traduction des arnm maternels d’ovocytes bovins …
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LYNE MASSICOTTE
TRADUCTION DES ARNM MATERNELS D’OVOCYTES BOVINS IMPLIQUÉS DANS LE
DÉVELOPPEMENT EMBRYONNAIRE
Thèse présentée à la Faculté des études supérieures de l’Université Laval
dans le cadre du programme de doctorat en sciences animales pour l’obtention du grade de Philosophiae Doctor (Ph. D.)
DÉPARTEMENT DES SCIENCES ANIMALES FACULTÉ DE L’AGRICULTURE ET DE L’ALIMENTATION
UNIVERSITÉ LAVAL QUÉBEC
2006 © Lyne Massicotte, 2006
i
Résumé Durant sa croissance, l’ovule entrepose des organelles, des protéines et des ARNm dits
maternels qui permettront de supporter les premières étapes du développement
embryonnaire dans le but primordial d’activer le génome embryonnaire. Un ovocyte
capable de supporter cette étape est dit compétent au développement embryonnaire.
Le premier objectif avait pour but de déterminer des populations d’embryons ayant
différents niveaux de compétence au développement. Le développement d’une nouvelle
approche, la triple sélection consiste à utiliser en même temps deux caractères reliés à
l’ovule tels que la taille d’origine de son follicule et la morphologie de son complexe
cumulus-ovocyte, et un caractère relié à l’embryon, soit le temps du premier clivage. Les
différentes populations générées par la sélection permettront ainsi la recherche des facteurs
de compétence au développement.
Le deuxième objectif avait pour but de connaître le protéome traduit de la traduction des
ARNm maternels lors du développement embryonnaire, ainsi que de connaître les besoins
constants en protéines de l’embryon, mais également de l’ovocyte, soit les protéines
"housekeeping" maternels. Cette expérience a démontré clairement que suite à la reprise de
la méiose (Coenen et al., 2004) et ensuite de la fécondation, la traduction des ARNm
maternels présente un continuum d’évènements qui mène à l’activation du génome
embryonnaire. Malgré un réservoir commun d’ARNm, les besoins lors de la maturation de
l’ovocyte et lors du développement de l’embryon sont loin d’être les mêmes. Seulement
une cinquantaine de protéines sont communément traduites lors de ces deux évènements
cellulaires. Onze de ces protéines ont été identifiées : les protéines de choc thermique 71 et
70, la cyclophiline A (2 fois), la glutathione-S-transférase mu 5, la protéine épithéliale liant
les acides gras, la 2,3-biphosglycérate mutase, la sous-unité epsilon TCP-1 de la
chaperonine, l’ubiquitine carboxyl-terminal hydrolase isozyme L1, l’enzyme conjuguant
l’ubiquitine E2D3 et l’isoforme alpha et gamma de l’actine.
Le troisième objectif avait pour but de déterminer des facteurs de compétence au niveau de
l’embryon à 2-cellules basé sur les populations observées lors de la triple sélection. Nous
ii avons compris la traduction des ARNm maternels dans les embryons incompétents au
développement. Ces derniers présentent une traduction basale des ARNm maternels, tandis
que les plus compétents présentent bon nombre de protéines exclusives qui représentent des
facteurs de compétence potentiels. Afin d’identifier ces facteurs de compétence, nous avons
pu observer que les protéines traduites lors du développement embryonnaire ne sont que
transitoires, observation supportée également par la seconde expérience. Les protéines ne
s’accumulent pas dans le cytoplasme rendant ainsi leur identification très difficile. Malgré
tout, six protéines ont été identifiées: la thiolase cytosolique, l’isocitrate déshydrogénase, la
peroxiredoxine 6, la sous-unité alpha du proteasome-6 et la thiamine triphosphatase. Deux
protéines « housekeeping » d’origine maternelle découvertes durant l’expérience
précédente sont également moins présentes dans les embryons non compétents.
De ces expériences de protéomique a découlé une nouvelle méthode de confirmation de
l’identification des protéines, la confirmation in silico. Le génome et le protéome de Bos
taurus étant limité, l’identification de nos protéines a souvent été faite soit chez d’autres
espèces ou uniquement à partir de fragments d’ADN des banques de EST de Bos taurus.
Cette méthode permet donc de reconstruire le messager bovin, d’en traduire la protéine
bovine, d’identifier le patron peptidique théorique et de le comparer à nos résultats de
séquençage, augmentant ainsi le recouvrement de notre protéine.
En conclusion, la protéomique de la compétence au développement de l’ovocyte bovin a
permis l’identification de candidats qui comparativement à la génomique sont plus
restreints. Une nouvelle méthode a découlé de ces expériences. La confirmation in silico
permet maintenant la confirmation des protéines identifiées sans utilisation de matériel
supplémentaire.
iii
Abstract During the growth and the maturation of the oocyte, organelles, proteins and mRNA known
as maternal are stockpiled in order to prepare and supply material to the developing embryo
in the main goal to activate the embryonic genome. An oocyte that is able to supply to this
step is called developmental competent.
The objective of the first experiment was to determine an embryos population with
different level of developmental competence. The triple selection lies in two characters
related to the oocyte, which are the follicular size and the morphology of the COC and one
is related to the embryo, which is the time of first cleavage post insemination. The different
population generated by this selection has provided a population highly competent to
development and a population lacking developmental competence that will be useful for the
study of developmental competence.
The objective of the second experiment was the study of the proteomic of the translated
maternal mRNA during the early embryo development. We wanted to know which proteins
play the role of maternal housekeeping proteins during oocyte maturation and early embryo
development. This experiment has clearly demonstrated that when the oocyte resume
meiosis (Coenen et al., 2004) and after fertilization, the translated protein pattern follows a
continuum events which conducts embryo to his activation. Although they are supply by
the same reservoir of mRNA, the needs of the oocyte and the embryo are different. Only
about fifty proteins are commonly translated during oocyte maturation and early
development. Eleven of them have been identified: HSC71; HSP70; CypA (2 times); UCH-
L1; GSTM5; Cct5; E-FABP; 2,3-BPGM, ubiquitin-conjugating enzyme E2D3; and β-
actin/γ-actin.
The third experiment consists of the discovery of factors related to developmental
competence. Three populations from the triple selection with high, low and developmental
competence was compared by a proteomic study. This study has shown that developmental
incompetent embryos translate a minimum of maternal mRNA, which the majority is the
embryo housekeeping found in the previous study. Whereas high and low developmental
iv competent embryos present shared and exclusive translated proteins, these proteins
represent potential factors related to developmental competence. By trying to identify these
proteins, we have found that most translated proteins are transient and are not accumulated
in the cytoplasm. In spite of this observation, we have identified six proteins: cytosolic
thiolase, isocitrate dehydrogenase 1, peroxiredoxin 6, proteasome-α6, hypothetical protein
My027 and thiamine triphosphatase. Two maternal housekeeping proteins were also
missing for the incompetent 2-cell embryos: UCH-L1 and CypA.
From these experiments, a new method of protein identification confirmation, called in
silico confirmation, was developed. As the genome and the proteome of Bos taurus is
limited, the protein identification was made in foreign species or from Bos taurus EST
databases. This method as made possible to rebuilt the bos taurus messager, to translate the
bovine protein, find his theoretical peptide mass fingerprint and compare it to the
experimental spectrum and thus increase the number of matched peptides.
In conclusion, the proteomic study on the developmental competence of the bovine oocyte
has identified of a reduce number of candidates compared to genomic studies. A new
method has been developed during this work. The in silico confirmation allowed the
confirmation of protein identification without additional material.
v
Avant-propos Après tant d’années aux études graduées, il y a tellement de monde qui m’ont aidée.
Certaines sont parties et d’autres sont entrées. Mais tous resteront à jamais dans ma
mémoire.
Premièrement, mon directeur Marc-André Sirard. Marc-André, tu es une frégate qui vogue
toujours à une vitesse fulgurante vers des mers agitées. Il est difficile de suivre ton sillage.
À mainte reprise je t’ai perdu de vue. Par chance, nous nous sommes rencontrés à quelques
reprises à ton port d’attache. Avec les années, l’expérience acquise à te suivre sur le bon
bateau que tu m’avais fourni au départ de mon odyssée, j’ai décidé de suivre ma voie et
faire mes propres expériences. J’espère que dans l’avenir nos routes se croiseront dans les
ports du monde où l’on pourra prendre le temps d’échanger à nouveau. Je te remets le
bateau que tu m’avais fourni et en voici le journal de bord.
Le bateau que tu m’avais fourni avait un équipage exceptionnel, toujours fidèle au poste.
La plus importante, Karine Coenen. Nous avons essuyé des tempêtes que nous avons
matées haut la main. Mais resteront toujours dans ma mémoire les moments d’accalmies où
nous avons profité de la beauté de la mer. Karine, tu as trouvé un magnifique coin de pays
où tu écoules maintenant des moments paisibles. Je garderai toujours dans mon itinéraire
une halte pour te revoir. Merci énormément pour tout. Il y a également Isabelle Dufort et
tous les étudiants de Marc-André. Vous êtes tous géniaux et je vous remercie pour vos
conseils et votre amitié. Merci à Susan Novak qui a su rendre les cartes des nouveaux
territoires que j’avais dessinées plus compréhensibles. Bonne route sur vos chemins
respectifs!
Il y a également le port du Département des Sciences Animales. Du village de mes débuts,
beaucoup sont partis dans les terres. Vous méritez votre repos. Mission accomplie! Une
relève est arrivée et poursuit votre travail avec rigueur et fidélité. Merci à tous et continuer
votre travail.
vi Il y a également le port du Centre de recherche en biologie de la reproduction. Des gens de
très grande valeur. Vous n’avez pas votre pareil. Je remercie chaque professeur, car pas un
ne m’a pas aidé à un moment ou un autre de mes travaux. Je remercie également leurs
étudiants avec qui j’ai passé de très bons moments. Bonne route à tous!
Le plus important dans cette aventure, est mon très cher Mathieu. Tu es mon nord, mon
sud, mon est et mon ouest. Je ne peux imaginer ma route sans toi. Nous avons bâti notre
propre navire. Je le sens solide, stable et confortable, car après les tempêtes que nous avons
essuyées ensemble, la cale est toujours restée sèche. Nous avons tenu la barre ensemble et
nous en sommes sortis plus forts que jamais. Nous avons maintenant un petit “Lou” de mer
qui grandit notre joie. Oui, tu as raison, prenons soins de nous maintenant.
Un tout dernier merci très spécial à ma famille. Je vous aime, tout simplement.
À ma Famille
viii
Table des matières Résumé.....................................................................................................................................i Abstract................................................................................................................................. iii Avant-propos ..........................................................................................................................v Table des matières .............................................................................................................. viii Liste des tableaux...................................................................................................................xi Liste des figures ................................................................................................................... xii Liste des abréviations...........................................................................................................xiv CHAPITRE I ..............................................................................................................................1 INTRODUCTION ........................................................................................................................1
La production d’un ovule....................................................................................................2 Le développement prénatal .............................................................................................2 Le développement post-natal ..........................................................................................4
Cycle oestral ...............................................................................................................5 La folliculogénèse.......................................................................................................6
Croissance folliculaire ............................................................................................6 L’activation des follicules primordiaux..................................................................6 Croissance folliculaire préantrale ...........................................................................7 Les vagues folliculaires ..........................................................................................9 L’atrésie folliculaire..............................................................................................10
La croissance de l’ovocyte........................................................................................12 La maturation nucléaire et reprise de la méiose ...................................................12 La maturation cytoplasmique................................................................................14
La fécondation ..................................................................................................................14 Le développement embryonnaire......................................................................................15
Le début du développement embryonnaire chez le bovin ............................................15 Le début de l’activité transcriptionnelle dans l’embryon .............................................16 Les facteurs maternels impliqués dans le développement embryonnaire jusqu’à la transition maternel-embryonnaire.................................................................................17
Le contrôle de l’expression des gènes et des protéines dans l’ovocyte et l’embryon avant la transition maternel-embryonnaire.................................................................................19
La synthèse des ARNm.................................................................................................19 L’entreposage................................................................................................................20 La polyadénylation .......................................................................................................21 La régulation de la traduction .......................................................................................22 La dégradation des protéines et l’ubiquitine.................................................................24
La compétence au développement ....................................................................................26 Critère de sélection de la compétence...........................................................................28
L'ovocyte...................................................................................................................28 L'embryon .................................................................................................................30
Les marqueurs de compétence......................................................................................32 Objectifs............................................................................................................................35 Tableaux............................................................................................................................37
CHAPITRE II ...........................................................................................................................46
ix A SELECTION PROCEDURE FOR COMPETENT BOVINE EMBRYOS PRODUCED BY IN VITRO MATURATION, FERTILIZATION AND CULTURE OF OOCYTES FROM SLAUGHTERHOUSE OVARIES..............................................................................................................................................46
Résumé..............................................................................................................................47 Abstract.............................................................................................................................48 Introduction.......................................................................................................................49 Materials and methods ......................................................................................................52
Oocytes Recovery .........................................................................................................52 In vitro production (IVP) ..............................................................................................52
TCM system..............................................................................................................52 Modified SOF (mSOF) system.................................................................................53 In vitro Fertilization (IVF)........................................................................................53
Experiment 1: Chronology............................................................................................54 Experiment 2: Triple Selection .....................................................................................55 Statistical Analysis........................................................................................................56
Results...............................................................................................................................57 Experiment 1.................................................................................................................57 Experiment 2.................................................................................................................57 Experiment 3.................................................................................................................59
Discussion.........................................................................................................................60 Acknowledgement ............................................................................................................65 Tables................................................................................................................................66
CHAPITRE III..........................................................................................................................71 MATERNAL HOUSEKEEPING PROTEINS PRESENT IN IMMATURE OOCYTES AND TRANSLATED FROM MATERNAL MRNA TRHOUGHOUT BOVINE OOCYTE MATURATION AND EARLY EMBRYO DEVELOPMENT BEFORE THE MATERNAL-EMBRYONIC TRANSITION.........................................71
Résumé..............................................................................................................................72 Abstract.............................................................................................................................73 Introduction.......................................................................................................................74 Materials and Methods......................................................................................................76
In vitro embryo production (IVP).................................................................................76 Radiolabeling of oocytes and embryos.........................................................................77 2-Dimensional electrophoresis (2DE) ..........................................................................78 Proteome analysis .........................................................................................................78 Protein identification and confirmation ........................................................................79 MALDI-TOF and MS/MS............................................................................................79 In Silico protein confirmation.......................................................................................80
Results...............................................................................................................................81 Discussion.........................................................................................................................83 Acknowledgement ............................................................................................................90 Tables................................................................................................................................91 Figures ..............................................................................................................................94
CHAPITRE IV .........................................................................................................................99 PROTEOMIC STUDY AND IDENTIFICATION OF PROTEIN SYNTHESIZED BY 2-CELL IN VITRO PRODUCED BOVINE EMBRYOS OF VARYING DEVELOPMENTAL COMPETENCE ..........................99
Résumé............................................................................................................................100
x
Abstract...........................................................................................................................101 Introduction.....................................................................................................................102 Materials and Methods....................................................................................................104
Oocyte and embryo selection and in vitro culture ......................................................104 Identification of proteins associated with developmental competence ......................104
Radiolabelling of 2-celled embryos for detection of newly synthesized proteins..104 Identification of the proteins associated with developmental competence.............106
Results.............................................................................................................................109 Discussion.......................................................................................................................111 Acknowledgement ..........................................................................................................116 Tables..............................................................................................................................117 Figures ............................................................................................................................119
DISCUSSION GÉNÉRALE........................................................................................................125 Bibliographie ......................................................................................................................132
xi
Liste des tableaux
Tableau 1 Ensemble des différentes étapes de la croissance de l’ovocyte à partir du follicule primordial au repos jusqu’à l’ovulation. (Tiré et adapté de Hyttel et al., 1997) 37
Tableau 2 Blastocyst rate produced by the triple selection based on follicles size, cumulus-oocytes complexe morphology (COC) and time of cleavage in co-cultured TCM-199 – FCS in vitro production system ................................................................66
Tableau 3 Blastocyst rate produced by the triple selection based on follicles size, cumulus-oocytes complexe morphology (COC) and time of cleavage in co-cultured SOF–BSA in vitro production system ..........................................................................67
Tableau 4 Comparison of the cell number (cell number ± SEM) of total, innner cell mass (ICM) and trophectoderm (TE) and the ratio of ICM on total cell number in blastocysts who have reached between 64 and 128 cells or more than 128 cells in TCM system and mSOF system ...................................................................................68
Tableau 5 Identification of potential maternal housekeeping proteins synthesized throughout maturation and early embryonic development by MALDI-TOF or LC-MS/MS. Observed molecular mass (kDa) is based on 2DE migration, and theoretical values (pI/kDa) are calculated from amino acid sequences..........................................91
Tableau 6 In silico confirmation of identified proteins from foreign species with complete or partial construction of the Bos taurus protein sequence from the Bos taurus EST database. The number of peptides matched and the coverage rate for each protein is compared between the actual MALDI-TOF or MS/MS analysis and those obtained in silico with the new Bos taurus protein sequence from the Bos taurus EST database are indicated ...................................................................................................92
Tableau 7 Update of public databases of nucleotides, genes and proteins in different species 93
Tableau 8 Identification by Q-TOF of five spots related to developmental competence. Observed molecular mass (kDa) are based on 2DE migration, and theoretical values (pI/kDa) are calculated from the amino acid sequence...............................................117
xii
Liste des figures
Figure 1 La morphologie et le temps de la méiose (a) ainsi que le cycle cellulaire du développement embryonnaire (b) suivant la fécondation chez l’embryon bovin. GP : globule polaire. PN : pronoyau. ....................................................................................43
Figure 2 Schéma explicatif des sections concernant A) l’entreposage des ARNm maternels, B) la polyadénylation des ARNm qui ont été entreposés et finalement C) la régulation de la traduction des ARNm maternels. Cette figure a été tirée et adapté de l’article Mendez and Richter, 2001...............................................................................45
Figure 3 Progression of cleavage rate according to the main started groups between 32 to 42hpi as presumptive bovine zygotes had reached 2-cell or ≥3-cell stage in the TCM (a) or mSOF (b) system. The production of ≥3- cell embryos was higher (P<0.01) in the MSOF system compared to the TCM system. Data are presented as means ± SD...................................................................................................................69
Figure 4 The chronology of time of cleavage versus developmental competence. As both IVP systems were not significantly different according to their respective general blastocyst rate, the selected blastocyst rates from TCM and MSOF systems were pooled according to timing of cleavage to the bovine 2-cell or ≥3-cell stage between 32 and 42hpi. Data are presented as means ± SD. Letters a, b and c, d represent differences (P < 0.06) in 2-cell and ≥3-cell stage embryos, respectively. Superscripts (*) represent differences (P < 0.06) between 2-cell and ≥3-cell stage embryos within the same hpi determined by a student t-test. .................................................................70
Figure 5 Scheme of labeling experiment described in materials and methods. ..............94
Figure 6 Seven steps for in silico identification confirmation of a protein identified by MALDI-TOF from species other than bos taurus. This process can be used to identified post-translational modified peptides and discriminate different isoforms. The first five steps serve to reconstitute the unknown Bos taurus mRNA and protein starting with the mRNA of the identified proteins. Step 6 and 7 is the comparison of the in silico tryptic digestion of the newly reconstituted Bos taurus protein with the experimental MALDI-TOF peptide mass fingerprint (PMF). If new specific Bos taurus peptides are matched, the identification is confirmed. The given websites are useful tools that have been used in this process............................................................95
Figure 7 Number of proteins translated from maternal mRNA during embryo development at the 2-cell, 4-cell and 8-cell stages, for a total of 291, 373 and 252 proteins respectively. The number of proteins shared by two or three developmental stages is shown in circle intersections. The numbers outside of these intersections are proteins expressed only during that particular developmental stage. ...........................96
Figure 8 2DE gels illustrating proteins that are translated from maternal mRNA during early embryo development. A) at the 2-cell stage between 36-40 hpi, B) at the 4-cell
xiii
stage between 45-49 hpi and C) at the 8-cell stage between 60-64 hpi. Panel C’) is based on 8-cell stage gels and the 123 spots represent the proteins that are expressed throughout these three stages of development. The numbered proteins are the 11 identified spots found in Tableau 5...............................................................................97
Figure 9 A) Averaged gel of oocytes in MII stage between 24-28 h of in vitro maturation. The encircled spots represent the proteins that are commonly expressed throughout oocyte maturation (n=92). The 46 arrowed proteins represent the proteins that are commonly expressed during oocyte maturation and embryo development up to and including the 8-cell stage. The black and white arrows represent the proteins that are respectively found or not in the immature oocytes CBB gel. B) Micropreparative CBB gel of 3000 GV stage bovine oocytes. The 32 encircled proteins are the maternal housekeeping proteins; they are present at the germinal vesicle stage (GV) and are translated up to the 8-cell stage. The numbered proteins have been sent for mass spectrometry analysis. The black arrowed proteins have been identified and the numbers correspond to those found in Tableau 1 .........................................................98
Figure 10 Labelling protocol of different origin 2-cell embryos of high (HDC) and low (LDC) developmental competence between 36-40hpi, and uncompetent (NDC) late cleaving 2-cell embryos between 45-49hpi. EA: early atretic, H: healthy. ...............119
Figure 11 Average gel of each treatment a) HDC b) LDC and c) NDC. Encircled spots represent the protein spots that will be compared between treatment groups to find proteins associated with developmental competence. ................................................120
Figure 12 Number of proteins translated from maternal mRNA shared or unique to the three 2-cell embryos showing high, low and none developmental competence, HDC, LDC and NDC, respectively. Proteins unique to the HDC and shared with LDC are potentially implicated in developmental competence.................................................121
Figure 13 The numbered spots represent proteins that are exclusively present in HDC treatment (circle) and as well shared with LDC treatment (rectangle). Theses proteins are absent from the treatment NDC. They represent potential proteins implicated in the developmental competence.........................................................................................122
Figure 14 Tracking labelled proteins (a) on a silver stained protein pattern (b) of 500 cleaved embryos at 40hpi. The encircled proteins in each gel represent their homologues and are possibly usable for sequence analysis. In gel (a) shows the numbered proteins exclusively from HDC (circle) and as well shared with LDC treatment (rectangle). ..................................................................................................123
Figure 15 Colloidal blue (a) and silver (a) stained proteins patterns of the same gel made from two thousand cleaved embryos at 40hpi. In both gels, numbered proteins are exclusively from HDC (circle) or as well shared with LDC treatment (rectangle). Spots points out with a black arrow have been sent for identification by mass spectrometry analysis..................................................................................................124
xiv
Liste des abréviations AMH Hormone anti Müllerian ANOVA Analysis of variance/analyse de la variance BSA Bovine serum albumin/albumine de sérum bovin BMP15 Bone morphogenetic protein 15 Ca2+, Mg2+ Calcium, magnesium CCTε Chaperonin containing TCP-1 epsilon subunit CL Corps lutéal CO2 Carbon dioxide COC Cumulus-oocyte complex/complexe cumulus-ovocyte cAMP Cyclic adenosine monophosphate cGMP Cyclic guanosine monophosphate CT Acetyl-CoA transferase like protein (thiolase) cytosolic CypA Cyclophilin A DNA Acide deoxyribonucleic E2 Estradiol E2D3 Ubiquitin-conjugating enzyme E2D3 EDTA ethylenediaminetetraacetic acid E-FABP Epidermal Fatty acid-binding protein EST Expressed sequence taq FCS Fetal calf serum/sérum de veau fœtal FD Dominant follicle/Follicule dominant FGF Fibroblastic growth factor FD Dominant follicle/Follicule dominant FS Subordinated follicle/Follicule subordonné FSH Follicle stimulating hormone/hormone folliculostimulante GDF-9 Growth and differentiation factor 9 GnRH Gonadolibérine GV Germinal vesicle/vésicule germinale GVBD Germinal vesicle Breakdown/Bris de la vésicule germinale h Hour(s)/heure hpi Hour(s) post-insemination/heure après la fécondation Hepes 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid hnRNA Heterogeneous nuclear RNA HSC71 Heat shock cognate 71kDa HSP70 Heat shock protein 70 Hsf1 Heat-shock factor-1 GSTM5 Glutathione-S-transférase mu 5 ICM Inner cells mass/ masse de cellules internes IDH1 Isocitrate dehydrogenase NADP+-dependent cytosolic IGF Insuline growth factor IU International unit/unité international IVM/ IVF/IVC In vitro maturation / in vitro fertilization / in vitro culture
xv kDa Kilo daltons KGF Keratinocyte growth factor LH Luteinizing hormone/hormone luténéisante MALDI-TOF Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight spectrometry MAS Meiosis-activating stérol MS/MS Tandem mass spectrometry MI, MII Metaphase I, metaphase II ml, μl, l Milliliter, microliter, liter mM, μM, M Millimolar, micromolar, Molar mg, μg, ng, g Milligram, microgram, nanogram, gram mm, μm, nm, m Millimeter, micrometer, nanometer, meter MPF M-phase promoting factor / maturation promoting factor mRNA Messenger RNA/ARN messager My027 Hypothetical protein My027 n Number of observations/nombre d’observations NOBOX Newborn ovary homeobox-encoding gene P Probability/probabilité P4 Progestérone PBS Phosphate buffered saline PGC Primordial germ cell/ cellules germinales primordiales pH Hydrogen potential pI Isoelectric point/point isoélectrique PRDX6 Peroxiredoxin 6 PSMA6 Proteasome subunit alpha type 6 RNA Ribonucleic acid TCM-199 Tissue culture medium-199 TE Trophectoderm cell/Cellule du trophectoderme THTPA Thiamine triphosphatase TLH Hepes buffered tyrode`s medium UCH-L1 Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L1 v:v Volume:volume w/v Weight/volume ZAR1 Zygotic arrest 1 °C Degree celsius % Percentage 1DE One dimension electrophoresis 2DE Two dimension electrophoresis 2,3-BPGM 2,3-bisphosphoglycerate mutase
1
CHAPITRE I
INTRODUCTION L’ovule est considéré comme une cellule immortelle, car c’est une cellule qui présente un
cycle palingénésique d’une génération à l’autre. Effectivement, suite à la fécondation,
l’ovocyte devient finalement l’ovule, un gamète haploïde. Cependant, un autre processus
est déjà enclenché: le développement embryonnaire. Suite à la fécondation, les premières
cellules de l’embryon sont totipotentes. Cette totipotence se perd très rapidement lors de la
différenciation cellulaire embryonnaire. Toutefois, très tôt dans le développement
embryonnaire, une lignée de cellules germinales est formée. Ces cellules germinales se
multiplient par mitose et débuteront leur méiose pour former un nouveau pool d’ovocytes
qui entreront en repos. Lorsque l’ovocyte sortira de son repos, il continuera sa croissance
afin de devenir prêt à être fécondé et à supporter les premières étapes du développement
embryonnaire, et ainsi de suite.
L’espèce étudiée dans cette étude est le bovin, dont le nom latin est Bos taurus. Cette revue
de littérature se concentrera premièrement sur les recherches effectuées chez le bovin à
moins que des informations acquises chez d’autres mammifères, tel que chez la souris (Mus
musculus), viennent ajouter des connaissances au modèle de la croissance et du
développement de l’ovule. Cette section portera sur les différentes étapes de la production
d’un ovule en commençant par la formation des ovules à partir des cellules germinales au
niveau du développement embryonnaire. La deuxième partie de cette section portera sur
leur croissance afin de produire un ovocyte prêt à l’ovulation et à supporter les premières
étapes du développement embryonnaire, mieux connu comme la compétence au
développement.
2
La production d’un ovule
Le développement prénatal La lignée de cellules germinales commence lors de l’apparition des cellules germinales
primordiales (PGC). Les PGC sont de très grosses cellules rondes avec beaucoup de
ribosomes libres et un très gros noyau. Les PGC possèdent une très haute activité
phosphatase alcaline, ce qui permet de les distinguer des cellules somatiques (Eddy, 1984).
Chez les mammifères, avant l’apparition des marqueurs cellulaires des PGC, la présence
des cellules potentielles des PGC peut être déduite par l’étude du potentiel de la
différenciation cellulaire. Chez la souris, jusqu’au stade de 8-cellules, les blastomères sont
totipotents. Les premières différenciations cellulaires apparaissent entre le stade 8 et le
stade 16 cellules. Il y a les cellules externes et internes qui deviendront respectivement les
cellules du trophectoderme (TE) et de la masse cellulaire interne (ICM). Chez le bovin,
c’est au stade de 32 cellules que se produit cette différentiation (Van Soom, et al., 1997a).
Au stade de blastocyste, seulement l’ICM conserve le pouvoir de produire des PGC. Chez
la souris, au stade E4.5, c’est-à-dire 4.5 jour après la fécondation, si une cellule de
l’épiblaste est transplantée dans un blastocyste (E3.5), elle possède toujours la capacité de
se développer en cellules germinales ou somatiques. Toujours chez la souris, au stade E7,
les PGC sont identifiées pour la première fois dans l’endoderme du sac vitellin, à la racine
de l’allantoïde dans la partie postérieure de la ligne primitive (Ginsburg, et al., 1990). Chez
la souris, comme chez les autres mammifères, les PGC sont donc d’origines
extragonadiques et même extra-embryonnaires (Magre and Vigier, 2001).
Lorsque toutes les PGC se sont regroupées dans l’allantoïde au jour E7.5, elles se divisent
en deux populations qui vont migrer respectivement vers la crête génitale droite ou gauche
(Chicoine, 1954). Les PGC migrent par une combinaison de mouvements amiboïdes et de
transfert passif par les tissus environnants (Zamboni and Merchant, 1973).
Outre le terme PGC, le mot gonia peut être utilisé pour les cellules germinales
indifférenciées qui peuvent se diviser par mitose (Byskov, 1981). Lorsque les gonades
3 deviennent morphologiquement identifiables, les cellules germinales femelles sont appelées
ovogonies (Byskov, 1981). Et finalement, quand les cellules germinales entrent en méiose,
le terme ovocyte est utilisé.
Chez le bovin, les PGC ou gonias arrivent au niveau de la crête génitale qu’au 30e jour de
la gestation. Au 57e jour, les PGC arrêtent de se déplacer et des ponts intercellulaires se
créent entre elles afin de synchroniser leurs divisions mitotiques. Cette période de division
se produit entre les jours 62 et 82 de la gestation. À ce stade, il y a un mélange de deux
types d’ovogonies. Une partie des ovogonies sont en mitose et les autres attendent en
interphase afin de fournir davantage d’ovogonies. Au 82e jour de gestation, lorsque la
production d’ovogonies est complétée, les premières méioses sont observées et elles
deviennent ainsi des ovocytes (Russe, 1983).
Selon les espèces, le début de la méiose commence à différents moments du dévelopement
ovarien. Il en existe deux groupes. Le premier groupe, appelé "méiose immédiate", est
caractérisé pour avoir les premières ovogonies qui entrent en prophase méiotique presque
simultanément ou très peu de temps après que les cordes testiculaires se soient formées
chez leur homologue mâle du même âge (souris et homme). Le deuxième groupe, appelé
"méiose retardée" entre en méiose après la différentiation sexuelle (mouton, porc, lapin et
bovin). Ces deux groupes diffèrent également dans la distribution des ovogonies. Dans les
premiers groupes, les ovogonies sont distribuées uniformément dans les gonades, tandis
que dans le deuxième groupe, elles sont entourées de cordons cellulaires distincts qui sont à
leur tour, enveloppés légèrement de tissu mésenchymateux durant la période précédent la
méiose.
