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Title 母子分離ストレスの恐怖条件付け記憶増強の分子メカニズムに関する研究

Author(s) 戸田, 裕之

Citation 北海道大学. 博士(医学) 乙第6927号

Issue Date 2014-09-25

DOI 10.14943/doctoral.r6927

Doc URL http://hdl.handle.net/2115/57211

Type theses (doctoral)

Note 配架番号：1680

File Information Hiroyuki_Toda.pdf

Hokkaido University Collection of Scholarly and Academic Papers : HUSCAP

学 位 論 文

母子分離ストレスの恐怖条件付け記憶増強の

分子メカニズムに関する研究

（Molecular mechanisms for the enhancement of

conditioned fear memory induced by maternal separation）

２０１４年９月

北 海 道 大 学

戸 田 裕 之

Hiroyuki Toda

学 位 論 文

母子分離ストレスの恐怖条件付け記憶増強の

分子メカニズムに関する研究

（Molecular mechanisms for the enhancement of

conditioned fear memory induced by maternal separation）

２０１４年９月

北 海 道 大 学

戸 田 裕 之

Hiroyuki Toda

目次

発表論文目録および学会発表目録 ............................................................ 1

I 緒 言 ................................................................................................ 2

II 略語表 .............................................................................................. 4

III 実験方法........................................................................................... 5

IV 実験結果 ........................................................................................ 12

V 考 察 .............................................................................................. 19

VI 総括および結論 ............................................................................... 23

VI 謝 辞 ............................................................................................. 24

VII 引用文献 ....................................................................................... 25

1

発表論文目録および学会発表目録

本研究の一部は以下の論文に発表した。

1. Hiroyuki Toda, Shuken Boku, Shin Nakagawa, Takeshi Inoue, Akiko Kato,

Naoki Takamura, Ning Song, Masashi Nibuya, Tsukasa Koyama, Ichiro

Kusumi

Maternal Separation Enhances Conditioned Fear and Decreases the mRNA

Levels of the Neurotensin Receptor 1 Gene with Hypermethylation of This

Gene in the Rat Amygdala

PLoS One May 15;9(5):e97421, 2014

本研究の一部は以下の学会に発表した。

1. Hiroyuki Toda, Shin Nakagawa, Suken Boku, Ning Song, Akiko Kato, Takeshi

Inoue, Tsukasa Koyama

Dexamethasone /corticotrophin releasing hormone test in maternal

separation stress models

Society for Neurosciences 39th Annual Meeting Neuroscience, 2009, Cicago

2. Hiroyuki Toda, Shin Nakagawa, Shuken Boku, Ning Song, Naoki Takamura,

Akiko Kato, Takeshi Inoue, Tsukasa Koyama

Maternal separation stress and vulnerability to anxiety behavior in rats

World congress for CINP, 2010, Hong Kong

3. Hiroyuki Toda, Shin Nakagawa, Shuken Boku, Naoki Takamura, Ning Song,

Akiko Kato, Takeshi Inoue, Tsukasa Koyama

Influence of early-life stress on behavior, HPA axis activity, gene expressions

and hippocampal neurogenesis in adulthood rats

Society for Neurosciences 40th Annual Meeting Neuroscience, 2010, San

Diego

4. Hiroyuki Toda, Shin Nakagawa, Shuken Boku, Ning Song, Naoki Takamura,

Akiko Kato, Takeshi Inoue, Tsukasa Koyama

Vulnerability to anxiety behavior induced by maternal separation stress may

occur through the increase of DNA methylation at neurotensin type 1

receptor promoter region in rat amygdala.

