kehrenberg für die hervorragende wissenschaftliche Betreuung während der Zeit meiner Doktorarbeit, die vielen konstruktiven Gespräche und die immer währende Bereitschaft zur Hilfestellung sowie die stets freundliche und geduldige Arbeitsatmosphäre. Dank ihrer besonderen Fachkompetenz habe ich während dieser Zeit viel lernen können. Für die finanzielle Förderung von Teilen dieser Arbeit gilt mein Dank dem Sanitätsamt der Bundeswehr, vertreten durch den Oberstabsveterinär Herrn Dr. Alfred Binder. Für die finanzielle Unterstützung der Standardisierungsarbeiten der Methode danke ich dem Bundesministerium für Wirtschaft und Technologie. Danken möchte ich auch Herrn PD Dr. med. vet. Carsten Krischek für seine Bereitschaft sich in die komplizierten Sachverhalte etwaiger Fragestellungen einzuarbeiten und sein offenes Ohr bei der Diskussion von statistischen Auswertungen. Eine andere Sicht auf die Dinge kann manchmal sehr hilfreich sein. Frau PD Dr. rer. nat. Maren von Köckritz-Blickwede danke ich herzlich für die Möglichkeit im Institut für Physiologische Chemie die fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen durchführen zu können und für ihre Hilfestellung bei den Auswertungen trotz ihrer sehr knapp bemessenen Zeit. Für die Anleitung bei der Verwendung des Statistikprogrammes bin ich ihr besonders dankbar. Allen Mitarbeitern des Instituts, vor allem auch meinen Mit-Doktoranden und den technischen Mitarbeitern im PCR-Labor, möchte ich für die schöne und erlebnisreiche Zeit, ihre Unterstützung und die angenehme Arbeitsatmosphäre während der Doktorarbeit danken. Herrn Manfred Merle danke ich für die Hilfe bei Problemen mit dem Computer. Ganz besonders meiner Mit-Doktorandin und Bürokollegin, Ulrike Rensch, danke ich für die harmonische gemeinsame Zeit, für die vielen interessanten Gespräche, für die gegenseitige Unterstützung und für den Einblick in die „Welt der Lebensmittelchemie“, so dass aus einer Kollegin eine wahre Freundin wurde. Meiner Familie und insbesondere meinen Eltern und meiner Schwester danke ich sehr, dass sie mich auf meinem Weg fortwährend unterstützt haben und dabei einen sehr großen finanziellen, verständnisvollen und hilfreichen Teil geleistet haben. Herzlichen Dank für Eure Unterstützung und Geduld!
130 Danksagung
Zuletzt und ganz besonders von Herzen, danke ich meinem lieben Daniel für all die Unterstützung während der Zeit meiner Doktorarbeit. Ich danke Dir für Dein Verständnis und die Aufmunterungen sowie deine Bereitschaft Dich in das Arbeitsleben in einem Labor hineinzuversetzen, so dass auch für Dich die „Risikolebensmittel“ kein Fremdwort mehr sind. Ich freue mich sehr, dass es Dich gibt!