Le début de la méiose, autant que la formation et la croissance folliculaire, commencent
toujours au centre de l’ovaire. Des études ont montré que la première ovogonie à entrer en
méiose, est la première qui entre en contact avec les cellules du rete dérivées du
mésonéphros. Ces dernières cellules sont essentielles pour générer la méiose. Il n’existe
qu’une petite fenêtre où elles ont ce pouvoir car, ensuite, elles inhibent la méiose. Les
cellules provenant du rete dérivées du mésonéphros deviennent les cellules de la granulosa
(Byskov, 1981). Chez le bovin, la méiose fœtale arrête vers la 90e journée de gestation au
4 stade dictié de la prophase I. L’arrêt de la méiose coïncide avec la formation du follicule
autour de l’ovocyte. Ainsi, la forme dormante de l’ovocyte se retrouve enveloppée dans le
follicule primordial (Erickson, 1966). À partir de ce moment, le noyau de l’ovocyte est
appelé la vésicule germinale (GV). Les follicules primordiaux se retrouvent au niveau du
cortex de l’ovaire. Aux environs du 140e jour de la gestation, les vagues folliculaires
apparaissent (voir section 1.2.2.2.1.3), puisque les premiers follicules primordiaux activés
sont observés.
Il existe un dogme chez les mammifères stipulant que le pool d’ovocytes produit lors du
développement embryonnaire représente le nombre maximal d’ovocytes, et que le pool
diminue par la suite jusqu’à l’épuisement des stocks (Zuckerman, 1951). Ce dogme
explique entre autres la ménopause chez la femme. En 2004, une publication de Johnson et
collaborateurs a ébranlé ce dogme (Johnson, et al., 2004). Cette étude démontrerait la
présence potentielle de cellules souches germinales chez un mammifère, la souris adulte.
Certaines réticences à cette nouvelle découverte ont été publiées par la suite (Gosden, 2004,
Greenfeld and Flaws, 2004), bien qu’ils incitent la communauté scientifique à confirmer ou
infirmer le dogme à l’aide des nouveaux outils technologiques. Toutefois, la même équipe
vient de publier leur nouvelle recherche qui démontre que des cellules souches de la moelle
osseuse seraient capables de produire de nouvelles structures semblables aux ovocytes en
24h (Johnson, et al., 2005). Néanmoins, comme la ménopause est un fait indéniable, il y
aurait une limite à la capacité de ces cellules souches de repeupler l’ovaire.
Le développement post-natal Selon les espèces, les vagues folliculaires débutent bien avant où très tôt après la naissance,
pourtant un ovule mature ne pourra être produit avant la puberté due à l’immaturité de l’axe
hypothalamo-hypophyso-ovarien (Kinder, et al., 1995). Toutefois, durant la période
prépubère, l’ovocyte acquiert progressivement la capacité à produire un ovocyte apte à
engendrer un embryon suite à la fécondation (Presicce, et al., 1997). Chez la souris, les
premières vagues folliculaires débutent autour de la naissance. Entre la 14e et la 16e
journée, l’ovocyte atteint pour la première fois sa taille maximale, mais les follicules
n’atteignent leur taille maximale qu’à la 20e journée. À partir de la 21e journée, les souris
5 peuvent répondre à des traitements hormonaux. Mais normalement, la première ovulation
ne se produit qu’à 1 mois (Bachvarova, 1985). Chez le bovin, avant le 5e et le 6e mois post-
natal, la compétence au développement est très faible suite à des traitements de
surovulation (Earl, et al., 1998, Majerus, et al., 1999, Salamone, et al., 2001, Camargo, et
al., 2005). Avec l’âge, la taille maximale du follicule dominant (FD) augmente, de même
que celle des follicules subordonnés (FS). L’influence du FD sur ces derniers augmente
également avec l’âge. L’augmentation de la sécrétion des gonadotrophines autour du 5e
mois coïncide avec l’augmentation du diamètre folliculaire de même que du nombre
maximum de follicules à la surface des ovaires (Evans, et al., 1994). Chez le bovin, la
première ovulation se produit autour de 1 an (Evans, et al., 1994).
Cycle oestral Chez la vache, la durée du cycle œstral est de 20 ou 23 jours selon qu’il est constitué de 2
ou 3 vagues folliculaires. Le cycle oestral débute à l'ovulation. Suite à l'ovulation, les
cellules de la thèque et de la granulosa du FD complètent leur transformation en cellules
lutéales et prolifèrent afin de former le corps lutéal (CL). C'est la phase lutéale chez le
bovin. C’est en partie la durée de cette phase qui détermine le nombre de vagues
folliculaires lors d’un cycle oestral (Ginther, et al., 1989, Fortune, 1993). Le CL sécrète de
la P4 et un peu d’œstrogènes afin de diminuer la fréquence des pulses de GnRH, ayant pour
conséquence d’empêcher un pic de LH préovulatoire en réponse à la croissance d’un
nouveau FD, et ainsi empêcher son ovulation (Savio, et al., 1993, Stock and Fortune, 1993).
Une autre fonction de la P4 est la préparation de l’utérus à l’implantation. Le CL persiste
jusqu’au jour 16 ou 18 du cycle selon le nombre de vagues. À ce moment, s’il n’y a pas de
gestation, le CL cesse la sécrétion de P4, c’est le début de la phase folliculaire. La phase
folliculaire est caractérisée par une augmentation du niveau d’œstrogènes, plus
particulièrement de l’E2 produite en grande partie par le FD. Arrivée à un certain seuil,
l’E2 perd son rôle de rétroaction négative sur l’hypophyse et permet à cette dernière de
répondre à nouveau aux pulsations de GnRH. La pulsatilité de la GnRH permet la libération
des gonadotrophines, mais surtout de la LH. Suite à un pic de GnRH, un pic de LH est
produit ainsi qu’un pic de moindre envergure de FSH. En réponse au pic de LH, il y a
6 déclenchement de l’œstrus (≈J20-J23) qui dure entre 12-16h (Déziel, 1996) et l’ovulation
est observée au jour (J0) soit 10 à 15h après la fin de l’œstrus ou 29-31h après le pic de LH
(Driancourt, et al., 2001).
La folliculogénèse
Croissance folliculaire Chez le bovin et l’humain, un follicule prend environ 5 à 6 mois pour passer du follicule
primordial au follicule préovulatoire (Lussier, et al., 1987), comparativement à environ 3
semaines chez la souris (Bachvarova, 1985) et 8 semaines chez le rat (Hirshfield, 1991).
Suite à l’activation du follicule primordial, il a été évalué que 70 jours de croissance sont
nécessaires pour passer au follicule secondaire et 20 jours sont nécessaires pour se rendre
au jeune follicule tertiaire (Russe, 1983, Lussier, et al., 1987). Le temps de croissance du
follicule tertiaire de 1mm à 12mm, soit le follicule préovulatoire, est d'environ 6 jours
(Jaiswal, et al., 2004). Toutefois, selon la durée d'une vague folliculaire, une fois que les
follicules de ≥4mm sont recrutés dans la vague folliculaire, il reste entre 8 et 10 jours aux
follicules pour se rendre à la taille préovulatoire, soit la taille de 18 mm. Il a été longtemps
considéré que seuls les follicules plus grands que 4 mm présentaient une dynamique de
croissance en vague folliculaire. Il a été démontré que les follicules entre 1 et 3 mm
présentent également un patron de croissance en vague. Leur nombre varie inversement aux
follicules de ≥4mm, c’est-à-dire qu’ils sont plus nombreux durant la dominance où il n’y a
que le FD et quelques follicules secondaires et diminue lors du recrutement et de la
sélection (Jaiswal, et al., 2004).
L’activation des follicules primordiaux Depuis sa formation au stade fœtal, le follicule primordial est au repos. Toutefois, à un
moment donné, il quitte le stade de repos et débute sa croissance: c’est l’activation. Le
processus d’activation est malheureusement peu connu. Par contre, plusieurs indices
indiquent que le contrôle est intraovarien car les variations hormonales systémiques
n’affectent pas le niveau d’activation des follicules primordiaux (Peters, et al., 1973). Pour
7 ce qui est de l’activation, des études in vitro ont montré que la FSH et l’activine n’ont
aucun effet.
Plusieurs facteurs de croissance (Nilsson and Skinner, 2001), facteurs de croissance
neurotropique et d’autres neurotrophines (Dissen, et al., 2001) ainsi que l’insuline et
l’hormone anti Müllerienne (AMH) (Durlinger, et al., 1999, Durlinger, et al., 2002) ont été
identifiés comme étant des régulateurs de l’activation des follicules. Effectivement, même
si les souris knock-out pour l’hormone anti Müllerienne montrent une formation normale
de leur pool de follicules, ce pool s’épuise très tôt comparativement aux souris de type
sauvage. Les hétérozygotes, quant à eux, présentent des stades intermédiaires (Durlinger, et
al., 1999). Chez les ruminants, lors d’études in vitro avec de minces couches de cortex
ovarien, les follicules primordiaux entrent en activation spontanément, même en absence de
sérum, ou autres facteurs de croissance ou hormones (Wandji, et al., 1996). Donc, les autres
régions de l’ovaire doivent avoir un effet inhibiteur sur les follicules primordiaux situés
dans le cortex. Chez les rongeurs, la culture d’ovaires entiers étant possible, l’activation
spontanée in vitro n’est pas observée et est similaire aux contrôles in vivo (Eppig and
O'Brien, 1996). Toutefois, leur activation arrête au stade primaire. Ainsi seulement
quelques follicules se rendent au stade secondaire.
Croissance folliculaire préantrale Suite à l’activation du follicule primordiale, les cellules de la granulosa qui entourent
l’ovocyte, passent d’une morphologie aplatie à cubique pour devenir le follicule primaire.
Ensuite, le nombre de cellules et le nombre de couches cellulaires s’accroissent. Le
follicule passe ainsi au stade de follicule secondaire. La principale transformation observée
à ce stade, c’est l’apparition de plaques de zone pellucide (ZP). La ZP est sécrétée
principalement par l’ovocyte créant ainsi une barrière entre lui et les cellules du cumulus
(Shimizu, et al., 1983, Maresh, et al., 1990). Bien qu’ils semblent séparés l’un de l’autre, il
en est tout autrement. Effectivement, les cellules de cumulus conservent des projections
cytoplasmiques au travers de la ZP et ancrent ses projections cytoplasmiques à la surface de
l’ovocyte. Ces structures sont nommées projections transzonales (TZP) (revue par Albertini
and Barrett, 2003). Les TZP forment de larges contacts par jonctions gap et de types
8 adhésions qui sont maintenus lors de l’expansion du follicule. La densité et la structure des
TZP changent au cours de la folliculogénèse. La présence et la variation de ces contacts
entre les cellules de granulosa et l’ovocyte indiquent qu’il y a une communication constante
entre eux. La présence de TZP et la sécrétion de produits locaux solubles consistent en une
action autocrine et paracrine coordonnant l’oogenèse et la folliculogénèse (Gougeon, 1996,
Albertini and Barrett, 2003).
Voici un exemple de stimulation paracrine de l’ovocyte vers les cellules de la granulosa.
Deux protéines de la famille des TGFβ, sont produites dans l’ovule, soit GDF-9 et BMP-15
(ou GDF-9B) (revue par Wu and Matzuk, 2002). Elles sont étroitement impliquées dans la
folliculogenèse. L’ARNm de GDF-9 est présent dans l’ovocyte à partir du follicule
primaire jusqu’à l’ovulation chez la souris, tandis que, chez le bovin, on l’observe dès le
follicule primordial. BMP-15 suit un patron d’expression similaire à GDF-9. Les souris
femelles GDF-9-/- sont infertiles tandis que les souris BMP-15-/- sont sous-fertiles. Les
mâles sont, quant à eux, normaux. Le phénotype des souris femelles GDF-9-/- présente des
ovaires plus petits et le développement folliculaire arrête au stade primaire. Par la suite,
outre les problèmes d’organisation des cellules de granulosa, il n’y a pas de formation de
cellules de la thèque. Toutefois, l’ovocyte croît davantage et plus rapidement. Les souris
femelles BMP-15-/- présentent une histologie ovarienne relativement normale. Toutefois,
lors de traitements de surovulation, des ovocytes plus gros et dénudés sont produits. Des
faibles taux d’ovulation ont également été observés.
Il y a également la protéine NOBOX (newborn ovary homeobox-encoding gene) qui est
spécifique à l’ovocyte. L’ARNm est présent dans l’ovocyte du follicule primordial et tout
au long de la croissance de l’ovocyte (Suzumori, et al., 2002). Les souris Nobox-/- ne
présentent pas d’activation des follicules et perdent rapidement leur stock d’ovocytes. La
protéine NOBOX serait également impliquée dans l’expression des gènes tels que GDF-9
et Oct-4 (Rajkovic, et al., 2004).
Un exemple de sécrétion des cellules de la granulosa vers l’ovocyte est le ligand de kit
(KITL). Il est exprimé par les cellules de la granulosa tandis que son récepteur est exprimé
à la surface de l’ovocyte. Le ligand et son récepteur sont coexprimés à partir du follicule
9 primordial (Manova, et al., 1990, Manova, et al., 1993). Chez la souris, une mutation dans
la région codant pour KITL entraîne l’arrêt de la folliculogenèse au stade primaire, ainsi
que l’arrêt de la croissance de l’ovocyte à 22 µm de diamètre comparativement à 70-80µm
pour les souris sauvages (Bachvarova, 1985).
Les vagues folliculaires La majorité des cycles oestraux (>95%) présentent 2 ou 3 vagues folliculaires (Ginther, et
al., 1989, Adams, 1994). Une vague dure entre 8 à 10 jours. Dans un cycle à deux vagues,
elle débute aux jours 0 et 10. Dans un cycle à trois vagues, elle débute aux jours 0, 9 et 16
(Ginther, et al., 1989). Outre le temps, il y a une autre différence entre les cycles oestraux à
2 et 3 vagues : la présence d’un nombre plus élevé de follicules lors de la vague ovulatoire
que ce soit la 2e ou la 3e vague. Ces deux différences semblent être reliées, car en réduisant
le temps entre les vagues, la période de suppression de la FSH est moins importante et
permettrait la croissance d'un plus grand nombre de follicules (Ginther, et al., 1989).
La vague folliculaire normale se divise en 4 étapes : le recrutement, la sélection, la
dominance et la divergence. Toutefois, lorsqu'une vague folliculaire émerge (≥ 4mm), la
prochaine est en préparation (1-3 mm) (Jaiswal, et al., 2004). La FSH est l'hormone qui
régit les vagues folliculaires. La sécrétion de FSH présente un patron diurne (Jaiswal, et al.,
2004). La sécrétion augmente progressivement durant la journée pour atteindre un
maximum en soirée. La vitesse de croissance des follicules d’une vague folliculaire suit le
même patron de sécrétion que la FSH, mais décalée de 6h. Ainsi la vitesse de croissance
folliculaire est maximale 6h après le pic de FSH journalier (Jaiswal, et al., 2004). Environ
60h avant le début de la vague folliculaire normale (ou pendant la dominance de la vague
précédente) commence la croissance de la prochaine vague folliculaire (Adams, et al.,
1992, Jaiswal, et al., 2004). Le nombre de follicules de 1-3mm augmente. Dès lors, le futur
FD ainsi que le futur premier et le deuxième FS peuvent être distingués parmi la population
de petits follicules. Leur croissance est régie par la sécrétion diurne de FSH qui est trop
faible pour les FS de la vague précédente, mais suffisante pour leur croissance.
10 Le recrutement ou le début de la vague folliculaire (J0) coïncide avec le pic de FSH. Les
FD et FS mesurent entre 4-5 mm. Ils sont dits être FSH-dépendants (Adams, et al., 1992,
Gong, et al., 1995, Gong, et al., 1996). La sélection du FD (J2.5) est caractérisée par la
taille significativement plus grande du FD (8.5 mm) (Ginther, 2000) et une augmentation
de la concentration d’inhibine qui entraîne la diminution de la sécrétion de FSH. La
croissance des FS est ralentie. Le FD ayant augmenté le nombre de ses récepteurs à la LH,
il entre en phase de dominance. Durant environ 2 jours, les FS sont toujours bons et prêts à
remplacer le FD, c’est la phase statique. Le FD sécrète toujours de l’E2 et de l’inhibine afin
d’inhiber la sécrétion de FSH qui entraîne vers le 5e jour l’atrésie (voir section sur L’atrésie
folliculaire) des FS (Adams, et al., 1992, Adams, et al., 1993, Kaipia and Hsueh, 1997).
Selon le moment du cycle œstral, la phase de divergence, impliquera l’atrésie du FD ou
l'ovulation si le cycle est respectivement en phase lutéale ou folliculaire. Dans les deux cas,
la perte du FD engendre une nouvelle vague folliculaire (Adams, et al., 1993).
L’atrésie folliculaire L’atrésie folliculaire réfère à la dégénérescence de tous les follicules qui n’ovuleront pas,
soit plus de 99.9% des follicules. L’atrésie peut survenir à n’importe quel moment de la
croissance folliculaire (Gougeon, 1986), à l’exception du stade final, le corpus luteum.
L’atrésie est le terme utilisé en reproduction pour décrire l’apoptose des cellules du
follicule (Hsueh, et al., 1994). L’atrésie est régulée au niveau endocrinien par la FSH et la
LH, ainsi que par des facteurs paracrines tels que l’IGF-I, le EGF, le bFGF, l’activine et
l’IL-1β. Parmi les facteurs induisant l’atrésie, appelés facteurs atrétogéniques, on retrouve
le TNF-α, la GnRH, les androgènes, l’IL-6 et les radicaux libres (Kaipia and Hsueh, 1997).
L’atrésie est un événement cellulaire actif qui nécessite la transcription de gènes
spécifiques et la traduction de nouveaux facteurs (Svanberg and Billig, 1999). Selon la
littérature, la majorité, sinon la totalité des inhibiteurs d’atrésie sont régulés par la FSH et la
LH (Markström, et al., 2002).
Il existe deux familles de régulateurs intracellulaires de l’apoptose : la famille des caspases
et celle de Bcl-2. Les caspases sont reconnues pour exécuter l’apoptose: dégradation des
11 protéines du cytosquelette et de la membrane nucléaire, ainsi que la digestion de l’ADN.
Les membres de la famille de Bcl-2 sont responsables de la régulation de l’apoptose. La
famille Bcl-2 est constituée d’autant de membres anti (Bcl-2 et Bcl-XL) que pro-apoptose
(Bax, Bid, Bik, BOD et Bcl-XS) (Billing, et al., 2002). Les mitochondries sont cruciales
dans la machinerie apoptotique, car elles renferment des agents pro-apoptotiques
(Cytochrome c, apoptosis-inducing factor (AIF) et plusieurs pro-caspases) qui sont relâchés
dans le cytoplasme suite à un signal spécifique.
Au stade primordial, l’ovocyte semble être le responsable de la dégénérescence folliculaire
(Morita and Tilly, 1999, Reynaud and Driancourt, 2000). Comme facteurs anti-
apoptotiques, il y a l’interaction de Kit avec le ligand de Kit (Driancourt, et al., 2000) et le
facteur GDF-9 (Dong, et al., 1996) qui sont cruciaux pour la survie des ovocytes et des
petits follicules. D’autres facteurs anti-apoptotiques sont produits dans le follicule
préantral, comme le Keratinocyte growth factor (KGF) et le Fibroblast growth factor (FGF)
(McGee, et al., 1999) qui aident également à la croissance et la différentiation. Les
estrogènes (Billing, et al., 2002), le GMPc (McGee, et al., 1997) et la vitamine C (Murray,
et al., 2001) jouent également un rôle anti-apoptotique.
Vers la fin de la croissance du follicule, la réduction du grand nombre de follicules en
croissance pour arriver qu’à un seul follicule ovulatoire est principalement dû à l’apoptose
des cellules de granulosa (Hsueh, et al., 1994, Reynaud and Driancourt, 2000). Après
l’entrée en apoptose des cellules de granulosa et le début de l’invasion des leucocytes suite
au bris de la membrane basale du follicule, le complexe ovocyte et cellules du cumulus
(COC) est un des derniers à être affecté par l’atrésie (Kruip and Dieleman, 1982). À ce
stade, l’ovocyte entre en pseudo-GVBD. Dans ces circonstances, ce phénomène est appelé
pseudomaturation. Ce phénomène serait le résultat de la perte de contact entre les cellules
du cumulus et l’ovocyte. Lors de la vague folliculaire, le début de l’atrésie se produit au
stade tardif de la phase statique et au début de la phase de régression des follicules
(Salamone, et al., 1999).
12 La croissance de l’ovocyte La croissance ovocytaire est un processus complexe au niveau nucléaire et cytoplasmique
qui prépare l’ovocyte à être apte à reprendre la méiose, à être fécondé, ainsi qu’à supporter
le développement embryonnaire et à coordonner l’activation du génome embryonnaire.
L’activation du génome embryonnaire est appelée la transition maternel-embryonnaire
(MET). Tout au long de sa croissance, l’ovocyte est maintenu en arrêt méiotique jusqu’au
pic de LH. Le Tableau 1 résume chaque étape de la croissance de l’ovocyte et du
développement folliculaire.
La maturation nucléaire et reprise de la méiose Comme il a été mentionné dans la section sur le développement prénatal des ovocytes, les
ovocytes sont en arrêt méiotique au stade dictié de la prophase I, soit en phase G2 du cycle
cellulaire. L’ovocyte ne reprendra la méiose soit à la suite du pic de LH (Hyttel, et al.,
1997), par l’atrésie folliculaire (Assey, et al., 1994) ou s’il est retiré du follicule (Pincus and
Enzmann, 1935). La capacité de l’ovocyte à reprendre la méiose est dépendante de sa taille.
Les ovocytes d’une taille inférieure à 90µm sont incapables de reprendre la méiose. Entre
91-100µm, ils entreront en GVBD, mais ne complèteront pas la MI avant d’atteindre
101µm. Seuls les ovocytes de plus de 110µm peuvent se rendre jusqu’en MII (Fair, et al.,
1995). Ce sont en général les follicules de plus de 3mm qui possèdent ces ovocytes.
Le premier signe visible de la reprise de la méiose est l'ondulation et la disparition de la
membrane nucléaire que l'on nomme la rupture de la vésicule germinale (Germinal vesicle
breakdown, GVBD). Il y a ensuite condensation des chromosomes, c'est la métaphase I
(MI). Par la suite, les chromosomes se séparent, c'est l'anaphase I (AI), suivie par la
télophase I (TI). C'est à cette étape que le génome du gamète femelle se réduit à une copie
double de chaque chromosome, car l'autre chromosome est expulsé de l'ovocyte et se
retrouve dans le globule polaire. La deuxième reprise de la méiose (MII) se produira avec
l’arrivée du spermatozoïde lors de la fécondation (voir section 1.3).
Chez le bovin et les animaux domestiques, la reprise de la méiose nécessite la synthèse de
protéines dès les premières heures de la maturation (Sirard, et al., 1989, Kastrop, et al.,
13 1990, Kastrop, et al., 1991a, Kastrop, et al., 1991b) et tout au long de la maturation (Sirard,
et al., 1989, Kastrop, et al., 1991b, Milovanov and Sirard, 1994). L’étude des patrons
protéiques en électrophorèse en 2-dimension (2DE) a permis d’observer les changements
des patrons protéiques lors de la maturation (Coenen, et al., 2004). On distingue trois
patrons protéiques reliés aux différents stades de la méiose soit, aux stades GV (0-4h), la
transition GVBD et MI (4-16 h), ainsi que la transition de MI à l’arrêt en MII (16-28 h).
Ces observations viennent confirmer ce qu’avait été conclu par électrophorèse en 1-
dimension (1DE) (Kastrop, et al., 1990, Gandolfi, et al., 1998).
Au niveau biochimique, la reprise de la méiose est régulée par l’activation du Maturation-
promoting factor (MPF) qui est responsable de l’induction de la GVBD. Ce facteur
entraîne, induit et promeut la progression de la maturation jusqu’au stade MII (Masui,
2001). Le MPF est constitué de deux sous-unités, une catalytique, la p34cdc2, et une
régulatrice, la cycline B1. Bien qu’il existe également la cycline B2, la cycline B1 est la
seule qui soit essentielle à la reprise de la méiose chez le bovin (Brandeis, et al., 1998). La
régulation de l’activation du MPF varie selon les espèces. Chez le bovin, les ARNm de
p34cdc2 et cycline B1 sont présents en grande quantité dans l’ovocyte en GV (Robert, et
al., 2002a). Toutefois, bien que la protéine p34cdc2 soit présente, il y a très peu de protéine
cycline B1 dans l’ovocyte en GV (Levesque and Sirard, 1996, Paradis, et al., 2005,
Tremblay, et al., 2005), d’où l’importance de la traduction lors de la maturation. La
traduction de la cyclin B1 est régulée par la polyadénylation, car l’inhibition de la
polyadénylation inhibe complètement la reprise de la méiose (Traverso, et al., 2005,
Tremblay, et al., 2005). L’injection intracytoplasmique de cycline B1 induirait à elle seule
la reprise de la méiose (Levesque and Sirard, 1996, Traverso, et al., 2005). La protéine
cycline B1 apparaît après 3h de maturation (Levesque and Sirard, 1996). L’activité MPF
lors de la maturation chez le bovin montre un patron biphasique classique. La première
phase d’activité du MPF induit la GVBD et la condensation des chromosomes qui conduit à
la MI entre 6-12h de maturation. Par la suite, une baisse de l’activité du MPF induit la
transition métaphase-anaphase entre 15 et 18h de maturation. Finalement, la deuxième
phase induit l’expulsion du premier globule polaire et la continuité de la maturation
jusqu’en MII entre 18 et 20h de maturation (Wu, et al., 1997).
14 La maturation cytoplasmique La maturation cytoplasmique est un processus qui se déroule durant tout le développement
embryonnaire. L’apparition, la migration, l’augmentation de la taille et du nombre, ainsi
que des changements morphologiques des organelles se produisent durant la croissance de
l’ovocyte (Tableau 1). Plus particulièrement, les granules corticaux apparaissent au stade
du follicule secondaire. Ils se regroupent ensemble et augmentent leur nombre jusqu'à
l’ovulation. Les mitochondries adoptent une morphologie différente des cellules
somatiques. Elles sont rondes ou allongées au début et deviennent rondes avec une vacuole
ouverte sur le cytoplasme vers la fin. Durant la croissance, elles sont plus en périphérie et
suite à l’ovulation, elles se regroupent au centre. Les gouttelettes lipidiques augmentent en
nombre et taille, et suivent le patron de migration des mitochondries.
Suite au pic de LH, l’ovocyte subit des transformations importantes qui représentent la
maturation finale, appelée également la capacitation de l’ovocyte. Les transformations sont
les suivantes. Le nucléole prend la forme d’un anneau avant de disparaître lors de la
GVBD. Une perte de contact entre les cellules du cumulus et l’ovocyte, l’alignement des
granules corticaux sous l’oolemma afin de prévenir la polyspermie suite à la fécondation,
l’association des gouttelettes lipidiques avec les mitochondries et leur migration au centre
de l’ovocyte, la diminution des appareils de Golgi et la redistribution des ribosomes près
des chromosomes (Hyttel, et al., 1997) sont des changements qui se produisent dans les 24h
suivant le pic de LH (Tableau 1). Ces changements cumulatifs indiquent un statut
métabolique moins actif. Cette baisse d’activité métabolique indique que l’ovocyte est mûr
et prêt à être fécondé (Dieleman and Bevers, 1993).
La fécondation La fécondation est un évènement cellulaire qui permet à l’ovoyte se terminer sa méiose et
d’enclencher le développement embryonnaire, elle est donc le pont entre la maturation de
l’ovocyte et développement embryonnaire. Longtemps la contribution paternelle à
l’embryon s’est limitée au matériel génétique. En plus de cette importante contribution, le
15 spermatozoïde apporte des éléments importants pour la structure de l’embryon tel que le
centrosome zygotique ainsi que des molécules et des récepteurs impliqués dans la
fécondation et le développement embryonnaire qui sont ancrés dans la membrane
plasmique et la thèque périnucléaire du spermatozoïde (revue par Sutovsky and Schatten,
2000). La thèque périnucléaire est un élément unique du cytosquellette extranucléaire qui
entoure le noyau du spermatozoïde et qui subit des changements lors du transit
épididymaire (Mujica et al. 2003).
Lors de la fécondation, le spermatozoïde induit l’activation de l’ovocyte et ainsi le début du
développement embryonnaire. L’activation est un processus où le spermatozoïde initie dans
l’ovocyte une oscillation du calcium intracellulaire. Cette oscillation serait causée soit par
une interaction récepteur-ligand du spermatozoïde avec l’oolemma (Swann, et al., 1989,
Jones and Whittingham, 1996) ou l’introduction d’un facteur activateur spermatique dans
l’ooplasme (Parrington, et al., 1996, Sette, et al., 1997, Kimura, et al., 1998). Cette
oscillation suit la libération initiale de calcium qui est le signal pour différents évènements
cellulaires, tels que le relâchement des granules corticaux qui servent à prévenir la
polyspermie, à la reprise finale de la méiose, à la formation des pronoyaux et les divisions
mitotiques embryonnaires subséquentes (Schultz and Kopf, 1995). Suite à la fécondation,
seulement les ovocytes matures pourront répondre au signal d’induction de l’oscillation du
spermatozoïde. L’âge de l’ovocyte en MII déterminera également si l’oscillation de calcium
intracellulaire entraînera le développement embryonnaire normal ou l’apoptose de
l’embryon (Fissore, et al., 2002).
Le développement embryonnaire
Le début du développement embryonnaire chez le bovin Le premier cycle cellulaire présente les quatre phases du cycle cellulaire, soit la phase G1,
S, G2 et M. Il dure entre 24 et 36 h selon les études (Barnes and Eyestone, 1990, Barnes
and First, 1991, Van Soom, et al., 1992, Blondin, et al., 1996, De Sousa, et al., 1998a,
Holm, et al., 1998, Majerus, et al., 2000). C’est le stade de formation des pronoyaux
jusqu’au premier clivage. Le second cycle (2 à 4 cellules), présente seulement une phase S
16 et M (≈12h). Le troisième (4 à 8 cellules) présente une phase S, G2 et M (≈12h) et
finalement le quatrième (8 à 16 cellules) présente à nouveau les quatre phases du cycle (≈
45h) (Barnes and Eyestone, 1990, Holm, et al., 2002) (Figure 1). Par la suite, les cycles
cellulaires sont d’environ 18 et 24h (Holm, et al., 2002). L’embryon à 16-cellules passe à
morulae, morulae compact, à jeune blastocyste, à blastocyste en expansion et finalement au
blastocyste qui éclot.
Le début de l’activité transcriptionnelle dans l’embryon L’ovocyte prépare l’embryon à la transition maternel-embryonnaire. Cette transition est
nécessaire pour permettre le développement subséquent de l’embryon. Trois évènements
moléculaires se produisent lors de la transition. Le premier consiste à détruire les transcrits
spécifiques à l'ovocyte, tels que la protéine liant l'ARN, MSY2 (Yu, et al., 2001) et les
histones H1oo (Tanaka, et al., 2001). Le deuxième consiste à remplacer les transcrits
d'origine maternelle qui sont communs à l'ovocyte et à l'embryon par des transcrits
embryonnaires. Le troisième consiste à promouvoir la reprogrammation du patron
d'expression des gènes par des nouveaux gènes spécifiques à l'embryon (Latham, et al.,
1991). Ce dernier servirait au passage de la cellule différenciée qu'est l'ovocyte à celle de
l'embryon dont les blastomères sont totipotents.