Society for Neurosciences 41st Annual Meeting, 2011, Washington DC

2

I 緒 言

１．幼少期のストレスと精神障害の関係

過去の臨床研究で、出生後の発達段階でストレス（early life stress, ELS）にさら

されることによって、成人後のうつ病、不安障害や物質乱用のリスクが増加すること

が示されている 1,2。例えば、Caspi らは、セロトニントランスポーター遺伝子プロモー

ター領域の遺伝子多型と環境要因（虐待、ストレス）との相互作用が大うつ病性障

害の発症に関与していることを前方視的なコホート研究で明らかにした 3。また、ヒト

と同様に、他の哺乳類でも、ELS に暴露されると、不安状態やうつ病様行動発現

への脆弱性が高まることが報告されている 4-8。これらの所見から、幼少期の環境が

遺伝的要因に影響して、遺伝子発現、そして生物学的な機能の変化を引き起こし、

成人期における精神障害の発症に至ると考えられる。このような“プログラム”効果

は、ゲノム遺伝子の構造変化を伴うエピジェネティックな制御によって生じる可能

性が指摘されている 5,9。

２．幼少期のストレスとエピジェネティクスの関係

母 ラットの授 乳 期 の 養 育 行 動 が仔 ラットの海 馬 グルココルチコイド受 容 体

（glucocorticoid receptor, GR）の発現に影響し、さらに視床下部‐下垂体‐副腎

（hypothalamic-pituitary-adrenal、HPA)系の反応に影響を与えることが明らかに

なっている 10。養育行動が不良な母ラットの仔は、成獣後、海馬の GR 遺伝子のプ

ロモーター領域の DNA メチル化が亢進し、GR の発現量が低下する。その結果、

HPA 系のネガティブ・フィードバックが障害される。また、離乳前に一日 3 時間母マ

ウスから分離された仔は、成獣後、視床下部室傍核のアルギニンバソプレッシン遺

伝子のプロモーター領域のメチル化が低下している。その結果、アルギニンバソプ

レッシンの発現量が増加し、HPA 系のネガティブ・フィードバックの障害を生じうつ

様行動の原因となっていると報告されている 11。動物実験における所見は、ヒト死

後脳を用いた研究でも証明されている。自殺者の海馬 GR 発現量が幼少期に虐

待を受けた群で低下し、その発現低下は GR 遺伝子のプロモーター領域のメチル

化によって惹起されていることが示されている 12。このように、幼少期に受けたストレ

スは遺伝子の構造的な変化を引き起こして、成人後もその影響が続き精神疾患発

症の脆弱性が高まっている可能性がある。すなわち、エピジェネティックな変化を

介して環境要因が遺伝子にプログラミングされているといえよう。

３．恐怖条件付けモデルと幼少期ストレス

3

恐怖条件付けモデル（conditioned fear stress paradigm, CFS）は、パブロフ型条

件付けを元にした実験課題である。条件付けの段階に、情動的に中性な刺激（音、

絵、光、コンテクストなど）と情動的に嫌悪な刺激（電気刺激など）を同時に与え、

再度、中性的な刺激のみを与えた時に生じる条件付け反応を評価する。CFS は身

体的な刺激によらない心理学的なストレスとみなされ、不安や恐怖の単純な動物

モデルとして幅広く使用されている 13-16。ELS を受けた仔は成長後に、条件付け恐

怖反応が亢進していることが報告されている 17,18。しかしながら、ELS によって生じ

る恐怖の記憶プロセスに対して、エピジェネティックな制御が関与するのか、またど

のような役割をしているのかは明らかにされていない。

４．恐怖条件付けモデルにおけるニューロテンシンの役割

DNA マイクロアレイを用いた我々の研究で、CFS によって変化し、様々な不安障

害の治療薬の一種であるセロトニン再取り込み阻害薬でその変化が回復するただ

一つの遺伝子として、ニューロテンシン（neurotensin, NTS）を見出している 19。NTS

は内在性の神経ペプチドで、モノアミン神経伝達系と強く結びついている 20。NTS

受容体（NTS receptor, NTSR）１と２は、不安や記憶のプロセスに関連がある扁桃

体や海馬に豊富に存在する 21。ラットを用いた研究で、NTSR1 アゴニストの全身投

与が、フットショックによって条件付けられた超音波発声 22 や、驚愕反応を減少さ

せる 23 ことが報告されている。さらには、NTSR1 ノックアウトマウスを用いた研究では、

コンテクスト条件付け恐怖反応が亢進することが示されている 15。しかしながら、

ELS によって生じる恐怖条件付け反応の亢進における NTS の役割については明ら

かにされていない。

４．研究の目的

本研究の目的は、母子分離ストレス（maternal separation, MS）を負荷されたラッ

トの CFS における障害の分子メカニズムを解明することである。我々の過去の研究

で CFS との関連が示唆された NTS 系に焦点を当てて行った。MS はげっ歯類を用

いた研究で ELS を誘導するストレスとして一般的に用いられている。本研究におい

て、MS と NTSR1 アンタゴニストは CFS において、すくみ行動を増強させた。また、

MS は扁桃体の NTSR1 遺伝子発現を減少させ、NTSR1 DNA のプロモーター領域

のメチル化亢進を認めた。

4

II 略語表

本文中および図中で使用した略語は以下の通りである。

AFR animal facility rearing

BrdU bromodeoxyuridine

CFS conditioned fear stress

CRFBP corticotrophin releasing factor binding protein

CRH corticotrophin releasing hormone

CRHR corticotrophin releasing hormone receptor

DEX dexamethasone

EF eluted fragment

ELS early life stress

GCL granule cell layer

GR glucocorticoid receptor

HPA hypothalamic-pituitary-adrenal

MR mineralocorticoid receptor

MS maternal separation

NR2B N-methyl D-aspartate receptor subtype 2B

NTS neurotensin

NTSR neurotensin receptor

SD Sprague-Dawley

Ucn urocortin

UF unbound fragment

5

III 実験方法

1. 動物

体重 230 – 270 g の雄性 Sprague-Dawley（SD）ラットを、静岡動物実験センター

（Shizuoka，Japan）から購入し、4 匹／ケージで飼育した。妊娠 14 日目の SD ラット

を購入し（静岡動物実験センター）、1 匹／ケージで飼育した。全てのラットは、標

準的なケージを使用し、餌と水は自由に摂取させ、室温 22±1℃、12 時間の明暗

サイクル（0600 – 1800 明相）の条件で飼育した。全ての実験は、北海道大学動物

実験委員会によって承認され、国立大学法人北海道大学動物実験に関する規定

を遵守して実施した。

2. MS ストレス

MS ストレスは Plotsky と Meaney24 の方法をもとに実施した。9 時～17 時に生まれ

た仔ラットは出産日を生後 0 日目とし、17 時～9 時に生まれた仔ラットは出産日を

生後 1 日目とした。生後 2 日目に、仔ラット間の差異を少なくするために、仔ラット

を全て集めて雄性仔ラット 8 匹、雌性仔ラット 2 匹、合計１０匹を母ラットのケージに

戻した。生後 2 - 14 日目の 9 時半～12 時半の間に、MS ストレス負荷やケージ交

換を行った。MS 群では、最初に母ラットを他のケージに移して、仔ラットをおが屑

が敷き詰められたプラスティック製の箱に移し、27～30℃に設定した保温箱の中で

3 時間母ラットと分離した。その後、仔ラットを元のケージに戻してから、母ラットを同

ケージに戻した。MS ストレスの間は、仔ラット同士は分離せずに扱った。通常飼育

（AFR、animal facility rearing）ラットをコントロール群とし、動物実験施設飼育者が

週に１回ケージ交換を行った。以下の実験では、雄性仔ラットのみ使用し、行動実

験、生化学・分子生物学的実験を 10～14 週令目に施行した。

3. Dexamethasone/corticotropin releasing hormone 試験

Dexamethasone （ DEX ） /corticotropin releasing hormone （ CRH ） 試 験 は

Hatzinger ら 25 の方法を用いて行った。DEX/CRH 試験の６日前にペントバルビタ

ール・ナトリウム（40 mg/kg, i.p.）の麻酔下で、無菌操作にて外頚静脈からカテー

テルを挿入した。ゲンタマイシン（30,000 IU/ラット）を含んだ滅菌生理食塩水 0.2

ml を注入した後に、カテーテルを皮下に通してラットの頸部背側に固定した。

DEX/CRH テスト当日、７時にラットの体重を測定し、８時に外頸静脈カテーテルを

自由移動装置（Eicom, Kyoto, Japan）を介してプラスティックシリンジに接続した。

プラスティックシリンジ及びカテーテル内は滅菌ヘパリン化生理食塩水（50 IU/ml）

6

で満たした。12 時に DEX（Sigma, St. Louis, MO）（30 ug/kg, 0.5 ml/kg）をカテー

テルから静脈内投与して、18 時、18 時半、19 時、19 時半に 0.2 ml の血液を採取

した。19 時 31 分に CRH（吉富薬品より移譲, Osaka, Japan）（50 ng/kg, 0.5 ml/kg）

をカテーテルより静脈内投与して、19 時 40 分、20 時、20 時 20 分、20 時 40 分に

0.2 ml の血液を採取した。コルチコステロンの濃度はコルチコステロン EIA キット

（Cayman, Ann Arbor, MI）を用いて Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay 法に