On a longtemps cru que la transcription embryonnaire commençait lors du quatrième cycle
cellulaire soit au stade 8-16 cellules (Camous, et al., 1986, Telford, et al., 1990, De Sousa,
et al., 1998b, Memili and First, 2000). Les premières études d'incorporation d’uridine tritiée
dans des embryons bovins ont démontré son incorporation dans le noyau et le nucléole vers
la fin du stade 8 cellules (Camous, et al., 1986). L’α-amanitine est un inhibiteur de la
transcription, plus particulièrement, il se lie à l’ARN polymérase II, enzyme responsable de
la transcription des ARNm. Lorsque les embryons sont traités avec de l’α-amanitine, il y a
arrêt du développement embryonnaire lors de la MET, soit entre 8-16 cellules (Barnes and
First, 1991). C’est également au stade de 8 cellules qu’apparaît un vrai nucléole (Plante, et
al., 1994, Laurincik, et al., 2000). La transcription de l’ARNr, partie intégrante du
ribosome, est activée également lors du quatrième cycle cellulaire (Hyttel, et al., 2000,
17 Laurincik, et al., 2000). C’est également à ce moment qu’un changement majeur du patron
protéique est observé (Frei, et al., 1989).
Toutefois, la machinerie transcriptionnelle est opérationnelle bien avant le stade de 8-16
cellules. Des périodes d'incubation plus longues à l'uridine tritiée, ont montré une
incorporation aussi tôt que le stade de 1 cellule (Hay-Schmidt, et al., 1997) ainsi que le
stade de 2 cellules (Plante, et al., 1994, Hyttel, et al., 1996, Viuff, et al., 1996). Dès le
premier cycle cellulaire, il a été démontré que lors de la réplication de l'ADN, l'ouverture de
l'ADN permet à la machinerie transcriptionnelle d'accéder à certains promoteurs (Memili
and First, 1999). La présence d'acétylases (McGraw, et al., 2003) permet aussi l'ouverture
de l'ADN en diminuant les interactions histones-ADN. L'utilisation d'un inhibiteur de la
réplication de l'ADN : l’aphidicolin, d’un inhibiteur de déacétylation et du tricostain A, aux
stades 1 et 2 cellules, a montré que certaines protéines y étaient sensibles (Memili and First,
1999). L’utilisation de l’α-amanitine a également montré que les premières protéines à être
sensibles à la transcription embryonnaire apparaissent entre 36 et 48 h après la fécondation,
soit au stade 2-cellules (Barnes and First, 1991, Memili and First, 1999). En conséquence,
une activité transcriptionnelle mineure est détectée avant le stade 8-16 cellules chez
l'embryon bovin.
Les facteurs maternels impliqués dans le développement embryonnaire jusqu’à la transition maternel-embryonnaire Au cours des dernières années, l’utilisation de la génomique a permis l’observation et la
découverte d’un large spectre de gènes impliqués au niveau de la maturation de l’ovocyte
(Dalbies-Tran and Mermillod, 2003) et du développement embryonnaire. Certains sont
uniques à l’ovocyte ou sont présents et entreposés dans l’ovocyte pour une action ultérieure
lors du développement embryonnaire jusqu’à la MET.
La protéine MATER, est une protéine de 125kDa spécifique à l’ovocyte (Tong and Nelson,
1999). Des souris knock-out du gène mater ont un phénotype mâle fertile, mais bien que la
femelle présente un système reproducteur dont la maturation et la fécondation des ovocytes
sont normales, les embryons qui en résultent arrêtent leur développement au stade de 2
18 cellules. Le phénotype est imputé à l’absence d’activation du génome embryonnaire (Tong,
et al., 2000). Le messager apparaît dans les follicules primordiaux activés tandis que la
protéine apparaît dans les follicules primaires. Le messager est présent tout au long de la
maturation et disparaît lors du développement embryonnaire, tandis que la protéine persiste
jusqu’au blastocyste, mais semble diminuer au niveau du blastocyste en expansion. La
protéine est présente au niveau des mitochondries et du nucléole (Tong, et al., 2004). Le
gène mater bovin a été récemment étudié (Pennetier, et al., 2004). Contrairement à la
souris, le messager est observé jusqu’au stade embryonnaire de 5-8 cellules, soit jusqu’à la
MET chez le bovin.
ZAR1, pour zygotic arrest 1, est une autre protéine spécifique à l’ovocyte. Chez la souris,
on retrouve l’ARNm au niveau de l’ovocyte jusqu’à l’embryon de 2 cellules, mais il est
complètement disparu au niveau de l’embryon de 4 cellules. Le phénotype de souris knock-
out présente les mêmes caractéristiques que pour le gène mater. La seule différence est que
les embryons issus de femelles Zar1-/- arrêtent leur développement plus tôt soit
majoritairement au stade zygote. De plus, seulement quelques embryons se rendent à 2
cellules. La protéine ZAR1 est présente uniformément dans le cytoplasme des ovocytes des
follicules primaires à tertiaires, durant la maturation jusqu’au stade 2-cellules où elle
commence à diminuer. Le rôle de ZAR1 au niveau de l’activation du génome embryonnaire
semble se produire avant MATER, car l’activité transcriptionnelle est beaucoup plus faible
et que l’arrêt du développement se produit plus tôt chez les embryons issus de femelle
Zar1-/- que Mater1-/- (Wu, et al., 2003).
La protéine orthologue bovine a été également caractérisée (Brevini, et al., 2004).
Contrairement à la souris, l’ARNm de ZAR1 est également présent au niveau des muscles
squelettiques et du myocarde. Il est présent de l’ovule jusqu’au blastocyste, mais il y a une
augmentation de l’ARNm suite à de la transcription embryonnaire au stade 4-cellules. Ces
observations suggèrent donc une différence au niveau de son importance dans le
développement de l’embryon bovin comparativement au développement de l’embryon de
souris.
19 L’Hsf1, heat-shock factor-1, est un transactivateur de gènes qui sont inductibles au stress.
Toutefois, il est impliqué au niveau de la fertilité femelle, bien qu’il ne soit pas spécifique à
l’ovocyte. Chez des souris knock-out, des embryons issus de femelle Hsf1-/- arrêtent leur
développement au stade zygotique. Bien que l’arrêt du développement est similaire avec les
phénotypes des gènes Mater et ZAR1 gènes, l’implication de HSF1 au niveau de
l’activation du génome embryonnaire n’est pas essentiel, mais des problèmes au niveau de
l’intégrité de la structure nucléaire ont été observés et pourraient être responsables de l’effet
léthal du phénotype Hsf1-/- . HSF1 n’a pas encore été étudié au niveau de l’embryon bovin.
La protéine NALP9, qui fait partie de la même famille que MATER, aussi nommée NALP5
(Dade, et al., 2004), est seulement présente au niveau des tissus reproducteurs (chez le
bovin). Chez le bovin, le messager est fortement exprimé au niveau de l’ovocyte. (Dalbies-
Tran, et al., 2005). Suite à la fécondation, il est présent également au niveau de l’embryon
jusqu’au stage 5-8 cellules, par la suite son expression diminue fortement au niveau de la
morulae et encore au niveau du blastocyste. Son rôle n’a pas encore été étudié.
Le contrôle de l’expression des gènes et des protéines dans l’ovocyte et l’embryon avant la transition maternel-embryonnaire Dans un premier temps, il y a synthèse d’ARNm. Par la suite, il y a leur entreposage suite à
leur déadénylation. Lorsqu’ils sont prêts à être utilisés, il y a adénylation des ARNm pour
qu’ils soient recrutés dans la machinerie traductionnelle afin de produire les protéines. Pour
réguler l’activité des protéines par leur dégradation. Toutes ces étapes sont les pierres
angulaires de la maturation et du développement embryonnaire jusqu’à l’activation du
génome embryonnaire. Différents systèmes régulent chacune de ces étapes et chacune
d’elle sera décrite dans cette section.
La synthèse des ARNm L’ovocyte est actif transcriptionnellement tout au long de sa croissance. Cependant une
activité transcriptionnelle accrue se produit dès le début du stade tertiaire (Fair, et al., 1995,
Fair, et al., 1996, Fair, et al., 1997). Cette activité transcriptionnelle est visible par les
20 changements morphologiques du nucléole (Tableau 1). Il y a toujours une activité
transcriptionnelle lors de la maturation nucléaire de l’ovocyte. Toutefois, cette activité
diminue drastiquement, mais progressivement jusqu’en MII (Hyttel, et al., 1997, Memili, et
al., 1998, Tomek, et al., 2002). Un ovocyte contient 2,4 ng d'ARN total dont seulement 1-
2% présente une queue polyA (Bilodeau-Goeseels and Schultz, 1997a, Picton, et al., 1998).
Chez la souris, il a été démontré que la moitié des messagers sont déadénylés ou dégradés
durant la maturation. (Paynton, et al., 1988, Paynton and Bachvarova, 1994). Chez le bovin,
il n’y a pas de réduction de la quantité d’ARNm, ni d’ARNr durant la maturation.
Toutefois, la quantité d’ARNm polyadénylé passe de 53pg à 25pg après la maturation
(Lequarre, et al., 2004).
En résumé, chez les eucaryotes, la synthèse et la maturation des ARNm se produit dans le
noyau. Le transcrit primaire produit par l’ARN polymérase II est appelé le pre-ARNm ou
heterogeneous nuclear RNA (hnRNA) (Dreyfuss, et al., 2002). Les protéines qui
interagissent avec l’ARNm dans le noyau, sont habituellement appelées heterogeneous
ribonucléoproteins (hnRNP), tandis que les protéines cytoplasmiques sont appelées
ribonucléoproteins (mRNP) (Dreyfuss, et al., 2002). Suite à la transcription, l’extrémité 5’
du pre-ARNm est additionnée d’une 7-methylguanidine triphosphate (m7GpppN). Cette
transformation augmente la stabilité de l’ARNm et prévient sa dégradation par des
exonucléases. L’extrémité 3’ subit également une modification, car une séquence
AAUAAA est reconnue par l’enzyme polyadénylate polymérase qui sectionne le pre-
ARNm à 20 bases après le signal et ajoute, par la suite, une queue poly-A. Il y a également
l’épissage. L’épissage est le processus qui retire les introns et qui juxtapose les exons. C’est
également à ce niveau que peut se produire l’épissage alternatif ; processus qui permet, à
partir d’un même gène, la production de plusieurs isoformes de la même protéine
(Dreyfuss, et al., 2002).
L’entreposage Suite à une déadénylation, les messagers qui contiennent un élément cytoplasmique de
polyadénylation (CPE) ont le pouvoir d’être masqués et ainsi d’empêcher l’assemblage du
complexe de préinitialisation de la traduction à l’ARNm. Le masquage des ARNm
21 s’effectue principalement à l’aide de trois protéines: la protéine liant l’élément
cytoplasmique de polyadénylation (CPEB), Maskin et eIF4E. Le CPEB se lie à la séquence
CPE, tandis que eIF4E se lie à l’extréminité 5’-Capé. La Maskin interagit avec ces deux
protéines afin de former un ARNm en boucle (Stebbins-Boaz, et al., 1999) (Figure 2a).
L’interaction de la Maskin avec eIF4E prévient la traduction, car il entre en compétition
avec eIF4G qui, en se liant à eIF4E, promeut la formation du complexe de pré-initiation de
la traduction (voir section 1.5.4). Il existe également des hnRNP qui se lient à un élément
de contrôle DICE dans la région 3’-UTR, médié par hnRNP protéines K et E1 qui
préviennent la liaison de la sous-unité 60S ribosomal (Mendez and Richter, 2001). Chez
Xénopus, la synthèse de la 3-maskin oscille avec le cycle cellulaire et est nécessaire à la
désactivation de la traduction de la cycline B1. Elle assure ainsi la transition de la phase M
à la phase S (Groisman, et al., 2002).
Chez la souris, MSY2 s’accumule dans l’ovocyte en croissance et représente environ 2%
des protéines totales. Cette protéine est spécifique aux cellules germinales. Elle serait
impliquée dans la régulation de la stabilité et de la traduction des ARNm maternels. Cette
protéine se lie, in vitro, à l’ARNm en reconnaissant une séquence courte
(UACCACAUCCACU) (Yu, et al., 2001, Yu, et al., 2002, Yu, et al., 2003). L’utilisation de
RNAi contre MSY2 a permis de déterminer son action in vivo (Yu, et al., 2004). Les
ovocytes ayant seulement 40% de leur MSY2, présentent moins d’ARN total (75-80%) et
une synthèse protéique plus faible. Il en résulte une baisse de la qualité de l’ovocyte. Le
messager de MSY2 a été étudié chez le bovin (Vigneault, et al., 2004). Il est présent en
grande quantité dans les ovocytes immatures. Il diminue en MII pour rester stable jusqu’au
stade 4 cellules et diminue au stade 8 cellules.
La polyadénylation Comme il a été mentionné dans la section précédente, les messagers en dormance ont une
queue poly-A courte, entre 20-40 nucléotides et ce n’est que lorsqu’elle atteint la taille d’au
moins 150 nucléotides que la traduction se produit (Mendez and Richter, 2001). Pour qu’il
y ait polyadénylation (Figure 2b), il existe des séquences signales situées dans la partie 3’
non-traduite (3’-UTR) de l’ARNm. Il faut au moins la présence de deux séquences, soit un
22 hexanucléotide et le CPE. L’hexanucléotide est constitué de la séquence suivante
AAUAAA. L’hexanucléotide est également important lors de la maturation du messager.
Le CPE est à environ 20-30 nucléotides de l’hexanucléotide. La séquence du CPE est
variable (UUUUAU à UUUUAACA), mais la plus fréquente est UUUUUAU. Donc, la
séquence du CPE, le nombre de copies de CPE, la distance entre le CPE et l’hexanucléotide
peuvent réguler le temps de la polyadénylation et ainsi réguler la traduction (Mendez and
Richter, 2001). La protéine qui lie le CPE (CPEB) est l’instigatrice de la polyadénylation
avec la kinase Eg2. Après la liaison avec l’ARNm, la CPEB phosphorylé par Eg2/Aurora
(connu chez le bovin) possède plus d’affinité avec le cleavage and polyadenylation
specificity factor (CPSF). Le rapprochement de CPSF avec le CPEB permet la liaison de
CPSF avec l’hexanucléotide. Toutes ces interactions permettraient le recrutement d’une
poly(A) polymérase (PAP) cytoplasmique à la fin du messager (Mendez and Richter,
2001). Une fois que la queue poly-A est allongée, il y a recrutement de la PABP qui se lie
également avec eIF4G. Le nouveau complexe PABP- eIF4G déplace la Maskin de eIF4E et
permet le positionnement du complexe de pré-initiation à l’extrémité 5’ (Cao and Richter,
2002).
La régulation de la traduction La maturation de l’ovocyte est caractérisée par l’arrêt de la transcription et une régulation
de la maturation et du développement embryonnaire par la traduction. Lors de la maturation
chez le bovin, il a été démontré qu’il y a une grande activité traductionnelle entre 6-14h de
maturation, puisqu’une forte incorporation d’acides aminés radioactifs a été rapportée
(Tomek, et al., 2002). Ce niveau d’incorporation est corrélé avec la synthèse d’un grand
nombre de protéines entre 0 – 12 h de maturation (Coenen, et al., 2004). Cette synthèse
protéique est corrélée à une activité accrue de la polyadénylation et non à la transcription de
nouveau ARNm (Brevini-Gandolfi, et al., 1999a, Tomek, et al., 2002). Finalement, suite à
la maturation nucléaire de l’ovocyte, la traduction revient à un niveau basal similaire à ce
qui est observé au stade GV (Wu, et al., 1996, Tomek, et al., 2002 ), même si le nombre de
protéines différentes traduites est réduit (Coenen, et al., 2004). Toutefois, cette activité
traductionnelle basale ne réflète pas une diminution de la présence d’ARNm avec une
23 longue queue poly(A). L’accumulation d’ARNm avec une longue queue poly(A) dans
l’ovocyte en MII laisse sous-entendre que l’ovocyte se prépare à la fécondation et est prêt à
traduire rapidement les messagers nécessaires afin d’initier le développement embryonnaire
(Tomek, et al., 2002). La quantité de protéines présentes dans l’ovocyte mature, l’embryon
à 2-cellules et à 8-cellules sont respectivement de 122ng, 137ng et 111ng (Thompson, et
al., 1998). La quantité accrue de protéines au niveau de l’embryon de 2-cellules provient
nécessairement de la traduction des ARNm maternels.
Comme il y a beaucoup d’ARNm dans le cytoplasme, il y a compétition entre les différents
messagers. La présence de séquences régulatrices dans la région 3’-UTR est la clée de la
régulation de la traduction (Mendez and Richter, 2001). Le contrôle de la traduction est
exercé à l’étape initiale de la traduction, c’est-à-dire lorsque la sous-unité ribosomale 40S
se lie à l’ARNm (Figure 2c). Cette liaison est facilitée par l’extrémité 5’-capée de l’ARNm
par le Cap-binding protein complex. Ce complexe est constitué de trois sous-unités soit la
protéine de liaison à l’extrémité 5’-capée, la eIF4E; l’ARN hélicase eIF4A; et la protéine de
liaison eIF4G. Outre de permettre la liaison de eIF4E et eIF4A, la protéine eIF4G permet la
liaison entre le ribosome et l’ARNm par l’interaction de eIF3. En plus d’interagir avec la
partie 5’-Capée, eIF4G interagit avec la protéine cytoplasmique qui lie l’extrémité 3’-polyA
(PABP) de l’ARNm, pour ainsi faciliter la traduction des messagers possédant une queue
poly(A). Donc la PABP joue le rôle de régulateur positif de la traduction. À cause de
l’interaction entre les deux extrémités de messager, l’ARNm forme une boucle (Mendez
and Richter, 2001). Lors de la maturation de l’ovocyte, lorsqu’il y a élongation de la queue
poly(A), la PABP s’y lie et permet l’association de eIF4E et eIF4G pour former le
complexe de pré-initiation qui serait plus stable que le complexe eIF4E/maskin/CPEB
(Mendez and Richter, 2001).
Lors de l’initiation de la traduction, plusieurs autres protéines entre en jeu, l’eIF4B qui
permet d’éliminer les structures secondaires de l’ARNm afin de faciliter le transit de la
sous-unité 40S jusqu’au codon de départ (AUG) de la première méthionine afin de lier
l’ARNt (iARNt-Met). La sous-unité 40S est complexée avec eIF3 et eIF2/GTP, afin de
former le complexe de pré-initiation (43S) pour introduire l’iARNt-Met. Arrivé au codon
24 de départ AUG, l’iARNt-Met est lié par l’hydrolyse du GTP. Cette hydrolyse permet
également le relâchement des différents facteurs d’initiation de la traduction et permet ainsi
la liaison de la sous-unité ribosomal 60S avec la sous-unité 40S par eIF5B/GTP pour
former, après l’hydrolyse et le relâchement d’eIF5B/GDP, le ribosome 80S. Suite à la
formation du ribosome 80S, la traduction passe au stade d’élongation de la traduction
(Mendez and Richter, 2001).
Un autre mécanisme de promotion de la traduction est la modification du 5’-capée. Il est
toutefois important de noter que ce n’est pas tous les messagers qui subissent cette
transformation. Chez Xénopus, l’ARNm de Mos suite à sa polyadénylation, voit son
extrémité 5’-capée méthylée. L’inhibition de cette méthylation entraîne un arrêt de la
maturation donc l’arrêt de la traduction de Mos (Kuge and Richter, 1995, Kaipia and
Hsueh, 1997, Gillian-Daniel, et al., 1998, Kuge, et al., 1998).
La dégradation des protéines et l’ubiquitine Le mécanisme ubiquitine/26S protéasome est un processus d’identification et de
dégradation des protéines afin de réguler différents processus physiologiques tels que la
maturation et l’embryogenèse en régulant la méiose et la mitose par la dégradation des
cyclines (Glotzer, et al., 1991, Hershko, et al., 1991) ainsi que la destruction des
mitochondries parentales (Sutovsky and Schatten, 2000).
La dégradation des protéines débute par un processus qui s’appelle l’ubiquitination.
L’ubiquitine est un polypeptide de 76 acides aminés (8.5kDa) qui lie son extrémité C-
terminale de façon covalente à la chaîne latérale d’un résidu lysine (K) d’une protéine
destinée à la dégradation. Toutefois, le degré d’ubiquitination joue un rôle dans le devenir
de la protéine. Outre un signal pour la dégradation des protéines, l’ubiquitine sert
également dans le traffic intracellulaire, l’activation de kinase et sur la régulation des gènes
(Conaway, et al., 2002). Les protéines destinées aux protéasomes présentent plusieurs
chaînes d’ubiquitines. Ces ubiquitines forment des chaînes polyubiquitines. Néanmoins,
des chaînes multi-ubiquitines atypiques n’induisent pas la protéolyse de la protéine
(Pickart, 2004).
25 La réaction d’ubiquitination est une réaction séquentielle catalytique ATP-dépendante. Il y
a premièrement l’enzyme activant l’ubiquitine (E1) qui crée un lien thiol ester entre elle et
l’ubiquitine. L’activité de la E1 est dite limitante dans le mécanisme de l’ubiquitination.
Ensuite vient l’enzyme conjugant l’ubiquitine, E2, qui transfert l’ubiquitine de la E1 à elle.
L’enzyme ligant l’ubiquitine (E3) vient catalyser le transfert de l’ubiquitine de la E2 à la
protéine cyclée (Hershko, et al., 1983). Une quatrième protéine, la déubiquitine (DUB),
bien qu’elle regénère les ubiquitines individuelles lors du processsus de dégradation des
protéines est considérée comme faisant partie de la classe des enzymes de l’ubiquitination.
Le mécanisme décrit ci-haut se reproduit à plusieurs reprises afin de créer plusieurs chaînes
polyubiquitines sur une même protéine afin que celle-ci soit recrutée par le protéasome
26S. Le protéasome 26S est un complexe hétéromérique d’au moins 64 sous-unités qui sont
codées par au moins 32 gènes indépendants. Le protéasome 26S utilise également l’ATP
pour déplier et transloquer la protéine ubiquitinilée à l’intérieur d’une chambre où elle sera
dégradée en plusieurs petits peptides et où est impliqué la DUB (Baumeister, et al., 1998).
La spécificité de l’ubiquitination pour différentes protéines réside principalement par la
multitude de E3. La E2 et la protéine se lient à différents sites sur la E3. La E3 se divise en
2 groupes. Il y a les domaines HECT qui font un lien covalent avec l’ubiquitine avant de le
transférer à la protéine, et il y a les domaines RING qui transferent directement l’ubiquitine
à la protéine. De plus, les E3 à domaine RING sont constitués de deux sous-unités. Chaque
enzyme E3 ne reconnaît que quelques protéines et est servie par une ou quelques E2. Donc
l’E2 joue également un rôle dans la spécificité de l’ubiquitination d’une protéine donnée.
Un grand pourcentage du génome humain et de la souris est dédié au mécanisme de
l’ubiquitination. Au moins une cinquantaine de E2 et environ 70 DUB ont été répertoriées
chez l'humain (Semple, 2003).
Mais comment ces enzymes reconnaissent-ils la protéine à dégrader? Il y a la règle du N-
terminal ou degron qui signifie qu’il existe une relation entre l’acide aminé en N-terminal
(acétylation et oxidation) ou des modifications post-traductionnelles (phosphorylation,
glycosylation, déacétylation, hydroxylation) et la stabilité de la protéine (Bachmair, et al.,
1986, Varshavsky, 1997). Cette reconnaissance est non seulement essentielle, mais elle est
26 suffisante pour induire l’ubiquitination d’une protéine. Régulièrement, de nouveaux
degrons sont découverts (Pickart, 2004).
La compétence au développement La compétence au développement est généralement définie comme étant la capacité ou le
potentiel d'un ovocyte à compléter la maturation, à être féconder et à se développer jusqu'au
stade de blastocyste pour ultérieurement engendrer une descendance (revue par Duranthon
and Renard, 2001, Sirard, 2001, Trounson, et al., 2001). La compétence au développement
s'acquiert tout au long de la croissance ovocytaire et folliculaire. Chaque étape décrite ci-
haut est primordiale au succès du développement embryonnaire. Il est indiscutable que les
ovocytes produits in vivo dans le cadre d'un cycle oestral normal, sont les plus compétents
au développement. Les chances qu'un ovocyte produit in vivo produise un embryon sont
d'environ 85%. Malheureusement, la production naturelle d'ovocytes est très limitée et ne
suffit pas à fournir le matériel nécessaire aux différentes applications des biotechnologies
des reproductions telles que le clonage et la transgénèse. L'utilisation de traitements de
surovulation est très efficace (Blondin, et al., 2002), mais nécessite des installations et
équipements spéciaux pour les animaux, des chirurgies, ainsi que les hormones dont bon
nombre de laboratoires ne disposent pas. Dans le milieu des années 80 début 1990,
l’efficacité de la maturation in vitro (MIV) (Sirard, et al., 1988), la fécondation in vitro
(FIV) (Parrish, et al., 1984, Parrish, et al., 1986, Parrish, et al., 1988) ainsi que de la culture
d'embryons in vitro (CIV) (Eyestone and First, 1989, Ellington, et al., 1990a, Ellington, et
al., 1990b) rendirent possibles l’utilisation de matériels d’abattoir comme source
presqu’illimitée d'ovocytes.
Toutefois, certaines réserves existent face à la qualité des embryons issus d'ovocytes
récoltés sur des ovaires provenant de l’abattoir. Les taux d'embryons sont loins de ceux
obtenus in vivo, soit environ 40% de production de blastocystes (Sirard, et al., 1998, van de
Leemput, et al., 1999). Une fois les blastocystes produits in vitro, leur taux de gestation
suite à leur transfert est significativement plus faible que les blastocystes in vivo (Farin and
Farin, 1995, Hasler, et al., 1995, Drost, et al., 1999). Plusieurs études ont démontré que la
qualité de l'ovocyte de départ est la principale cause de ce faible taux d'embryons (revue par
27 Lonergan, et al., 2003c). Dans un système de MIV, les ovocytes recueillis de follicules
entre 3-5mm sont privés de 4-5 jours de maturation à l'intérieur du follicule et de la
maturation finale suite au pic endogène de LH. Contrairement à l’ovocyte de souris, même
si l’ovocyte a atteint sa taille maximale, il n’est pas nécessairement compétent au
développement (Fair et al., 1995). En conséquence, la compétence au développement est
acquise par l'ovocyte lorsqu'il est encore dans le follicule (Blondin, et al., 1997a). Par
exemple, un traitement de surovulation constitué de 6 doses égales de FSH (total : 300mg
i.m.) suivi d’une période de sevrage à la FSH de 48h (Sirard, et al., 1999) et d’une dose de
LH 6h avant la récolte, produit des ovocytes prématures qui, une fois introduits dans les
trois étapes du système de production d'embryons in vitro, produisent un bon taux de
blastocystes (≈80%) (Blondin, et al., 2002). Une autre étude a toutefois démontré que des
ovocytes recueillis juste avant le pic de LH, et maturés in vitro sont moins compétents au
développement que des ovocytes maturés complètement in vivo (Rizos, et al., 2002b). La
différence entre ces deux études réside dans le traitement de surovulation utilisé. Cette
importance du traitement de surovulation implique qu’une manipulation de
l’environnement folliculaire est importante sur le développement de la compétence. Donc le
système de production d’embryons in vitro peut supporter la MIV, la FIV et le CIV tant que
l’ovocyte, au départ, a complété sa croissance. Cependant, une amélioration du système de
MIV est nécessaire afin de permettre et compléter la croissance des ovocytes provenant de
tissus d’abattoir. Comme la croissance de l’ovocyte in vivo se produit dans un
environnement maintenant l’arrêt méiotique, l’utilisation d’inhibiteurs réversibles de la
méiose, tels que cycloheximide (inhibiteur de la synthèse protéique) et la 6-
diméthylaminopurine (inhibiteur non-spécifique des protéines kinases) (Lonergan, et al.,
1997), la roscovitine (inhibiteur de Cdks) et le butyrolactone-I (inhibiteur spcigfique de la
famille kinase cdc2) (Kubelka, et al., 2000, Lonergan, et al., 2000a, Mermillod, et al., 2000,
Ponderato, et al., 2001, Hashimoto, et al., 2002) ont été utilisés. Seul le butyrolactone a pu
augmenter la compétence au développement (Hashimoto, et al., 2002). Cependant des
modifications morphologiques ont été observées, mais il est difficile d’évaluer leur
importance sur le développement embryonnaire subséquent (Lonergan, et al., 2003a).
28 Bien que la qualité de l’ovocyte ait toute son importance, le milieu de culture des embryons
en a une également. Effectivement, plusieurs différences ont été observées entre les
blastocystes produits in vitro versus in vivo, il existe même des dissimilitudes entre les
embryons produits dans différents systèmes in vitro (revue par Thompson, 1997, Holm and
Callesen, 1998). Il y a des différences entre les divers transcrits (Wrenzycki, et al., 1998,
Wrenzycki, et al., 2001, Rizos, et al., 2002a, Rizos, et al., 2002b, Lonergan, et al., 2003b,
Rizos, et al., 2003, Kim, et al., 2004), leur morphologie (nombre de cellules, TE vs ICM),
l’imprinting des gènes, leur métabolisme, problème de ségrégation des chromosomes
(Lonergan, et al., 2004), la cinétique du développement (Holm, et al., 2002), ainsi que leur
résistance à la cryopréservation (Rizos, et al., 2002b). Un phénotype fréquemment
rencontré chez les veaux issus de la production d’embryons in vitro est le syndrome du gros
veau où des problèmes au niveau de la croissance de certains organes sont observés (Farin
and Farin, 1995, Young, et al., 1998, van Wagtendonk-de Leeuw, et al., 2000). Le ou les
responsables de toutes ces variations sont l’utilisation de substances complexes telles que le
sérum, dont la composition n’est pas entièrement connue.
Critère de sélection de la compétence
L'ovocyte Comme il a été démontré dans la section précédente, la qualité de l'ovocyte est primordiale
à la production d'un blastocyste. Le taux de production d'embryons à partir d'ovocytes
d'abattoir est faible dû principalement à l'hétérogénéité de leur population et le fait que peu
de follicules sont près de l’ovulation chez des animaux d’abattoir au hasard de leur cycle
(Kruip and Dieleman, 1982, Pavlok, et al., 1992). Plusieurs critères de sélection des
ovocytes ont été développés afin de discerner dans cette population les ovocytes qui sont
les plus susceptibles de produire des embryons in vitro.
La morphologie ovarienne a été étudiée comme méthode simple et noninvasive. La
morphologie de l'ovaire étant séparée en trois catégories: A) présence d'un follicule
≥10mm, B) présence de plus de 10 follicules entre 2-5mm sans follicule de ≥10mm et C)
moins de 10 follicules entre 2-5mm sans follicule de ≥10mm. Les COC prélevés de la
29 catégorie C sont moins compétents au développement, 5.5% versus 28.9 et 22.9% pour A et
B respectivement (Gandolfi, et al., 1997). Suivant la morphologie ovarienne, la compétence
au développement de l'ovocyte a été corrélée au moment de la phase folliculaire. Les
follicules au stade statique ou en régression possèdent des COC plus compétents au
développement (Salamone, et al., 1999). Plus précisément, les COC recueillis d'ovaires au
jour 5 de la vague folliculaire présentent un potentiel de développement plus élevé (22.7%)
(Vassena, et al., 2003), ce qui correspond à la phase statique tardive et au début d'atrésie
(Adams, 1999). Au jour 5 de la phase folliculaire, on retrouve une population ayant
légèrement de plus de petits follicules (1-3mm), que de follicules ≥4 mm, leur nombre
variant entre 10 et 8 respectivement (Jaiswal, et al., 2004). Ce qui se rapproche aux
catégories A) et B) de la première étude. Toutefois, le prélèvement individuel des paires
d'ovaires afin de déterminer le jour de la phase folliculaire est un travail fastidieux et
presqu’irréalisable lorsque les ovaires proviennent de l'abattoir.
La taille des follicules est le second critère qui influence la compétence. Selon la taille des
follicules, les ovocytes compétents au développement apparaissent dans les follicules 2-3
mm (Pavlok, et al., 1992, Blondin and Sirard, 1995). La taille des ovocytes prélevés dans
ces follicules est de plus 110 µm, c'est la taille à laquelle les ovocytes commencent à être
compétents au développement (Fair, et al., 1995). Cependant, la compétence n'est pas
homogène dans les follicules > 2-3mm (revue par (Hendriksen, et al., 2000)), car les
follicules se retrouvent à différents stades de la vague folliculaire. Selon certaines
expériences, les follicules entre 3-8mm auraient le même potentiel de développement
(Blondin and Sirard, 1995, Hagemann, 1999a, Hagemann, et al., 1999b). Dans d'autres
expériences, dans la même population, les follicules de plus de 4mm (Lequarre, et al.,
2005), de plus de 6mm (Tan and Lu, 1990, Lonergan, et al., 1994b, Lequarre, et al., 2005),
entre 4-8mm (Tan and Lu, 1990, Pavlok, et al., 1992, Lonergan, et al., 1994b) ou plus
grands que 13mm (Blondin and Sirard, 1995, Hagemann, 1999a) auraient un potentiel de
développement plus grand que ceux de taille plus petite. De ce fait, la frontière de la taille
des follicules qui présentent les COC les plus compétents au développement se situerait
entre 6 et 13mm.
30 L'autre caractéristique étudiée, afin d'augmenter la compétence au développement, est la
morphologie du COC. Dans un premier temps, la présence et le nombre de couches de
cellules de cumulus est très important afin de fournir le support nécessaire à maturation de
l'ovocyte, ainsi qu'à la fécondation in vitro (Fukui and Sakuma, 1980, Zhang, et al., 1995,
Fatehi, et al., 2002). Dernièrement, il a été démontré qu'une interaction directe entre le
cumulus et l'ovocyte n'est pas nécessaire au développement de la compétence. Seule la
présence de COC avec des ovocytes dénudés lors de la maturation et de la fécondation
produit des taux d'embryons semblables à ceux obtenus avec COC (Luciano, et al., 2005).
Néanmoins, les COC qui ont beaucoup de cumulus avec une légère expansion et un
ooplasme légèrement granulaire, c'est-à-dire que les COC présentent les premiers signes
d'atrésie, sont plus compétents au développement que les COC ayant un cumulus compact
et un ooplasme homogène (Blondin and Sirard, 1995, Blondin, et al., 1997b, de Wit, et al.,
2000, Vassena, et al., 2003).
L'embryon La compétence au développement chez l'embryon s’exprime par la vitesse et le rythme
auquel il se divise. Ces observations additionnées à la morphologie de l’embryon sont
utilisées dans les cliniques humaines et bovines afin d’évaluer la qualité des embryons afin
d’optimiser les succès des transferts embryonnaires. La compétence au développement de
l'ovocyte est le principal responsable du succès du développement embryonnaire.
Cependant il existe un effet taureau, ainsi qu'un effet du milieu de culture sur la cinétique
de développement des embryons.
En général, dans un milieu de culture in vitro, des zygotes produits in vivo présentent des
longueurs de cycle cellulaire plus courts (1-5h) que des zygotes produits in vitro (Holm, et
al., 2002). Il a été démontré clairement que les embryons les plus compétents au
développement se divisent plus rapidement durant les trois premiers cycles cellulaires. La
présence de sérum dans le système de production in vitro affecte également la cinétique de
développement des embryons. Utilisé durant la maturation et la fécondation, le sérum
entraîne le prolongement de certains cycles cellulaires, entre autre le premier, tandis
31 qu'utilisé uniquement lors de la culture d'embryons, il accélère le 4e cycle cellulaire (5 à 9
cellules) (-5h) et la production du blastocèle (Holm, et al., 2002).
L'effet taureau, c’est-à-dire l’origine des spermatozoïdes utilisés lors de la fécondation, a
une incidence sur le temps du premier clivage. Cet effet peut être tellement important, qu'il
peut servir de marqueur de fertilité du taureau. Effectivement, la longueur de la phase S du
premier cycle cellulaire est corrélée au taux de non retour des vaches (Eid, et al., 1994). Les
taureaux avec un meilleur taux de fertilité in vivo débutent la phase S 1-1.5h plus tôt que
les taureaux à faible taux de fertilité. Subséquemment, la longueur de la phase S peut avoir
un effet sur la vitesse de clivage, mais malheureusement ceci n'a pas été démontré
directement.
De toutes ces différences de cinétiques de développement embryonnaire, la plus importante
et la plus utilisée comme marqueur de compétence est le temps du premier clivage, soit la
longueur du premier cycle cellulaire (1 à 2 cellules) (Plante, et al., 1994, Holm, et al., 1998,
Majerus, et al., 2000). Normalement, un zygote clive 30h après l'insémination (hpi) (Van
Soom, et al., 1992, Plante, et al., 1994, Majerus, et al., 2000), 32hpi (Barnes and First,
1991, Holm, et al., 1998) ou 40hpi (De Sousa, et al., 1998c). Cependant, selon différentes
études, le taux de production de blastocystes est plus élevé si les zygotes clivent autour de
22-27hpi (Majerus, et al., 2000), 30hpi (Plante, et al., 1994) et 32hpi (Van Soom, et al.,
1992, Holm, et al., 1998). Pourtant, il faut faire attention, car ce n'est pas nécessairement
les plus rapides qui sont les plus compétents au développement, mais ceux qui présente un
clivage d’un temps intermédiaire (Van Soom, et al., 1997b). Selon la littérature, la vitesse
de clivage varie d'une étude à l'autre (Grisart, et al., 1994, Plante, et al., 1994, De Sousa, et
al., 1998a, De Sousa, et al., 1998c, Lonergan, et al., 1999a). À la même heure
d'observation, le ratio entre le nombre d’embryons clivés à 30hpi sur le taux de clivage total
varie énormément, soit entre 9% à 92%. Cette variabilité peut être expliquée par l'utilisation
de différents systèmes de production d'embryons in vitro ou l'utilisation de différents
taureaux.
32 Les marqueurs de compétence Différentes études ont été réalisées pour chercher des marqueurs de compétence au
développement de l'ovocyte. La recherche de marqueurs de compétence dans les cellules de
granulosa du follicule contenant un ovocyte compétent serait un moyen d’évaluer la
compétence de l’ovocyte suite à un traitement de surovulation et ce sans conséquence sur
l’ovocyte ou le l’embryon. Cet indicateur de la qualité du futur embryons permettrait le
transfert rapide d’un embryon à la fois afin de minimiser les effets des systèmes in vitro
(Robert, et al., 2001), ainsi que les problèmes issus de grossesses multiples. Des études
comparées à haut-rendement entre des ovocytes compétents et non compétents selon la
taille des follicules d'origine des COC, ont pu démontrer que certains gènes de l’ovule sont
exprimés différemment selon le potentiel de compétence des ovocytes. Selon Robert et
collaborateurs (Robert, et al., 2000), les ovocytes prélevés de follicules 3-5 mm présentent
davantage de messagers de cyclin B1, splicing factor ccl.4, cytochrome c oxidase,
mineralocorticoid receptor, pregnancy-specific glycoprotein, nuclear factor IV, drosophila
lethal (2) giant larvae protein et surfactant protein B que les ovocytes prélevés de follicules
< 2 mm. Une autre étude faite également à partir de la taille des follicules a démontré que
les gènes suivant sont différentiellement exprimés chez les ovocytes issus de follicules <2
mm versus >5mm: Oct4, Msx1, Znf198, NDFIP1, Cyclin A2, SLBP (stem-loop binding
protein), Dja4 et Trappc (Donnison and Pfeffer, 2004). Dans les deux études, des gènes non
connus ont été également trouvés. L’étude de la compétence au développement se référant à
la taille des follicules reflètent les différences au niveau de la croissance folliculaire.
Effectivement, les ovocytes prélevés de follicules plus petits que 2mm, présentent des
ovocytes qui sont majoritairement inaptes à reprendre la méiose (Fair, et al., 1995).
L’étude de la compétence à partir des embryons de 2-cellules (Fair, et al., 2004b) permet
l’évaluation de la compétence à partir d’un pool d’ovocytes ayant au moins une même
compétence méiotique. Tel qu’il a été décrit dans la section précédente, le temps de clivage
est un marqueur de compétence. Les ARNm des embryons qui clivent tôt ont été soustraits
d'embryons qui clivent tardivement. Plusieurs séquences homologues à des séquences EST
bovines et à des gènes connus ont été trouvées. Les gènes suivants ont été étudiés: histone
33 H3, cycline B1 et au BMP15. Seul le messager de l’histone H3 est présent davantage dans
les embryons qui clivent tôt versus les embryons qui clivent tardivement.
Dans le cadre de recherches plus ciblées, d'autres travaux ont été amorcés pour observer
comment les transcrits de certains gènes sont présents dans des ovocytes de compétence
différente. Lonergan et al., 2003, ont démontré que les gènes de la Mn-superoxide
dismutase mitochondrial (MnSOD), la Cu/Zn-superoxide dismutase cytosolique
(Cu/ZnSOD), l'oxidase sarcosine (SOX), le facteur de différentiation de croissance (GDF-
9), la glucose-6-phosphate deshydrogénase (G6PDH) et la cycline B1 varient selon qu'ils
proviennent d'ovocytes d'abattoir immatures ou maturés in vitro, et maturés in vivo,
recueillis avant le pic de LH et maturés in vitro, ou recueillis avant l'ovulation. Les
ovocytes maturés complètement in vivo sont significativement plus compétents au
développement que les deux types d'ovocytes maturés in vitro (Rizos, et al., 2002a). Les six
gènes étudiés présentent des différences entre les ovocytes maturés in vitro versus les
ovocytes ayant maturés in vivo. Seul le gène GDF-9 présentait des différences entre les
ovocytes maturés in vivo recueillis avant le pic de LH et maturés in vitro que les ovocytes
recueillis avant l'ovulation. Ces résultats laissent entendre que la maturation finale est
importante au développement de la compétence. Donnison et Pfeffer, 2004 (Donnison and
Pfeffer, 2004), ont observé que GDF-9 et C-mos étaient plus abondants dans les ovocytes
recueillis de follicules de >5 mm versus <2mm, mais que BMP15 étaient plus abondant
dans les ovocytes recueillis de follicules <2mm versus >5mm.
Le gène Ped produit l'antigène Qa-2. Cet antigène est reconnu comme contrôlant la vitesse
de clivage des embryons de souris durant la période préimplantatoire du développement. La
présence de Qa-2 est corrélée avec la vitesse de clivage rapide, tandis que son absence est
corrélée à une vitesse de clivage plus lente (Warner, et al., 1987a, Warner, et al., 1987b).
Fair et collaborateurs (Fair, et al., 2004a) ont démontré que l'expression du gène Ped est
présente également chez le bovin. Il est présent davantage chez les embryons qui clivent tôt
comparativement aux embryons qui clivent tardivement. Ils ont également observé une
expression accrue chez les embryons in vivo versus les embryons in vitro. La glucose-6-
phosphate déhydrogénase, l’hypoxanthine phosphorybosyl transférase et le ligand insulin-
34 like growth factor-1 sont présentes davantage dans les embryons qui clivent tôt
comparativement à ceux qui clivent tardivement (Lonergan, et al., 2000b).
Ces différentes études ont su trouver des gènes impliqués dans le développement
embryonnaire. Toutefois, des résultats contradictoires sur l’implication de la cycline B1
(Robert, et al., 2000, Fair, et al., 2004b) ou du BMP15 (Donnison and Pfeffer, 2004, Fair, et
al., 2004b) sur la compétence au développement, montrent que les comparaisons utilisées
afin de trouver les facteurs de compétences semblent refléter des raisons différentes aux
défaillances du développement embryonnaire. La sélection par la taille des follicules, dans
les deux cas < 2mm et > 3-5mm, fait ressortir les facteurs de compétence autant impliqués à
la reprise de la méiose qu’au développement embryonnaire. Effectivement les ovocytes
recueillis de follicules < 2 mm, regroupent des ovocytes dont une partie est incapable de
compléter la méiose, mais ils sont tous incompétents au développement embryonnaire
(Fair, et al., 1995). Tandis que les follicules > 3-5mm sont compétents à compléter la
méiose et le développement embryonnaire. Il n’est donc pas surprenant de voir que la
cycline B1 est moins présente dans ces ovocytes, car il a été démontré précédemment que la
cycline B1 est essentielle à la reprise de la méiose chez le bovin (Levesque and Sirard,
1996). Tandis que la comparaison au niveau de la vitesse de clivage des embryons compare
des embryons uniquement au niveau de leur compétence au développement embryonnaire,
c’est-à-dire la maturation finale de l’ovocyte d’origine.
Outre la quantité de messagers, la régulation de la traduction des messagers maternels par
la polyadénylation est différemment exprimée entre les embryons qui clivent tôt versus
ceux qui clivent tard (Brevini, et al., 2002). La longueur de la queue poly(A) de différents
ARNm reste constante, augmente ou diminue avec la vitesse de clivage des embryons. La
β-actine et la pyruvate dehydrogénase phosphatase restent constantes, la connexin 43, Oct-4
et plakophilin diminuent graduellement. La connexine 32 et l’activateur du plasminogène
augmentent tandis que la RNA poly(A) polymérase, la HSP-70 et transporteur de glucose
de typeI diminuent et rallongent par la suite. Donc une asynchronie de la polyadénylation
causerait un retard dans le développement embryonnaire et réduirait la compétence au
développement.
35 Objectifs L’objectif général de cette thèse est l’identification de facteurs de compétence au
développement qui sont entreposés sous forme d’ARNm dans le cytoplasme de l’ovocyte et
qui sont traduits durant le développement embryonnaire avant la transition maternel-
embryonnaire. Comme il a été décrit dans la section précédente, plusieurs études ont été
faites afin d’identifier ces facteurs potentiels de la compétence au développement. Une des
premières difficultés rencontrées dans ce type de recherche est l’identification d’une
population d’ovocytes ou d’embryons la plus homogène possible afin d’effectuer les
comparaisons qui seront les plus judicieuses et ainsi cerner les vrais facteurs qui nous
intéressent. L’utilisation de matériel in vivo étant limitée et nettement insuffisant,
l’utilisation de matériel provenant de l’abattoir est la source du sujet d’étude. Dans la
section sur les Critère de sélection de la compétence), il est bien décrit toute la complexité
qui existe dans l’identification des ovocytes compétents au développement à partir
d’ovaires d’abattoir. Alors comment peut-on identifier une population la plus homogène
possible? Selon la littérature, la taille du follicule, la morphologie du COC ainsi que le
temps de clivage des embryons semblent être les plus importants facteurs. En conséquence,
dans une première étude nous avons expérimenté une triple sélection à partir d’ovaires
provenant de l’abattoir afin de déterminer la population ayant le plus grand potentiel de
développement embryonnaire ainsi que la population ayant le plus faible. Ce mode de
sélection a été utilisé pour les expériences subséquentes.
Les études qui ont déjà été faites sur les facteurs de compétence ont utilisé exclusivement
les outils de la biologie moléculaire, tel que le differential display (DDRT) et le SSH
(Robert, et al., 2001). Toutefois, avant le stade de 8 cellules, les niveaux d’ARNm ne
signifient pas nécessairement qu’il y a traduction des messagers. Pour cette raison, cette
étude s’est concentrée sur la traduction des ARNm maternels lors des premières étapes du
développement embryonnaire jusqu’au stade de 8 cellules, soit jusqu’à l’activation du
génome embryonnaire. Après l’ère de la génomique vient l’ère de la protéomique. Les
outils tels que les gels d’électrophorèse en deux dimensions (2DE), l’analyse d’images
assistée par ordinateur, la sensibilité croissante de la spectrométrie de masse ainsi que
l’utilisation des bases de données de séquences protéiques, génomiques et les EST ont été
36 les outils privilégiés de cette thèse afin d’identifier les protéines impliquées dans la
compétence au développement embryonnaire.
Avant d’étudier la compétence au développement au niveau de l’embryon, nous avons
étudié la protéomique de l’embryon bovin jusqu’au stade 8-cellules. Cette étude nous a
permis de connaître les besoins constants en protéines des ovocytes (Coenen et al., 2004) et
des embryons. Nous avons appelé les protéines qui sont présentes dans les ovocytes
immatures et traduites durant la maturation et le développement embryonnaire : les
protéines housekeeping maternels. Quelles protéines sont partagées entre ces deux
évènements qui puisent leurs protéines dans le même pool d’ARNm? Seront-elles
nombreuses ?
Finalement, à l’aide des populations d’embryons présentant des compétences au
développement variables ainsi que les connaissances des patrons protéiques de l’embryon,
nous avons analysé les facteurs de compétence au développement au niveau de la synthèse
des protéines chez l’embryon à 2-cellules.
.
Tableaux
Tableau 1 Ensemble des différentes étapes de la croissance de l’ovocyte à partir du follicule primordial au repos jusqu’à l’ovulation. (Tiré et adapté de Hyttel et al., 1997)
38
Développement folliculaire Primordial repos Primordial activé Primaire SecondaireTaille du follicule 34,6 ± 3,7 µm 46,1 ± 6,1 µm 101,7 ± 41,8 µmTaille de l'ovocyte 27,9 ± 3,3 µm 31,6 ± 4,3µm 45,6 ± 14,0 µmTemps de croissance J0 J70Follicules/ovocyte
Cumulus compact compact compact compacta)Type de cellules plates plates/cuboïdales cuboïdales cuboïdales
2 couchesb)Nbre de cellules équatorialles 5-8 5-14 8-20 croissanceJct Granulosa/ovocyte adherens adherens adherens gap/adherensZona pelucida non non rare petites plaquesEspace périvitelline absente absente absente absenteMicrovelli couché couché couché/érecté couché/érectéNoyau central/eccentrique eccentrique eccentrique eccentriquea)Membrane nucléaire sphérique sphérique sphérique sphériqueb)Maturation nucléaire GV GV GV GVc)Transcription nucléoplasmique inactif inactif inactif actif modéréd)Transcrition nucléolaire inactif inactif inactif actif modérée)Nucléole prédominant G G FGe/FGp FGe/FGpf)Nucléoplasme et nucléole
Mitochondries a)Localisation périnucléaire périnucléaire cortex profond cortex profondb)Forme prédominante rond rond rond/qql allongées rond/qql allongéesNbre goutellettes lipidiques 0 à 3 0 à 5 0 à 3 0 à 15a)Taille petite petite petite petiteb)Localisation périnucléaire périnucléaire migration périphérieNbre de vésicules rare rare rare peuFree SER/RER extensive extensive extensive extensiveNbre de complexes Golgien 1 à 4 1 à 4 1 à 3 1 à 2a)Taille petitb)Localisation périnucléaire cortex profondCoat pits nombreuse nombreuse nombreuse modéréeGranules corticaux non non non peua) localisation - - - cortex profondb)taille du groupe - - - petit Changements cytoplasmiques
Tableau 1.1 Ensemble des différentes étapes de la croissance de l’ovocyte à partir du follicule primordial au repos jusqu’à l’ovulation. (1ère partie)
39
(J -2.5) (J -2) (J -1) Recrutement (J0) Sélection (J1)
Jeune antral130µm 1mm 2mm 3mm < 4mm 4mm80µm < 100µm 100 - <110µm 110 - < 120µm > 120µmJ90 J135-160
compact compact compact compact compactcuboïdales> 2 couchescroissance
gap/adherens gap/adherens gap/adherens gap/adherens gap/adherenscomplète absente absente début élargie élargieérecté érecté couché/érecté couché couché
eccentrique eccentrique migration périphérie périphériesphérique sphérique sphérique sphérique sphérique
GV GV GV GV GVactif actif actif activité faible inactifactif actif actif activité faible inactifhFG hFG/aFG aFG/hFG/FGs Fd(Fv) Fd(Fv)
partout cortex/périphérie périphérie périphérie périphérierond/allongées rond/chapeau chapeau/qql all. chapeau chapeau
5 à 20 10 à 20 10 à 20 10 à 30 10 à 40petite petite petite petite moyenne
périphérie périphérie périphérie périphérie périphériemodéré modéré modéré beaucoup beaucoup
extensive extensive modéré rare rare2 à 6 2 à 9 4 à 7 4 à 12 5 à 8
augmentepériphérie
rare rare rare rare rarecomplète complète complète complète complète
cortex profond cortex profond cortex profond périphérie périphériegros gros gros gros gros
Tertiaire
Vague folliculaire
Tableau 1.1 (2e partie)
40
Dominance (J 2-3) (J6) Ovulation (J 0)LH 9-12h 15h 24h
8-9 mm 12 mm 16 - 18 mm
compact compact/expansion compact/expansion expansion très en expansion
qql allongé allongé allongé allongégap/adherens + superficiel + superficiel absente absente
élargie élargie élargie + élargie + élargie +
couché/# diminué plus érecté érecté érecté érectépériphérie périphérie absent absent absentsphérique ondulation dissolution
GV GV GVBD MI MIIinactif -inactif actif inactif inactif inactif
Fd anneau absent absent absent
périphérie périphérie migration migration centre avec G.L.chapeau chapeau chapeau chapeau chapeauaugmente augmente augmente augmente augmente?
grosse grosse grosse grosse très grosse périphérie périphérie vers le centre vers le centre centre avec mitobeaucoup beaucoup beaucoup beaucoup beaucoup
rare rare rare rare seul en périphérie diminue diminue diminue diminue presque absent
diminue diminue diminue diminue très petitscortex
rare rare rare rare rarecomplète complète complète complète complètesuperficie superficie superficie dislocation sous oolemma
+ petit + petit + petit + petit individuel
Tableau 1.1 (3e partie)
Oestrus (J 7-9)
41 Légende :
J : jour
Nucléole : G : granulaire, FGe : fibrillo-granulaire externe, FGp : fibrillo-granulaire périphérique, hFG: hétérogéno-fibrillaire granulaire, aGF: agrégat-fibrillaire granulaire, FGs : fibrillo-granulaire superficiel, Fd : fibrillaire dense, FV : fibrillaire vacuolé.
Changements cytoplasmiques : M : mitochondrie, R: vésicules, RER : réticulum endoplasmique rugueux, CP : coated pits, SER : réticulum endoplasmique lisse, L : gouttelette lipidique, ZP : zone pellucide, CG : granules corticales, G : complexe de Golgi, Nu : nucléole.
42
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43
Figure 1 La morphologie et le temps de la méiose (a) ainsi que le cycle cellulaire du développement embryonnaire (b) suivant la fécondation chez l’embryon bovin. GP : globule polaire. PN : pronoyau.
44
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45 Figure 2 Schéma explicatif des sections concernant A) l’entreposage des ARNm
maternels, B) la polyadénylation des ARNm qui ont été entreposés et finalement C) la
régulation de la traduction des ARNm maternels. Cette figure a été tirée et adapté de
l’article Mendez and Richter, 2001.
46
CHAPITRE II
A SELECTION PROCEDURE FOR COMPETENT BOVINE EMBRYOS PRODUCED BY IN VITRO MATURATION,
FERTILIZATION AND CULTURE OF OOCYTES FROM SLAUGHTERHOUSE OVARIES
Lyne Massicotte, Atef A. Ali and Marc-André Sirard
47
Résumé Deux expériences ont été conduites afin de déterminer une procédure de sélection pour
discriminer des embryons de haute et de faible compétence à se développer dans un
système in vitro. Deux systèmes de production d’embryon in vitro furent utilisés: le
système TCM et le système SOF modifié (mSOF). Dans la première expérience les
embryons furent sélectionnés à toutes les 2 h entre 32 h et 42 h post-insémination (hpi) afin
de déterminer la population avec le plus haut taux de blastocystes. Les embryons qui
clivent avant 36 hpi présentent une meilleure compétence au développement. Dans la
seconde expérience, une triple sélection fut développée. Les ovocytes furent recueillis selon
leur diamètre folliculaire : 3-5 mm, 5-10 mm et de plus de 10 mm. Les ovocytes furent
ensuite séparés selon la morphologie de leur COCs présentant aucun ou seulement les
premiers signes d’atrésie. Toujours cultivés séparément, les embryons furent par la suite
sélectionnés selon leur état de clivage à 36hpi afin de déterminer quelle combinaison de ces
trois facteurs produit les meilleurs et les plus faibles taux d’embryons in vitro. Aucune
différence au niveau du taux de blastocystes n’a été observée entre les follicules entre 3-5
mm et 5-10 mm, mais les embryons provenant de COCs présentant les premiers signes
d’atrésie présentent des taux d’embryons supérieurs comparativement aux COCs compactes
et sans aucun signe d’atrésie. Suite à la sélection des embryons à 2-cellules à 36 hpi, les
COCs présentant les premiers signes d’atrésie provenant des follicules de 3-5 mm et 5-10
mm ont respectivement des taux d’embryons de 71.4% et de 73.1% dans le système-TCM
et de 62.5% et 38.1% dans le système mSOF. Tandis que les zygotes clivant après 36hpi
provenant des COCs sans aucun signe d’atrésie de follicules 3-5 mm, présentaient les plus
faibles taux d’embryons, entre 0 et 6.3%. En conclusion, la triple sélection permet le
regroupement d’embryons ayant des compétences semblables au développement soit de
peu à très compétents.
48 Abstract Two experiments were conducted to determine a selection procedure to discriminate high
and low embryo developmental competence using in vitro production systems. Two
different in vitro embryo production systems were used: TCM-system and the modified
SOF-system (mSOF). In the first experiment, embryos were selected every 2 h between 32
h to 42 h post-insemination (hpi) to determine which population of embryos had the highest
blastocyst rate. Zygotes that cleaved before 36hpi presented a better developmental
competence. In the second experiment, a triple selection was elaborated. COCs from
different follicular sizes 3-5 mm, 5-10 mm and more than 10 mm, were aspirated
separately. Harvested COCs were classified in two groups according to their morphology:
healthy compact COCs and early atretic COCs. Produced embryos were subject to post-
cleavage selection at 36hpi to determine which combination gave the highest blastocyst
rate. While, no differences in blastocyst rate were observed between COC from 3-5 mm
and 5-10 mm follicles, early atretic COCs showed a superior blastocyst rate than healthy
COCs. Setting the selection of two-cell embryos at 36hpi, early atretic COCs from 3-5 mm
and 5-10 mm follicles showed similar blastocyst rates of 71.4% and 73.1% in the TCM
system and 62.5% and 38.1% in the mSOF systems. Zygotes that cleaved after 36hpi from
3-5 mm follicle and healthy COCs had a lower blastocyst rate; between 0 and 6.3%. In
conclusion, this triple step selection homogenizes the selected embryos population,
allowing the production of embryos of very high and very low developmental competence.
49
Introduction It has been known that in vivo matured oocytes are more developmentally competent than
those matured in vitro (Sirard, et al., 1998, van de Leemput, et al., 1999). Van de Leemput
et al., (1999) established that the critical part in the in vitro production system (IVP) is the
in vitro maturation (IVM) portion, by demonstrating that the in vitro embryos culture (IVC)
and the in vitro fertilization (IVF) systems were not the limiting factors to produce embryo.
Recently in our laboratory, a superovulation treatment followed by transvaginal aspiration
in the bovine has been developed to produce immature oocytes, that when introduced into
the IVP system can achieve a blastocyst rate near 90%, which is similar to the normal in
vivo blastocyst rate (Blondin, et al., 2002). These results support previous hypothesis that
oocyte developmental competence must be acquired before IVM (Blondin, et al., 1997a).
Superovulation is an expensive procedure and requires space, specialized equipment,
animals and highly skilled employees. Slaughterhouse ovaries, which are more economical
compared to transvaginal aspiration, are widely used to improve IVP and also to understand
the characteristics of a competent oocyte (Robert, et al., 2000). The principal problem of
working with slaughterhouse ovaries is the heterogeneity of the population in terms of their
developmental competence (Kruip and Dieleman, 1982, Pavlok, et al., 1992).
Different factors such as follicular size, morphology of oocyte-cumulus complex (COC)
and time of first cleavage have been studied to determine rapid observable physiological
characteristics related to oocyte developmental competence from slaughterhouse ovaries.
The beginning of developmental competence coincides with the follicular size of 2 to 3 mm
(Pavlok, et al., 1992, Blondin and Sirard, 1995). However, developmental competence is
not homogenous in follicles larger than 2 or 3 mm (review by Hendriksen, et al., 2000).
According to characteristics of the follicular wave (reviewed by Ginther, 2000), follicles
between 3 to 5mm represent usually the follicles recruited by the FSH peak, whereas
follicles larger than 5mm represent the selected follicles including the future dominant and
subordinate follicles, and follicles larger than 10mm represent the dominant ones.
According to previous experiments, follicles between 3 to 8 mm have a similar
developmental competence potential (Blondin and Sirard, 1995, Hagemann, 1999a,
50 Hagemann, et al., 1999b) but in some studies, within the same population, oocytes from
follicles greater than 6mm (Tan and Lu, 1990, Lonergan, et al., 1994b), between 4-8mm
(Tan and Lu, 1990, Pavlok, et al., 1992, Lonergan, et al., 1994b) or greater than 13mm
(Blondin and Sirard, 1995, Hagemann, 1999a) have been shown to contain more competent
oocytes to support early embryonic development than their smaller counterparts. However,
it seems that the oestrous state has an effect, because large follicles at the late static stage
possess oocytes that are more competent to development (Salamone, et al., 1999). The
morphology of the COC is another characteristic that reflects the developmental
competence (Blondin and Sirard, 1995, Salamone, et al., 1999, de Wit, et al., 2000). It has
been shown several times that COCs showing early signs of atresia have higher
developmental competence than COCs showing healthy appearance. Time of first cleavage
is another indicative factor for developmental competence (Van Soom, et al., 1992, Plante,
et al., 1994, Lonergan, et al., 1994a, Holm, et al., 1998, Majerus, et al., 2000). It has been
shown that zygotes who cleave faster have more chance to develop to the blastocyst stage.