よって測定した。

4. オープンフィールド試験

縦 90 cm、横 90 cm、高さ 40cm の正方形のオープンフィールドを使用した。フィ

ールドは、黒色の線で 81 個の同サイズの正方形で区切られ、フィールドの中心が

200 ルクスになるように照度を調整した。フィールド領域は、外側領域（外周から幅

20cm）と内側領域（それ以外の中心部）に分けられる。ラットは 1 匹ずつ、フィール

ドの中心部において、30 分間行動を観察し、総移動距離と内側領域滞在時間を

行動追跡ソフト（LimeLight, Actimetrics, Wilmette, IL）を用いて解析した。総移動

距離はラットの全般的な活動量、内側領域滞在時間はラットの不安症状を評価す

る目的で測定した。全ての行動試験は、概日リズムの影響を少なくするために、14

時～16 時の間に行った。

5. 高架式十字迷路試験

高架式十字迷路装置は、50 x 10 cm の 2 本の開放アーム、高さ 40cm の壁に囲

まれた 2 本の閉鎖アームからなり、中心部の 10 cm 四方のプラットフォームから各々

のアームが伸びている。床から 50 cm の高さに固定され、中心部位の明るさを 200

ルクスに設定した。ラットは１匹ずつ、中心部のプラットフォームに開放アームに正

対するように置いて、5 分間の行動を解析した。総移動距離と開放アームに侵入し

た回数を行動追跡ソフト（Actimetrics）で解析した。総移動距離は活動量を表す。

ラットは開放空間を避ける性質があるため 26、開放アーム侵入回数は記憶非依存

性恐怖を表す。全ての行動テストは、概日リズムの影響を少なくするために、14 時

～16 時の間に行った。

6. 海馬における Bromodeoxyuridine (BrdU) 陽性細胞数の測定

外頚静脈カテーテル挿入術の２日前と１日前に、合計４回 BrdU（200 mg/kg）を

腹腔内投与した。DEX/CRH 試験の翌日にペントバルビタール・ナトリウムで十分

に麻酔を行ってから、4%パラホルムアルデヒドで還流固定した後に脳を取り出した。

ドライアイスで冷却したミクロトームを用いて、海馬全体を含む冠状断の 30 um の連

7

続切片を切り出し、６枚毎にスライドに乗せペルオキシダーゼ法による BrdU 免疫

染色を行った。切片を 90℃の 0.01 M クエン酸溶液で 10 分間加熱、0.1%のトリプシ

ン（0.1 %の塩化カルシウムを含むトリス溶液、室温）で 10 分間消化、2 N の塩酸溶

液で 30 分間変性、室温の 3%の normal horse serum で 20 分間ブロック、4℃の 50

倍希釈のマウス BrdU 抗体（Becton Dickinson, Mountain View, CA）（3％の normal

horse serum と 0.1%の Tween 20 を含む PBS 溶液）で一晩 incubate した。翌日、200

倍希釈のマウス immunoglobulin G 抗体（Vector Laboratories Inc., Burlingame,

CA）で 60 分間、室温の 50 倍希釈のアビジン・ビオチン・セイヨウワサビペエルオキ

シダーゼ（Vector Laboratories Inc.）で incubate、3,3'-diaminobenzidine を用いて

発色した後に脳切片をクルスタルバイオレットで染色した。海馬の顆粒細胞層

（granule cell layer, GCL）と門部（hilus）の BrdU 陽性細胞数を、オリンパス BX-60

（Olympus Optical Co. Ltd., Tokyo, Japan）で 100 倍の対物レンズを用いてカウン

トした。海馬の両側の細胞数を染色した全ての切片でカウントして 6 倍したものを、

合計細胞数とした。

6. フットショック感受性試験

MS がフットショックの疼痛閾値に影響を与えるかどうか検討した。発声、前足挙

上、後ろ足挙上、ジャンプの 4 行動を疼痛の指標とした。これらの行動はホットプレ

ート法の評価の際に一般的に用いられている 27。ラットは１匹ずつ、金属製のグリッ

ド床（19 x 22 x 20 cm）のショック箱に入れ、5 分間の適応時間の後に、各々15 秒

間のフットショックを与えた。電撃ショックは 0.4 mA から開始して 40 秒間のインター

バルの後に、最大 3.2 mA まで、0.2 ｍA ずつ増加した。ラットの行動を観察して、

上記 4 行動が初めて現れた電流の強さを決定した。

7. 恐怖条件付けストレス（CFS）モデル

グリッド床のショック箱（30 x 24 x 30 cm, Med Associates Inc., St. Albans, VT）28

で、ラットに１匹ずつ 5 分間の逃避不能フットショックを負荷した。5 回のフットショッ

ク（2.0 mA スクランブルフットショック, 30 秒間）は ENV-410 ショック発電機（Med

Associates）を用いた。24 時間後、電撃ショックを負荷したラットを、同一の箱にフッ

トショックを負荷せず 5 分間暴露（１回目暴露）し、すくみ行動を評価した。48 時間

後、再度、同一のラットを同一の箱に 5 分間暴露（２回目暴露）した。すくみ行動は、

呼吸による影響を除いた骨格と髭の動きと定義した。5 秒間隔でラットの行動を

freezing もしくは active と分類して、freezing の回数をパーセント得点で表した 28。

また、CFS による遺伝子発現の経時的な変化を検証するため、１回目暴露直前

（control）、1 時間後、2 時間後、4 時間後、6 時間後のラットから脳を取り出した。

8

8. 定量 RT-PCR

ペントバルビタール・ナトリウムで十分に麻酔を行ってから断頭し、取り出した脳を

氷冷却したリン酸化緩衝生理食塩水（PBS; pH 7.4）で洗浄した。ブレインスライサ

（Muromachi, Tokyo, Japan）を用いて、脳を冠状断で厚さ 1 mm の切片に切り、氷

冷却した PBS を満たした皿に入れた。海馬と扁桃体を含む領域を注意深く切り分

け、RNeasy Lipid Tissue Mini Kit（Qiagen, Hilden, Germany）を用いて全 RNA を

抽出した。全 RNA は Quantitect Reverse Transcription kit（Qiagen）を用いて

cDNA に逆転写した。SYBR GreenER qPCR SuperMix for ABI PRISM（Invitrogen）

を用いて、ABI PRISM 7600 Sequence Detection System（Applied Biosystems,

Foster, CA）にて、定量 PCR を行った。全てのサンプルは三重測定した。PCR の条

件は、50℃2 分と 95℃10 分の後、95℃15 秒と 60℃1 分を 40 サイクルとした。

Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)をコントロールとして使用し

た。測定サンプルは、標準サンプル（ラットの海馬から抽出した cDNA）と同時に

PCR 反応を行った。測定サンプルの corticotrophin releasing factor binding

protein (CRFBP)、CRH、CRH receptor (CRHR)１、CRHR２、GAPDH、GR、

mineralocorticoid receptor （MR）、N-methyl D-aspartate receptor subtype 2B

（NR2B）、NTS、NTSR1、NTSR2、urocortin (Ucn)、Ucn2 の相対濃度は、標準サン

プルから作成した標準曲線を用いて計算し、CRFBP、CRH、CRHR１、CRHR２、

GR、MR、NR2B、NTS、NTSR1、NTSR2、Ucn、Ucn2 の相対濃度を GAPDH の相対

濃度で除して割合を計算した。各々の遺伝子のプライマーの塩基配列を表１に示

した。

遺伝子名 塩基配列

CRFBP Forward primer 5’-CCTGCATGGCCTTCAGTT-3’

Reverse primer 5’-AGCAGCTCCACAAAGTCTCC-3’

CRH Forward primer 5’-ACAGAAGTCCCGCTGCTC-3’

Reverse primer 5’-AACACGCGGAAAAAGTTAGC-3’

CRHR1 Forward primer 5’-CGTCCTGGGGTATACACTGAC-3’

Reverse primer 5’-TGCGGACAATGTTGAAGAGA-3’

CRHR2 Forward primer 5’-TCATCCTCGTGCTCCTCAT-3’

Reverse primer 5’-TTCCTGTACTGGATGGTCTCG-3’

GAPDH Forward primer 5’-AGCTGGTCATCAATGGGAAA-3’

Reverse primer 5’-ATTTGATGTTAGCGGGATCG-3’

GR Forward primer 5’-CTGCTTTGCTCCTGATCTGA-3’

Reverse primer 5’-TTCATAGGATACCTGCAATCTTTG-3’

9

MR Forward primer 5’-GATAGAGGCCAAATTAATCTTTCAA-3’

Reverse primer 5’- CCTTCTGCGTCAGCTTAGGT-3’

NR2B Forward primer 5’-CAGCAAGAAACCCCTGGAC-3’

Reverse primer 5’-AGGTCGCTGAGCTGGCTAT-3’

NTS Forward primer 5’-GCTGACCGTATTCCAACTCC-3’

Reverse primer 5’-CATTGCCATGATCGAGGATA-3’

NTSR1 Forward primer 5’-AAGCAGGCACCCTTCATCT-3’

Reverse primer 5’-GGAGGCTGGATGGTTCTGT-3’

NTSR2 Forward primer 5’-CCTGGTGAGACACAAGGATG-3’

Reverse primer 5’-ACGATGGCTCTGAGAACCTG-3’

Ucn Forward primer 5’-ATCGACCTCACCTTCCACCT-3’

Reverse primer 5’-TCGAATATGATGCGGTTCTG-3’

Ucn2 Forward primer 5’-CAGCTTCCTGGAGCAACTCT-3’

Reverse primer 5’-GACATCCAGGGAGAGTATGACA-3’

表１ 定量 RT-PCR に使用したプライー配列

9. NTSR1 プロモーター領域メチル化解析

MS と AFR のゲノム DNA を DNeasy Blood & Tissue キット(Qiagen)を用いて、扁

桃体から抽出した。MethylCollectorTM Ultra キット(Active Motif, Carlsbad, CA)を

用いて CpG メチル化 DNA 切片を濃縮した。本キットはメチル化 CpG アイランド・リ

カバリーアッセイ法に基づいており、MBD2b/MBD3L1 複合体がメチル化 DNA へ

高親和性であることを利用している。NTSR1 のプロモーター領域に Bfa I (New

England Biolabs, Ipswich, MA)の認識部位が存在するため、ゲノム DNA を Bfa I を

用いて断片化した。MBD2b/MBD3L1 蛋白 DNA 複合体を、その断片化された

DNA に加えて CpG メチル化 DNA を結合させた。この蛋白 DNA 複合体をニッケル

コーティングの電磁ビーズに結合させて、次の洗浄工程で、メチル化が少ない

DNA 断片を取り除いた（非結合断片、unbound fragment, UF）。メチル化 DNA 断

片はプロテインキナーゼ K を用いて磁性ビーズから抽出した（eluted fragment,

EF）。UF と EF は MinElute PCR purification kit（Qiagen）を用いて精製した。

NTSR1 のプロモーター領域を含む CpG アイランド内にある 3 片の DNA 断片（フラ

グメント A、B、C）を標的にして、PCR プライマーを作成した。各々のフラグメントは、

転写開始 ATG コドンを 0 として、-969 から-674（フラグメント A）、-673 から-283（フ

ラグメント B）、-273 から+263（フラグメント C）の位置にある。定量 PCR は SYBR

GreenER qPCR SuperMix for ABI PRISM（Invitrogen）を用いて、ABI PRISM 7600

Sequence Detection System（Applied Biosystems, Foster, CA）にて行った。全て

10

のサンプルは三重測定した。各々のフラグメントのメチル化の程度を表す、エンリッ

チメント（％）を以下の式にて計算した：エンリッチメント（%） = 2CT (UF) – CT (EF)/(1 + 2CT

(UF) – CT (EF)) x 100。PCR の条件は、50℃2 分と 95℃10 分の後、95℃15 秒と 60℃1

分を 40 サイクルとした。各々のフラグメントのプライマーの塩基配列は表２に示し

た。

遺伝子名 塩基配列

フラグメント A Forward primer 5’-CCGAGCCAGCTGTACAAAG-3’

Reverse primer 5’-GGCAGCACAATCTTCTCCTT-3’

フラグメント B Forward primer 5’-CAAGCAGAAGAGGGAGAACG-3’

Reverse primer 5’-TGCTACGGACCTCCAGATTC-3’

フラグメント C Forward primer 5’-AGAAGAGTGGATCCCTGAGC-3’

Reverse primer 5’-TATGCTGCTTTGTCCTGCAC-3’

表２ NTSR1 プロモーター領域メチル化解析に使用したプライマー配列

10. 脳内局所注入法

ペントバルビタール・ナトリウム（40 mg/kg, i.p.）の麻酔下で無菌的操作法にて行

った。Bregma と lambda を水平になるように、ラットの頭部を脳定位固定装置に固

定し、通常飼育したラットの両側扁桃体（扁桃体中心核）に 26 ゲイジのガイドカニ

ューラ（Plastics One, Roanoke, VA）を挿入した。カニューラの先端を、bregma から

2.5 mm 後方、正中から両側に 4.7 mm、頭骨表面から 7.2 mm 腹側になるように調

整した。術後は、ダミー針をガイドカニューラに挿入して、一匹飼いとし 10 – 12 日

の回復期間を置いた。回復期間に 4 回のハンドリングを実施した。NTSR1 の選択

的アゴニストである PD149163 は NIMH Chemical Synthesis and Drug Supply

Program（Washington D.C.）と SRI International（Menlo Park, California）から譲渡

された。SR48692 は Tocris Biosciens（Bristol, UK）から購入した。PD149163 は

0.9%の生理食塩水に 1 mM の濃度で溶解したものを原液として、SR48692 は

DMSO に 1 mM の濃度で溶解したものを原液として、各々-20℃で保存した。恐怖

条件付けの 24 時間後に、ラットの扁桃体両側に、カニューラから 0.5 ul /片側の投

与量で、生理食塩水、DMSO、PD149163（10, 100, 1000 ul）、SR48692（10, 100,

1000 nM）のいずれかを投与した。ダミーカニューラを抜去した後に、ガイドカニュ

ーラの先端から 1 mm 突出するように調整した 33 ゲイジのステンレス製のカニュー

ラを用いて、両側同時に 30 秒かけて、薬剤を注入した。各々のカニューラはポリエ

チレンチューブによって、100 ul のシリンジに接続され、1 ul/分の量で注入した。薬

物注入後、薬剤が十分に浸透するようにカニューラを 1 分間留置した。薬剤注入

10 分後、同一の箱にフットショックを負荷せず 5 分間暴露（１回目暴露）し、すくみ

11

行動を評価した。24 時間後、再度、同一のラットを同一の箱に 5 分間暴露（２回目

暴露）した。薬液量の 0.5 ul は過去の論文を元にした 29。NTS の免疫反応を示す

神経が扁桃体の中心核に存在するため 30、カニューラの先端部は扁桃体中心核

に位置するように調整したが、注入する 0.5 ul という薬液量は扁桃体の中心核以

外にも影響を与える可能性があるため 31、薬剤は扁桃体全体に行き渡ると考えた。

第 2 回目の暴露後、過去の報告と同様の方法でカニューラ先端部の位置を確認

した 29。カニューラ先端部の位置が適切なサンプルのみデーター解析に使用した。

11. 統計解析

全てのデーターは SPSS Statistics version 21 (SPSS, Chicago, IL)を用いて解析

した。Unpaired t-test、１元配置分散分析もしくは反復２元配置分散分析を用いて

解析し、事後検定は Tukey’s post hoc 法を用いた。全ての解析において、p <

0.05 を有意水準とし、データーは平均値 ± 標準誤差で表記した。

12

IV 実験結果

１．MS の HPA 系、体重、非条件付け行動に対する影響

MS が終了した生後 14 日目の体重は、MS 群と AFR 群で有意差はなかった。ま

た、生後 70 日目までの体重は、反復 2 元配置分散分析の結果、2 群間で、群間

の主効果、交互作用ともに有意差は存在しなかった（図 1A）。MS の HPA 系の異

常の有無を DEX/CRH テストを用いて検討した（図 1B）。反復 2 元配置分散分析

の結果、群間（F(1, 84) = 5.389, p < 0.05）と時間（F(7, 84) = 15.75, p < 0.001）の主効

果に有意差が存在したが、群と時間の交互作用に有意差は存在しなかった。CRH

の投与後、コルチコステロンの濃度は AFR 群と比較して MS 群では有意に上昇し

ており、AUC も上昇していた（MS: 14650 ± 2584; AFR: 8032 ± 1372; p < 0.05）。

Tukey 法による多重比較では、20 時の MS 群のコルチコステロンの濃度が AFR 群

13

と比較して有意に高値であった（p < 0.05）。18 時～19 時半のコルチコステロンの

基礎値は MS 群と AFR 群で有意差がなかった。

オープンフィールド試験と高架式十字迷路試験によって、記憶非依存性の不安

行動を評価した。オープンフィールド試験において（図 1C）、総移動距離と内側領

域滞在時間に有意差はなかった。また、高架式十字迷路試験において（図 1D）総

移動距離と開放アーム侵入回数に有意差はなかった。

２．MS の BrdU 陽性細胞数に対する

影響

MS の BrdU 陽性細胞数への影響

を図２に示した。海馬の顆粒細胞層

（GCL）、門部（hilus）ともに、MS 群、

AFR 群で BrdU 陽性細胞数には有

意差はなかった。

３．MS の CFS に対する影響

図３A は、痛みに関連した行動が

初めて現れたフットショックの強さの最小値を示している。発声、前足挙上、後ろ足

挙上、ジャンプのいずれも MS 群と AFR 群で有意差は認めなかった。このことにより、

2 群間で、フットショックの感受性に変化がないことが示された。次に、記憶に関連

した行動を CFS にて評価した（図３B）。反復２元配置分散分析にて、すくみ行動

（％）の群間（F(1, 19) = 5.25, p < 0.05）、暴露回数（F(1, 19) = 37.17, p < 0.01）の主効

14

果はともに有意差を認めたが、群間と暴露回数の交互作用には有意差は存在し

なかった。

４．MS の扁桃体、海馬における NTS 系の mRNA 発現に対する影響

扁桃体と海馬は恐怖の学習と記憶において中心的な役割を果たす 29,32。過去の

研究にて恐怖記憶のプロセスに重要な役割を果たしていることが分かっている遺

伝子の扁桃体と海馬における発現量への MS の影響を検討した。図４A は、扁桃

体（図左）と海馬（図右）の切除部位を示している。図４B は NTS、NTSR1 と NTSR2

の扁桃体と海馬における mRNA の発現量、図４C は扁桃体と海馬における GR、

15

MR の mRNA 発現量、図４D は扁桃体における CRH、CRHR1、CRHR2、CRFBP、