Nevertheless, zygotes who cleaved at an intermediate rate present a better blastocyst rate
(Van Soom, et al., 1997b). In IVP, zygotes usually cleave at 30 h after post-insemination
(hpi) (Van Soom, et al., 1992, Plante, et al., 1994, Majerus, et al., 2000), 32 hpi (Barnes and
Eyestone, 1990, Holm, et al., 1998) or 40 hpi (De Sousa, et al., 1998c).
The main objective of our study was to develop a method to discriminate between superior
and inferior embryos in terms of developmental competence from slaughterhouse ovaries.
The rational is to access large quantities of material for gene expression and proteomic
studies. Our approach is to select the population of embryos with a higher rate of
developmental competence according to their moment of first cleavage within a narrow
range of time. Furthermore, using this selected time of first cleavage, we determined if
selection of oocytes by follicular size in combination with the morphology of COCs, are
factors that can increase the homogeneity of the population and thus increase the blastocyst
rate, and furthermore, reduce the variability in future proteomic and molecular biology
research between replicates. Our experiments were performed using two different culture
systems during IVM and IVC. The first system is a complex system using tissue culture
media 199 (TCM-199) supplement with fœtal calf serum (FCS) and co-culture of embryos
51 systems with oviductal cells, called TCM system. The second system is based on a
complete semi-defined system, using modified synthetic oviduct fluid (SOF) supplemented
with bovine serum albumin (BSA), called the SOF system. One of the goal was to compare
the TCM system, similar to the system used by Blondin et al. (2002), which is efficient in
supporting the entire IVP system, with the semi-defined SOF system. Although the TCM-
system still supports a better and constant blastocyst rate after the selection procedure, our
selection procedure can increase the homogeneity of the embryo population and thus
become a very good discrimination method of embryo developmental competence.
52
Materials and methods All reagents and media supplement used in these experiments were obtained from Sigma-
Aldrich (Oakville, Ontario, Canada) unless otherwise indicated. TCM-199 and MEM
amino acids were provided by Gibco Laboratories (Burlington, Ontario, Canada).
Oocytes Recovery Ovaries from cycling heifers or cows were harvested immediately after slaughter. Ovaries
arrived at the laboratory within 4h after collection at about 32°C in a saline solution (0.9%
(w/v) NaCl containing 100 000 IU•l-1 penicillin, 100 mg•l-1 streptomycin and 250 µg•l-1
amphotericin B). All follicles were aspirated using an 18g needle and collected in a 50 ml
Falcon centrifuge tube. COC from follicles greater than 5 mm were harvested in a Hepes-
buffered Tyrode’s medium (TLH) supplemented with 0.3% (w/v) Fraction V BSA, 0.2 mM
pyruvic acid, 50 mg•ml-1 gentamicin, and 10 IU•ml-1 of Heparin (Hepalean, CDMV,
Québec) to prevent follicular fluid coagulation.
In vitro production (IVP) As mentioned earlier, two completely different systems were used, the TCM system
(Blondin and Sirard, 1995) and SOF system (Vigneault, et al., 2004). No combinations
were made between these two systems; only the IVF system was the same for both systems.
During maturation (IVM) and fertilization (IVF), groups of ten COC were matured in 50µl
droplets of maturation medium covered with mineral oil. For embryo culture (IVC), groups
between one to ten embryos or more than ten were cultured in 25µl and 50µl droplets
respectively. The oocytes were matured for 23-24h before IVF. The incubation
environment for all incubations was fixed at 38.5°C, 5% CO2, 95% air atmosphere, and
100% humidity unless otherwise stated.
TCM system
After collection, oocytes were washed three times in TLH medium supplemented with 10%
(v/v) of heat-treated foetal calf serum (FCS) (Heat-treated FCS, Immunocorp Sciences inc.,
53 Montreal, Québec, Canada). For IVM, the maturation medium consisting of TCM-199 with
Earle’s salts and bicarbonate, supplemented with 10% FCS, with 0.5µg•ml-1 follicle-
stimulating hormone (FSH) (National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney
Diseases, NIDDK, Bethesda, MD), 5µg•ml-1 luteinizing hormone ((LH) (NIDDK), 1µg•ml-
1 17b-estradiol (E2), 0.2 mM pyruvic acid, and 50µg• ml-1 gentamicin.
For IVC, the TCM development medium is the same medium used in IVM except no
hormones were added. Epithelial oviductal cells were prepared from fresh oviducts 48h
before co-culture to form vesicles that were added to each development droplet 24h before
addition of embryos (Blondin and Sirard, 1995). Embryos were allowed to develop for 9
days and the medium was changed every 48h.
Modified SOF (mSOF) system After collection, oocytes were washed three times in the same TLH-BSA medium without
heparin. For IVM, the maturation medium, the SOF system is composed with 1.5 mM of D-
glucose, 0.8% BSA, 1X MEM nonessential amino acids, 1X MEM essential amino acids
and 1 mM glutamine, with the same hormone supplement as in TCM system, 0.4 mM
pyruvic acid, and 50µg•ml-1 gentamicin.
For IVC, two-step procedure was used: mSOFC1 and 2 (Ali and Sirard, 2002). For the first
72h of development, mSOFC1 containing 0.8% BSA, 1.5 mM D-glucose, 1X MEM
nonessential amino acids, 1mM glutamine and 10 µM EDTA was used. Embryos were
transferred to the SOFC2 medium containing 0.8% BSA, 1X MEM nonessential amino
acids, 1X MEM essential amino acids and 1mM glutamine for the remaining 144 h of
culture and medium was replaced after 72h. The incubation conditions were conducted
under low oxygen tension (7% O2).
In vitro Fertilization (IVF) After IVM, respective COC from both systems were washed two times in TLH medium
supplemented with 0.3% BSA, 0.2 mM pyruvic acid and 50 µg•ml-1 gentamicin. The COC
were transferred to 48 µl drops of fertilization medium consisting of Tyrode’s lactate
54 medium, 0.6% fatty acid free BSA, 0.2 mM pyruvic acid, 50 µg•ml-1 gentamicin and
1.78U×ml-1 heparin. Before the addition of spermatozoa, 2µl of PHE (penecillamine 2mM,
hypotaurine 1 mM, epinephrine 250 mM) were added to each droplet. Semen pooled from
three bulls (Centre d’Insémination Artificielle du Québec; CIAQ, St-Hyacinthe, Québec,
Canada) was thawed at 35°C for 1min and applied to a discontinuous Percoll gradient of
1:1 45% (v/v) and 90% (v/v) Percoll separation in a 15mL centrifuge tube, and centrifuged
at 700Xg for 30 min at 26°C. The supernatant was removed and the pellet was resuspended
in 1mL of modified Tyrode’s medium (TALP) and centrifuged at 250Xg for 5 min at 26°C.
After removal of the supernatant, the final concentration of sperm in each droplet was
adjusted to 1x106spermatozoa•ml-1. The fertilization lasted between 15-18 h.
After fertilization, presumptive zygotes from the SOF system were completely denuded by
repeated pipetting and washed three times in phosphate buffered saline (2.68 mM KCl, 1.5
mM KH2PO4, 136.9 mM NaCl, 8 mM Na2HPO4, 5.5 mM Glucose and 1 mM Pyruvic
acid), 0.3% BSA and 50 mg•ml-1 gentamicin, and transferred into the IVC of the SOF
system. Zygotes from the TCM system were partly denuded and washed three times in
TLH supplemented with 10% FCS, 2 mM pyruvic acid, and 50 mg•ml-1 gentamicin, and
transferred in the IVC of the TCM system.
Experiment 1: Chronology Follicles between 3 and 6mm were aspirated from slaughterhouse ovaries. COC were
recovered with the aid of a stereomicroscope (400X) and were introduced into the IVP
mSOF system or TCM system. After fertilization zygotes were transferred into their
respective development medium. Every two hours between 32 up to 42 hours post-
insemination (hpi), cleaved zygotes were removed from their main group and divided
according to their developmental stage, either the 2-cell, or three or more cells (≥ 3-cell).
The cleavage rate (number of cleaved embryos/total number of presumptive zygotes) was
determined only from the main groups, and the final cleavage rate was measured at the first
medium renewal. After eight days of culture, the blastocyst rate was recorded for each
group of selected hours and reported as the selected blastocyst rate (number of blastocysts
on selected embryos) or general blastocyst rate (number of blastocysts on the total retrieved
55 COC). Embryos were classified according to recommendations of the International Embryo
Transfer Society, as excellent or good early blastocysts to expanded hatched blastocysts
(Robertson and Nelson, 2000).
Experiment 2: Triple Selection In a factorial design, COC were harvested separately from follicles between 3-5mm
inclusively (S), between 5-10mm exclusively (M) and larger 10mm inclusively (L). The
second selection is according to the morphology of more than five layer of cumulus cells
COC as they present healthy (H) or early signs of atresia (EA) (Blondin and Sirard, 1995).
After fertilization, zygotes were observed at 36 hours post insemination (hpi) determined in
experiment 1. Two-cell embryos and embryo which have developed beyond the 2-cell stage
(≥3 mm) were separated from the starting group. The uncleaved zygotes were allowed to
continue in culture. The blastocyst rate was observed on day 7 post insemination. This
experiment was made also with the two IVP systems.
Experiment 3: Differential Staining of Inner Cell Mass and
Trophectoderm
We have used the differential staining approach described by (Van Soom, et al., 1996) to
compare the quality of the embryos between SOF and TCM system. The removal of the
zona pellucida has been achieved by pronase digestion (P-5147) and acid TLH solution (pH
2). To stop the digestion, embryos were washed in a TLH-20% FCS three times and
transferred in a culture medium of TCM-199-20% FCS for 2 to 3h. After this culture
period, blastocysts that were still showing a good cavity were proceeding to the staining
protocol. The trophectoderm (TE) and inner cell mass (ICM) nuclei of the embryos were
differentially labeled with propidium iodide (PI) and Hoechst respectively. For the
coloration of the ICM by the Hoescht, the embryos have been fixed in 100µl of formalin
(cat no HT50-1-1) for 15min, then rinsed in 200µl 0.5% Triton X-100 before being
mounted over a drop of Mowiol (cat. No 324590; Aldrich) gelatin containing Hoescht
33354 (5 µg•ml-1) as described by (Campagna, et al., 2001).
56 Statistical Analysis In experiment 1, data from three replicates were used and each replicate was considered as
a block. Data from the 2-cell groups were transformed by an arcsine operation and analyzed
by ANOVA procedures using the General Linear Models (GLM) of SAS/STAT and a
protected Fisher’s least significant difference (LSD) for the TCM system and a least
squares means (LSM) for SOF system as in some observed hours no embryos had cleaved.
The 2-cell and ≥3-cell selected blastocyst rate within an observed time were compared by a
t-student test (P < 0.06). General blastocyst rates from both systems were compared by
contrast analysis.
Four replicates were used in the triple selection and each replicate was considered as a
block. Data were subject to ANOVA (GLM) to analyze the effects of follicular size, COC
morphology and the interaction between the two parameters by factorial analysis with
SAS/STAT system. Only data from ≥ 3-cell groups and delayed cleaved zygotes were
transformed by an arcsine operation. Protected LSD was done on blastocyst rate from
without post-cleavage selection embryos, within the 2-cell and ≥3-cell selected embryos at
36hpi and finally within the embryos that were not cleaved at 36hpi to determine
differences between follicular size, COC morphology and time of cleavage. The different
unselected or selected blastocyst rates, within the early atretic COC from large follicles,
healty or early atretic COCs from medium follicles and healty or early atretic COCs from
small follicles was compared by a protected LSD (P < 0.05) blastocyst rate within each
group.
In experiment 3, blastocysts were separated in two groups according to their total cell
number as they present between 64 to less than 128 cells and more than 128 included. The
means ± SEM of the number of total, ICM and TE cells, and ratio of ICM on total cell were
compiled and compared by student t-test between blastocysts derived from SOF system and
TCM system.
57
Results
Experiment 1 Most 2-cell embryos were observed between 32hpi and 42hpi (Figure 3). In the two culture
systems, embryos with ≥3-cell, usually between three and four cells, were already observed
at 32hpi. In general, the final cleavage rate in both systems was almost reached within the
first 42hpi. Moreover, between observations at 2h intervals, some zygotes had already
cleaved to three or more cells. The overall proportion of ≥3-cell embryos was significantly
higher (P < 0.0001) in the SOF system compared to the TCM system, 30.24±7.85% and
11.53±3.06% at 42h, respectively.
No differences were observed in the general blastocyst rate between the two systems
(17.66±4.93% and 17.66±3.78% in TCM and SOF systems, respectively). Therefore,
selected blastocyst rate from each observed times from both systems were pooled (Figure
4). The selected blastocyst rate of the zygotes that reached the 2-cell stage before 36hpi was
significantly higher than compared to zygotes, which cleaved later. Similar results were
observed with the ≥3-cell groups, except that zygotes that cleaved at 36hpi were not
different from the delayed zygotes.
We conclude from this first experiment that the critical moment of selection must be prior
to 36hpi, where 2-cell embryos represent respectively 81.98±12.53% and 65.23±13.68%
for TCM and SOF systems of the general blastocyst production (Number of blastocysts
from the selected 2-cell embryos observed between 32 to 36hpi/ Total blastocysts in the
experiment).
Experiment 2 For oocyte selection, both follicle size and COC morphology were used as criteria to select
oocytes and assess developmental competency, which was measured as blastocyst rate. For
the third criteria, the time of first cleavage, the embryos were assessed for cleavage at 36
hpi and embryos were grouped as 2-celled embryos or embryos with three or more cells (≥
3-cell). After the selection, uncleaved embryos were allowed to continue their development
58 and the final cleavage rate was calculated at 72hpi. Cleaved embryos were selected and
called post-selection embryos. When COC morphology was examined, healthy COCs were
never observed from large (≥10mm follicles).
Follicular size and COC morphology had independent effects on blastocyst rates as there
was no interaction observed on blastocyst production between follicular size and COC
morphology in either IVP system. Therefore, these criteria can be studied independently.
No significant differences were observed for the cleavage rates from different follicle sizes,
COC morphology nor IVP system. However, both follicular size and the morphology of the
COCs had an effect on overall blastocyst rates irrespective of time of first cleavage in the
TCM system and the mSOF system.
In the TCM system, the blastocyst rate without selection at 36hpi tended to be higher (P =
0.068) for early atretic COCs (29.6 ± 22.9%) compared to healthy COCs (22.9 ± 11.1%),
irrespective of follicular size groups. Furthermore, in the TCM system the blastocyst rates
obtained from small (26.7±14.9%) and medium (34.2± 17.9%) follicle sizes are
significantly higher from large follicles (7.4±12.8%), irrespective of COC morphology.
When follicular size and COC morphology were considered together, early atretic COCs
from small and medium follicles had higher (P<0.05) blastocyst rates than compared to
large early atretic follicles (Tableau 2). Heathly COCs from small and medium follicles
were not different from any of the early atretic COCs. Following the 2-cell embryo
selection at 36hpi, the same effect of the morphology of the COCs (29.5 ± 26.9% and 58.4
± 36.1% for healthy and early atretic COCs, respectively) and the follicular size
(45.36±36.3%, 59.14±29.3% and 0% for small, medium and large follicles, respectively)
were observed. No significant differences were observed according to the morphology of
the COCs nor the follicular size for ≥3-cell embryos at 36hpi nor embryos that have
cleaved after 36hpi.
For the mSOF system, the blastocyst rate without selection at 36hpi obtained regardless of
the origin of the follicles was higher in early atretic COCs (20.64 ± 13.3%) than for healthy
COCs (5.32 ± 7.1%). No significant differences were observed according to the follicular
size neither after embryo selection at 36hpi. When follicular size and COC morphology
59 were taken together, early atretic COCs from small and medium follicles had higher
(P<0.05) blastocyst production than healthy appearing follicles from medium follicles
(Tableau 3). Healthy COCs from small follicles and early atretic COCs from large follicles
presented an intermediate blastocyst production rate. Following embryo selection at 36hpi,
an effect of the morphology of the COCs was observed for the 2-cell embryos (18.4 ±
21.3% and 42.7 ± 31.7% for healthy and early atretic COCs, respectively) and the late
cleaving embryos (0% and 8.5 ± 13.3% for healthy and early atretic COCs, respectively).
No significant differences were observed according to the morphology of the COCs for ≥3-
cell embryos at 36hpi.
The results of the three selection criteria on the observed blastocyst rates for the TCM
system are shown in Tableau 2, and the mSOF system are shown in Tableau 3. By selecting
the embryos at the 2-cell stage at 36 hpi from those at 3 or more cells, we have increased
(P<0.05) the proportion of cleaved embryos reaching the blastocyst stage from both COCs
morphologies and follicular size except for healty COCs from medium follicles in both
system, and early atretic COCs from large and small follicles in the TCM system.
Especially in the TCM system, 2-cell embryos from early atretic COCs from medium
follicles have shown significantly higher blastocyst rate compared to if no selection at
36hpi has been done. Post-selection cleaved embryos and the fast cleaving embryos (≥ 3-
cells at 36hpi) have shown the lowest blastocyst rate regardless of the IVP system used.
Experiment 3 As presented in Tableau 4, after nine days of culture, the total cell number of blastocysts
with more than 128 cells is significantly higher in blastocysts produced in the SOF system
than in the TCM system. The difference comes from the number of trophectoderm (TE)
cells that are higher in SOF system than in the TCM system, since the number of ICM was
not significantly different. No significant difference was observed in the ratio of ICM cells
on total cell number. For blastocysts between 64 and 128 cells, contrarily to blastocysts
with more than 128 cells, no significant difference was observed, neither for total, ICM or
TE cells.
60
Discussion In general, our results demonstrate that zygotes cleaving before 36hpi are more competent
to develop. At this point, at least half of the zygotes have cleaved and they represent around
three quarter of the future blastocysts. Our results also confirm that follicle size and
morphology of the COC are two factors that affect the developmental competence of
oocytes. If these two factors are not considered during the post-cleavage selection, the
homogeneity of the embryos population is affected. However, the morphology of the COCs
seems to be a better discrimination factor since there was no effect of follicular size on
oocyte developmental competence in our SOF system. The selection process employed in
this study can clearly improve the blastocyst rate in vitro, especially using early atretic
COCs obtained from small and medium follicles. Zygotes that originate from healthy
COCs, even if they cleave before 36hpi, present a lower developmental potential. These
observations confirm early hypothesis of Blondin et al. (1995) on the effect of atresia on
competence.
Previous studies indicate that early-cleaved zygotes have a higher developmental potential
(Van Soom, et al., 1992, Grisart, et al., 1994, Plante, et al., 1994, Holm, et al., 1998,
Lonergan, et al., 1999a, Majerus, et al., 2000). The present results demonstrate that zygotes
that cleaved between 32hpi and 36hpi are more competent to develop than zygotes that
cleaved later regardless of the IVP system used. It is surprising to observe that blastocyst
rate from cleaved embryos at 32hpi are not significantly different of those from 34hpi and
36hpi, contrarily to what have been clearly observed by Lonergan et al. (1999a). Their
respective kinetic of cleavage is similar and the kinetics of cleavage versus developmental
competence are not statically different, regardless of the culture media used. According to
the experiment of Ward et al. (2001) and other papers in the literature which have study the
cleavage rate at different time (Barnes et al., 1991; Grisart et al., 1994; Holm et al., 1998;
Lonergan et al., 1999a; Majerus et al., 2000; Plante et al., 1994; Van Soom et al., 1992; De
Sousa et al., 1998) the cleavage rate at a certain checkpoint after insemination present a
large variation surely influenced by the semen quality. Paternal effects have been observed
before the maternal-embryonic transition and are possibly related to the length of the S-
61 phase in the first cell cycle (Eid, et al., 1994, Comizzoli, et al., 2000). Therefore, the
kinetics of cleavage versus developmental competence in the experiment 1 must be
repeated every time a new bull or pooled sperm is employed.
Another type of embryos that are characterized by a shorter first and second cell cycle was
also observed. Usually, a normal second cell cycle would last between 7 to 14 hours
(Barnes and First, 1991, Majerus, et al., 2000), however Plante et al. (1994) demonstrated
that embryos with ≥3-cell can develop within a period of less than six hours. The present
study has demonstrated that 1-cell embryos can move from the 1-cell to 3 to 4-cell stage
and even in a rare observation, to the 8-cell stage within a period of two hours. An
additional experiment has been carried out to evaluate if this was simply cytoplasmic
fragmentation. An average of 30% of these fixed abnormal embryos did not present nucleus
in all cells (results not shown) but the rest did contain more than 2 nuclei. The short cell
cycle or fragmented embryos seen in this study were also observed by Plante et al. (1994)
and by Van Soom et al. (1997a) who showed that these embryos gave a reduced blastocyst
rate compared to normally cleaving embryos. In contrast, embryos cultured in the mSOF
system had a higher proportion of short cell cycle or fragmented embryos than in the TCM
system, but the development potential of embryos from the mSOF system was not
compromised as their overall blastocyst rate is not significantly different from the TCM
system.
In the factorial analysis, the absence of interaction between follicular size and morphology
of the COCs may support the hypothesis that those two factors are independent as
demonstrated during superovulation treatments (de Loos, et al., 1991, Blondin, et al.,
1996).
One interesting observation from this study is that most of the research groups around the
world exclusively used the time of cleavage to select their competent and incompetent
embryos population, but the present results show that even if embryos derived from healthy
COCs cleaved at the same moment as embryos derived from early atretic COCs, they are
significantly less competent to develop at the blastocysts stage.
62 Blondin and Sirard (1995) and Hagemann et al. (1999b) using individual culture were
unable to see differences in blastocyst rate between embryos produced from COCs between
3 to 8mm follicles, which is consistent with our results, compared to Pavlok et al. (1992)
who observed significant differences between follicular size 2-4mm and 4-8mm.
Nevertheless, the observed difference must come from the fact that Pavlok and their
collaborators have introduce COCs from 2mm follicles which are known to have problem
to complete their meiosis (Fair et al., 1995). Although several groups have reported that
COCs obtained from large follicles (>6mm and >13mm) result in higher blastocyst rates
(Tan and Lu, 1990, Pavlok, et al., 1992, Lonergan, et al., 1994b, Hagemann, 1999a),
surprisingly the blastocyst rate from large follicles was lower in the TCM system, or not
significant in the mSOF system, when compared to the small and medium follicle size
groups. It has been demonstrated that depending on the phases of the oestrus cycle, large
follicles can provide different levels of competent oocytes (Hagemann, 1999a). During the
growth phase of the follicular wave, COCs from large follicles can reach a blastocyst rate
close to 70%, but during the dominance phase, it declines to 30% and again to 24% during
the regression phase (Hagemann et al. 1999b). This can partly explain the large variation in
the blastocyst rate seen from our large follicle groups since COCs were aspirated regardless
of the status of oestrus cycle of the ovary. The difference observed could also be attributed
to a low recovery rate of competent COCs, as follicles obtained by Pavlok et al. (1992) and
Hagemann et al. (1999ab) were dissected compared to our experiment where they were
aspirated. Our situation can be similar to what is observed during ovum pick up after
superovulation treatment, where COCs from growing follicles are tightly attached to the
follicular wall (Ménard, et al., 1995).
As mentioned by Blondin and Sirard (1995) and de Wit et al. (2000), healty COCs are
clearly less competent to develop to the blastocyst stage than early atretic COCs. The
dominant period is characterized by the reduction of FSH secretion, and is divided in two
phases, the static and regression or ovulation phase depending on the stage of the oestrous
cycle. In the late static phase, the granulosa cells show signs of atresia, the tissue is less
compact and the number of degenerating cells is increased (Singh and Adams, 2000). As
observed by Hagemann (1999a), different levels of atresia are observed in larger follicles
63 present: low levels during the growing phase of the follicular wave and high levels during
the dominance phase. In this study, COCs harvested from large follicles show different
levels of atresia: the early atretic COCs, as well as COCs showing darker and lightly
expanded cumulus cells and also COCs with strongly expanded cumulus cells with dark
spots. The two later categories were excluded from the experiment because their nuclear
status could not be characterized before IVM.
In the first experiment, embryos were examined and selected at six different times between
32 and 42hpi. In these conditions, both the mSOF and the TCM systems produced a
suboptimal blastocyst rate of approximately 17% compared to embryo rates usually
obtained in our laboratory (35%), regardless of the IVP system. Furthermore, in the second
experiment, controls have been kept in the incubator to assess a potential negative effect of
pulling the dishes out every 2 hours, but no significant difference was observed between the
blastocyst rate from selected embryos (data not shown) and the untouched ones, as it have
been shown by Lonergan et al. (1999a), De Sousa et al. (1998) and Van Soom et al.
(1997a). We observed that in the mSOF system the blastocysts rate varied more between
the replicates than in the TCM system. This observation may represent a ph sensibility of
the mSOF system and a quick manipulation is recommended. It has been shown that 2-cell
embryos and oocytes are more sensitive to environmental stress than later developmental
states (Edwards and Hansen, 1997b). Oviductal cells were absent in the mSOF system and
the embryos were transferred from 7% up to 20% oxygen during this examination period,
potentially leaving the embryos exposed to oxidative stress and low CO2. Therefore, pH
changes and oxidative stress could explain the variations between replicates while in TCM
the oviductal cells can provide protection against reactive oxygen species and buffer the Ph
(Lapointe and Sirard, 1998, Lapointe and Bilodeau, 2003) during the selection procedure.
According to Van Soom et al. 1996 and 1997b, the ratios of ICM on total cells varies
between 0.29 to 0.33 for an average of 0.32 and stay relatively constant regardless of the
total cell number of the blastocysts and the culture medium (TCM or B2 Ménézo).
According to de la Fuente and King (1997), using one step coloration with the Ca2+
ionophore A23187 to permeate the TE, the ratio of ICM/TOT was 0.23 for in vitro 8 or 9
64 days blastocysts with approximately 100-166 blastomeres and 0.27 for in vivo 8 days
blastocysts with 195 blastomeres. In our study, the mSOF system seemed better for
embryos development, as the number of total cells and TE cells were higher in blastocyst
with more than 128 cells compared with the TCM system. The mSOF system presents a
larger variation according to the ratio of the two groups of blastocyst, which is relatively
constant in the TCM system.
In conclusion, we were able to identify a population of oocytes and/or embryos
demonstrating a high developmental potential. Our results indicate that the selected early-
cleaved zygotes originate from early atretic COCs of small or medium follicles can provide
competent embryos. In fact, early atretic COCs from medium follicles can reach a
blastocyst rate not very far from what can be produced by superovulation and ovarian
aspiration (Blondin, et al., 2002) or what is observed in vivo. The three different steps of
selection according to the follicular size, the COC morphology and the time of first
cleavage, presented in this study can provide high rates of competent embryos for future
research on competence factors. Healthy COCs and/or developmentally delayed embryos
can serve as a negative control. Using these two populations, it is now possible to
accumulate sufficient biological material for gene expression and proteomic studies.
65
Acknowledgement The authors thank Mathieu Boilard, Karine Coenen, Marie-Lou Laprise and Serge McGraw
for their assistance, Dr Susan Novak for her revision of the English and statistical advice
and the financial support of the Canadian National Sciences and Engineering Research
Council.
66
Tables
Tableau 2 Blastocyst rate produced by the triple selection based on follicles size, cumulus-oocytes complexe morphology (COC) and time of cleavage in co-cultured TCM-199 – FCS in vitro production system
Without selection With selection at 36hpi Post-Selection
2-cell ≥ 3-cell Follicles COC N C n (%) C n (%) C n (%) C n (%)
L H 0 - - - - - - - EA 38 30 2 (6.7)b 11 0 (0.0)c 8 0 (0.0) 11 2 (18.2)
M H 51 45 18 (40.0)ab 14 7 (50.0)b 23 9 (39.1) 8 2 (25.0)
EA 86 76 36 (47.4)a, d 21 15 (71.4)a, c 34 16 (47.1) d 21 5 (23.8) d
S H 84 68 13 (19.1)ab, cd 29 7 (24.1)b, c 23 5 (21.7) d 16 1 (6.3) d
EA 84 69 32 (46.4)a, cd 26 19 (73.1)a, c 22 7 (31.8) cd 21 6 (28.6)d
L, M, S: Follicles size of ≥ 10mm (L), 5-10mm exclusively (M) and 3–5mm (S) H, EA: Healty and early atretic cumulus-oocyte complexe, respectively N: Total number of oocytes C: Number of cleaved embryos n: Number of blastocysts %: Is the pourcentage of n/C a,b: Values within each column with different letters are significantly different (P < 0.05) *: Superscripts are significantly different between 2-cell selection or not (P < 0.05)
67
Tableau 3 Blastocyst rate produced by the triple selection based on follicles size, cumulus-oocytes complexe morphology (COC) and time of cleavage in co-cultured SOF–BSA in vitro production system
Without selection With selection at 36hpi Post-Selection
2-cell ≥ 3-cell Follicles COC N C n (%) C n (%) C n (%) C n (%) L H 0 - - - - - - - - EA 42 33 7 (21.2)ab,cd 13 6 (46.2) c 6 0 (0.0) d 14 1 (7.1) d
M H 23 16 1 (6.3)b 6 1 (16.7) 3 0 (0.0) 7 0 (0.0) EA 38 28 11 (39.3)a,cd 16 10 (62.5) c 4 0 (0.0) d 8 1 (12.5) d
S H 74 59 7 (11.9)ab, cd 23 6 (26.1) c 13 1 (7.7) d 23 0 (0.0) d
EA 88 69 18 (26.1)a, cd 21 8 (38.1) c 27 5 (18.5) d 21 5 (23.8) cd
L, M, S: Follicles size of ≥ 10mm (L), 5-10mm exclusively (M) and 3–5mm (S) H, EA: Healty and early atretic cumulus-oocyte complexe, respectively N: Total number of oocytes C: Number of cleaved embryos n: Number of blastocysts %: Is the pourcentage of n/C a,b: Values within each column with different letters are significantly different (P < 0.05) *: Superscripts are significantly different between without and with 2-cell selection (P < 0.05)
68
Tableau 4 Comparison of the cell number (cell number ± SEM) of total, innner cell mass (ICM) and trophectoderm (TE) and the ratio of ICM on total cell number in blastocysts who have reached between 64 and 128 cells or more than 128 cells in TCM system and mSOF system
Cell number/Blastocyst Medium 64 – 127 cells ≥ 128 cells
TCM 47 16 n SOF 28 29
TCM 92.8 ± 2.9 146.5 ± 3.9d Total SOF 98.3 ± 2.9 159.1 ± 4.6c
TCM 58.8 ± 2.3 98.3 ± 2.8b TE SOF 60.3 ± 2.6 109.8 ± 3.8a
TCM 34.3 ± 1.7 48.4 ± 3.2 ICM SOF 38.2 ± 2.2 49.5 ± 2.3
TCM 0.37 ± 0.02 0.33 ± 0.02 ICM/TOT SOF 0.39 ± 0.02 0.31 ± 0.01 After a t-student between the TCM system and mSOF system a,b: P < 0.02; c,d: P < 0.05
69 Figures
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
32 34 36 38 40 42 Final
Time (hpi)
Clea
vage
rate
(%)
a)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
32 34 36 38 40 42 Final
Time (hpi)
Cle
avag
e ra
te (%
)
b)
Figure 3 Progression of cleavage rate according to the main started groups between 32 to 42hpi as presumptive bovine zygotes had reached 2-cell ( ) or ≥3-cell stage ( ) in the TCM (a) or mSOF (b) system. The production of ≥3- cell embryos was higher (P<0.01) in the MSOF system compared to the TCM system. Data are presented as means ± SD.
70
0
10
20
30
40
50
60
32 34 36 38 40 42Time (hpi)
Bla
stoc
yst r
ate
(%) a c
a c
a
*cd b
b
b
*d d d
Figure 4 The chronology of time of cleavage versus developmental competence. As both IVP systems were not significantly different according to their respective general blastocyst rate, the selected blastocyst rates from TCM and MSOF systems were pooled according to timing of cleavage to the bovine 2-cell ( ) or ≥3-cell stage ( ) between 32 and 42hpi. Data are presented as means ± SD. Letters a, b and c, d represent differences (P < 0.06) in 2-cell and ≥3-cell stage embryos, respectively. Superscripts (*) represent differences (P < 0.06) between 2-cell and ≥3-cell stage embryos within the same hpi as determined by a student t-test.
71
CHAPITRE III
MATERNAL HOUSEKEEPING PROTEINS PRESENT IN IMMATURE OOCYTES AND TRANSLATED FROM MATERNAL MRNA TRHOUGHOUT BOVINE OOCYTE MATURATION AND EARLY EMBRYO DEVELOPMENT BEFORE THE MATERNAL-
EMBRYONIC TRANSITION
Lyne Massicotte, Karine Coenen, Marina Mourot and Marc-André Sirard
Accepted Proteomics, 2006
72
Résumé Les gènes housekeeping sont définis comme étant des gènes ou des protéines dont toutes
les cellules ont besoins. La synthèse des protéines à partir des ARNm maternels est
nécessaire à la maturation de l’ovocyte et au développement embryonnaire avant la MET.
Donc, les protéines qui sont traduites durant toute cette période peuvent être considérées
comme des protéines housekeeping maternels (MHKP). Nos objectifs étaient
l’identification des MHKP avant la MET. Les protéines synthétisées durant la maturation et
le développement embryonnaire furent marquées au S35-Met et S35-Cys et visualisées en
gel à 2DE. De l’α-amanitine fut ajoutée au milieu de culture des embryons afin d’inhiber la
transcription embryonnaire. Les ovocytes furent marqués à tous les 4h durant la maturation
et les embryons pendant 4h aux stades 2, 4 et 8 cellules. L’analyse d’images assistée par
ordinateur a permis de créer les patrons protéiques types de chaque stade de
développement. Lors de la maturation et du développement embryonnaire, 92 et 123
protéines ont été observées respectivement à tous les stades étudiés. Seulement 46 protéines
sont présentes à la fois pendant la maturation et le développement embryonnaire, 21 d’entre
elles furent analysées par MALDI-TOF et MS/MS. Dix furent identifiées avec succès:
HSC71; HSP70; CypA; UCH-L1; GSTM5; Cct5; E-FABP; 2,3-BPGM, l’enzyme
conjugant l’ubiquitine E2D3; et la γ-actine/β-actine. Une nouvelle méthode appelée
confirmation de l’identification in silico fut développée en utilisant les banques de EST.
Cette méthode s’est avérée indispensable dans l’étude protéique des tissues rares et dont le
protéome est peu connu. Comme MHKP, seulement la CypA et la γ-actine/β-actine sont
reconnus comme étant des « housekeepings ». Les MHKP découverts dans cette étude,
pourront être utilisés comme marqueurs lors d’études protéomiques de l’ovocyte jusqu’au
stade de 8-cellules.
73
Abstract Housekeeping genes can be defined as a set of constitutively expressed genes/proteins that
are needed in all cell types. Protein synthesis from maternal mRNAs is needed to sustain
oocyte maturation and embryo development prior to the maternal-embryonic transition
(MET). Therefore, the proteins that are expressed throughout this time may be considered
as maternal housekeeping proteins (MHKP). Our objectives were to identify the MHKP
prior to MET. Proteins synthesized during oocyte maturation and embryo development
were labelled using S35-Met and S35-Cys, and visualized by two-dimensional
electrophoresis (2DE). Embryos were cultured with α-amanitine to inhibit new
transcription. Oocytes were labelled every 4h during maturation and embryos were labelled
during 4h intervals at the 2-cell, 4-cell and 8-cell stages. Image analysis software enabled
the comparison of the protein maps of different stages of development. Ninety-two and 123
proteins were identified to be commonly expressed during oocyte maturation and embryo
development, respectively. Only 46 proteins were present throughout all stages, and 21 of
these were sequenced using MALDI-TOF and MS/MS. Ten proteins were identified:
HSC71; HSP70; CypA; UCH-L1; GSTM5; Cct5; E-FABP; 2,3-BPGM, ubiquitin-
conjugating enzyme E2D3; and γ-actin/β-actin. A new method called in silico protein
identification confirmation was developed using EST databases. This method is a
promising approach for use in rare tissue or from species with an incomplete protein
database. As MHKP, only γ-actin/β-actin and CypA were previously known as cell
housekeeping proteins. These MHKP can be used as markers for 2DE studies on bovine
oocytes and early embryos up to the 8-cell stage.
74
Introduction The matured oocyte not only contributes half of the embryonic genome, but it supports
fertilization and early embryonic development until the maternal-embryonic transition
(MET). The MET or activation of the embryonic genome occurs at different moments
depending on the species. In the bovine, the MET occurs at the 8-16 cell stage (Telford, et
al., 1990, De Sousa, et al., 1998b, Memili and First, 2000). However, it has been shown
that a minor transcription period occurs as early as the 2-cell stage (Plante, et al., 1994,
Viuff, et al., 1996). Some proteins from embryonic origin resulting from this minor
transcription activity were revealed by two-dimensional electrophoresis (2DE) (Memili and
First, 1999), and major changes in the protein pattern are observed between the zygote and
the 8-16 cell stage (Frei, et al., 1989). The 8-16 cell stage represents the first complete cell
cycle after the zygotic stage. Furthermore, the 8-16 cell stage is particularly longer (60 h)
than a normal cell cycle (24 h) (Barnes and Eyestone, 1990, Barnes and First, 1991,
Memili, et al., 1998), likely due to the start of transcriptional activity.
To achieve the proper continuum of events during the period from fertilization to the MET,
the oocyte has to accumulate instructions as proteins and mRNA during growth and
maturation. Transcription is active before germinal vesicle breakdown (GVBD) but
diminishes rapidly during maturation and ceases after GVBD (Hyttel, et al., 1997, Tomek,
et al., 2002). The maternal mRNA are masked and stored in the cytoplasm until a signal
induces their translation. The translation of these stocked mRNA is believed to be regulated
by their 3’untranslated regions (UTRs). The 3’UTR region regulates both the
polyadenylation/deadenylation and thus the translational activation (Richter, 1999, Mendez
and Richter, 2001).
The developmental potential of an oocyte may rely on the accumulation of the appropriate
mRNA and their translation into proteins. Furthermore, the proteins present in immature
oocytes and which are constitutively expressed throughout oocyte maturation and
embryonic development until MET may be necessary for the successful activation of the
embryonic genome. The most abundant proteins are often associated with housekeeping
genes, which are constitutively expressed genes/proteins with functions that are needed in
75 all cell types. The mRNA of different housekeeping genes like β-actin, GAPDH, ubiquitin,
lamin B, tubulin, histone H2A, cytochrome b and histone H3 are present throughout oocyte
maturation and embryonic development as determined by semi-quantitative and
quantitative PCR (Bilodeau-Goeseels and Schultz, 1997b, Robert, et al., 2002b). Usually,
the quantity of the mRNA is high in the immature oocyte and remains stable or diminishes
during maturation and early embryo development, but the temporal expression of the
protein products of these housekeeping genes is not well known. It is known, however, that
the general protein synthesis rate diminishes between the zygotic and 8-cell stages (Frei, et
al., 1989).
This study was designed to 1) determine the protein expression patterns from translated
maternal mRNA of bovine embryos treated with α-amanitine to suppress transcription at
the 2-cell, 4-cell and 8-cell stages prior to the MET using 2DE, 2) determine the major
proteins that are present in immature oocyte and translated from maternal mRNA during
maturation (Coenen, et al., 2004) up to the 8-cell stage embryo, 3) identify these potential
maternal housekeeping proteins (MHKP) by matrix-assisted laser desorption/ionization
time of flight spectrometry (MALDI-TOF) and tandem mass spectrometry (MS/MS) and 4)
confirm their identification by using a combination of EST Bos taurus banks and MALDI-
TOF spectrum.
76
Materials and Methods All reagents and media used in these experiments were obtained from Sigma-Aldrich
(Oakville, Ontario, Canada) unless otherwise indicated. TCM-199 and MEM amino acids
were provided by Gibco Laboratories (Burlington, Ontario, Canada).
In vitro embryo production (IVP) Ovaries from cycling heifers or cows were harvested immediately after slaughter. Ovaries
arrived at the laboratory within 4 h after collection at 32°C in a saline solution (0.9% (w/v)
NaCl containing 100 000 IU/l penicillin, 100 mg/l streptomycin and 250 µg/l amphotericin
B. All 3-6 mm follicles were aspirated using an 18-g needle and collected in a 50 ml Falcon
centrifuge tube. After collection, oocytes were washed three times in a Tyrode Hepes
buffered medium (TLH) supplemented with 0.3% (w/v) Fraction V BSA, 0.2 mM pyruvic
acid and 50 µg/ml gentamicin. Groups of ten cumulus cell-oocyte complexes (COC) were
matured in 50 µl droplets of maturation medium covered with mineral oil. The maturation
medium is based on a synthetic oviduct fluid (SOF) medium composed of 1.5 mM of D-
glucose, 0.8% BSA, 1X MEM nonessential amino acids, 1X MEM essential amino acids
and 1 mM glutamine, in the presence of 0.5 µg/ml follicle-stimulating hormone (FSH;
National hormone and peptide program; NHPP), 5 µg/ml luteinizing hormone (LH; NHPP),
1µg/ml 17β-estradiol (E2), 0.4 mM pyruvic acid, and 50 µg/ml gentamicin (Ali and Sirard,
2002). The in vitro maturation (IVM) lasted 23-24 h in an environment fixed at 38.5°C, 5%
CO2, 95% air atmosphere, and 100% humidity.
After IVM, COC were washed two times in TLH medium The COC were transferred to 48
µl drops of fertilization medium consisting of TLH, 0.6% fatty acid free BSA, 0.2 mM
pyruvic acid, 50 µg/ml gentamicin and 1.78U/ml heparin. Before the addition of
spermatozoa, 2 µl of PHE (2 mM penicillamine, 1 mM hypotaurine, 250 mM epinephrine)
were added to each droplet. Semen pooled from three bulls (Centre d’Insémination
Artificielle du Québec; CIAQ, St-Hyacinthe, Québec, Canada) was thawed at 35°C for 1
min and applied to a discontinuous Percoll gradient of 2 mL of 45% (v/v) and 2 mL of 90%
(v/v) Percoll separation in a 15-mL centrifuge tube, and centrifuged at 700 g for 30 min at
77 26°C. The supernatant was removed and the pellet was resuspended in 1 mL of modified
Tyrode’s medium (TALP) and centrifuged at 250 g for 5 min at 26°C. After removal of the
supernatant, the final concentration of sperm in each droplet was adjusted to
1x106spermatozoa/ml. The fertilization lasted between 15-18 h in the same environment as
for the maturation.
After fertilization, presumptive zygotes were completely denuded by repeated pipetting,
washed three times in phosphate buffered saline (PBS; 2.68 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4,
136.9 mM NaCl, 8 mM Na2HPO4, 5.5 mM glucose and 1 mM pyruvic acid), 0.3% BSA
and 50 µg/ml gentamicin, and transferred into the in vitro culture (IVC) system. A two-step
procedure was used: SOFC1 and 2 (Ali and Sirard, 2002). For the first 72 h of
development, SOFC1 containing 0.8% BSA, 1.5 mM D-glucose, 1X MEM nonessential
amino acids, 1mM glutamine and 10 µM EDTA was used. Embryos were transferred to the
SOFC2 medium containing 0.8% BSA, 1X MEM nonessential amino acids, 1X MEM
essential amino acids and 1mM glutamine for the remaining 144 h of culture and medium
was replaced after 72 h. The incubation conditions were conducted under low oxygen
tension (7% O2).
Radiolabeling of oocytes and embryos The labelling method for bovine oocytes has been described in detail previously in our
laboratory (Coenen, et al., 2004). The bovine embryos were labelled in the SOFC1 medium
where BSA was replaced by 0.1% Polyvinylpyrrolidone 40 kDa (PVP-40), containing 1
mCi/ml of [S35]-Methionine and [S35]-Cysteine (ICN Canada Ltee, Saint-Laurent, Qc,
Canada) (specific activity:1175 Ci/mmol) in the same atmosphere as in the IVC system. In
addition, the embryos were cultured with 100 µg/ml of α-amanitine after 15 hours post-
insemination (hpi). Embryos were labelled for 4 h between 36-40 hpi at the 2-cell stage, 48-
52 hpi at the 4-cell stage and 60-64 hpi at the 8-cell stage (Figure 5). After labelling,
oocytes and embryos were washed three times in TLH without BSA and three times in
PBS. Pools of 10 embryos were frozen at –80°C for use in 2DE.
78 2-Dimensional electrophoresis (2DE) The studied spectrum consists of proteins with an isoelectric point between pH 3-10 and
with a molecular weight between 8-180 kDa. Oocytes and embryos were solubilised in
rehydration buffer consisting of 8 M urea, 2% CHAPS, 0.5% IPG buffer 3-10 (Amersham
Biosciences, Baie d'Urfé, Qc, Canada), 2.8 mg/ml dithiothreitol (DTT; Fisher Scientific,
Nepean, On, Canada) and bromophenol blue to proceed for first dimension isoelectric
focusing. Denatured proteins were separated using 13 cm Immobiline DryStrip with a pH
range of 3-10 with IPGphor isoelectric focusing system (Amersham Biosciences).
Isoelectric focusing was done in 4 steps: active rehydration at 30 V for a minimum of 10 h;
500 V for 1 h; 1 000 V for 1 h and 8 000 V to reach a total of 17 500 Vh. After focusing,
strips were equilibrated for 15 min in 50 mM Tris-HCl, 6 M urea, 30% (v/v) glycerol, 2%
(w/v) SDS and bromophenol blue, and loaded onto 12% SDS-PAGE gels of 1 mm
thickness. Pre-stained molecular weight markers were run in parallel (Pre-stained protein
ladder, Canadian Life Technologies, Burlington, On, Canada). Gels were fixed in 10%
acetic acid and 40% methanol for a minimum of 30 min and then washed 3 times in water
and soaked for 30 min in Amplify (Amersham Biosciences) to intensify the signal. Gels
were dried and exposed for 30 days to Kodak Biomax MR Films at –80°C.
Proteome analysis The labelling experiments were repeated three times for all time periods. The radiograms
were analyzed with the ImageMaster 2D Elite image analysis software (Amersham
Biosciences) as previously described in our laboratory (Coenen, et al., 2004). Individual
proteins present in GV stage and matured oocytes, and 2- 4- and 8-cell embryos were
identified using the software. Only proteins present in at least 2 of the 3 replicates for each
stage were considered to create a reference gel of each stage. To determine which proteins
were constitutively expressed throughout oocyte maturation, the protein patterns from the
4h time intervals during IVM were compared. Comparisons were also made between the
three stages of embryos (2-cell, 4-cell and 8-cell), to determine which proteins were
constitutively expressed throughout these early stages of development. To elucidate which
proteins were expressed throughout all of oocyte maturation and embryo development, the
79 24-28h maturation period was compared with the 2-cell embryo stage, and only those
proteins expressed throughout either all of oocyte maturation or embryo development were
considered. Of these constitutively expressed proteins, only proteins which are already
present in immature oocytes were selected for sequencing and identification.
Protein identification and confirmation Although proteome analysis was performed with analytical gels containing 10 oocytes or
embryos, these gels do not contain enough protein to enable identification with mass
spectrometry techniques. A micropreparative gel containing 3000 denuded GV stage
oocytes was run and stained with Coomassie G250 Stain (Bio-Rad Laboratories, Hercules,
CA) to identify proteins of interest. The gel containing 3000 oocytes was run as described
previously except the first dimension isoelectric focusing time was extended to
accommodate the higher protein load. The program was 30V during 10h, 1h at 100V,
250V, 500V, 1000V, 2000V, 2 h at 4000V and at 8000V until it reached 16000Vh for a
total of 28150 Vh.
Proteins of interest from the micropreparative gel were manually excised using small tubes
of surgical steel (2, 3 and 4-mm diameter) mounted on 10 ml-syringes, washed 2 times 5
min in 50% acetonitrile in water and frozen at –20° until digestion and processed by
MALDI-TOF or MS/MS.
MALDI-TOF and MS/MS All protein identifications were performed at the Eastern Quebec Proteomics Centre, Centre
Hospitalier de l’Université Laval, Quebec, Tryptic digestions of the proteins were
performed on a MassPrep liquid handling robot (Micromass, Manchester, England)
according to the manufacturer’s specifications and using sequencing grade modified trypsin
(Promega, Madison, WI). The sample handling and analysis process is described in detail
by Novak and collaborators (Novak, et al., 2004).
80 In Silico protein confirmation The identification of the selected proteins was confirmed in silico. All steps of in silico
confirmation are summarized in Figure 6. If the protein identification from MALDI-TOF or
MS/MS was corresponding to a Bos taurus protein, only known post translational
modifications were added to measure the predicted mass of the modified peptide obtained
by mass spectrometry to validate the unidentified peaks. This process enabled the
identification of different isoforms. If the identified proteins were from Homo sapiens, Mus
musculus, rattus norvegious, equus gallus or sus scrofa, their corresponding nucleotide
sequence were used as a starting tool to find the homologous Bos taurus sequence in
nucleotide databases. First, the nucleotide sequence of the identified protein was used to
BLAST the EST-others database to find the corresponding Bos taurus ESTs. The resulting
multiple Bos taurus EST sequences were aligned using the identified sequence as a
template. Once the sequence was aligned, the new nucleotide sequence was translated. As a
result, the theoretical bovine protein sequence was found.
Once the hypothetical bovine protein sequence was found, the in silico peptide mass
fingerprint was determined. An in silico tryptic digestion with zero to two missed cuts and
all modifications caused by the identification process were added to digested peptides to
match with the experimental peptide mass fingerprint. Modifications to amino acids were
the carboxamidomethylation of cysteine and oxidation of methionine. All peptides were
charged [M+H]+ during the MALDI-TOF process. The experimental and in silico peptide
mass fingerprint were then compared, using a mass deviation of less than 0.1 Da between
the predicted and experimental peptide. New peptides found by the in silico identification
correspond to unique new Bos taurus peptides that are different from originally unmatched
peptides from another species. This in silico confirmation increased the number of peptides
matched between the theoretical and experimental protein, and confirm the identification.
81
Results Embryos were cultured in the presence of α-amanitine, thereby limiting the protein
synthesis during embryo development to translation of maternal mRNA. Following
radiolabelling, the 2DE gels and image analysis, the number of proteins detected in 2-cell,
4-cell and 8-cell stage embryos, was 291, 373 and 252, respectively (Figure 7). These
proteins represent the average protein pattern of each studied developmental stage, where
only proteins present in at least 2 of 3 replicates for each stage were considered. Of these
proteins, 70, 83 and 28 proteins were translated exclusively at the 2, 4 and 8-cell stage,
respectively. Between the 2-4-cell stages, the 4-8-cell stages and the 2-8-cell stages, there
are 82, 85 and 16 proteins that are shared, respectively. There are 123 proteins that are
continuously synthesized de novo during all three stages and represent candidates for
potential MHKP (Figure 8).
The details of protein synthesis patterns during oocyte maturation have been previously
reported in our laboratory (Coenen, et al., 2004). In this study, a total of 92 proteins were
synthesized throughout in vitro maturation. These 92 proteins are candidates for MHKP.
To determine if some of the 92 constitutively expressed proteins from oocyte maturation
are identical to the 123 proteins expressed continuously throughout development, the
protein patterns between the oocyte and the embryo have been overlaid. From the 92
proteins synthesized during oocyte maturation and the 123 proteins synthesized de novo
during early embryo development before the MET, only 46 proteins are shared (Figure 9a).
These represent the potential MHKP. To identify which proteins are already present in
immature oocyte, a micropreparative gel was made with 3000 immature bovine oocytes for
identification of these 46 proteins. Of these 46 proteins, 32 were successfully detected on
the micropreparative gel (Figure 9b).
Twenty-one of the 32 proteins were sent for identification by mass spectrometry: spot
numbers are 44, 45, 50, 67, 95, 120, 135, 139, 146, 213, 236, 254, 271,272, 285, 329, 335,
336, 345, 348 and 361. Eleven spots have been identified with high confidence using in
manual and in silico confirmation: 44, 50, 67, 236, 271, 272, 335, 336, 345, 348 and 361.
82 Their identification results are present in Tableau 5. Six identified spots were known from
Bos taurus databases, and two different spots, 335 and 336, were identified as the same
protein. The other proteins were identified from other species databases. For the Bos taurus
unknown proteins, the Bos taurus EST databases have been scanned to recreate the Bos
taurus mRNA as explained in Figure 6. The 2,3-bisphosphoglycerate (2,3-BPGM) mutase
was the only protein that could not completely be rebuilt in the Bos taurus EST database.
Nevertheless, in Tableau 6, each newly created Bos taurus mRNA and its corresponding
theoretical mass peptide fingerprint has increased the number of matched experimental
peptides and consequently the coverage rate. The newly matched peptides have confirmed
the hypothetical identification previously obtained.
Sometimes, proteins from a same protein family, isoform or from replicated genes can
share similar protein sequences, thus making identification or distinction more difficult. In
this study, protein number 361 was identified as either β and γ actin. Further research was
done to discriminate between β and γ actin isoforms. The mRNA sequence of the Bos
taurus γ-actin, which was not completely known, was reconstructed using the Bos taurus
EST databases. Both proteins are similar except for four amino acids at the N-terminal end.
Examination of each of these isoforms from different species showed that both proteins
undergo post-translational modifications: acetylation of the N-terminal end and methylation
on the histidine-72. For our Bos taurus protein, each post-translational modification has
been confirmed except for the acetylated N-terminal for the beta isoforms by adding the
corresponding additional mass for acetylation and methylation, followed by matching the
newly separated peptide masses. Unfortunately, the presence of the beta isoform cannot be
confirmed as absent, as the corresponding peak was not clearly established in the
experimental MALDI-TOF spectra. Another alternative for possible differentiation between
the two isoforms is to see if their respective mRNA is present in the oocyte. The coding
region of the mRNA from each isoform shares a high homology, however their 3’-UTR
regions are different. A PCR was performed against their 3’-UTR regions, and it was
determined that both mRNA are present in the oocyte (data not shown). In conclusion, as
mRNA from both isoforms is present, and the molecular weight of the isoforms differs by
83 only 99.89 Da and 0.05 pI units, there is a high probability that both proteins are translated
and present.
Discussion The problems frequently encountered in the identification of bovine proteins in such a
study depend on the availability of bovine sequences in various databases. In Table 3, there
is an update of some different public databases. Although these databases are increasing in
size every month, the representation of bovine genes, cDNA, proteins and expressed
sequence tags (EST) remains relatively low. Half of the proteins sent for sequencing have
not been identified probably because of the limited knowledge of the Bos taurus genome
and their limited protein sequence homology with other species. The same problem has
been observed in high throughput research on the developmental competence of the Bos
taurus oocyte, where large numbers of unidentified clones where found (Robert, et al.,
2000, Robert, et al., 2001, Donnison and Pfeffer, 2004, Fair, et al., 2004b). However, the
information present from different species can allow the identification of the potential
MHKP of bovine oocytes and early embryos by MALDI-TOF and MS/MS. In addition, we
have shown the possibility of using EST databases to elucidate the mRNA sequence of an
unknown Bos taurus sequence from the identified protein of foreign species. With this
method, we were able to increase the peptide coverage to confirm identification and create
new specific Bos taurus peptides.
In this study, ten of the 32 proteins present in the immature oocyte and translated from
maternal mRNA during maturation and early embryo development up to the MET have
been identified (Tableau 5). These proteins are four chaperones: (HSC71, HSP70-2, CCTε
and CypA), two proteins related to the protein degradation pathway (UCH-L1 and E2D3),
the glycolytic pathway protein, 2,3-BPGM, the cytoskeleton proteins, β and/or γ-actin, an
anti-oxidant protein, GSTM5, and one protein implicated in lipid transport, the E-FABP.
Among these proteins, only β-actin, γ-actin, and CypA were known and widely recognized
as standard housekeeping genes. (Feroze-Merzoug, et al., 2002, Robert, et al., 2002b,
Ropenga, et al., 2004). Regardless of the species, out of these ten identified proteins only
84 the E-FABP has yet to be reported in the oocyte or the ovary, and CCTε has never been
observed in the oocyte.
It has already been shown by Frei and collaborators (1989) that the rate of protein
synthesis, as reflected by the incorporation rate of Met-[S35], diminishes between the
zygote and the 8-cell stage, and others have reported reduction of the total protein content
during this time (Thompson, et al., 1998). However, the present results suggest that the
reduction of translational activity is not associated with a reduction of diversity of proteins,
as in general the number of protein species remains relatively stable between the 2-cell and
8-cell stages, but it is probable that a general reduction in the rate of synthesis of each
protein occurs before MET.
The protein pattern obtained by 2DE gels between the 2-cell and 8-cell stages seems
similar, however there are only 123 proteins detected that are synthesized throughout all
developmental stages studied, which represent 41%, 33% and 49% of the total detected
proteins at the 2, 4 and 8-cell stage, respectively. It is obvious however that there were no
major changes in the pattern of de novo synthesized proteins before the MET compared
with the protein pattern observed after the MET as observed in one-dimension gels during
bovine embryo development (Frei, et al., 1989). Nevertheless, the present results suggest
that some changes in the protein pattern occur before the MET as less than 50% of
synthesized proteins are conserved between 2-cell up to 8-cell stage. The changes in the
proteins expressed between the 2-cell stage and the 8-cell suggest that the translation of
maternal mRNA presents a transition during embryo development that will drive the
embryo to the MET. This hypothesis is supported by the fact that except for the 123
proteins, almost no proteins are shared by the 2-cell and the 8-cell stage. Furthermore, new
proteins appear at each stage of development and there are proteins that are uniquely
detected in each stage. This relative exclusivity reflects the importance of each
developmental stage in the programming and the preparation of the embryonic genome to
the MET.
Previous work from our laboratory (Coenen, et al., 2004) has shown that the number of
proteins constantly synthesized throughout oocyte maturation (n = 92) is less than for the
85 three embryo stages in this study (n = 123). As these proteins are suspected to be maternal
housekeeping proteins, it is surprising that only 46 proteins are shared between oocyte
maturation and the early embryo development before the MET. This observation may
suggest that the basal metabolism of the oocyte maturation and the early embryo
development are not exactly the same. Fertilization of the oocyte must trigger a switch in
maternal mRNA translation. However, out of these 46 proteins, 70% are already present in
immature oocytes, which suggest that they play an important role from the growth of the
oocyte and the embryo up to the MET.
Protein identity confirmation is required in all proteomic studies involving mass
spectrometry analysis. The in silico confirmation method for protein identification
presented here is very useful in the study of the bovine oocyte proteome. For each protein
identified from a species other than Bos taurus, the in silico confirmation method has
increased the number of matched peptides from the MALDI-TOF spectra for each protein.
This novel method has demonstrated that the analysis of the peptide mass fingerprint can be
made directly using the EST databases, and has also shown the importance of working with
the peptide mass fingerprint from the MALDI-TOF analysis. In addition, the peptide mass
fingerprint can also be deduced from the MS/MS analysis, as the mass of each fragmented
peptide is given in the list of analyzed peaks. However, direct screening of EST databases
can serve as a starting point since many possible matched peptides can be missed as the
ESTs represent only a partial protein sequence. In silico confirmation can be used to match
peptides that overlay two EST sequences. Furthermore, the inability to differentiate
between the presence of β and γ actin, has shown that particular attention must be paid
when different isoforms of a protein exist.
The most abundant and common protein family found in the present study are the
molecular chaperones: chaperones HSC71 and HSP70-1, the CCTε, and CypA. In general,
chaperones assist protein folding from their denatured state to the correctly folded product
(Ellis and van der Vies, 1991, Bukau and Horwich, 1998). The present results confirmed
previous observations that both constitutive and inducible forms of HSC71 and HSP70,
respectively, are translated during bovine oocyte maturation and early embryo development
86 (Edwards and Hansen, 1996, Edwards and Hansen, 1997a) and HSC71 is also translated
during pig oocyte maturation (Novak, et al., 2004). Without exposure to heat shock, the
presence of the inducible form of HSP70 might act as protein carrier and participate in
post-translational modifications (Lund, 1995). These proteins could also affect the
microtubule network during the completion of MII in addition to maintaining the integrity
of the nucleus/nucleolus (Kawarsky and King, 2001). During oocyte maturation and
embryo development up to the 2-cell stage, the regulation of the length of the poly(A) tail
of the HSP70 messager has been studied (Brevini, et al., 2002). It follows a reduction
pattern during maturation and an elongation pattern during the zygotic and 2-cell stage.
Interestingly, it has been recently shown that the amount of mRNA of HSP-70 is possibly
related to developmental competence of bovine oocytes (Humblot, et al., 2005).
A member of the class II chaperonins, the hetero-oligomeric chaperonins-containing TCP-1
(CCT) contains 8 subunits, including the subunit CCTε (Rommelaere, et al., 1993, Creutz,
et al., 1994, Kubota, et al., 1994, Hynes, et al., 1996). In vivo, actins and tubulins are the
major substrate of CCT (Sternlicht, et al., 1993, Llorca, et al., 2001). It has been shown that
the subunit CCT� is one of the subunits that interact specifically with actin (Llorca, et al.,
1999). In yeast, a series of data indicates the importance of CCT for the proper organization
of microtubules, by displaying cell-cycle arrest (Ursic, et al., 1994), perturbation in nuclear
division and microtubule migration (Chen, et al., 1994, Miklos, et al., 1994). The
cyclophilins were discovered as cellular binding protein for cyclosporin A, an
immunosuppressive drug (Handschumacher, et al., 1984). After many years of research, it
appears that cyclophilins are multifunctional proteins that are involved in protein folding,
gene expression (Yang, et al., 2005), mitochondrial functions, apoptosis (Montague, et al.,
1994), interaction with CD147, the immune system, and cancers (Yao, et al., 2005). CypA
is ubiquitously distributed in many cell types and is the most abundant cyclophilins. CypA
has peptidylprolyl cis-trans-isomerase activity (PPIase), which is crucial for is chaperone
activity (Galat, 1993). In conclusion, the chaperones found in this study seem to play a
direct role in oocyte meiotic resumption and early embryo mitosis.
87 The 2,3-BPGM is usually related to erythroid tissue, and more specifically reticulocytes. In
erythrocytes, 2,3-bisphosphoglycerate mutase (BPGM) is a multifunctional enzyme that
controls the metabolism of 2,3-diphosphoglycerate (Fujita, et al., 1998), the main allosteric
effectors of haemoglobin (Joulin, et al., 1986). The 2,3-BPGM has been reported to be
oocyte specific as it is not present in post-MET mouse 8-cell embryos (Zeng, et al., 2004).