Ucn、Ucn2、NR2B の mRNA 発現量を示している。MS 群は AFR 群と比較して扁桃

体で NTSR1（p < 0.05）、CRH（p < 0.01）の発現量が有意に低下していたが、扁桃

体におけるその他の遺伝子の発現量に差はなかった。海馬では測定した全ての

mRNA で両群に有意な変化はなかった。

５．CFS の扁桃体における NTS 系、CRH 系 mRNA 発現に対する影響

CFS によって NTS 系遺伝子（NTS、NTSR1、NTSR2）発現が変化するかどうかを

検討するために、恐怖条件付け（フットショック）刺激の 24 時間後に、同一箱 5 分

間に露した際の mRNA の発現量の変化を定量 PCR で解析した（図５A）。これまで

の研究で、扁桃体における CFS との関連が示されている CRH 系遺伝子 33（CRH、

CRHR1、CRHR2、CRFBP）も同時に測定した（図５B）。暴露前（control）、暴露 1

時間後、2 時間後、4 時間後、6 時間後に扁桃体を切り出した。扁桃体の切り出し

方法は結果４と同様である。１元配置分散分析の結果、NTS（p < 0.05）、CRH（p <

0.001）、CRHR11（p < 0.001）で mRNA が有意に上昇していた。NTSR1、NTSR2、

CRHR2、CRFBP には有意な変化はなかった。Tukey 法による多重検定の結果、

NTS、CRH、CRHR いずれのｍRNA も control と比較して 4 時間後が有意に高値を

示した。

16

６．NTSR1 アンタゴニストとアゴニストの扁桃体局所投与の CFS に対する影響

扁桃体における NTSR1 が、CFS において重要な役割を果たしているかどうかを

検討するために、扁桃体に NTSR1 のアンタゴニストとアゴニストを局所注入して

CFS への効果を検討した。SR48692 は NTSR2 と比較して NTSR1 に対して高い親

和性を有しているため 34、NTSR1 アンタゴニストとして使用した。PD149163 は

NTSR2 に対する親和性はなく NTSR1 に選択的に結合するため、NTSR1 アゴニスト

として使用した 35。CFS と薬剤投与の時間を図６A に示した。カニューラの先端の位

置を図６B と６C に示した。薬物投与群と生理食塩水投与群の両方ともに、脳組織

の明らかな損傷はなかった。図６C は、生理食塩水または SR49692（10 nM – 1000

nM）を扁桃体に局所投与した際のすくみ行動（% DMSO 群）を示している。１元配

置分散分析によって、すくみ行動は１回目暴露(F(1, 19) = 5.25, p < 0.05)、２回目暴

露(F(1, 19) = 37.17, p < 0.01)ともに、薬剤投与によって有意な変化を示した。Tukey

17

法による多重比較では、１回目暴露では全ての薬剤投与群で DMSO 群と比較して

有意な変化はなかったが、２回目暴露群では 1000 nM 投与群が DMSO 投与群よ

りすくみ行動が亢進していた（p < 0.05）。図６E は生理食塩水、もしくは PD149163

（10 uM - 1000 uM）を扁

桃体に投与したときのすく

み行動（% 生理食塩水群）

を示している。１元配置分

散分析によって、１回目

暴露では有意な変化はな

かったが、２回目暴露(F(3,

25) = 5.45, p < 0.05)では

有意な変化を認めた。

Tukey 法による多重検定

では、2 回目暴露の 100

uM 投与群が生理食塩水

投与群と比較して、すくみ

行動の有意な減少を認め

た（p < 0.05）。これらの結

果より、NTSR1 アゴニスト

（PD149163）の扁桃体へ

の投与によって、条件付

けられたすくみ行動が減

少して、NTSR1 アンタゴニ

スト（SR48692）の扁桃体

への投与によってすくみ

行動が増強することが示

された。

７．MS の NTSR1 遺伝子

プロモーター領域のメチ

ル化の検討

図 4B で示したように、

MS は成獣期の扁桃体の

NTRS1 mRNA の発現量

を減少させる。このような

18

長期間続く効果は、DNA メチル化などのエピジェネティックな機序によって生じると

こが報告されている 36。よって、我々は、扁桃体の NTSR1 遺伝子のプロモーター領

域のメチル化が MS によって生じるかどうかを検討した。

図７A は NTSR1 遺伝子の略図と CpG アイランドを示した。図７B は NTSR1 のプロ

モーター領域の塩基配列と転写因子（GATA, アクチベータータンパク質 2 (AP2),

特異的タンパク質 1 (SP1), CAAT ボックス, cAMP 応答配列（CRE）,核因子インタ

ーロイキン 6 (NF IL6)）の結合可能部位を示した 37。第 1 エクソンの転写開始配列

ATG（+1）をアスタリスクで示した。NTSR1 遺伝子には、CpG アイランドの特徴を持

つ G+C 豊富な領域が、転写開始配列を含む転写領域から伸びている（64.5%, 700

nt: -648 から+52）。-662 から-470 の間の転写領域に、NTSR1 遺伝子発現を促進

する強い制御領域が存在する。この領域には、TATA や CAAT ボックスといった典

型的な転写因子結合配列は含まれていないが、CRE-like half site と Sp1 結合部

位が存在しており、この部位が NTSR1 発現に対して重要な役割を担っている可能

性がある。フラグメント A、B、C の位置を図７A、B に示した。図７B の下線を引いた

配列はフラグメント A、B、C のプライマーの位置を示している。エンリッチメント（％）

は、各々のフラグメントのメチル化の程度を表している。リアルタイム PCR 解析によ

って、フラグメント B と C のエンリッチメント（％）は、MS 群は AFR 群と比較して有意

に高値であることが示された（unpaired t-test; p < 0.01 と p < 0.05）（図７C）。

19

V 考 察

本研究では、MS を負荷したラットは成獣後、恐怖条件付けされた不安行動が増

強した。また、扁桃体の NTSR1 遺伝子発現が減少し、同遺伝子のプロモーター領

域の DNA メチル化が亢進した。加えて、扁桃体の NTSR1 を薬理学的に遮断する

と恐怖条件付けられた不安行動は増強し、逆に、NTSR1 を刺激すると不安行動は

減弱した。これらの結果から、MS によって扁桃体の NTSR1 遺伝子のプロモーター

領域の DNA メチル化が亢進し、その結果 NTSR1 の発現量が減少して、恐怖条件

付けられた不安行動が増強している可能性が示された。

１．MS を負荷したラットの恐怖条件付け不安行動の増強

MS ラットは AFR ラットと比較して、DEX/CRH テストにて、CRH 投与後のコルチコ

ステロン血中濃度が有意に高値を示した。このことは、ELS によって HPA 系の異常

が長期間にわたって続くという、過去のヒト及び動物実験の結果と一致している12,36,38,39。Meaney らのグループは 36,40、養育行動が不得手な母ラットに育てられた

仔ラットは、成獣後、海馬の GR の発現が低下しており、そのために HPA axis のネ

ガティブ・フィードバック機能低下が生じてストレス脆弱性の原因となっていると報

告している。本研究においては、海馬の GR の mRNA の発現量は MS ラットで低下

していなかった。よって、Meaney らの母親の養育行動に注目した研究と異なり、本

研究の MS ラットは海馬の GR の発現減少以外の要因で HPA axis の異常が生じ

ていると考えられる。MS は体重、高架式十字迷路試験で評価した不安行動、オー

プンフィールド試験で評価した活動量、フットショックによる痛みへの感受性には影

響を与えなかった。一方で、CFS におけるすくみ行動は MS によって増加した。これ

らの結果から、MS を負荷されたラットは成獣後、恐怖条件付けられた不安記憶の

プロセスに障害が生じている可能性が示唆された。恐怖記憶想起後には、恐怖記

憶を維持させる再固定化（reconsolidation）と、逆に恐怖記憶を減弱させる消去

（extinction）の二つの相反する記憶プロセスが誘導されるとされている 41-43。これま

での研究によると、消去もしくは再固定化のどちらに誘導されるかは、再暴露時間

の長さによって決定するとされている。短時間の再暴露の場合は記憶の固定化が

誘導され（再固定化）、一方、長時間の再暴露の場合は新たな記憶が形成されて

元の記憶が書き換えられる（消去）42-49。しかしながら、恐怖記憶が形成されてから

の時間、強さなども、この記憶プロセスに関連しているとされている。本研究での再

暴露時間は 5 分間と短時間であったが、MS によって恐怖記憶の再固定化が促進

20

されたのか、消去が阻害されたのかを判断するには実験結果が不十分であると判

断し、MS によって恐怖条件付け不安行動が増強されるとのみ結論づけた。

２．CFS における不安行動の増強と NTSR1 の関係

発達精神生物学の領域における研究では、環境によって遺伝子発現がリプログ

ラミングされるという報告が存在する。これらの研究で共通して指摘されているのは、

発達段階の環境が遺伝子発現とそれに引き続く機能の変化を引き起こし、その環

境イベントが終了した後の成人になってからも続くということである 6,7,50。我々の結

果では、MS によって、成獣後の扁桃体 NTSR1 の mRNA の発現量低下が生じてい

た。また、フットショック刺激 24 時間後の context への暴露で、NTS の mRNA が増

加していた。加えて、扁桃体の NTSR1 を薬理学的に遮断すると CFS の 2 回目の

暴露時のすくみ行動が増加し、NTSR1 を薬理学的に刺激すると CFS の 2 回目暴

露時のすくみ行動が減少した。これらの結果は、条件付けられた恐怖刺激におけ

る扁桃体の NTSR1 の重要性を示唆している。これまでの報告でも、条件付けフット

ショック超音波発声モデルにおいて、NTSR1 アゴニストの全身投与が抗不安効果

を示す 22 ことや、NTSR1 ノックアウトマウスがコンテクスト恐怖記憶において、すくみ

行動が増加することが示されている 51。我々の NTSR1 アゴニストとアンタゴニストを

用いた扁桃体局所投与実験の結果も、これらの結果と矛盾しない。

NTS とその受容体は痛みの伝達に関連していると言われている 52-56。すなわち、

NTSR1 アゴニストとアンタゴニストの CFS における作用は、恐怖記憶ではなく痛み

伝達を変化させることで生じている可能性がある。この可能性を除外するために、

NTSR1 アゴニストとアンタゴニストは１回目のコンテクストの暴露の前に注入し、恐

怖条件付け時のフットショックによる疼痛閾値に影響を与えないようにした。よって、

本研究の局所注入実験における結果は、疼痛閾値やその他の恐怖記憶獲得時

に関連した非特異的な要因の影響ではない。`本研究では、PD149163（NTSR1 ア

ゴニスト）を pmol 単位で投与した（10 – 1000 pmol）。これは、過去の PD141９63 を

脳内に投与した研究と同程度の量である 53,54。一方、SR48692（NTSR1 アンタゴニ

スト）の投与量は fmol 単位とした（10 – 1000 fmol）。高用量だと SR48692 はアゴニ

スト作用を有するためであり 57,58、同用量もまた、過去の研究と同程度の量である53,59-61。本研究では扁桃体の CRH の mRNA が MS ラットで有意に減少していた。

扁桃体の CRH 機能の低下は CFS によるすくみ行動などの不安行動の減少と関連

しているとされていることから 33,62,63、本研究の扁桃体の CRH mRNA の減少は MS

による不安行動の増強の原因ではないと考えた。

３．MS の恐怖条件付けられた不安行動の増強と NTSR1 遺伝子のメチル化の関係

21

本研究では、MS の扁桃体の NTSR1 遺伝子プロモーター領域のメチル化につい

て検討した。フラグメント B と C の DNA メチル化は MS 群で有意に高値を示してい

た。フラグメント B は転写開始配列から 673-283 bp 上流に位置しており、NTSR1

遺伝子の発現を促進する強い制御領域を含んでいる。CpG ジヌクレオチド、特に、

5’プロモーター領域のメチル化の亢進は、一般的に遺伝子発現の減少を引き起

こすと言われている 64。よって、本結果から、MS ラットの NTSR1 遺伝子プロモータ

ー領域のメチル化の亢進が、NTSR1 mRNA の発現の低下を引き起こしていると考

えられる。一方で、翻訳領域のメチル化亢進の機能は明確にされておらず、MS ラ

ットのフラグメント C のメチル化の亢進がどのような意味を持つかは明らかでない。

要約すると、MS を負荷されたラットは成獣後、恐怖条件付けられた不安行動の亢

進を認め、これは、扁桃体の NTSR1 遺伝子のプロモーター領域のメチル化の亢進

によって生じている可能性が考えられる。

近年、ELS によって引き起こされた DNA のメチル化が、精神障害の発症・進行に

関連している可能性が指摘されている 11,12。さらには、ヒトを対象とした臨床研究に

おいて、ELS は心的外傷後ストレス障害や恐怖症の発症を促進すると報告されて

いる 65-69。心的外傷後ストレス障害や恐怖症は、恐怖記憶のプロセスの異常が重

要な役割を果たしているとされており 13,70,71、本研究の結果から、扁桃体の NTSR1

遺伝子のプロモーター領域のメチル化が、心的外傷後ストレス障害や恐怖症への

脆弱性と関連している可能性が示唆された。

４．本研究の限界

本研究では、MS によって生じている扁桃体の NTSR1 mRNA の発現低下と恐怖

記憶のプロセスの障害との関連が、因果関係があるのか相関しているだけなのか

を明らかにはしていない。この点が本研究の重大な限界である。このことを証明す

るためには、例えば、MS ラットの扁桃体の NTSR1 遺伝子を過剰発現させて、MS ラ

ットの条件付けられた恐怖記憶の増強が改善することを確認する必要がある。本

研究では NTSR1 の mRNA の発現量の変化しか結果に示さなかった。本来であれ

ば、MS ラットの扁桃体の NTSR1 蛋白の発現量減少を確認する方が望ましいため、

ウェスタンブロットと免疫染色を試みたが、技術的な問題もあり成功しなかった。ま

た、恐怖記憶のプロセスには様々な遺伝子が関連していると報告されている。本研

究では、過去に恐怖記憶のプロセスに関連がある報告されているもののうち、NTS

系遺伝子 15,22,23、CRH 系遺伝子 33,62,63、GR72-75、MR76,77、NR2B78,79 の mRNA の発

現を扁桃体・海馬で測定したが、今回測定した以外の遺伝子が恐怖記憶のプロセ

スに関連している可能性がある。恐怖条件付けモデルでは、再暴露の直前に薬剤

を投与した際に効果が出ることが多いため 15、本研究では１回目暴露の直前に

22

NTSR1 アゴニストとアンタゴニストを投与した。しかしながら、NTSR1 の CFS への効

果を検討するために、恐怖条件付けの前や、条件付けの前と１回目暴露の前の両

方などに薬剤を投与する実験も将来的に必要と考える。

23

VI 総括および結論

本研究では、MS によって扁桃体の NTSR1 遺伝子のプロモーター領域にエピジ

ェネティックな変化が生じ、成獣後の恐怖条件付け記憶の増強を引き起こしている

可能性があることを示した。これは、扁桃体の NTSR1 遺伝子のプロモーター領域

の DNA のメチル化の変化が、恐怖条件付け記憶と関連していることを示した初め

ての研究である。しかしながら、本研究では、エピジェネティックな変化が相関して

いるだけなのか、因果関係があるのかについては証明することができていない。

ELS は、成人後の不安障害やうつ病発症・進行の脆弱性に重要な役割を担って

いるとされている。本研究の結果から、扁桃体の NTSR1 遺伝子を操作することによ

って、これらの疾病から回復する可能性が示唆された。この仮説を証明するために

は、MS ラットの扁桃体の NTSR１遺伝子を過剰発現することによって、MS によって

増強された恐怖条件付け不安記憶の増強から回復するかどうかを確認する必要

がある。

24

VI 謝 辞

本研究を遂行し学位論文をまとめるに当たり、多くのご支援とご指導を賜りまし

た、指導教官である久住一郎教授、具体的に親身にご指導いただきました中川伸

講師、研究の初期の段階から研究の大部分の期間を御指導下さった小山司名誉

教授に深く感謝いたします。また、本論文をご精読いただき有用なコメントをいただ

きました神経薬理学分野吉岡充弘教授と神経生物学分野神谷温之教授に心より

感謝致します。

研究に行き詰まった時に貴重なご助言をいただいた井上猛准教授、研究を通

じて日々活発に議論して頂いた Albert Einstein 大学博士研究員朴秀賢氏、そし

て、独立行政法人産業技術総合研究所北海道センター・生物プロセス研究部門

加藤亜紀子さんには、本研究において、実験準備から動物飼育、実験補助、デー

ター解析等多種多様なご協力をいただき、感謝の言葉もありません。さらには、研

究の実施に際して暖かく見守っていただいた精神医学分野のみなさまに心から感

謝申し上げます。

25

VII 引用文献

1. Gluckman, P.D., Hanson, M.A., Cooper, C. & Thornburg, K.L. Effect of in

utero and early-life conditions on adult health and disease. N. Engl. J.