The BPGM found in this study could be related to the production of pyruvate in the
glycolysis pathway by producing the 2,3-diphosphoglycerate and thus energy for the
oocyte.
Two proteins of the ubiquitin pathway have been found, the ubiquitin carboxy-terminal
hydrolase L1 (UCH-L1) and the ubiquitin-conjugating enzyme E2D3. UCH-L1 is
implicated in proteolytic pathway as a deubiquitinating enzyme (Larsen, et al., 1998)
whereas E2D3 is implicated in ubiquitination itself. The UCH-L1 is one of the most
abundant proteins in the brain (Wilkinson, et al., 1989, Wilkinson, et al., 1992), and it has
recently shown to be more abundant in the pig oocyte than actin (Ellederova, et al., 2004).
Its presence is also important in testis and epididymis and may play an important role in the
regulation of spermatogenesis and sperm quality control (Kwon, et al., 2005). It belongs to
the deubiquitinating enzymes, and its thought to cleave polymeric ubiquitin to monomers
and to hydrolyze bonds between ubiquitin molecules and small adducts such as glutathione
and cellular amines (Larsen, et al., 1998). The ubiquitin-conjugating enzyme E2D3 has not
been studied particularly. It is one of the multiple E2 enzymes, which give substrate
specificity for ubiquitination (Semple, 2003). The presence of the ubiquitin protein pathway
in the oocyte and early embryo is important as the turnover of proteins is fast. As discussed
previously in this paper, a transitional protein pattern is observed during early embryo
development and the protein pattern changes during oocyte maturation (Coenen, et al.,
2004). The ubiquitin pathway is particularly essential for driving the cell cycle (Hershko, et
al., 1991, Bebington, et al., 2001, Huo, et al., 2004, Sun, et al., 2004) and in the fertilization
process (Sutovsky, 2003).
In general, the glutathione-S-transferase protects against reactive oxygen species (ROS)
and electrophilic compounds (Hayes and Pulford, 1995). The isoform found in this study,
88 the GSTM5 has been found previously in brain, testis and lung tissues (Takahashi, et al.,
1993) and during pig oocyte maturation (Ellederova, et al., 2004). The isoform GSTM5
seems to be important in germ cells. It is one of the most abundant proteins in the pig
oocyte (Ellederova, et al., 2004). Interesting fact is that the amount of GSTM5 is stable
during pig oocyte maturation. This constant amount is probably support by a constant
translation like the one present in this study. In the testis, this isoform was specifically
detected and the most abundant isoform in the germ cells (Rao and Shaha, 2001).
This is the first report of E-FABP in the oocyte. The E-FABP is implicated in binding,
targeting and transport of long-chain fatty acids (Glatz, et al., 1993, Siegenthaler, et al.,
1993, Siegenthaler, et al., 1994). It is usually found in the epidermal cells, keratinocytes, it
has previously been found in brain (Cheon, et al., 2003), liver (Yu, et al., 2000) and
monocytes (Grau, et al., 2003). Other isoforms of FABP have been found in the
reproductive system. A specific testicular isoform has shown to be important in sperm
quality (Kido, et al., 2005). The heart isoforms (hFABP) have been found in zebrafish
oocyte (Liu, et al., 2003). The hFABP is also present in the bovine blastocyst (Dufort and
Sirard, personnal communication). The mRNA of hFABP is up regulated in the BSA
mSOF system compared to in vivo and FSC supplemented mSOF medium. In vitro-
produced bovine embryos differ from their in vivo counterparts has the lipid content
present more triglycerides and less lipids from other classes (Abd El Razek et al., 2000).
Therefore the present of the E-FABP maternal housekeeping protein related to the lipid
transport may play a key role in the oocyte and embryo lipid metabolism.
The presence of the isoforms β-actin and γ-actin in the bovine oocyte is not surprising. In
mouse oocytes, β-actin is the most abundant protein followed by γ-actin (Taylor and Piko,
1990). In the bovine, β-actin has been frequently used as a housekeeping marker (Bilodeau-
Goeseels and Schultz, 1997b, Robert, et al., 2002b). In contrast to γ-actin, the complete
protein sequence of γ-actin in Bos taurus is not known. We have however, deduced the
projected protein sequence by using the EST database. The β-actin mRNA is well
characterized in the bovine oocyte. The amount of β-actin messenger varies across oocyte
maturation and the embryo preimplantation period (Bilodeau-Goeseels and Schultz, 1997b,
89 Robert, et al., 2002b, Fair, et al., 2004b). However the length of the polyA tail is stable
during maturation up to the 2-cell embryo, suggesting that the translation of β-actin should
be relatively constant (Brevini-Gandolfi, et al., 1999b, Brevini, et al., 2002). Our results are
in agreement in the previous results from Brevini and collaborators as β-actin is translated
continuously during oocyte maturation and early embryo development to the MET.
However, the translation pattern of HSP70 is similar to β-actin, but the length of the polyA
tail is not constant through maturation and embryo development as mention earlier. So, we
can not assume that the regulation of the length of poly(A) of the mRNA of all the proteins
identified in this study are similar.
In conclusion, proteins translated during preimplantation embryo development before the
MET represent a transitional protein pattern that prepares the embryo for MET.
Furthermore, when comparing protein synthesis patterns on 2DE gels, we have found that
few proteins are shared between oocyte maturation and embryo development. From these
shared proteins, so-called MHKP, only the β-actin/γ-actin and CypA were known and
already categorized as housekeeping genes. This shown that the oocyte and early embryo
have specificity in his housekeeping maintenance system and this is the first evidence of
some of these proteins in the oocyte. Most of proteins have been already found in the
oocyte or in the ovary, but a new protein can be added to the oocyte proteome, E-FABP.
These MHKP proteins can be used as markers for future proteomic studies on bovine
oocyte maturation and the first step of embryo development up to the 8-cell stage. Finally
the value of an in silico protein identification confirmation in proteomics of rare tissue has
been demonstrated in species where the complete protein map is not available.
90
Acknowledgement The authors thank the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada for
their financial support and Dr Susan Novak and Dr Mathieu Boilard for critical reading of
the manuscript.
91 T
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5
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5.7
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2495
339
67
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6.130
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5
271
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5 MM
6.4
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26.9
35
6754
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272
MALD
I-TOF
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oxyl-
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H-L1
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26.7
5.1
24.9
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2924
335
LC-M
S/MS
Cy
cloph
ilin A
Cy
pA
BT
7.513
.8 8.4
17
.9 30
68
401
336
LC-M
S/MS
Cy
cloph
ilin A
Cy
pA
BT
7.613
.8 8.4
17
.9 30
68
401
345
LC-M
S/MS
Ub
iquitin
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gatin
g enz
yme E
2D3
E2D3
HS
7.1
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12
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348
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Actin
γ-A
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5.3
48.8
5.4
41.7
53
2265
5316
16
25
1 BT
: Bos
taur
us; E
C :
Equu
s cab
allu
s; H
S : H
omo
sapi
ens;
MM
: M
us m
uscu
lus
92 Tableau 6 In silico confirmation of identified proteins from foreign species with complete or partial construction of the Bos taurus protein sequence from the Bos taurus EST database. The number of peptides matched and the coverage rate for each protein is compared between the actual MALDI-TOF or MS/MS analysis and those obtained in silico with the new Bos taurus protein sequence from the Bos taurus EST database are indicated
Observed In silico confirmation Spot No. Identification Protein
sequence Peptides matched
(n)
Sequence covered
(%)
Peptides matched
(n)
Sequence covered
(%) 67 CCTε Complete 17 31% 18 34% 236 2,3-BPGM Partial 7 25% 10 34% 271 GSTM5 Complete 10 38.8% 17 65% 272 UCH-L1 Complete 6 35% 13 49% 345 E2D3 Complete 2 12.2% 7 36%
93 Tableau 7 Update of public databases of nucleotides, genes and proteins in different species
*http://ca.expasy.org/sprot/relnotes/relstat.html (Update December 6th 2005) **http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=unigene (Update December 19th 2005) ***http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/dbEST_summary.html (Update November 11th 2005)
NCBI Swiss-Prot* Nucleotide EST*** UniGenes** Proteins
Rank n Rank n Homo sapiens 7 471 078 54 576 208 280 1st 7 057 754 1st 13186Mus musculus 5 780 661 43 104 125 964 2nd 4 688 047 2nd 10281Rattus norvegious 1 108 716 41 687 45 714 4th 704 494 5th 4740Bos taurus 652 239 39 432 12 165 7th 702 645 14th 1725
94
Figures
METα-amanitine
-24 0 36 48 60 108 hpi
GV MII 1-cell 2-cell 4-cell 8-cell 16-cell
METα-amanitine
-24 0 36 48 60 108 hpi
GV MII 1-cell 2-cell 4-cell 8-cell 16-cell
Figure 5 Scheme of labeling experiment described in materials and methods.
95
Figure 6 Seven steps for in silico identification confirmation of a protein identified by MALDI-TOF from species other than bos taurus. This process can be used to identified post-translational modified peptides and discriminate different isoforms. The first five steps serve to reconstitute the unknown Bos taurus mRNA and protein starting with the mRNA of the identified proteins. Step 6 and 7 is the comparison of the in silico tryptic digestion of the newly reconstituted Bos taurus protein with the experimental MALDI-TOF peptide mass fingerprint (PMF). If new specific Bos taurus peptides are matched, the identification is confirmed. The given websites are useful tools that have been used in this process.
1. MALDI-TOF results analysis: Identification of protein from a foreign species
2. Template: Nucleotide sequence of the identified protein
3. Search for dbEST database: Nucleotide-Nucleotide BLAST search for bos taurus dbEST homologous sequences
4. Construction of the new bos taurusmRNA: Alignment of bos taurus dbEST and selection of concensus sequence
5. New bos taurus protein: Translation of the new bos taurus mRNAand selection of the open reading frame
6. In silico MALDI-TOF: Theoretical tryptic peptide mass fingerprint (PMF)
7. Identification confirmation: Comparaison between theoretical in silico and experimental PMF (Difference < 0.1 Da)
http://us.expasy.org/tools/peptide-mass.html
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
http://www.ebi.ac.uk/clustalw/
http://us.expasy.org/tools/dna.html
http://prowl.rockefeller.edu/profound_bin/WebProFound.exehttp://www.matrixscience.com/cgi/search_form.pl?FORMVER=2&SEARCH=PMF
NH3____________________COOH
Theoretical
1958.98581717.80361605.73521510.70281261.50411239.61901188.66231084.5092
Experimental
1958.9791605.7341261.5891207.423 1188.665
5’____________________3’
5’____________________3’
NH3____________________COOH
NH3 ____/___/_/_____/_/__/___COOH
5’____________________3’
1. MALDI-TOF results analysis: Identification of protein from a foreign species
2. Template: Nucleotide sequence of the identified protein
3. Search for dbEST database: Nucleotide-Nucleotide BLAST search for bos taurus dbEST homologous sequences
4. Construction of the new bos taurusmRNA: Alignment of bos taurus dbEST and selection of concensus sequence
5. New bos taurus protein: Translation of the new bos taurus mRNAand selection of the open reading frame
6. In silico MALDI-TOF: Theoretical tryptic peptide mass fingerprint (PMF)
7. Identification confirmation: Comparaison between theoretical in silico and experimental PMF (Difference < 0.1 Da)
http://us.expasy.org/tools/peptide-mass.html
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
http://www.ebi.ac.uk/clustalw/
http://us.expasy.org/tools/dna.html
http://prowl.rockefeller.edu/profound_bin/WebProFound.exehttp://www.matrixscience.com/cgi/search_form.pl?FORMVER=2&SEARCH=PMF
NH3____________________COOH
Theoretical
1958.98581717.80361605.73521510.70281261.50411239.61901188.66231084.5092
Experimental
1958.9791605.7341261.5891207.423 1188.665
5’____________________3’
5’____________________3’
NH3____________________COOH
NH3 ____/___/_/_____/_/__/___COOH
5’____________________3’
96
Figure 7 Number of proteins translated from maternal mRNA during embryo development at the 2-cell, 4-cell and 8-cell stages, for a total of 291, 373 and 252 proteins respectively. The number of proteins shared by two or three developmental stages is shown in circle intersections. The numbers outside of these intersections are proteins expressed only during that particular developmental stage.
123
82
8516
2-cell
4-cell
8-cell
70
28
83
123
82
8516
2-cell
4-cell
8-cell
70
28
83
97
pH 3 10 3 10181.8 __115.5 __
82.2 __
64.2 __
48.8 __
37.1 __
25.9 __
19.4 __
14.8 __
6.0 __
Mw (kDa)
181.8 __
115.5 __82.2 __
64.2 __
48.8 __
37.1 __
25.9 __
19.4 __
14.8 __
6.0 __
Mw (kDa)
A) B)
C) C’)
4467
50
361
348345
335336
271
236272
pH 3 10 3 10181.8 __115.5 __
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Mw (kDa)
181.8 __
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Mw (kDa)
A) B)
C) C’)
4467
50
361
348345
335336
271
236272
Figure 8 2DE gels illustrating proteins that are translated from maternal mRNA during early embryo development. A) at the 2-cell stage between 36-40 hpi, B) at the 4-cell stage between 45-49 hpi and C) at the 8-cell stage between 60-64 hpi. Panel C’) is based on 8-cell stage gels and the 123 spots represent the proteins that are expressed throughout these three stages of development. The numbered proteins are the 11 identified spots found in Tableau 5.
98
Figure 9 A) Averaged gel of oocytes in MII stage between 24-28 h of in vitro maturation. The encircled spots represent the proteins that are commonly expressed throughout oocyte maturation (n=92). The 46 arrowed proteins represent the proteins that are commonly expressed during oocyte maturation and embryo development up to and including the 8-cell stage. The black and white arrows represent the proteins that are respectively found or not in the immature oocytes CBB gel. B) Micropreparative CBB gel of 3000 GV stage bovine oocytes. The 32 encircled proteins are the maternal housekeeping proteins; they are present at the germinal vesicle stage (GV) and are translated up to the 8-cell stage. The numbered proteins have been sent for mass spectrometry analysis. The black arrowed proteins have been identified and the numbers correspond to those found in Tableau 1
181.8__115.5__
82.2__
64.2__
48.8__
37.1__
25.9__
19.4__
14.8__
6__Mw (kDa)
4467
50
361
348345
335336
271
236
272
45
95
120
135139146
213
254
285
329
4467
50
361
348345
335336
271
236
272
45
95
120
135139146
213
254
285
329
pH 3 10 3 10
A) B)
99
CHAPITRE IV
PROTEOMIC STUDY AND IDENTIFICATION OF PROTEIN SYNTHESIZED BY 2-CELL IN VITRO PRODUCED BOVINE
EMBRYOS OF VARYING DEVELOPMENTAL COMPETENCE
Lyne Massicotte, Karine Coenen and Marc-André Sirard
100
Résumé L’identification des facteurs reliés à la compétence au développement est l’un des plus
grands enjeux de la biologie du développement. Par contre, les différentes qualités
d’embryons produits in vitro interfèrent dans la découverte de ces facteurs. Trois groupes
d’embryons de 2-cellules de compétence différente furent sélectionnés à partir de la triple
sélection. Ceux de haute compétence (HDC) et de compétence moyenne (LDC) sont des
embryons qui clivent rapidement, mais dont le premier groupe vient des COC légèrement
atrésiques provenant de follicules entre 5-10mm et l’autre groupe vient de COC en santé
provenant de follicules de 3-5mm. Les embryons incompétents (NDC) sont des embryons
de 2-cellules qui ont clivé tardivement et qui proviennent de COC en santé de follicules
entre 3-5mm. Les protéines des embryons de 2-cellules furent marquées au S35-Met et
S35-Cys et visualisés en gel 2DE. De l’α-amanitine fut ajoutée au milieu de culture des
embryons afin d’inhiber la transcription embryonnaire. Les groupes HDC et LDC furent
marqués entre 36-40hpi et les NDC entre 45-49hpi. La faible homologie entre les patrons
de protéines totales et les protéines traduites a permis de repérer 22 protéines sur 138
protéines potentiellement associées à la compétence par spectrométrie de masse. Des 5
protéines les plus abondantes, deux seulement étaient présentes uniquement dans les HDC
et les trois autres étaient également présentes dans les LDC: la thiolase cytosolique,
l’isocitrate déshydrogénase, la peroxiredoxine 6, la sous-unité alpha du proteasome-6, la
thiamine triphosphatase et la protéine hypothétique My027. L’identification de ces
protéines donne un aperçu des facteurs reliés à la compétence au développement de
l’ovocyte bovin.
101
Abstract Identification of factors related to developmental competence in the oocyte presents one of
the most important challenges in developmental biology. However, the variation in quality
of in vitro produced embryos interferes with the discovery of these important factors. In
this study, three groups of embryos with differing levels of developmental competence
(high, low and no), were compared. The high developmentally competent embryos were
early cleaving embryos obtained from oocytes in the early stage of atresia from follicles of
diameters from 5 to 10 mm and the low developmental embryos were derived from healthy
COC aspirated in follicles of diameters between 3 and 5 mm. The non-developmentally
competent (NDC) embryos were late cleaving embryos from healthy COC and 3-5 mm
follicles. Two-cell embryos from these treatment groups were labelled with S35-Met and
S35-Cys and the newly synthesized proteins were visualized by two-dimensional
electrophoresis (2DE). To prevent de novo embryonic transcription embryos were also
incubated with α-amanitine. The HDC and LDC groups were radiolabelled between 36-
40hpi whereas NDC embryos were radiolabelled between 45-49hpi. Poor homology
between translated and total protein pattern allowed the tracking of 22 of the 138 proteins
associated with developmental competence for mass spectrometry analysis. Five abundant
spots, two present in the HDC only and three present in both HDC and LDC groups were
identified: cytosolic thiolase, isocitrate dehydrogenase 1, peroxiredoxin 6, proteasome-α6
and thiamine triphosphatase. The identification of these proteins has given some insight
into the important factors related to developmental competence in bovine oocytes.
102
Introduction The quality of an oocyte is most often evaluated by its capacity to proceed to the blastocyst
stage following fertilization, but ultimately it must be associated with the birth of a healthy
offspring (Duranthon and Renard, 2001). It is well known that in vivo matured oocytes are
more competent than in vitro matured oocytes (reviewed by Lonergan, et al., 2003c) and
the intrinsic problem originates from the quality of the oocyte. Developmental competence
of the oocyte has been related to follicular size, cumulus-oocyte complex (COC)
morphology and the time of first cleavage of the embryo (see section 2.3). Follicles beyond
2-3mm represent oocytes that are all able to complete meiosis (Fair, et al., 1995), but have
limited abilities to produce blastocysts (Pavlok, et al., 1992, Blondin and Sirard, 1995,
Hendriksen, et al., 2000).
During the growth and maturation of the oocyte, proteins and mRNA are stockpiled in
order to prepare and supply material to the developing embryo until the maternal-
embryonic transition (MET), when the embryonic genome is activated. The major MET
occurs at the 8-16-cell stage in the cattle (Telford, et al., 1990, De Sousa, et al., 1998b,
Memili and First, 2000). A minor transcription occurs before this period (Plante, et al.,
1994, Viuff, et al., 1996) and some proteins of embryonic origin have been visualized by
two-dimensional electrophoresis (2DE) (Memili and First, 1999). However, proteins that
are synthesized from oocyte maturation through to the MET may be critical to MET
induction and the future development of the embryo.
Efforts are now being made to understand the oocyte quality at a molecular level. The
suppression subtractive hybridization approach (SSH) has been useful to identify factors of
developmental competence in oocytes according to follicular size (Robert, et al., 2000,
Donnison and Pfeffer, 2004) and with respect to the time of first cleavage (Fair, et al.,
2004b). Although quite informative, the mRNA analysis does not indicate if the associated
protein is actually being translated or is functionally active at a given time. Electrophoresis
gel analysis has been used in different species to study the variation of the protein pattern in
the oocytes and early embryos (Schultz, et al., 1979, Cullen, et al., 1980, Barnes and
Eyestone, 1990, Latham, et al., 1991, Latham, et al., 1994, Tedeschi, et al., 1998, Coenen,
103 et al., 2004), yet none of these studies have examined proteins directly related to
developmental competence.
The present study was designed to compare high, low and none developmentally competent
embryo population according to three different selection criteria; follicular size, COC
morphology and the time of first cleavage (see CHAPITRE II). Secondly, proteomic analyses
using radiolabelling, two-dimensional gels (2DE), image analysis, mass spectrometry were
applied to these embryos to identify potential protein related to developmental competence.
104
Materials and Methods All reagents and media supplements used in these experiments were obtained from Sigma-
Aldrich (Oakville, Ontario, Canada) unless otherwise indicated. TCM-199 and MEM
amino acids were provided by Gibco Laboratories (Burlington, Ontario, Canada).
Oocyte and embryo selection and in vitro culture Ovaries from cycling heifers or cows were harvested after slaughter. Ovaries arrived at the
laboratory within 4h after collection at around 32°C in a saline solution (0.9% (w/v) NaCl
containing 100 000 IU•l-1 penicillin, 100mg•l-1 streptomycin and 250µg•l-1 amphotericin
B). All follicles were aspirated using an 18-g needle attached to a 10 ml syringe and
collected in a 50 ml Falcon centrifuge tube. COCs from follicles larger than 5 mm were
harvested in a Hepes-buffered Tyrode’s medium (TLH) supplemented with 0.3% (w/v)
Fraction V BSA, 0.2 mM pyruvic acid, 50 mg•ml-1 gentamicin, and 10 IU•ml-1 of Heparin
(Hepalean, CDMV, Québec) to prevent follicular fluid coagulation. COCs were separated
based on the follicular size, between 3-5 mm inclusively and between 5-10 mm exclusively,
and the morphology of the COCs, as either healthy or exhibiting early signs of atresia
(Blondin et al 1995).
The modified SOF (mSOF) system described in section (Modified SOF (mSOF) system)
was used for oocyte maturation and embryo culture. The fertilization system (IVF) used in
this experiment is described in details at section (In vitro Fertilization (IVF).
Identification of proteins associated with developmental competence
Radiolabelling of 2-celled embryos for detection of newly synthesized proteins Based on the blastocyst rates obtained from the triple selection, three groups of different
developmental competency at the early 2-cell stage were labelled with radioactivity to
visualize their translational activity. The groups were 2-cell embryos at 36hpi from 5-
10mm follicles and early atretic COCs, with high developmental competency (HDC),
cleaved 2-cell embryos at 36hpi from 3-5mm follicles and healthy COCs, with low
105 developmental competency (LDC), and 2-cell cleaved after 36hpi from 3-5mm follicles and
healthy COCs, with no developmental competency (NDC) . Radiolabelling occurred for 4 h
periods between 36-40hpi for 2-cell HDC and LDC embryos, and between 45-49 hpi for
NDC embryos Figure 10. After fertilization, embryos designated for radiolabelling were
incubated with 100 µg•ml-1 of α-amanitine to prevent new transcription. The embryos
were radiolabelled with 1mCi·ml-1 of Tran35S-LabelTM with 70% of [S35]-Methionine
and 15%[S35]-Cysteine (specific activity:1175Ci·mmol-1) (ICN Canada Ltd, Saint-
Laurent, Qc, Canada) in an culture environment set at 38.5°C, 7% O2, 5% CO2, 95% air
atmosphere, and 100% humidity for 4 h. After radiolabelling, the embryos were washed
three times in TLH without BSA and three times in phosphate buffered saline (PBS). Pools
of 10 embryos were frozen at –80°C before being processed in 2D gels.
Groups of distinct ten embryos per treatment were used for 2DE. Replicates were done
according to the number of embryos available; HDC (n=4), LDC (n=7) and NDC (n=5).
The electrophoretic separation of proteins has been described elsewhere by Coenen et al.
(2004). Briefly, embryos were solubilised in rehydration buffer for the first dimension.
Proteins were separated using 13 cm Immobiline DryStrips with a pH range of 3-10 with
the IPGphor isoelectric focusing system (Amersham Biosciences). Isoelectric focusing was
done in 4 steps: active rehydration at 30 V for a minimum of 10 h; 500 V for 1 h; 1 000 V
for 1 h and 8 000 V to reach 17 500 Vh final. After focusing, strips were equilibrated for 15
min and loaded onto 1 mm 12% SDS-PAGE gels. The gels were fixed in 1:4 acetic acid
and methanol for a minimum of 30min, gels were washed 3 times in water and soaked for
30 min in Amplify (Amersham Biosciences) to enhance the signal. They were then dried
and exposed for 30 days to Kodak Biomax MR Films at –80°C.
The radiograms were analysed with the ImageMaster 2D Elite Version 4.1 image analysis
software (Amersham Biosciences). The analysis was performed as previously described
(Coenen, et al., 2004). The average protein pattern for each treatment represents proteins
that have been observed in at least half of the replicates (2 of 4 gels for the HDC group, 4
of 7 replicates for the LDC group and 3 of 5 replicates for the NDC group). After
determining the average protein pattern for each treatment, the protein patterns from the
106 LDC and NDC groups were compared to the HDC embryos to identify the additional
proteins present in developmentally competent embryos.
Identification of the proteins associated with developmental competence To obtain enough material to create a master gel for protein sequencing, around 2000
cleaved (≥ 2 cells) embryos at 40hpi were produced in vitro. It was necessary to collect
many embryo pools and therefore a methanol/chloroform precipitation step was necessary
to concentrate proteins prior to the first dimension. Embryos were sonicated in 100µl of
PBS solution with proteases inhibitors (0.1 mg/ml pepstatin, 1 mg/ml leupeptin, 10 mg/ml
PMSF), followed by the addition of 4 volumes of methanol and 1 volume of chloroform.
Tubes were incubated at –80°C for 2h. Three volumes of water were added. Samples were
mixed and centrifuged at 10 000 X g at 4°C for 10 min. The upper layer was carefully
removed and 400 µl of methanol was added. The solution was very gently mixed and
centrifuged for another 10min in the same conditions. The methanol was removed and the
pellet was air-dried. After precipitation, the rehydratation buffer (250µl) used to solubilise
the proteins for the first dimension was distributed among the tubes containing the embryo
pools, let stand 1 h at room temperature and then vortexed for 5 minutes before the tubes
were pooled together. The first dimension program was extended due to the protein
quantity loaded onto the gel. The program was 30V during 10h, 1h at 100V, 250V, 500V,
1000V, 2000V, 2h at 4000V and at 8000V to reach 16000Vh for a total of 28150Vh. After
the 2DE, the gel was first stained with colloidal blue and scanned to evaluate the quantity
of protein, followed by light silver staining to facilitate spot identification for excision.
For Colloidal blue staining, the gel was soaked in Bio-Safe Coomassie Stain solution (Bio-
Rad) from between 20 min to 1 h. After staining, the gel was washed 3 times in deionised
and distilled water to remove background. For silver staining, the gel was washed three
times in water for 5 min each and the gel was soaked in a fresh staining solution of 47mM
of AgNO3, 0.0756 % of NaOH and 0.42% ammonium hydroxide for 15 min. The staining
solution was removed and the gel was rinsed two times and then soaked for 10min in water.
The gel was then soaked in the developing solution (0.005% citric acid and 0.0185%
107 formaldehyde in water) until the desired image was achieved, and development was
stopped with a 1% acetic acid solution.
In order to facilitate spot matching between the radiograms showing newly synthesized
proteins and the native gel containing total proteins, a combined radiolabelled (hot) and non
radiolabelled (cold) embryos silver stained gel was made (Westbrook, et al., 2001). This gel
contained 140 radiolabelled cleaved (≥ 2 cells) embryos between 36-40 hpi and 360
unlabelled cleaved embryos harvested at 40 hpi, for a total of 500 embryos. After the 2DE,
the gel was silver stained and dried. After five days of exposition at –80°C, the radiogram
was produced. Both the silver stained image and the radiogram were scanned and matched
using Imagemaster software (Amersham Biosciences). This experiment allowed better spot
matches as the scan of the dry silver gel and the radiogram are of the same size and present
the same distortions. During image analysis with ImageMaster 2D Elite, if any
decentralization spot matching were noted, these matching were rejected.
The proteins identified as potential proteins related to developmental competency through
comparisons made between HDC versus LDC and NDC embryos were then matched to
spots on the combined silver-stained and radiolabelled gel. Matches were then made
between the 2000 embryo native gel and the combined gel to determine which proteins
could be excised and sent for sequencing.
Spots were cut and sent for identification to the Institute for Biomolecular Design,
University of Alberta, Edmonton, Alberta, Canada (http://www.projectcybercell.ca/).
Stained bands (spots) were excised and an automated in-gel tryptic digestion was
performed on a Mass Prep Station (Micromass, UK). The gel pieces were de-stained,
reduced (DTT), alkylated (Iodoacetamide), digested with trypsin (Promega Sequencing
Grade Modified) and the resulting peptides extracted from the gel and analyzed via
LC/MS/MS.
LC/MS/MS was performed on a CapLC HPLC (Waters, USA) coupled with a Q-ToF-2
mass spectrometer (Waters, USA). Tryptic peptides were separated using a linear
water/acetonitrile gradient (0.2% Formic acid) on a Picofrit reversed-phase capillary
108 column, (5 micron BioBasic C18, 300 Angstrom pore size, 75 micron ID x 10 cm, 15
micron tip) (New Objectives, MA, USA), with an in-line PepMap column (C18, 300
micron ID x 5 mm), (LC Packings, CA, USA) used as a loading/desalting column.
Results have been analysed by MASCOT (http://www.matrixscience.com), Phenyx Virtual
Desktop (http://www.phenyx-ms.com) and Profound
(http://prowl.rockefeller.edu/profound_bin/WebProFound.exe). Search parameters included
carbamidomethylation of cysteine, possible oxidation of methionine and one missed
cleavage per peptide. At first time, the MS/MS results were compared against the
nucleotide sequence from NCBI non-redundant database
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blastcgihelp.shtml#nucleotide_databases). In a
second time, they were compared against EST_others sequences representing non mouse or
human EST. The origin of the identified peptides from EST sequences was taken into
account. Some EST sequences were from “Bovine ESTs: Focus on Female Reproduction”
from Dr Prather laboratory and from Embryonic EST from Dr Renard laboratory. Based on
the MS/MS results, the peptide mass fingerprints (PMF) was deduced from the equation
m/z ((PM= (M-1)z) where PM = peptide mass, m = peptide mass measured by MS/MS and
z = the charge of the peptide). The In Silico protein confirmation also used and additional
peptides were found with the new bos taurus sequence.
109
Results Spot detection analysis of the radiolabelled 2-cell embryos from the HDC, LDC and NDC
groups revealed 295 ± 56, 332 ± 45 and 212 ± 68 spots, respectively for those treatment
groups. The resulting averaged gels, based on the inclusion criteria had a total of 290, 289
and 175 spots for gels from HDC, LDC and NDC 2-cell embryos , respectively (Figure 11).
After comparing the three averaged gels 148 proteins were common between the three
groups and therefore, probably not discriminatory for developmental competence (Figure
11). Two-cell embryos from the LDC group shared 76 spots with the HDC 2-cell embryos
and 62 spots are present exclusively in HDC 2-cell embryos (Figure 12). Those 62 spots
and the 76 spots shared with LDC embryos represent the potential proteins associated with
developmental competence (Figure 13). For NDC embryos, only 4 spots are shared with
HDC embryos and 20 spots with LDC embryos.