Med. 359, 61-73 (2008).

2. Wise, L.A., Zierler, S., Krieger, N. & Harlow, B.L. Adult onset of major

depressive disorder in relation to early life violent victimisation: a

case-control study. Lancet 358, 881-887 (2001).

3. Caspi, A., et al. Influence of life stress on depression: moderation by a

polymorphism in the 5-HTT gene. Science 301, 386-389 (2003).

4. Kalinichev, M., Easterling, K.W., Plotsky, P.M. & Holtzman, S.G.

Long-lasting changes in stress-induced corticosterone response and

anxiety-like behaviors as a consequence of neonatal maternal separation

in Long-Evans rats. Pharmacol. Biochem. Behav. 73, 131-140 (2002).

5. Meaney, M.J., Szyf, M. & Seckl, J.R. Epigenetic mechanisms of perinatal

programming of hypothalamic-pituitary-adrenal function and health.

Trends Mol. Med. 13, 269-277 (2007).

6. Kawano, K., et al. Prior neonatal isolation reduces induction of NGF

mRNA and decreases GDNF mRNA in the hippocampus of juvenile and

adult rodents subjected to immobilization stress. Synapse 62, 259-267

(2008).

7. Erabi, K., et al. Neonatal isolation changes the expression of IGF-IR and

IGFBP-2 in the hippocampus in response to adulthood restraint stress. Int.

J. Neuropsychopharmacol. 10, 369-381 (2007).

8. Imanaka, A., Morinobu, S., Toki, S. & Yamawaki, S. Importance of early

environment in the development of post-traumatic stress disorder-like

behaviors. Behav. Brain Res. 173, 129-137 (2006).

9. Jirtle, R.L. & Skinner, M.K. Environmental epigenomics and disease

susceptibility. Nat Rev Genet 8, 253-262 (2007).

10. Zhang, T.Y. & Meaney, M.J. Epigenetics and the environmental regulation

of the genome and its function. Annu. Rev. Psychol. 61, 439-466,

C431-433 (2010).

11. Murgatroyd, C., et al. Dynamic DNA methylation programs persistent

26

adverse effects of early-life stress. Nat. Neurosci. 12, 1559-1566 (2009).

12. McGowan, P.O., et al. Epigenetic regulation of the glucocorticoid

receptor in human brain associates with childhood abuse. Nat. Neurosci.

12, 342-348 (2009).

13. Cuthbert, B.N., et al. The psychophysiology of anxiety disorder: fear

memory imagery. Psychophysiology 40, 407-422 (2003).

14. Ressler, K.J. & Mayberg, H.S. Targeting abnormal neural circuits in mood

and anxiety disorders: from the laboratory to the clinic. Nat. Neurosci. 10,

1116-1124 (2007).

15. Inoue, T., Kitaichi, Y. & Koyama, T. SSRIs and conditioned fear. Prog.

Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry 35, 1810-1819 (2011).

16. Inoue, T., Koyama, T. & Yamashita, I. Effect of conditioned fear stress on

serotonin metabolism in the rat brain. Pharmacol. Biochem. Behav. 44,

371-374 (1993).

17. Stevenson, C.W., Spicer, C.H., Mason, R. & Marsden, C.A. Early life

programming of fear conditioning and extinction in adult male rats. Behav.

Brain Res. (2009).

18. Matsumoto, M., et al. Early postnatal stress alters the extinction of

context-dependent conditioned fear in adult rats. Pharmacol. Biochem.

Behav. 89, 247-252 (2008).

19. Inoue, T., et al. [DNA microarray study on the mechanism of anxiolytic

action of selective serotonin reuptake inhibitors (SSRIs)]. Annual Report

of Pharmacopsychiatry Research 38, 23-27 (2006).

20. Binder, E.B., Kinkead, B., Owens, M.J. & Nemeroff, C.B. Neurotensin and

dopamine interactions. Pharmacol. Rev. 53, 453-486 (2001).

21. Alexander, M.J. & Leeman, S.E. Widespread expression in adult rat

forebrain of mRNA encoding high-affinity neurotensin receptor. J. Comp.

Neurol. 402, 475-500 (1998).

22. Prus, A.J., Hillhouse, T.M. & Lacrosse, A.L. Acute, but not repeated,

administration of the neurotensin NTS1 receptor agonist PD149163

decreases conditioned footshock-induced ultrasonic vocalizations in rats.

Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry 49, 78-84 (2014).

23. Shilling, P.D. & Feifel, D. The neurotensin-1 receptor agonist PD149163

blocks fear-potentiated startle. Pharmacol. Biochem. Behav. 90, 748-752

(2008).

27

24. Plotsky, P.M. & Meaney, M.J. Early, postnatal experience alters

hypothalamic corticotropin-releasing factor (CRF) mRNA, median

eminence CRF content and stress-induced release in adult rats. Brain Res.

Mol. Brain Res. 18, 195-200 (1993).

25. Hatzinger, M., et al. Combined dexamethasone/CRH test in rats:

hypothalamo-pituitary-adrenocortical system alterations in aging.

Neuroendocrinology 64, 349-356 (1996).

26. Treit, D., Menard, J. & Royan, C. Anxiogenic stimuli in the elevated

plus-maze. Pharmacol. Biochem. Behav. 44, 463-469 (1993).

27. Carter, R.B. Differentiating analgesic and non-analgesic drug activities on

rat hot plate: effect of behavioral endpoint. Pain 47, 211-220 (1991).

28. Hashimoto, S., Inoue, T. & Koyama, T. Serotonin reuptake inhibitors

reduce conditioned fear stress-induced freezing behavior in rats.

Psychopharmacology (Berl.) 123, 182-186 (1996).

29. Inoue, T., et al. Selective serotonin reuptake inhibitor reduces

conditioned fear through its effect in the amygdala. Eur. J. Pharmacol. 497,

311-316 (2004).

30. Kahn, D., et al. Neurotensin neurons in the rat hypothalamus: an

immunocytochemical study. Endocrinology 107, 47-54 (1980).

31. Wilensky, A.E., Schafe, G.E. & LeDoux, J.E. The amygdala modulates

memory consolidation of fear-motivated inhibitory avoidance learning but

not classical fear conditioning. J. Neurosci. 20, 7059-7066 (2000).

32. Li, X., et al. 5-HT1A receptor agonist affects fear conditioning through

stimulations of the postsynaptic 5-HT1A receptors in the hippocampus

and amygdala. Eur. J. Pharmacol. 532, 74-80 (2006).

33. Kolber, B.J., et al. Central amygdala glucocorticoid receptor action

promotes fear-associated CRH activation and conditioning. Proc. Natl.

Acad. Sci. U. S. A. 105, 12004-12009 (2008).

34. Gully, D., et al. Biochemical and pharmacological profile of a potent and

selective nonpeptide antagonist of the neurotensin receptor. Proc. Natl.

Acad. Sci. U. S. A. 90, 65-69 (1993).

35. Petrie, K.A., et al. The neurotensin agonist PD149163 increases Fos

expression in the prefrontal cortex of the rat. Neuropsychopharmacology

29, 1878-1888 (2004).

36. Weaver, I.C., et al. Epigenetic programming by maternal behavior. Nat.

28

Neurosci. 7, 847-854 (2004).

37. Maeno, H., et al. Cloning and characterization of the rat neurotensin

receptor gene promoter. Brain Res. Mol. Brain Res. 40, 97-104 (1996).

38. Aisa, B., et al. Neonatal stress affects vulnerability of cholinergic neurons

and cognition in the rat: Involvement of the HPA axis.

Psychoneuroendocrinology (2009).