A combined radiolabelled and silver stained gel was produced with 500 embryos to aid in
matching radiolabelled proteins to the spots corresponding to total proteins on a native
gel.The radiogram has revealed 851 spots and the silver stained gel contained 605 spots
(Figure 14). Among this number of detected spots, only 166 spots are shared between the
radioactive and silver stained gels. These differences show that new protein synthesis is not
necessarily related to total protein abundance. These 166 spots represent translated proteins
that could be possibly cut from the total protein native gel and sent for mass spectrometry
analysis.
When the 138 proteins identified as associated with developmental competence from the
HDC and LDC groups were matched to this gel, only 24 proteins were potential candidates
for gel sequencing, where 7 spots are exclusive to the HDC embryos and the other 17 spots
were shared with the LDC embryos (Figure 14).
Only 16 (Figure 15) of the 24 (Figure 14) potential spots were visible on the colloidal blue-
stained gel before silver staining, suggesting that the quantity of the other 8 proteins (79,
116, 293, 131, 215, 229, 272, 274) on the native gel would not give enough material for
sequencing via mass spectrometry. On the 7 spots exclusively find in the HDC embryos, 5
110 were found on the silver stained gel (43, 79, 83, 116 and 261) but only 3 of them with
additional one were visible on the colloidal blue stained gel (43, 83, 261 and 273). The
other 12 proteins were common between HDC and LDC embryos. Five spots were chosen
for mass spectrometry analysis based on abundance and importance, spots 117, 135, 194,
261 and 273 (Figure 15).
Identification results for the five spots are shown in Tableau 8 Identification by Q-TOF
of five spots related to developmental competence. Observed molecular mass (kDa) are
based on 2DE migration, and theoretical values (pI/kDa) are calculated from the amino acid
sequence. Seven proteins have been identified. Spots 261 and 273 were showing two
proteins. The identities of the proteins were confirmed in Bos taurus species with a
combination of MS/MS spectra analysis, PMF analysis and in silico confirmation. Three
proteins are known in Bos taurus database and four proteins where partially known and
reconstruct with Bos taurus EST database. For the protein 117, corresponding to the IDH
from Bos taurus database, only one amino acid is different, from the peptide from Bos
taurus dbEST (gi|9738120) compared to a EST Bos taurus kidney foetus database,
GQETSTNPIASIFAWTR. This peptide is close to the GQETLTNPIASIFAWTR usually
found in Bos taurus IDH. The last peptide never match in the MSMS and PMF analysis,
and we can assume that it is absent from the identified proteins.
111
Discussion The objective of the present study was to identify proteins that could be associated with
developmental competence, by comparing embryos classified according to this triple
selection procedure. After proteomic analysis of 2-cell embryos with three predicted levels
of developmental competence, HDC, LDC and NDC, the five most abundant proteins
associated with developmental competence were identified by mass spectrometry.
The native protein pattern is quite conserved between oocyte and early embryo before the
MET (Thompson, et al., 1998). This high amount of common native proteins could
facilitate protein identification on a total protein gel, and reduce the number embryos
needed in the present study. However, it appeared that the native protein pattern and the
translated protein pattern are very different. Only 20% of translated proteins can be located
in the total protein pattern gel. Considering the fact that the total protein pattern of
immature oocytes and 2-cell embryos are quite similar and the newly translated proteins
patterns are different, these results suggest that proteins are translated in small amount
and/or are not accumulated in the oocyte nor the embryo, representing a fast turnover of
protein during maturation and early embryo development.
The comparison of the three levels of developmental competence of 2-cell embryos has
revealed important facts on the translational activity of late cleaving embryos. A lower
translational activity is observed in the delayed 2-cell embryos. The reduction of protein
translation is observed by a lower number of detected spots and a general reduction of
intensity of spots, although it has not been quantified. Most proteins present in delayed 2-
cell embryos are present in early cleaving 2-cell embryos suggesting that only a basal
translational activity is present in late cleaving embryos. This hypothesis could be
supported by the fact that the polyA tail of β-actin, a housekeeping messager, does not vary
regardless of the speed of cleavage (Brevini, et al., 2002). The reduction of protein
translation in the delayed 2-cell embryos could also be explained by the degradation of
maternal mRNA with time, since these embryos were labelled a few hours later than the
early cleaved 2-cell embryos. Experiments from our laboratory on translated proteins in 4-
cell embryos labelled between 48-52 hpi, has demonstrated a higher number of spots than
112 the delayed 2-cell embryos of the present study (see Figure 8). Consequently, the absence
of developmental competence in the delayed 2-cell embryos could be explained by an
independent time degradation and/or lack of maternal mRNA. It has been found by SSH
that various mRNA are differentially present between early and late cleavage 2-cell
embryos (Fair, et al., 2004a; Dode, et al., 2005). In addition, the reduction of translational
activity in our delayed 2-cell embryos could be explained by a regulation problem of the
poly(A) tail of maternal mRNA. It has been shown that the length of the poly(A) tail of
different maternal mRNA varied between early and late cleaving 2-cell embryos (Brevini,
et al., 2002). Finally, the late cleaving embryos show lower developmental competence that
may be caused by the reduction of translational activity probably resulting from the lack or
degradation of maternal mRNA and/or wrong regulation of the poly(A) tail which stop the
production of a variety of proteins needed for embryos developmental competence.
The mass spectrometry analysis of five spots has identified seven proteins, of which six are
potentially implicated in developmental competence. IDH1, PRDX6 and unnamed protein
#194 all function to protect the cell against either oxidative stress or the production of
advanced glycation end products. The first protein identified is IDH1, which function is to
protect the cell against oxidative stress. Previously found in the corneal epithelium in the
bovine, IDH1 is essential for efficient glutathione recycling (Sun, et al., 1999). The second
protein is PRDX6 also named antioxidant protein 2 and non-selenium glutathione
peroxidase. However, this protein also plays a role in cell proliferation and differentiation,
the immune response, and control of apoptosis (review by Rhee, et al., 2001). This protein
has been studied in immature and mature oocytes and during embryo development up to the
8-cell stage and PRDX6 is up regulated during in vitro maturation (Lequarre, et al., 2004).
The transcript is still present at the 2-cell embryo up to MET and only reappears at the
blastocyst stage. No significant difference at the mRNA level has been observed between
early and late cleaving embryos although this gene was highlighted by the differential
hybridation (Dode, et al., 2005). From the present study and the study of Dode and
collaborators, the developmental competence may not be regulated on the PRDX6 mRNA
level but at the traductionnal level, or as two proteins have been found in the same spot, it
is possible that it is only the PSMA6 which is implicated in developmental competence.
113 The third protein, unnamed protein #194 is related to a hypothetical protein My027 in the
Mus musculus and Homo sapiens databases, however there is no information about the
function of this protein in the literature. It is the first time that the protein has been
observed in a tissue, as only genomics studies have been performed on the predicted protein
product (Lai, et al., 2000, Okazaki, et al., 2002, Strausberg, et al., 2002). However, two
Glyoxalase I (Glo1) domains are predicted from the protein sequence of this unknown
protein, and GloI were known to be a protective agent for the cell. Glo1 protein is present
in all human tissues and more importantly specific activities of glyoxalases in foetal tissues
is approximately three times higher than in adult tissues. GloI reacts with glutathione,
consequently it has an antioxidant activity (Tiboni, et al., 1997). GloI is also known to bind
advanced glycation end products, which are cell damaging products (Thornalley, 2003).
The biosynthesis of cholesterol seems important to embryo developmental competence as
two proteins related to its metabolism have been found. Even if it is implicated in
glutathione recycling, IDH1 has also been shown to play a critical role in fat and
cholesterol biosynthesis (Koh, et al., 2004) and in supplying reduction equivalents and/or
energy required for capacitation and the acrosome reaction in cryopreserved bovine
spermatozoa (Cordoba, et al., 2005a, Cordoba, et al., 2005b). In our laboratory, the level of
IDH1 mRNA has been quantified according to early and late cleaving embryos. It has been
shown that mRNA level is higher in early cleaving compared to late cleaving embryo
(Dode, et al., 2005). This experiment has confirmed that IDH1 is related to developmental
competence. The second protein found, the thiolase cytosolic protein also known as
cytosolic acetoacetyl-CoA thiolase (CT ou ACAT2), beta-ketothiolase, acetyl-CoA
transferase protein or acetyl-CoA acetyltransferase 2 cytosolic variant. It is a member of the
thiolase family, and there are at least six thiolase isoenzymes which are localised in
mitochondria, peroxisomes and cytosol (Antonenkov, et al., 2000, Fukao, 2002). The
thiolase found in the present study is a cytosolic isoenzyme that is involved in the
biosynthetic pathway of cholesterol through the catalysing condensation of two molecules
of acetyl-CoA to acetoacetyl-CoA (Fukao, 2002).
114 The PSMA6 is one of the subunits constituting the catalytic core of the proteasome 20S
which consists of an alpha and beta subunit structure (Groll, et al., 1997). The proteasome
20S forms the proteasome 26S, which is an ubiquitin-dependant proteolytic system (review
by Roos-Mattjus and Sistonen, 2004). The proteasome is thought to be involved in
regulating the maturation and fertilization of oocyte through regulation of protein turnover
(Tokumoto, et al., 1997, Tokumoto, 1999, Marangos and Carroll, 2004). It has been shown
that the protein level of PSMA6 does not change during maturation in Xenopus laevis
(Wakata, et al., 2004). In our laboratory, the proteasome subunit alpha type 7 has been
found via SSH on oocytes harvested from different follicular sizes (personnal
communication of Dr Sirard).
For spot 273, both the proteins UCH-L1 and THTPA have been identified. In our
laboratory, UCH-L1 has previously been identified as a spot next to the one taken for
sequencing (see chapter 3), therefore it is presumed to be a contaminant and not implicated
in developmental competence. The THTPA is found only in mammalian tissues
(Makarchikov, et al., 2003) and it functions to specifically hydrolyze the subtrate thiamine
triphosphate (ThTP) (Makarchikov and Chernikevich, 1992, Makarchikov and
Chernikevich, 1998, Lakaye, et al., 2002). However the biological role of thiamine
triphosphate remains unclear. Although it is possibly involved in phosphorylation processes
(Nghiem, et al., 2000) and activation of large-conductance chloride channels (Bettendorff,
et al., 1993). ThTP might be part of a new signalling cascade involving protein
phosphorylation (Lakaye, et al., 2004). In mouse tissues, it (ThTP or THTPA) has been
shown to be more abundant in the testis, prostate and uterus and lowest levels were found
in the ovaries (Lakaye, et al., 2002, Lakaye, et al., 2004). However, the mRNA levels are
poorly correlated with ThTPase enzyme activities. The 3’-untranslated end of ThTPase
mRNA contains a unique, highly conserved sequence that might be involved in
translational control (Lakaye, et al., 2004). As there is currently no measure of mRNA of
THTPA in the oocyte, the present results show that the protein is translated from maternal
mRNA and present in high quantity in bovine 2-cell embryos. These observations together
with those made by Lakaye and collaborators support the hypothesis that a special control
is made at the translational level. A recent study has revealed that male mice (-/-), but not
115 female mice, lacking thiamine transporters Slc19a2 become infertile, As the germ cells do
not develop beyond primary spermatocytes (Fleming, et al., 2003). Therefore, the potential
implication of THTPA in developmental competence remains unclear.
In conclusion, the triple selection procedure has allowed the identification of groups of 2-
cell embryos with varying levels of developmental competence. All three factors have to be
taken in account to reduce the heterogeneity of COC from slaughterhouse ovaries and
create valuable data generated from in vitro studies aiming to understand the genomic or
proteomic factors that are associated with developmental competence. Late cleaving
embryos have shown a reduction in translational activity by showing only a basal
translational activity compared to faster-cleaving embryos. The protein patterns visualised
by 2DE have allowed the discrimination and selection of numerous potential developmental
competence factors, and six have been identified. Unfortunately the fast protein turnover
during oocyte maturation and early embryo development has reduced the potential
identification of most of the proteins associated with developmental competence by mass
spectrometry, and this will be the limiting factor for future proteomics studies using
oocytes and early embryos.
116
Acknowledgement The authors thank the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada for
their financial support and Dr Susan Novak for critical reading of the manuscript.
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Figures
Figure 10 Labelling protocol of different origin 2-cell embryos of high (HDC) and low (LDC) developmental competence between 36-40hpi, and uncompetent (NDC) late cleaving 2-cell embryos between 45-49hpi. EA: early atretic, H: healthy.
0 15 36 40 45 49
Hours Post Insemination (hpi)
α-amanitine
HDC Follicle 5-10mm, EA COC, n = 10
LDC Follicle 3-5 mm, H COC, n = 10
NDC Follicle 3-5 mm, H COC, n = 10
0 15 36 40 45 49
Hours Post Insemination (hpi)
α-amanitine
HDC Follicle 5-10mm, EA COC, n = 10
LDC Follicle 3-5 mm, H COC, n = 10
NDC Follicle 3-5 mm, H COC, n = 10
120
HD
C
181.
811
5.5
82.2
64.2
48.8
37.1
25.9
19.4
14.8 6
MrX
10-3
pH 3
p
H10
LDC
ND
C
a)b)
c)
Figu
re 1
1 A
vera
ge g
el o
f eac
h tre
atm
ent a
) HD
C b
) LD
C a
nd c
) ND
C. E
ncirc
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o fin
d pr
otei
ns a
ssoc
iate
d w
ith d
evel
opm
enta
l com
pete
nce.
121
Figure 12 Number of proteins translated from maternal mRNA shared or unique to the three 2-cell embryos showing high, low and none developmental competence, HDC, LDC and NDC, respectively. Proteins unique to the HDC and shared with LDC are potentially implicated in developmental competence.
62
45148
76
43 20
LDC
HDC
NDC
62
45148
76
43 20
LDC
HDC
NDC
122
Figure 13 The numbered spots represent proteins that are exclusively present in HDC treatment (circle) and as well shared with LDC treatment (rectangle). Theses proteins are absent from the treatment NDC. They represent potential proteins implicated in the developmental competence.
pH 3 pH 10
181.8115.582.2
64.2
48.8
37.1
25.9
19.4
14.8
6
Mr X 10-3
358
1 2
109 1415283031
414349 51 52535556
72 6879
81 839099
87
109 106
116
113375373
154171
191184
205212
222226 227231
246 245239252
261267270276
272273
286283293 291295
296 297
310303
314319
332339
352
pH 3 pH 10
181.8115.582.2
64.2
48.8
37.1
25.9
19.4
14.8
6
Mr X 10-3
358
1 2
109 1415283031
414349 51 52535556
72 6879
81 839099
87
109 106
116
113375373
154171
191184
205212
222226 227231
246 245239252
261267270276
272273
286283293 291295
296 297
310303
314319
332339
352
123
Figure 14 Tracking labelled proteins (a) on a silver stained protein pattern (b) of 500 cleaved embryos at 40hpi. The encircled proteins in each gel represent their homologues and are possibly usable for sequence analysis. In gel (a) shows the numbered proteins exclusively from HDC (circle) and as well shared with LDC treatment (rectangle).
181.8115.5
82.2
64.2
48.8
37.1
25.9
19.4
14.8
6
MrX10-3
pH 3 pH 10
a) b)
92
279 274
43
8379
116
261272
293
273
181.8115.5
82.2
64.2
48.8
37.1
25.9
19.4
14.8
6
MrX10-3
pH 3 pH 10
a) b)
92
279 274
43
8379
116
261272
293
273
124
Figure 15 Colloidal blue (a) and silver (a) stained proteins patterns of the same gel made from two thousand cleaved embryos at 40hpi. In both gels, numbered proteins are exclusively from HDC (circle) or as well shared with LDC treatment (rectangle). Spots points out with a black arrow have been sent for identification by mass spectrometry analysis.
181.8115.582.2
64.2
48.8
37.1
25.9
19.4
14.8
6
MrX10-3
pH 3 pH 10
8392
273
116
43
7983
261
46
92
118 117
135
194215 204
221 224 229
279
255
136
8392
273
116
43
7983
261
46
92
118 117
135
194215 204
221 224 229
279
255
136
273 261
43
92
46
118 117
194
224221204
255
279
136135
83
273 261
43
92
46
118 117
194
224221204
255
279
136135
83
a) b)
125
DISCUSSION GÉNÉRALE
Le but de ce projet de doctorat était l’étude de la compétence au développement de l’ovule
chez le bovin. Quelles sont les protéines traduites des ARNm maternels chez les embryons
compétents au développement, mais qui sont absentes dans les embryons incompétents?
Chez les mammifères, la fenêtre entre la fécondation et la MET varie entre les espèces. Elle
se produit au stade 1-2 cellules chez la souris (Aoki, et al., 1997), au stade 4-8 cellules
chez le porc (Hyttel, et al., 2000) et l’humain (Braude et al., 1988), et au stade 8-16 cellules
chez le bovin (Hyttel, et al., 2000) et le mouton (Crosby, et al., 1988). Par conséquent, cette
longue fenêtre chez le bovin nous a permis de mieux apprécier l’utilisation des ARNm
maternels lors des quatre premiers cycles cellulaires de l’embryon.
Aux cours de ces travaux, 1) nous avons élaboré la triple sélection qui a permis d’identifier
une population d’embryons dont le taux de blastocystes se rapproche de celui obtenu in
vivo, ainsi que des populations d’embryons d’une compétence intermédiaire jusqu’à nulle.
Nous espérons ainsi avoir trouvé un moyen d’homogénéiser les populations d’embryons en
procédant à une triple sélection qui considère à la fois l’origine folliculaire, la morphologie
du COCs et du temps de clivage de l’embryon (Chapitre II). 2) L’étude protéomique du
développement embryonnaire avant la transition maternel, nous a montré que la moitié des
différents ARNm maternels traduits, sont présents jusqu’à la MET, soit jusqu'au stade de 8-
cellules, tandis que l’autre moitié sont spécifiques à chaque stade embryonnaire ou entre les
deux stades embryonnaires subséquents. Cette étude conjuguée à celle effectuée sur la
protéomique de l’ovocyte durant la maturation (Coenen, et al., 2004), nous a démontré que
les besoins protéiques constants entre la maturation et le développement embryonnaire sont
très différents. Seulement 32 protéines sont présentes dans l’ovocyte immature et traduites
durant la maturation et le développement embryonnaire. Onze de ces protéines ont été
identifiées : les protéines de choc thermique 71 et 70, la cyclophiline A, la glutathione-S-
transférase mu 5, la protéine épithéliale liant les acides gras, la 2,3-biphosglycérate mutase,
la sous-unité epsilon TCP-1 de la chaperonine, l’ubiquitine carboxyl-terminal hydrolase
isozyme L1, l’enzyme conjuguant l’ubiquitine E2D3 et l’isoforme alpha et gamma de
l’actine. À cause du peu de connaissances du génome bovins, les protéines ont été
identifiées chez d’autres espèces. Le besoin de confirmer l’identification nous a forcés à
126 développer une approche in silico, car elle limite ainsi l’usage de matériel vivant
(CHAPITRE III). 3) Finalement, connaissant maintenant mieux le protéome de l’embryon
bovin avant la MET, nous avons étudié trois groupes d’embryons au stade 2-cellules
présentant des niveaux différents de compétence, passant de très compétent à non
compétent. Les embryons incompétents montrent un nombre réduit de protéines traduites
comparativement aux deux autres groupes. De ces protéines, 85% se retrouvent également
dans les embryons très ou moyennement compétents. De ces protéines communes, 62%
sont des housekeeping embryonnaires identifiées au CHAPITRE III à la Figure 8. De l’autre
côté, les embryons très compétents au développement présentent des protéines qui lui sont
exclusives et d’autres qu’ils partagent avec les embryons moyennement compétents. Il en
résulte que 48% des protéines traduites dans les embryons très compétents sont
potentiellement impliquées dans la compétence au développement embryonnaire,
comparativement à 26% dans les embryons moins compétents. Ces observations montrent
que les embryons incompétents présentent une carence dans la synthèse des protéines
potentiellement importantes à la compétence au développement embryonnaire. Cette étude
nous a conduits à observer que les patrons de protéines natives versus les patrons de
protéines traduites sont très différents. Seulement 27% des protéines traduites sont
présentes dans le patron de protéines natives. Se basant sur l’étude protéomique du chapitre
2, cette observation laisse entrevoir que nos protéines traduites de même que celles
potentiellement reliées à la compétence, sont produites en petite quantité et sont sûrement
dégradées rapidement. Seulement un petit nombre de protéines potentiellement reliées à la
compétence ont pu être identifiées : la thiolase cytosolique, l’isocitrate déshydrogénase, la
peroxiredoxine 6, la sous-unité alpha du proteasome-6, la thiamine triphosphatase et la
protéine hypothétique My027 (Chapitre 4).
Ces résultats sont importants parce qu’ils aident à mieux comprendre la compétence au
développement chez l’ovocyte bovin. La plupart des études sur la compétence au
développement se basant sur le développement embryonnaire tiennent compte uniquement
du temps de clivage de l’embryon et non de son origine folliculaire ou de la morphologie
de son COC (Plante, et al., 1994, Lonergan, et al., 1999a). Cette étude montre clairement
que des embryons clivant tôt ne sont pas nécessairement compétents au développement
127 s’ils proviennent de COC en santé de follicules de 3-5mm. Pourtant Plante (1994) et
Lonergan (1999) et leurs collaborateurs respectifs ont obtenu des taux égaux ou légèrement
plus faibles à ceux obtenus au Chapitre 2. Malheureusement, la présente étude n’explique
pas la cause de cette baisse de compétence au développement, malgré un rythme de
développement qui semble normal.
Durant son doctorat, le Dr Barnes a étudié les patrons protéiques en 2-DE des embryons de
1 cellule jusqu’à 8-16 cellules, afin de cerner le moment de l’activation embryonnaire
(Barnes, 1988). Comme dans la présente étude, il avait observé que certaines protéines
apparaissaient et disparaissaient lors du développement embryonnaire. Il avait observé un
changement plus important du patron protéique au cours du stade 4-cellules. Toutefois, son
étude incluait les protéines d’origine embryonnaire et il avait confirmé qu’une partie de ces
protéines étaient bien d’origine embryonnaire. Selon la présente étude qui est quantitative
et qui se concentre uniquement sur les protéines maternelles, on peut observer que près de
la moitié des protéines changent durant les stades 2, 4 et 8 cellules. Aucun changement
particulièrement marqué n’a été observé au stade 4-cellules, confirmant ainsi que le
changement protéique observé par Barnes et collaborateurs, au stade 4-cellules est d’origine
embryonnaire. Cette observation montre donc une utilisation séquentielle des ARNm
maternels. Il est clair qu’il y a un changement majeur au niveau du patron protéique lors de
la MET (Barnes, 1988, Frei, et al., 1989), mais il existe une bonne dynamique au niveau de
la traduction des ARNm maternels qui est loin d’être négligeable. Cette dynamique est
possiblement lié à la réussite de l’activation du génome embryonnaire.
Les ARNm maternels sont utilisés pour accomplir deux choses : la maturation méiotique et
le développement embryonnaire jusqu’à la MET. La reprise de la méiose ainsi que la
fécondation enclenchent des processus cellulaires différents. La présente étude démontre
très bien que les besoins en nouvelles protéines durant la maturation et le développement
embryonnaire sont très différents et seulement une cinquantaine de protéines sont
communément traduites. Ces protéines étant considérées comme des protéines
housekeeping maternels (MHKP). La moitié des protéines identifiées jouent un rôle au
niveau de la défense cellulaire (HSC71, HSP70, CCTε, GSTM5 et CypA). Deux autres sont
128 impliquées dans la dégradation des protéines (UCH-L1 et E2D3). Encore deux autres sont
impliquées dans des métabolismes énergétiques (2,3-BPGM et E-FABP). Les dernières, la
β-actine et γ-actine, sont impliquées au niveau du cytosquelette. Ces protéines pourront à
l’avenir servir de repère interne du pI et du poids moléculaire sur les gels 2-DE sur les
ovocytes et les embryons bovins. Sans être directement relié à la compétence, il est certain
qu’une déficience dans ces protéines entraînerait des conséquences négatives sur le
développement embryonnaire.
L’étude directe de la compétence du chapitre 4 a permis d’augmenter notre compréhension
sur le manque de compétence au développement des embryons qui clivent lentement. Il
avait déjà été démontré que ces embryons présentent un nombre réduit d’ARNm (Fair, et
al., 2004b) et une mauvaise polyadénylation de la queue poly(a) (Brevini, et al., 2002). La
présente étude représente sûrement les répercussions au niveau protéique de la mauvaise
production et gestion des stocks ARNm maternels. Les embryons incompétents au
développement produisent des protéines que l’on pourrait appeler de base car elles
correspondent aux housekeepings embryonnaires (Figure 8). De plus, plusieurs protéines
présentes dans les embryons compétents sont absentes chez l’embryon incompétent.
Certaines protéines housekeeping embryonnaires sont absentes du patron protéique des
embryons incompétents, soit CypA et l’UCH - L1. Par conséquent, les embryons
incompétents sont incapables de maintenir le métabolisme basal lors du développement
embryonnaire. Au moins 138 protéines sont potentiellement impliquées dans la compétence
au développement embryonnaire. Mais malheureusement, très peu d’entre elles
s’accumulent en assez grande quantité pour être identifiées. Cinq spots analysés ont permis
d’identifier sept protéines. Deux de ces protéines ont été étudiées au niveau de leur quantité
d’ARNm, l’IDH1 et PRDX6. Uniquement l’IDH1 présente une quantité d’ARNm
inférieure chez les embryons incompétents qui clivent tardivement comparativement aux
compétents qui clivent rapidement (Dode, et al., 2005). Toutefois, est-ce que la protéine
PRDX6 joue au rôle au niveau de compétence embryonnaire autre qu’au niveau de
l’ARNm? Où son identification n’est que le résultat d’une contamination d’une autre
protéine que celle recherchée? Je ne crois pas qu’une étude protéomique génère autant de
faux positifs que les études génomiques. En conséquence, l’analyse de la quantité
129 d’ARNm, mais également l’évaluation de la régulation de leur queue poly(A),
l’emplacement et le déplacement dans le temps et l’espace par immunohistochimie de la
protéine, ainsi que l’utilisation des RNAi afin d’évaluer le phénotype qu’engendre
l’absence ou la faible expression de la protéine étudiée sur le développement embryonnaire
(Paradis, et al., 2005), sont toutes des expériences qui doivent être faites afin de
comprendre l’implication de la protéine au niveau de la compétence au développement. Le
travail sera d’autant plus important pour la protéine hypothétique MyO27, car c’est la
première fois qu’elle est observée dans une cellule. Il y a également la thiamine
triphophatase qui serait impliquée dans la régulation d’une nouvelle voie de signalisation
impliquant la thiamine triphosphate dont le mécanisme d’action est encore inconnue, mais
qui répondrait à un au stress cellulaire (Makarchikov, et al., 2003, Lakaye, et al., 2004b).
De plus seulement, le stade 2-cellule a été étudié, mais qu’advient-il des patrons protéiques
aux stades 4 et 8-cellules? Il serait pertinent dans l’étude des embryons à 4 et 8 cellules
d’étudier les patrons avec et sans α-amanitine. On pourrait alors évaluer quelles protéines
maternelles sont absentes et quelles premières protéines embryonnaires ne sont pas
produites. Toutefois, il y a bien des chances que leur identification à partir des gels en 2-DE
soit presque impossible dû à leur rareté. Néanmoins, les outils de la protéique se
développent rapidement et permettront de mener ces études.
Toutes ces identifications de protéines chez le bovin nous ont permis de développer une
méthode efficace afin de confirmer l’identification des protéines chez des espèces où la
connaissance du génome est limitée. Bien que le niveau d’homologie inter espèce soit assez
élevé, puisque les ARNm bovins s’hybrident sur des DNA array humain (Dalbies-Tran and
Mermillod, 2003), cette homologie est moins importante pour les protéines. La sensibilité
de la spectrométrie de masse fait en sorte qu’une différence d’un acide aminé rejette
complètement l’identification du peptide. S’il y a identification inter espèces ou non, il est
essentiel de cribler les banques de EST de l’espèce étudiée afin de rechercher les vrais
peptides, de reconstruire la nouvelle protéine et de comparer son patron de digestion
théorique avec celui obtenu expérimentalement. De plus cette analyse permet d’identifier si
un autre isoforme existe. Une augmentation du nombre de peptides théorique qui matchent
130 avec le spectre expérimental confirme l’identification des protéines. Cette méthode n’a
comme limite que celle des banques de EST.
Bien que non rapportée dans cette thèse, une librairie de soustraction des ARNm a été
réalisée à partir des embryons à 36hpi. Des embryons de 2-cellules de haute compétence
(HDC) utilisés dans l’étude protéomique moins les embryons qui sont à 1-cellule à 36hpi,
c’est-à-dire qui sont destinés à cliver tardivement ou pas du tout, ont été soustraits. Par la
suite un DNA array a été produit afin de cribler un plus vaste éventail de gènes. Des gènes
ont été trouvés, mais aucun ne correspond exactement à celui d’une des protéines trouvées
au Chapitre IV. Cette expérience a généré beaucoup de clones dont l’implication dans la
compétence au développement reste à caractériser. Le travail a déjà commencé par les
travaux du Dr Dode aidée par Dr Dufort. Elle a trouvé que YEAF et Histone H2A sont
différemment présents entre les embryons qui clivent tôt versus ceux qui clivent tard.
Toutefois certains gènes, tels que la Cathepsin B, RAD50 et CCTβ sont presque
statistiquement différents entre les deux populations d’embryons. Leur ARNm étant
toujours plus abondant chez les embryons plus compétents.
En résumé, la compétence au développement semble résider d’avantage dans un grand
nombre de protéines qu’à quelques candidats, comme semble également démontrer les
recherches en génomique. Mais est-ce que ces candidats sont la cause du manque de
compétence et/ou le résultat d’une anomalie antérieure? Durant mes travaux sur la
compétence au développement de l’ovocyte, je me suis représentée ce modèle de la
compétence. Lors de sa croissance, l’ovocyte transcrit des ARNm et traduit des protéines
qu’il entrepose dans son cytoplasme. Toutefois, dans son environnement in vivo, il ne
reçoit aucun stress qu’il ne sera pas capable de contrer afin de compléter sa croissance avec
succès. La situation en est tout autrement in vitro. L’ovocyte doit faire face à des stress et
des manques de stimulations qu’il l’empêche de compléter sa croissance. Par conséquent, il
y a de forte probabilité que ces stress et ces manques de stimulations affectent
différemment chaque ovocyte, ayant ainsi des répercussions variables sur la transcription et
la traduction des ARNm maternels, mais dont l’issu final est l’arrêt du développement
embryonnaire. Ce modèle expliquerait pourquoi les études en génomique et en protéomique
131 génèrent autant de candidats. Il nous faudra remonter à la source de chaque candidat afin
d’évaluer ce qui a pu empêcher sa transcription ou sa traduction et ainsi améliorer les
conditions de culture in vitro. Je crois bien que de toutes ces études sur la compétence au
développement découlera l’identification d’une carte de probabilité de la compétence,
c’est-à-dire nous auront identifié une série d’ARNm et de protéines qui peuvent être
responsables du manque de compétence au développement et selon si l’embryon présente
un certain pourcentage d’anomalies, on évaluera sa capacité à produire un embryon viable à
un certain pourcentage.
La compétence au développement n’est toujours pas démystifiée, mais une partie en a été
dévoilée.
132
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