39. Rao, U., et al. Effects of early and recent adverse experiences on adrenal

response to psychosocial stress in depressed adolescents. Biol. Psychiatry

64, 521-526 (2008).

40. Weaver, I.C., et al. Reversal of maternal programming of stress responses

in adult offspring through methyl supplementation: altering epigenetic

marking later in life. J. Neurosci. 25, 11045-11054 (2005).

41. Nader, K., Schafe, G.E. & Le Doux, J.E. Fear memories require protein

synthesis in the amygdala for reconsolidation after retrieval. Nature 406,

722-726 (2000).

42. Myers, K.M. & Davis, M. Behavioral and neural analysis of extinction.

Neuron 36, 567-584 (2002).

43. Suzuki, A., et al. Memory reconsolidation and extinction have distinct

temporal and biochemical signatures. J. Neurosci. 24, 4787-4795 (2004).

44. Vianna, M.R., et al. Retrieval of memory for fear-motivated training

initiates extinction requiring protein synthesis in the rat hippocampus.

Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98, 12251-12254 (2001).

45. Quirk, G.J. & Mueller, D. Neural mechanisms of extinction learning and

retrieval. Neuropsychopharmacology 33, 56-72 (2008).

46. Maren, S. Seeking a spotless mind: extinction, deconsolidation, and

erasure of fear memory. Neuron 70, 830-845 (2011).

47. Parsons, R.G. & Ressler, K.J. Implications of memory modulation for

post-traumatic stress and fear disorders. Nat. Neurosci. 16, 146-153

(2013).

48. Sara, S.J. Retrieval and reconsolidation: toward a neurobiology of

remembering. Learn. Mem. 7, 73-84 (2000).

49. Eisenberg, M., Kobilo, T., Berman, D.E. & Dudai, Y. Stability of retrieved

memory: inverse correlation with trace dominance. Science 301,

1102-1104 (2003).

50. Suri, D., et al. Early stress evokes age-dependent biphasic changes in

29

hippocampal neurogenesis, BDNF expression, and cognition. Biol.

Psychiatry 73, 658-666 (2013).

51. Yamada, D., et al. Lack of neurotensin type 1 receptor facilitates

contextual fear memory depending on the memory strength. Pharmacol.

Biochem. Behav. (2010).

52. Clineschmidt, B.V., McGuffin, J.C. & Bunting, P.B. Neurotensin:

antinocisponsive action in rodents. Eur. J. Pharmacol. 54, 129-139 (1979).

53. Buhler, A.V., Choi, J., Proudfit, H.K. & Gebhart, G.F. Neurotensin

activation of the NTR1 on spinally-projecting serotonergic neurons in the

rostral ventromedial medulla is antinociceptive. Pain 114, 285-294 (2005).

54. Buhler, A.V., Proudfit, H.K. & Gebhart, G.F. Neurotensin-produced

antinociception in the rostral ventromedial medulla is partially mediated by

spinal cord norepinephrine. Pain 135, 280-290 (2008).

55. Roussy, G., et al. Evidence for a role of NTS2 receptors in the modulation

of tonic pain sensitivity. Mol Pain 5, 38 (2009).

56. Roussy, G., et al. Spinal NTS1 receptors regulate nociceptive signaling in

a rat formalin tonic pain model. J. Neurochem. 105, 1100-1114 (2008).

57. Yamada, M., Lombet, A., Forgez, P. & Rostene, W. Distinct functional

characteristics of levocabastine sensitive rat neurotensin NT2 receptor

expressed in Chinese hamster ovary cells. Life Sci. 62, PL 375-380

(1998).

58. Sarret, P., et al. Pharmacology and functional properties of NTS2

neurotensin receptors in cerebellar granule cells. J. Biol. Chem. 277,

36233-36243 (2002).

59. Laszlo, K., et al. The role of neurotensin in positive reinforcement in the

rat central nucleus of amygdala. Behav. Brain Res. 208, 430-435 (2010).

60. Laszlo, K., et al. Effects of neurotensin in amygdaloid spatial learning

mechanisms. Behav. Brain Res. 210, 280-283 (2010).

61. Laszlo, K., et al. The role of neurotensin in passive avoidance learning in

the rat central nucleus of amygdala. Behav. Brain Res. 226, 597-600

(2012).

62. Kalin, N.H., Takahashi, L.K. & Chen, F.L. Restraint stress increases

corticotropin-releasing hormone mRNA content in the amygdala and

paraventricular nucleus. Brain Res. 656, 182-186 (1994).

63. Lee, Y. & Davis, M. Role of the hippocampus, the bed nucleus of the stria

30

terminalis, and the amygdala in the excitatory effect of

corticotropin-releasing hormone on the acoustic startle reflex. J. Neurosci.

17, 6434-6446 (1997).

64. Rakyan, V.K., Preis, J., Morgan, H.D. & Whitelaw, E. The marks,

mechanisms and memory of epigenetic states in mammals. Biochem. J. 356,

1-10 (2001).

65. Lang, A.J., et al. Direct and indirect links between childhood maltreatment,

posttraumatic stress disorder, and women's health. Behav. Med. 33,

125-135 (2008).

66. Cougle, J.R., et al. Examining the unique relationships between anxiety

disorders and childhood physical and sexual abuse in the National

Comorbidity Survey-Replication. Psychiatry Res. 177, 150-155 (2010).

67. Brewin, C.R., Andrews, B. & Valentine, J.D. Meta-analysis of risk factors

for posttraumatic stress disorder in trauma-exposed adults. J. Consult.

Clin. Psychol. 68, 748-766 (2000).

68. Nishith, P., Mechanic, M.B. & Resick, P.A. Prior interpersonal trauma: the

contribution to current PTSD symptoms in female rape victims. J. Abnorm.

Psychol. 109, 20-25 (2000).

69. Classen, C.C., Palesh, O.G. & Aggarwal, R. Sexual revictimization: a

review of the empirical literature. Trauma Violence Abuse 6, 103-129

(2005).

70. Bentz, D., Michael, T., de Quervain, D.J. & Wilhelm, F.H. Enhancing

exposure therapy for anxiety disorders with glucocorticoids: from basic

mechanisms of emotional learning to clinical applications. J. Anxiety

Disord. 24, 223-230 (2010).

71. Yamamoto, S., et al. Single prolonged stress: toward an animal model of

posttraumatic stress disorder. Depress. Anxiety 26, 1110-1117 (2009).

72. Maddox, S.A., Schafe, G.E. & Ressler, K.J. Exploring epigenetic

regulation of fear memory and biomarkers associated with post-traumatic

stress disorder. Front Psychiatry 4, 62 (2013).

73. Wilber, A.A., Southwood, C.J. & Wellman, C.L. Brief neonatal maternal

separation alters extinction of conditioned fear and corticolimbic

glucocorticoid and NMDA receptor expression in adult rats. Dev.

Neurobiol. 69, 73-87 (2009).

74. Gourley, S.L., Kedves, A.T., Olausson, P. & Taylor, J.R. A history of

31

corticosterone exposure regulates fear extinction and cortical NR2B,

GluR2/3, and BDNF. Neuropsychopharmacology 34, 707-716 (2009).

75. Cai, W.H., et al. Postreactivation glucocorticoids impair recall of

established fear memory. J. Neurosci. 26, 9560-9566 (2006).

76. Korte, S.M. Corticosteroids in relation to fear, anxiety and

psychopathology. Neurosci. Biobehav. Rev. 25, 117-142 (2001).

77. Oitzl, M.S., Champagne, D.L., van der Veen, R. & de Kloet, E.R. Brain

development under stress: Hypotheses of glucocorticoid actions revisited.

Neurosci. Biobehav. Rev. (2009).

78. Wang, S.H., de Oliveira Alvares, L. & Nader, K. Cellular and systems

mechanisms of memory strength as a constraint on auditory fear

reconsolidation. Nat. Neurosci. 12, 905-912 (2009).

79. Fujita, Y., et al. Vorinostat, a histone deacetylase inhibitor, facilitates

fear extinction and enhances expression of the hippocampal

NR2B-containing NMDA receptor gene. J. Psychiatr. Res. 46, 635-643

(2012).